Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि के साथ पूरे माउंट रेटिना की इम्यूनोदाता

Published: March 6, 2021 doi: 10.3791/62178
Automatic Translation
1, 1
1Eye Research Institute, Oakland University

Summary

यहां हम मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और रेटिना न्यूरॉन्स और उनके उपकोशिकीय संरचनाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए पूरे माउंट रेटिना के लिए मस्तिष्क ऊतकों की स्पष्टता विधि को अनुकूलित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

ऊतक हाइड्रोगेल डिलिपिडेशन विधि (स्पष्टता), मूल रूप से Deisseroth प्रयोगशाला द्वारा विकसित, संशोधित किया गया है और व्यापक रूप से इम्यूनोदाता और मोटी मस्तिष्क नमूनों की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया । हालांकि, इस उन्नत तकनीक का इस्तेमाल अभी तक होल माउंट रेटिना के लिए नहीं किया गया है। हालांकि रेटिना आंशिक रूप से पारदर्शी है, लगभग 200 माइक्रोन (चूहों में) की इसकी मोटाई अभी भी गहरे ऊतक में एंटीबॉडी के प्रवेश को सीमित करती है और साथ ही उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए प्रकाश प्रवेश को कम करती है। यहां, हमने एक नैनोपोरस हाइड्रोजेल बनाने के लिए एक्रिलैमाइड मोनोमर के साथ उन्हें बहुलीकृत करके पूरे माउंट माउस रेटिना के लिए स्पष्टता विधि को अनुकूलित किया और फिर प्रोटीन हानि को कम करने और ऊतक क्षति से बचने के लिए उन्हें सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट में साफ़ किया। स्पष्टता-संसाधित रेटिना रेटिना न्यूरॉन्स, ग्लियल कोशिकाओं और सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांड थे, जो अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में घुड़सवार थे, और इमेज्ड थे। हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि स्पष्टता मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और पूरे माउंट तैयारी में रेटिना न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के लिए इमेजिंग की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, डोपामिनर्जिक आमाक्रीन कोशिकाओं की ठीक एक्सॉन जैसी और डेंड्रिटिक संरचनाओं के 3 डी संकल्प में स्पष्टता द्वारा बहुत सुधार हुआ। गैर-प्रसंस्कृत पूरे माउंट रेटिना की तुलना में, स्पष्टता सिनैप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 जैसे सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेटिंग प्रकट कर सकती है। हमारे परिणाम बताते हैं कि स्पष्टता लिपिड को हटाने के बाद रेटिना को अधिक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बनाता है और रेटिना न्यूरॉन्स और उनके प्रोटीन की ठीक संरचनाओं को बरकरार रखता है, जिसका उपयोग नियमित रूप से रेटिना न्यूरॉन्स और पूरे माउंट तैयारी में उनके उपकोशिकीय संरचनाओं के उच्च-संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

कशेरुकी रेटिना शायद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का सबसे सुलभ हिस्सा है, और यह मस्तिष्क के विकास, संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है। रेटिना में न्यूरॉन्स के पांच वर्गों को दो प्लेक्सिफॉर्म परतों से अलग तीन परमाणु परतों में वितरित किया जाता है। बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) में शास्त्रीय फोटोरिसेप्टर (छड़ और शंकु) होते हैं जो प्रकाश को विद्युत संकेतों में परिवर्तित करते हैं। विद्युत संकेतों को आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) में न्यूरॉन्स द्वारा संसाधित किया जाता है, जिसमें द्विध्रुवी, क्षैतिज और अमैक्रिन कोशिकाएं शामिल हैं, और फिर गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) में रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) को प्रेषित किया जाता है। आरजीसी रेटिना के आउटपुट न्यूरॉन्स हैं, जिनमें एक्सॉन मस्तिष्क को छवि बनाने और गैर-छवि बनाने वाले दृश्य समारोह में योगदान करने के लिए पेश करते हैं। इसके अलावा, तीन प्रकार की ग्लियल कोशिकाएं (मूलर कोशिकाएं, एस्ट्रोग्लिया और माइक्रोग्लिया) न्यूरॉन्स को पोषक तत्व प्रदान करती हैं और न्यूरॉन्स को उनके बाह्राश वातावरण में हानिकारक परिवर्तनों से बचाती हैं।

