Summary
Her præsenterer vi en protokol til at tilpasse klarhedsmetoden i hjernevævene til helmonterings nethinder for at forbedre kvaliteten af standard immunohistokemisk farvning og højopløsningsbilleddannelse af nethindeneuroner og deres subcellulære strukturer.
Abstract
Vævshydrogeldelipidationsmetoden (CLARITY), der oprindeligt blev udviklet af Deisseroth-laboratoriet, er blevet ændret og i vid udstrækning anvendt til immunostaining og billeddannelse af tykke hjerneprøver. Denne avancerede teknologi er dog endnu ikke blevet brugt til helmonterede nethinder. Selv om nethinden er delvist gennemsigtig, begrænser dens tykkelse på ca. 200 μm (hos mus) stadig indtrængen af antistoffer i det dybe væv samt reducerer lysindtrængning for billeddannelse med høj opløsning. Her har vi tilpasset KLARHED metode til hele montere musen nethinder ved polymerisere dem med en acrylamid monomer til at danne en nanoporous hydrogel og derefter rydde dem i natrium dodecyl sulfat for at minimere proteintab og undgå vævsskader. KLARHED-forarbejdede nethinder blev immunostained med antistoffer for nethinde neuroner, gliaceller, og synaptiske proteiner, monteret i et brydningsindeks matchende løsning, og afbildet. Vores data viser, at KLARHED kan forbedre kvaliteten af standard immunohistokemisk farvning og billeddannelse for nethinde neuroner og gliaceller i hele montering forberedelse. For eksempel blev 3D-opløsningen af fine axonlignende og dendritiske strukturer af dopaminergiske amacrinceller meget forbedret af KLARHED. Sammenlignet med ikke-forarbejdede helmonterede nethinder kan KLARHED afsløre immunostaining for synaptiske proteiner såsom postsynaptisk tæthedsprotein 95. Vores resultater viser, at KLARHED gør nethinden mere optisk gennemsigtig efter fjernelse af lipider og bevarer fine strukturer af nethindeneuroner og deres proteiner, som rutinemæssigt kan bruges til at opnå højopløsningsbilleddannelse af nethindeneuroner og deres subcellulære strukturer i hele monteringsforberedelsen.
Introduction
Hvirveldyr nethinden er måske den mest tilgængelige del af centralnervesystemet (CNS), og det tjener som en fremragende model for at studere udviklingen, strukturen og funktionen af hjernen. Fem klasser af neuroner i nethinden er fordelt i tre nukleare lag adskilt af to plexiform lag. Det ydre atomlag (ONL) består af klassiske fotoreceptorer (stænger og kegler), der omdanner lys til elektriske signaler. Elektriske signaler behandles af neuroner i det indre nukleare lag (INL), herunder bipolar, vandret og amacrinceller, og overføres derefter til nethindeganglionceller (RGCs) i ganglioncellelaget (GCL). RGCs er output neuroner af nethinden, med axoner projicere til hjernen for at bidrage til billeddannende og ikke-billeddannende visuel funktion. Derudover giver tre typer af gliaceller (Muller-celler, astroglia og microglia) næringsstoffer til neuroner og beskytter neuroner mod skadelige ændringer i deres ekstracellulære miljø.
En specialiseret delpopulation af amacrinceller producerer og frigiver dopamin, en vigtig neuromodulator i CNS, omkonfigurerer nethinde neurale kredsløb under lystilpasning1,2. Dopaminergiske amacrine celler (DACs) har et unikt træk ved morfologiske profiler. Deres somata er placeret i den proksimale INL med dendritter, der forgrener sig i den mest distale del af det indre plexiformlag (IPL). Axon-lignende processer af DAC'er er unmyelinated, tynde og lange, sparsomt forgrenet, og bærer varicosities (de steder, dopamin frigivelse). De danner en tæt plexus med dendritter i IPL, herunder ring-lignende strukturer omkring somata af AII amacrine celler. Axonerne løber også gennem INL mod OPL og danner en centrifugalvej over nethinden3. Vi har vist, at DAC processer udtrykke receptorer som reaktion på glutamat frigivelse fra presynaptic neuroner, herunder bipolar celler og iboende lysfølsomme retinal ganglion celler (ipRGCs)4,5,6. Det er dog uklart, om glutamatreceptorer udtrykker på axoner, dendritter eller begge dele, da de er afskåret i lodrette nethindesektioner og ikke kan skelnes fra hinanden5,6. Immunostaining skal udføres i helmonterings nethinder for at afsløre tredimensionel forgrening af DAC'er og tilstedeværelsen af glutamatreceptorer på subcellulære rum. Selv om nethinden er relativt gennemsigtig, tykkelsen af en mus hele mount nethinden er ca 200 μm, hvilket begrænser indtrængen af antistoffer i det dybe væv samt reducerer lys penetration for høj opløsning billeddannelse på grund af væv lys-spredning. For at overvinde disse begrænsninger tilpassede vi immunostaining kompatibel væv hydrogel delipidation metode (KLARHED) udviklet for nylig for tykke hjerne sektioner til hele montere musen nethinder7.
CLARITY-metoden blev oprindeligt udviklet af Deisseroth-laboratoriet til immunostaining og billeddannelse af tykke hjerneprøver7. Det bruger et stærkt vaskemiddel, natrium dodecyl sulfat (SDS) og elektroforese til at fjerne lipidkomponenterne (der forårsager vævslysspredning), hvilket efterlader proteiner og nukleinsyrer på plads. De fjernede lipider erstattes med et gennemsigtigt stillads bestående af hydrogelmonomerer som acrylamid for at understøtte den resterende proteinstruktur. Det ryddede væv kan mærkes via immunohistochemistry og afbildes med væsentligt øget lysindtrængningsdybde gennem vævet (op til flere millimeter under vævsoverfladen). Siden da er CLARITY-metoden blevet optimeret og forenklet af flere forskningsgrupper8,9,10. En modificeret CLARITY-protokol anvender en passiv clearingteknik for at undgå de mulige vævsskader, der frembringes ved elektroforese til rydning af hele hjernen og andre intakte organer11. Denne metode er dog endnu ikke anvendt på helmonterede nethinder. Her har vi tilpasset den passive KLARHED teknik til hele montere nethinder for at gøre dem mere gennemsigtige for immunohistochemistry og billeddannelse. Vi fandt, at et flertal af de testede nethindeproteiner blev bevaret under denne proces for immunhistokemi. Ved hjælp af brydningsindeks matching løsning, vi var i stand til at billedet nethinde neuroner på tværs af ca 200 μm tykkelse fra ONL til GCL i hele mount nethinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musepleje og alle forsøgsprocedurer blev udført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer for forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees på Oakland University (protokol nr. 18071).
BEMÆRK: Navnene på opløsningerne og deres sammensætninger er anført i tabel 1.
1. Vævspræparat
- Aflive musen med en overdosis af CO2, efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
- Foren øjnene med buede pincet og overfør dem til en lille petriskål med 0,1 M PBS(tabel 1). Under et dissektionsmikroskop skal du stikke et lille hul langs hornhinden-sclera-krydset med en nål. Overførsel til 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time.
- Overfør øjet tilbage til en skål med PBS. Under en dissektion mikroskop, bruge dissektion saks til at skære hele vejen rundt om hornhinden-sclera krydset. Fjern hornhinden og linsen. Skær i bunden af synsnerven og skræl forsigtigt scleraen af med pincet for at isolere nethinden.
- Lav fire små snit jævnt omkring nethinden og bruge en fin spids børste dyppet i PBS at lægge den fladt (GCL side ned) i en kløver-lignende form på en lille firkant skåret fra nitrocellulose filterpapir til at stabilisere nethinden.
- Overfør nethinden ved hjælp af tang til at holde hjørnet af nitrocellulose papir (uden at røre den monterede nethinden) og læg den i en 48-brønd plade med 4% PFA i 1 time.