आमाक्रीन कोशिकाओं की एक विशेष उप-आबादी सीएनएस में एक महत्वपूर्ण न्यूरोमोदुलेटर डोपामाइन का उत्पादन और विज्ञप्ति करती है, जो प्रकाश अनुकूलन1, 2केदौरानरेटिना तंत्रिका सर्किट को फिर से कॉन्फ़िगर करती है। डोपामिनेर्गिक अमैक्रिन कोशिकाओं (डीएसीएस) में रूपात्मक प्रोफाइल की एक अनूठी विशेषता है। उनकी सोमता प्रोसर्मल आईएनएल में स्थित हैं, जिसमें इनर प्लेक्सिफॉर्म लेयर (आईपीएल) के सबसे डिस्टल हिस्से में डेंड्रिट्स रैमिफाइंग हैं । डीएसीएस की एक्सॉन जैसी प्रक्रियाएं अअस्प्राषित, पतली और लंबी, विरल रूप से शाखाबद्ध और भालू वैरिकोसिटी (डोपामाइन रिलीज की साइटें) हैं। वे आईपीएल में डेंड्राइट्स के साथ एक घने जाल बनाते हैं, जिसमें एआईआई अमैक्रिन कोशिकाओं की सोमता के आसपास रिंग जैसी संरचनाएं शामिल हैं । अक्षतंप भी ओपीएल की ओर आईएनएल के माध्यम से चलाते हैं, रेटिना3भर में एक अपकेंद्रित्र मार्ग बनाने । हमने दिखा दिया है कि डैक प्रक्रियाएं प्रेसिनैप्टिक न्यूरॉन्स से ग्लूटामेट रिलीज के जवाब में रिसेप्टर्स व्यक्त करती हैं, जिसमें द्विध्रुवी कोशिकाएं और आंतरिक रूप से फोटोसेंसिटिव रेटिना गैंगलियन कोशिकाएं (आईपीआरजीसी)4,5,6शामिल हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ग्लूटामेट रिसेप्टर्स एक्सॉन, डेंड्राइट्स, या दोनों पर व्यक्त करते हैं क्योंकि वे ऊर्ध्वाधर रेटिना वर्गों में कटे हुए हैं और एक दूसरे से प्रतिष्ठित नहीं किए जा सकतेहैं 5,6। DACs की त्रि-आयामी शाखाओं को प्रकट करने और उपकोशिकीय डिब्बों पर ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की उपस्थिति को प्रकट करने के लिए पूरे माउंट रेटिना में इम्यूनोस्टेपिंग किए जाने की आवश्यकता है। हालांकि रेटिना अपेक्षाकृत पारदर्शी है, एक माउस पूरे माउंट रेटिना की मोटाई लगभग 200 माइक्रोन है, जो गहरे ऊतक में एंटीबॉडी के प्रवेश को सीमित करता है और साथ ही ऊतक प्रकाश-बिखरने के कारण उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए प्रकाश प्रवेश को कम करता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए विकसित इम्यूनोस्टेटिंग संगत ऊतक हाइड्रोजेल डिपिडेशन विधि (स्पष्टता) को पूरे माउंट माउस रेटिना7के लिए अनुकूलित किया।

स्पष्टता विधि मूल रूप से रोगदाग और घने मस्तिष्क के नमूनों की इमेजिंग के लिए Deisseroth प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था7. यह लिपिड घटकों (जो ऊतक प्रकाश-बिखरने का कारण बनता है) को हटाने के लिए एक मजबूत डिटर्जेंट, सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एसडीएस) और इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करता है, जिससे प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जगह में जाते हैं। हटाए गए लिपिड को शेष प्रोटीन संरचना का समर्थन करने के लिए एक्रिलैमाइड जैसे हाइड्रोगेल मोनोमर से बने पारदर्शी पाड़ के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। साफ ऊतक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से लेबल किया जा सकता है और ऊतक के माध्यम से काफी वृद्धि हुई प्रकाश प्रवेश गहराई के साथ छवि (ऊतक सतह के नीचे कई मिलीमीटर तक) । तब से, स्पष्टता विधि को कई अनुसंधान समूहों8,9,10द्वारा अनुकूलित और सरलबनायागया है। एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल पूरे मस्तिष्क और अन्य अक्षुण्ण अंगों को साफ करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उत्पादित संभावित ऊतक क्षति से बचने के लिए एक निष्क्रिय समाशोधन तकनीक का उपयोग करता है11। हालांकि, इस विधि को अभी तक पूरे माउंट रेटिना पर लागू नहीं किया गया है। यहां, हमने पूरे माउंट रेटिना के लिए निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक को अनुकूलित किया ताकि उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग के लिए अधिक पारदर्शी बनाया जा सके। हमने पाया कि इस प्रक्रिया के दौरान इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए परीक्षण किए गए अधिकांश रेटिना प्रोटीन संरक्षित थे । अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान का उपयोग करके, हम पूरे माउंट रेटिना में ओएनएल से जीसीएल तक लगभग 200 माइक्रोन मोटाई में रेटिना न्यूरॉन्स को छवि देने में सक्षम थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