- Overfør filterpapiret og nethinden til en brønd med PBS og vask (3x i 5 min hver).
- Overfør til A4P0 (tabel 1) og inkuber natten over ved 4 °C med let omrøring.
- Pipette vegetabilsk olie i brønden for helt at dække A4P0-opløsningen. Inkuber i et vandbad ved 40 °C i 3 timer uden rysten.
- Vask (3x i 5 min hver) i PBS, og sørg for, at al olien er blevet skyllet af. Brug om nødvendigt en pipet til forsigtigt at fjerne resterende olie fra toppen af brønden før den sidste skylning.
- Inkuber i 10% SDS ved 40 °C i to dage med blid omrystning. Udskift SDS med frisk opløsning på den anden dag.
- Filterpapiret og nethinden overføres til PBS med Triton-X-100 (PBST, tabel 1)og vaskes (5x for hver 1,5 h).
- Opbevares ved 4 °C i PBST med 0,01% natriumanzid (NaN3)eller flyttes direkte til immunostaining.
2. Immunostaining og brydningsindeks matching
- Fjern nethinden fra filterpapiret ved forsigtigt at skrælle det af med en fin spidsbørste i PBST.
- Nethinden i primærantistof (tabel 2) fortyndes i blokeringsopløsning (tabel 1) i 2 dage ved 40 °C med let omrystning.
- Vask (5x, 1,5 h hver) i PBST.
- Inkuberes med de relevante sekundære antistoffer (tabel 3) fortyndet i blokeringsopløsning i 2 dage ved 40 °C med skånsom omrystning og beskytter mod lys gennem resten af proceduren.
- Vask (5x, 1,5 h hver) i 0,02 M fosfatbuffer (se tabel 1).
- Inkuber i sorbitolbaseret refraktiv indeks matching solution (sRIMS, se tabel 1)ved 40 °C natten over med skånsom omrystning.
3. Montering
- Omrids en 18 mm x 18 mm x 1,5 mm glasovertræk med en permanent markør med fin spids for at markere en firkantet grænse på bagsiden af et glasmikroskoprutsjebane.
- Vend rutsjebanen over og brug en sprøjte til at spore grænsen med en tynd linje af silikonefedt på forsiden af rutsjebanen, hvilket efterlader et lille hul i det ene hjørne for overskydende monteringsopløsning at undslippe.
- Overfør nethinden til midten af det afgrænsede område og arranger med en fin spids børste, så den ligger fladt med photoreceptor side mod glasset dias.
- Der pipettes ca. 60 μL sRIMS, så den dækker den flade nethinde og strækker sig til det ene hjørne af kabinettet, idet man sørger for, at nethinden forbliver flad og på plads.
- Påfør coverlip starter fra hjørnet med sRIMS og langsomt sænke det, indtil det rører fedt på alle sider, undgå dannelsen af luftbobler.
- Placer en stak på 3 coverlips på hver side af den monterede nethinden som en afstandsstykke. Brug den lange kant af et andet dias til at trykke ned coverlip, så holderen er flad og jævn.
- Der skal opbevares lysbilleder fladt ved 4 °C, indtil der er billeder.
4. Billedbehandling
- Billedprøver på enten et konventionelt fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop (Tabel over materialer). Begynd med at placere diaset på mikroskopstadiet og finde prøven.
BEMÆRK: Hvis der anvendes et omvendt objektivt mikroskop, skal du placere rutsjebanen på hovedet på scenen, først for at sikre, at de udsatte områder af diaset er fri for al silikonefedt og monteringsopløsning. - For at opnå z-stablede billeder af co-mærkede prøver, først fokusere på signalet i hver kanal individuelt og indstille eksponeringstid eller scanning hastighed, for fluorescens eller konfokale mikroskoper, hhv.
- Angiv området for z-stakken enten ved manuelt at indstille brændplanet øverst og nederst i det ønskede område eller ved at indstille midtpunktet og derefter angive et område omkring midtpunktet.
- Juster trinstørrelsen eller antallet af udsnit efter behov.
- Hent billedet, og gem den oprindelige fil, og eksporter den som en TIFF-fil eller et andet ønsket format.
5. Billedanalyse
- Brug den foretrukne billedanalysesoftware (Tabel over materialer) til at justere lysstyrken og kontrasten i hver kanal, indtil der opnås optimal klarhed i både de enkelte billeder og den 3-dimensionelle gengivelse af z-stakken.
BEMÆRK: Hvis den valgte trinstørrelse er tilstrækkelig lille, kan der også udføres 3D-dekonvolution for at forbedre signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modificerede KLARHED-behandlede nethinder er optisk gennemsigtigt væv.
For at formulere en vævsrydningsmetode, der er kompatibel med immunohistokemiske applikationer i nethinden, samtidig med at vi sørgede for tilstrækkelig afdæmitning og bevarede cellulære proteiners strukturelle integritet, tilpassede vi CLARITY-vævsclearingmetoden til helmonterede musehindeinaer. Vi var i stand til at forenkle protokollen og ændre den for hele monterings-nethinder (se protokol). Efter at have afsluttet vævshybridering, rydning og brydningsindeksmatchning viste nethinder, der blev behandlet med denne ændrede CLARITY-protokol, næsten fuldstændig optisk gennemsigtighed i hele nethindens tykkelse (Figur 1A) sammenlignet med ikke-behandlede kontrolhindehinder (Figur 1B). Dette resultat tyder på, at denne ændring af CLARITY-protokollen giver tilstrækkeligt ryddet helmonterings nethindevæv.
Forbedret 3D-billeddannelse af neuroner i modificerede KLARHED forarbejdede nethinder.
For at vurdere kvaliteten og det praktiske i den immunokistemiske farvning, som denne modificerede CLARITY-metode giver, har vi behandlet klarhed med forskellige primære antistoffer (tabel 2). Disse antistoffer markerer hver større celletype i nethinden: keglefotoreceptorer, stangpolære biceller, amacrinceller, RDC'er og gliaceller samt antistoffer mod subcellulære synaptiske proteiner. Med undtagelse af celleaktivitetsmarkøren fosfor-S6 (pS6) viste alle testede antistoffer sig at være forenelige med KLARHED. Typiske eksempler er illustreret i figur 2. Vi udførte tredobbelt mærkning med antistoffer mod kegle arrestin, tyrosin hydroxylase (TH) og RNA-binding protein med flere splejsning (RBPMS). Vi tog en række z-stak confocal mikroskopi billeder fra ONL til GCL. Individuelle billeder viste arrestationen i mærkede kegler i ONL (Figur 2A), TH-mærkede DAC'er i INL (Figur 2B) og RBPMS-mærkede RPC'er i GCL (Figur 2C). Et overlejringsbillede afslørede den relative placering af disse neuroner i hele nethindens tykkelse (Figur 2D). Disse resultater tyder på, at KLARHED kan forbedre kvaliteten af mange standard immunohistokemiske farvning og klart afsløre 3D-strukturen af neuroner på tværs af hele tykkelsen af nethinden i hele mount præparater.
Modificeret KLARHED giver forbedret 3D-opløsning af fine processer af nethindeneuroner og synaptiske proteiner.
Vi analyserede yderligere TH farvning i KLARHED-forarbejdede helmontering nethinder(Figur 3A,B) og sammenlignede det med billeddannelse opnået fra standard hele mount forberedelse(Figur 3C,D). Konfokale billeder viser, at dac'ers dendritter og axonlignende processer blev afsløret meget tydeligere i en KLARHED behandlet nethinde (Figur 3A) end i en standard nethinde (Figur 3C). Især axon-lignende processer af DACs udstillet mere komplet ring-lignende strukturer i en klarhed nethinden (se en indsats i figur 3A) end i en standard nethinden (se en indsats i figur 3C). Især ringlignende strukturer i en KLARHEDs-nethinde taget ved hjælp af fluorescensmikroskopi (figur 3B) var næsten identiske med dem, der blev observeret ved hjælp af konfokale (figur 3A). Derudover løb axonlignende processer også mod den ydre nethinde, som blev observeret i X-Z-orienterede billeder (Figur 4A). Disse data tyder på, at KLARHED kan bruges til at identificere axon-lignende processer af DAC'er i helmonterede nethinder selv ved brug af konventionel fluorescensmikroskopi.