माउस देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रयोगशाला जानवरों के लिए स्वास्थ्य दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया और ओकलैंड विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया (प्रोटोकॉल नंबर १८०७१) ।

नोट: समाधान और उनकी रचनाओं के नाम तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।

1. ऊतक तैयारी

  1. सीओ 2 की ओवरडोज के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें,इसकेबाद सर्वाइकल अपभ्रंश।
  2. आंखों को घुमावदार संदंश के साथ नाभिित करें और उन्हें 0.1 एम पीबीएस(तालिका 1)के साथ एक छोटे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक सुई के साथ कॉर्निया-स्क्लेरा जंक्शन के साथ एक छोटे से छेद को प्रहार करें। 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में स्थानांतरित करें।
  3. आंख को पीबीएस के साथ एक डिश में वापस स्थानांतरित करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, कॉर्निया-स्क्लेरा जंक्शन के चारों ओर सभी तरह से काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। कॉर्निया और लेंस निकालें। ऑप्टिक तंत्रिका के आधार पर काटें और रेटिना को अलग करने के लिए संदंश के साथ स्क्लेरा को सावधानी से छील दें।
  4. रेटिना के चारों ओर समान रूप से चार छोटे कटौती करें और रेटिना को स्थिर करने के लिए नाइट्रोसेल्यूलोस फिल्टर पेपर से एक छोटे वर्ग कट पर एक क्लोवर जैसे आकार में इसे फ्लैट (जीसीएल साइड डाउन) रखने के लिए पीबीएस में डूबा हुआ एक अच्छा टिप ब्रश का उपयोग करें।
  5. नाइट्रोसेल्यूलोस पेपर के कोने को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करके रेटिना स्थानांतरित करें (घुड़सवार रेटिना को छूने के बिना) और इसे 1 घंटे के लिए 4% पीएफए के साथ 48-अच्छी प्लेट में रखें।
  6. फ़िल्टर पेपर और रेटिना को पीबीएस और वॉश (5 मिनट के लिए 3x) के साथ एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. A4P0(तालिका 1)में स्थानांतरित करें और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  8. पूरी तरह से A4P0 समाधान को कवर करने के लिए अच्छी तरह से पिपेट वनस्पति तेल। कोई मिलाते हुए के साथ 3 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में इनक्यूबेट।
  9. PBS में (5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x) धोएं, सुनिश्चित करें कि सभी तेल को धोया गया है। यदि आवश्यक हो, तो अंतिम कुल्ला से पहले कुएं के ऊपर से शेष तेल को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  10. कोमल मिलाते हुए दो दिनों के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 10% एसडीएस में इनक्यूबेट। दूसरे दिन नए समाधान के साथ एसडीएस की जगह लें।
  11. ट्राइटन-एक्स-100 (पीबीएसटी, टेबल 1) और वॉश (1.5घंटे के लिए 5x) के साथ फिल्टर पेपर और रेटिना को पीबीएस में स्थानांतरित करें।
  12. 0.01% सोडियम एजाइड (एनएएन3)के साथ पीबीएसटी में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे इम्यूनोदाता के लिए जाएं।

2. इम्यूनोस्टेटिंग और अपवर्तक सूचकांक मिलान

  1. PBST में एक ठीक टिप ब्रश के साथ धीरे से छीलने से फिल्टर पेपर से रेटिना निकालें ।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी(टेबल 2)में रेटिना को 2 दिनों के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 40 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान(तालिका 1)में पतला करें।
  3. पीबीएएसटी में (5x, 1.5 घंटे प्रत्येक) धोएं।
  4. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी(तालिका 3)के साथ इनक्यूबेट 40 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला कोमल झटकों के साथ और प्रक्रिया के शेष के माध्यम से प्रकाश से बचाएं।
  5. 0.02 एम फॉस्फेट बफर (टेबल 1 देखें) में धोएं (5x, 1.5घंटे प्रत्येक) ।
  6. सोर्बिटोल-आधारित अपवर्तक इंडेक्स मिलान समाधान (एसआरआईएमएस, टेबल 1देखें) में कोमल झटकों के साथ रात भर 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