Da AMPA-receptor-underenheden GluA2 og postsynaptisk tæthedsprotein 95 (PSD-95) blev undersøgt i standard helmonteringshinden, blev ingen af dem påvist, sandsynligvis på grund af dårlig indtrængen af antistoffer mod disse synaptiske proteiner i den dybe nethinden. For at afgøre, om KLARHED-forarbejdede nethinder tillader disse antistoffer at immunostain synaptiske proteiner, vi tredobbelt mærket TH med underenheden GluA2 og PSD-95. Immunostaining mod GluA2 og PSD-95 viste forskellige punkter, der afslørede individuelle GluA2-holdige AMPA-receptorer (Figur 4B) og formodede postsynaptiske steder (figur 4C). Et overlejringsbillede viste en vis punktlighed på DAC-processer (Figur 4D). Vi forestillede os et punkt af formodede kolocalization med alle tre pletter og præsenterede det i 3D-visninger(Figur 5). Fra alle tre visninger, kolocalized TH klart med både GluA2 og PSD-95(Figur 5 A-C). Disse 3D-perspektivresultater fra helmonterede nethinder validerer vores tidligere rapporter om synaptisk udtryk for GluA2-holdige AMPA-receptorer på DAC-processer i lodrette nethindeskiver5,6.
Figur 1. KLARHED giver optisk gennemsigtigt væv. Helmonterede musehindelinjer blev behandlet med den ændrede CLARITY-metode (se Protokol), og hele nethinden afbildet med et dissektionsmikroskop, overlejret på et 0,67 cm firkantet gitter for at vise skala. A: KLARHED-forarbejdet helmontering nethinden, med gitter linjer tydeligt synlige gennem gennemsigtige væv. Pile afgrænse placeringen af nethinden. B: Ikke-KLARHED-forarbejdet kontrol nethinden, fastsat i PFA for 1 h og inkuberes i PBS. Gitterlinjer skjules af vævets relative uigennemsigtighed. Skalalinje: ca. 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Forbedret 3D-billeddannelse af neuroner på tværs af tykkelsen af nethinden i KLARHED-behandlede nethinder. Hele mount KLARHED nethinder blev immunostained med antistoffer mod kegle arrestin, TH, og RBPMS. Billedet repræsenterer en 3D-diskenhedsgengivelse af et z-stablet konfokalt billede, der vises i X-Z-retning. A: Kegle fotoreceptorer (pil) mærket af kegle arrestin (blå). En lille speckle er synlig i den indre nethinden (pilespidser), sandsynligvis på grund af baggrund farvning. B: DAC soma og dendritter (pil) mærket med TH (rød). Pilespidser angiver nethinde blodkar i den indre nethinden, synlig på grund af multi-label immunostaining. C: RGC somata (pil) mærket af RBPMS (grøn). Pilespidser angiver nethinde blodkar synlige på grund af autofluorescens og ikke-specifik farvning af blodkar. D: Fusioneret billede af den tredobbelte mærket farvning, afslører den relative placering af disse neuroner på tværs af tykkelsen af nethinden, med kegle fotoreceptorer placeret i det ydre nukleare lag, DACs i det indre nukleare lag, og RGCs i ganglion celle lag. Skala af volumenvisningen er markeret i intervaller på 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. KLARHED afslører fine strukturer af DAC morfologi. TH immunostaining blev udført i KLARHED-forarbejdede (A og B) og standard (C og D) nethinder. Z-stablede billeder blev taget ved hjælp af confocal (A og C) og fluorescens mikroskopi (B og D). En indsats fra et enkelt optisk plan i hvert billede fremhæver ringlignende strukturer, formentlig dannet af axonlignende processer. Pilespidser angiver DAC somata, og mange ring-lignende strukturer er synlige (eksempler er angivet med pile) i den tætte plexus af dendritter og axon-lignende processer afsløret i KLARHED-forarbejdede nethinder (A og B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Modificeret KLARHED giver forbedret 3D-opløsning af fine dendritiske strukturer og synaptiske proteiner. Tredobbelt immunostaining blev udført i KLARHED-forarbejdede helmontering nethinder med antistoffer mod TH, GluA2, og PSD-95. En diskenhedsgengivelse blev rekonstrueret fra z-stablet konfokal billeddannelse og præsenteret i en vinklet X-Z-retning. A: TH-mærket DAC somata (pilespidser) i det indre nukleare lag og processer (gule pile) stratificerende i distal indre plexiform lag (rød). Hvide pile angiver centrifugalprocesser, der strækker sig mod den ydre nethinde. B: Tæt punktligt udtryk for GluA2-holdige AMPA-receptorer på tværs af det indre plexiformlag (grønt). Pil indikerer autofluorescens fra et nethinde blodkar. C: Puncta afslører postsynaptiske websteder mærket af PSD-95 i det indre plexiformlag (blåt). Pile angiver blodkar, tilsyneladende på grund af brugen af en mus monoklonalt antistof mod PSD-95. D: Overlejringsbillede, der demonstrerer overlapning af de TH-mærkede DAC-processer med udtrykket GluA2 og PSD-95. Skala af volumenvisningen er markeret i intervaller på 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Synaptisk udtryk for GluA2-holdige AMPA-receptorer på DAC'er. Et punkt med putativ tredobbelt colocalization af TH, GluA2 og PSD-95 vist i figur 4 blev valgt og undersøgt i 3D. A1 repræsenterer et segment af en DAC-proces (rød) i X-Z-retningen (A5). A2 og A3 viser en enkelt GluA2 punkttum (grøn) og PSD-95 punkttum (blå), henholdsvis i samme retning. Det flettede billede (A4) demonstrerer tredobbelt kolocalisering af TH, GluA2 og PSD-95 (pil). B1-B4 viser det samme punkt af kolokalisering (pil) i en Y-Z orientering (B5). C1-C4 viser kolokalisering af det samme punkt (pil) i X-Y-planet (C5). Tredobbelt colocalization er tydeligt tydelig i hver retning. Skalalinje: 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| opløsning | sammensætning | Noter |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | Juster pH-ind til 7,4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% acrylamid | Forbered dig på is, aliquot, og opbevar ved -20 ºC |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Blokerende løsning | 2% NDS eller 1% BSA | |
| 0,01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Fosfatbuffer | 11,93 g Na2HPO4/liter | Juster pH-ind til 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/liter | ||
| ddH2O | ||
| SRIMS | 70% sorbitol | Juster pH til 7,5 med NaOH |
| 0,1% mellem 20 og 20 | ||
| 0,01% NaN3 | ||
| 0,02 M fosfatbuffer | ||
Tabel 1. Opløsningernes sammensætning.