3. बढ़ते

  1. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के पीछे एक वर्ग सीमा को चिह्नित करने के लिए एक ठीक टिप स्थायी मार्कर के साथ 18 मिमी x 18 मिमी x 1.5 मिमी ग्लास कवरलिप की रूपरेखा तैयार करें।
  2. स्लाइड पर फ्लिप और स्लाइड के सामने सिलिकॉन तेल की एक पतली लाइन के साथ सीमा का पता लगाने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें, अतिरिक्त बढ़ते समाधान के लिए एक कोने में एक छोटा सा अंतर छोड़ने से बचने के लिए ।
  3. रेटिना को घिरा क्षेत्र के केंद्र में स्थानांतरित करें और एक ठीक टिप ब्रश के साथ व्यवस्था करें ताकि यह ग्लास स्लाइड के खिलाफ फोटोरिसेप्टर पक्ष के साथ सपाट हो।
  4. पिपेट लगभग 60 μL sRIMS इतना है कि यह चपटा रेटिना को कवर किया जाता है और बाड़े के एक कोने तक फैली हुई है, ध्यान है कि रेटिना फ्लैट और जगह में रहता है ।
  5. एसआरआईएमएस के साथ कोने से शुरू होने वाले कवरस्लिप को लागू करें और धीरे-धीरे इसे कम करें जब तक कि यह हवा के बुलबुले के गठन से बचते हुए सभी तरफ तेल को छू न जाए।
  6. एक स्पेसर के रूप में घुड़सवार रेटिना के प्रत्येक पक्ष पर 3 कवरस्लिप का एक ढेर रखें। कवरस्लिप को दबाने के लिए एक और स्लाइड के लंबे किनारे का उपयोग करें ताकि माउंट सपाट और यहां तक कि हो।
  7. इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड फ्लैट स्टोर करें।

4. इमेजिंग

  1. पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)पर छवि के नमूने। माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्लाइड रखकर और सैंपल का पता लगाकर शुरू करें।
    नोट: यदि एक उल्टे उद्देश्य माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा रहा है, तो स्लाइड को मंच पर उल्टा रखें, पहले यह सुनिश्चित करें कि स्लाइड के उजागर क्षेत्र सभी सिलिकॉन तेल और बढ़ते समाधान से स्पष्ट हैं।
  2. सह-लेबल नमूनों की जेड-स्टैक्ड छवियों को प्राप्त करने के लिए, पहले प्रत्येक चैनल में संकेत पर व्यक्तिगत रूप से ध्यान केंद्रित करें और क्रमशः फ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए एक्सपोजर समय या स्कैनिंग गति निर्धारित करें।
  3. जेड-स्टैक के लिए सीमा निर्धारित करें या तो मैन्युअल रूप से फोकल प्लेन को वांछित रेंज के ऊपर और नीचे सेट करके, या मिडपॉइंट सेट करके और फिर मिडपॉइंट के चारों ओर एक सीमा निर्दिष्ट करके।
  4. चरण के आकार या स्लाइस की संख्या वांछित के रूप में समायोजित करें।
  5. छवि को कैप्चर करें और मूल फ़ाइल को सहेजें और साथ ही इसे झगड़ा फ़ाइल या अन्य वांछित प्रारूप के रूप में निर्यात करें।

5. छवि विश्लेषण

  1. प्रत्येक चैनल में चमक और इसके विपरीत को समायोजित करने के लिए पसंद के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें जब तक कि एकल छवियों और जेड-स्टैक के 3-आयामी प्रतिपादन दोनों में इष्टतम स्पष्टता प्राप्त न हो जाए।
    नोट: यदि चयनित चरण का आकार पर्याप्त रूप से छोटा है, तो सिग्नल को बढ़ाने के लिए 3डी डिकोवोोल्यूशन भी किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

संशोधित स्पष्टता-प्रसंस्कृत रेटिना ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी ऊतक हैं।
एक ऊतक समाशोधन विधि तैयार करने के लिए जो रेटिना में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अनुप्रयोगों के साथ संगत है, जबकि पर्याप्त परिसीमन प्रदान करता है और सेलुलर प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है, हमने स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि को पूरे माउंट माउस रेटिना के लिए अनुकूलित किया। हम प्रोटोकॉल को सरल बनाने और इसे पूरे माउंट रेटिना के लिए संशोधित करने में सक्षम थे (प्रोटोकॉल देखें)। ऊतक संकरण, समाशोधन, और अपवर्तक सूचकांक मिलान को पूरा करने के बाद, रेटिना इस संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल के साथ संसाधित रेटिना रेटिना(चित्रा 1A)की मोटाई भर में लगभग पूरा ऑप्टिकल पारदर्शिता दिखाया जब गैर प्रसंस्कृत नियंत्रण रेटिना(चित्रा 1B) कीतुलना में । यह परिणाम इंगित करता है कि स्पष्टता प्रोटोकॉल का यह संशोधन पर्याप्त रूप से पूरे माउंट रेटिना ऊतक को मंजूरी प्रदान करता है।