| antistof | IHC | vært | fortynding | katalog # | leverandør | Ab-registreringsdatabase-id | mål |
| Blåfølsom opsin | +3 | Gedepolyklonal | 1:1000 | SC-14363 | Santa Cruz Bioteknologi | AB_2158332 | S-kegle |
| Kegle anholdelsein | +2 | Kanin polyklonal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | kegle |
| Protein kinase C alpha (PKC-α) | +3 | Kanin polyklonal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz Bioteknologi | AB_2168668 | Rod bipolar celle |
| Glial fibrillary surt protein (GFAP) | +3 | Gedepolyklonal | 1:500 | SC-6170 | Santa Cruz Bioteknologi | AB_641021 | Astrocyt |
| Tyrosin hydroxylase (TH) | +3 | Får polyklonal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Dopaminergisk amacrine celle |
| Tyrosin hydroxylase (TH) | +2 | Kanin polyklonal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Dopaminergisk amacrine celle |
| Cholin acetylkretransferase (ChAT) | +1 | Gedepolyklonal | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Stjerneskud amacrine celle |
| RNA-bindende protein med flere splejsning (RBPMS) | +1 | Marsvin polyklonal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Nethinde ganglion celle |
| GluA2 | +3 | Kanin polyklonal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Ca2+-uigennemtrængelig AMPA-receptor |
| GluA2 | +2 | Mus monoklonal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Ca2+-uigennemtrængelig AMPA-receptor |
| Postsynaptisk tæthedsprotein 95 (PSD-95) | +3 | Mus monoklonal | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Synaptiske websteder |
| Fosfor-S6 (pS6) | 0 | Kanin polyklonal | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Celleaktivitetsmærke |
Tabel 2. Resumé af de primære testede antistoffer. IHC-forklaring: +3 = konsistent, meget specifik farvning; +2 = konsekvent god farvning, minimal baggrund; +1 = god farvning, nogle baggrund; 0 = uforenelig med KLARHED.
| vært | Målarter | Konjugat | fortynding | leverandør |
| æsel | Anti-får | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Anti-får | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Anti-kanin | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Anti-kanin | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| ged | Anti-kanin | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Antimus | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Antimus | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Anti-ged | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| æsel | Anti-ged | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| ged | Anti-marsvin | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tabel 3 . Resumé af de testede sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændring af CLARITY-protokollen for helmonterings-nethinder.
Vi har forenklet KLARHED-protokollen for at opnå tilstrækkelig polymerisering uden behov for et vakuumevakuerings- eller udtørringskammer, som det bruges i de fleste tidligere undersøgelser7,9,11. Polymeriseringsprocessen hæmmes af ilt, hvilket kræver, at prøven isoleres fra luften under protokollens polymeriseringstrin. I stedet for at afgasse med nitrogen fandt vi imidlertid, at der dækker prøven med olie tilstrækkeligt isoleret prøven til at tillade polymerisering uden at påvirke resten af protokollen negativt efter en grundig skylning, som tidligere dokumenteret12. Vi har yderligere forenklet protokollen med en passiv clearingmetode for at begrænse risikoen for vævsbruning og skade på vævsstrukturen forbundet med elektrofobtisk rydning11. Den passive clearing accelereres af blid omrøring og forhøjet temperatur, hvilket giver mulighed for fuldstændig vævsrydning på kun to dage. I løbet af denne periode opnås der tilstrækkelig delipidation til at resultere i optisk gennemsigtigt væv, samtidig med at tabet af proteiner og andre biomolekyler, der er integreret i cellestruktur og immunokemisk farvning, minimeres.
KLARHED bevarer proteiner af nethindeneuroner og gliaceller i helmonteringspræparater.
Vores resultater viser, at næsten alle antistoffer testet arbejde i KLARHED forarbejdede nethinder. Disse antistoffer markerer fotoreceptorer, bipolære celler, amacrinceller, RDC'er og gliaceller. Selvom vi ikke var i stand til at teste antistoffer for undertyper af hver klasse af nethindeneuroner, antyder vores resultater, at KLARHED behandlede nethinder kan bruges til de fleste cellulære markører i nethinden. Selv om de fleste antistoffer vi testede kan også immunostain nethinde neuroner i ikke-klarhed forarbejdede nethinder, fandt vi, at KLARHED tilladt tilstrækkelig antistof penetration i det dybe væv i nethinden, hvilket giver god specificitet farvning i midten lag af nethinden. Derudover fandt vi, at KLARHED forbedret lys penetration i hele tykkelsen af nethinden, hvilket reducerer lysspredning og giver høj opløsning billeddannelse gennem selv de dybeste lag. Disse faktorer bidrager til en forbedring af både farvning og billeddannelse i de KLARHED-forarbejdede helmonterede nethinder sammenlignet med ikke-KLARHED standard helmontering IHC13. Den reducerede baggrund og forbedrede 3D-billeddannelse og volumengengivelser giver mulighed for en komplet undersøgelse af cellulære strukturer i alle lag på tværs af nethindens tykkelse.
KLARHED afslører fine processer og synaptisk struktur af DAC'er i helmonterede nethinder.
Vores resultater viser, at ring-lignende strukturer og centrifugalprocesser af DACs er afsløret i klarhed-forarbejdet bedre end i ikke-klarhed hele mount nethinder. Især immunostaining med KLARHED-forarbejdet væv giver mulighed for god opløsning af disse fine strukturer, selv med standard fluorescens mikroskopi uden behov for confocal billeddannelse. I betragtning af DAC'ernes betydning for den visuelle funktion kan KLARHEDspræparatet bruges til at undersøge DAC'ernes strukturer i normale nethinder og morfologiske ændringer under syge forhold.
Ved immunostaining for PSD-95 og GluA2 med standard fuldkornsvæv observerede vi lidt eller ingen mærkning af disse subcellulære strukturer i de dybe lag af nethinden, hvilket indikerer dårlig antistofindtrængning. Anvendelsen af CLARITY-protokollen tillader tydelig farvning af disse proteiner i de indre nethindelag, hvilket indikerer forbedret antistofindtrængning til det dybe væv. Vores resultater viser, at KLARHED gør det muligt at detektere synaptiske proteiner på DAC-processer i helmonterede nethinder, som normalt observeres i lodrette skivepræparater6. Da axon-lignende processer ikke kan skelnes fra dendritter i lodrette skiver, giver CLARITY helmonterede nethinder mulighed for at afgøre, om synaptiske input til DAC'er fra andre neuroner som bipolar celler og IPRGCs forekommer i dendritter, axonlignende processer eller begge5,6. Da AMPA-receptorer og PSD-95 proteiner er bredt fordelt over hele IPL, er udtrykket af disse proteiner på DAC'er et glimrende eksempel for KLARHEDs nethinder, der skal bruges til identifikation af synaptiske proteiner i andre retinale neuroner.
Overvejelser, begrænsninger og fremtidige anvendelser af CLARITY-protokollen til helmonterings-nethinder.
For det første tilføjer polymeriserings- og rydningsprotokollerne for KLARHED-behandlede helmonterings-nethinder flere dage til vævsforberedelsesprocessen. Metoden er dog stadig meget praktisk ved, at afklarede nethinder kan opbevares i natriumazidholdige PBS i op til to uger med minimal vævsforringelse. For det andet blev der observeret en vis udvidelse af vævet under hele rydningsprocessen som dokumenteret i tidligere anvendelser af KLARHED7,11. Vi fandt dog, at nethinden vendte tilbage til omtrent original størrelse ved ekvilibrering med brydningsindeksmatcheløsningen. De potentielle mindre ændringer i vævsvolumen kan ikke forårsage væsentlig forvrængning af cellulær eller subcellulær struktur7,11. For det tredje, når billeddannelse tykkere hjerneprøver, mikroskopet mål er ofte nedsænket direkte i montering medier til at tillade fuldstændig brydningsindeks matchende fra mikroskop linse gennem vævet12. Med tyndere prøver som nethinden brugte vi coverlips til montering for at gøre prøverne fladere og mere selv til billeddannelse. Virkningerne af brydning gennem coverlip synes at være minimal på billedbehandling. For det fjerde viser nogle af vores billeder ikke-specifik blodbeholderfarvning, fordi vi ikke perfuse hele dyret med intrakardiperfusion (foreslået at blive brugt til at undgå ikke-specifik farvning), før vi inducerer øjnene. Endelig kan den nuværende protokol, der er tilpasset mus, anvendes til nethinder af andre arter. Især nethinder af store dyr som hunde, grise, heste og primater er meget tykkere end mus. Denne KLARHED protokol kunne gøre nethinder af disse dyr mere optisk gennemsigtig efter fjernelse af lipider og bevare de fine strukturer af nethinde neuroner og deres proteiner til immunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Bing Ye, Nathan Spix og Hao Liu for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) og Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