संशोधित स्पष्टता संसाधित रेटिना में न्यूरॉन्स की बेहतर 3डी इमेजिंग।
इस संशोधित स्पष्टता विधि द्वारा वहन किए गए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग की गुणवत्ता और व्यावहारिकता का आकलन करने के लिए, हमने विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी(तालिका 2)के साथ स्पष्टता संसाधित रेटिना को दाग दिया। ये एंटीबॉडी रेटिना में प्रत्येक प्रमुख कोशिका प्रकार को चिह्नित करते हैं: शंकु फोटोरिसेप्टर, रॉड बाइपोलर कोशिकाएं, अमैक्रिन कोशिकाएं, आरजीसी, और ग्लियल कोशिकाएं, साथ ही उपकोशिकीय सिनेप्टिक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी। सेल गतिविधि मार्कर फॉस्फो-S6 (PS6) के अपवाद के साथ, सभी एंटीबॉडी का परीक्षण स्पष्टता के साथ संगत साबित हुआ। विशिष्ट उदाहरण चित्र 2में सचित्र हैं । हमने मल्टीपल स्प्लिसिंग (आरबीपीएम) के साथ शंकु गिरफ्तारी, टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) और आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ट्रिपल लेबलिंग का प्रदर्शन किया। हमने ओएनएल से जीसीएल तक जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों की एक श्रृंखला ली। व्यक्तिगत छवियों ने ओएनएल(चित्रा 2 ए),आईएनएल में टीएच-लेबल डीएसी(चित्रा 2 बी)और आरबीपीएमएस-चिह्नित आरजीसी में जीसीएल(चित्रा 2 सी)में लेबल वाले शंकु में गिरफ्तारी को दिखाया। एक ओवरले छवि रेटिना(चित्रा 2डी)की पूरी मोटाई भर में इन न्यूरॉन्स के सापेक्ष स्थान का पता चला । इन परिणामों से पता चलता है कि स्पष्टता कई मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं और स्पष्ट रूप से पूरे माउंट तैयारी में रेटिना की पूरी मोटाई भर में न्यूरॉन्स की 3 डी संरचना प्रकट करते हैं ।

संशोधित स्पष्टता रेटिना न्यूरॉन्स और सिनैप्टिक प्रोटीन की ठीक प्रक्रियाओं का बेहतर 3डी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है।
हमने स्पष्टता-संसाधित पूरे-माउंट रेटिना(आंकड़े 3 ए,बी)में टीएच धुंधला का विश्लेषण किया और इसकी तुलना मानक संपूर्ण-माउंट तैयारी(आंकड़े 3 सी,डी)से प्राप्त इमेजिंग से की। कॉन्फोकल छवियों से पता चलता है कि डीएसी की डेंड्राइट्स और एक्सॉन जैसी प्रक्रियाओं को एक मानक रेटिना(चित्रा 3सी) की तुलना में स्पष्टता प्रसंस्कृत रेटिना(चित्रा 3ए) में बहुत अधिक स्पष्ट रूप से प्रकट किया गया था। विशेष रूप से, डीएसीएस की एक्सॉन जैसी प्रक्रियाओं ने एक स्पष्टता रेटिना में अधिक पूर्ण रिंग जैसी संरचनाओं का प्रदर्शन किया (एक मानक रेटिना की तुलना में चित्रा 3 एमें एक डालें देखें)(चित्रा 3 सीमें एक डालें देखें)। विशेष रूप से, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3बी)का उपयोग करके ली गई स्पष्टता रेटिना की रिंग जैसी संरचनाएं कॉन्फोकल(चित्रा 3 ए)का उपयोग करके देखे गए लोगों के लगभग समान थीं। इसके अलावा, एक्सोन जैसी प्रक्रियाएं बाहरी रेटिना की ओर भी दौड़ीं, जो एक्स-जेड उन्मुख छवियों(चित्रा 4A)में देखी गई थीं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि स्पष्टता का उपयोग पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ भी पूरे माउंट रेटिना में डीएसीएस की एक्सॉन जैसी प्रक्रियाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

जब एम्पा-रिसेप्टर सबयूनिट ग्लूए2 और पोस्टसिनैप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (पीएसडी-95) की मानक पूरे-माउंट रेटिना में जांच की गई, तो उनमें से किसी को भी पता नहीं चला, इन सिनैप्टिक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के खराब प्रवेश के कारण गहरे रेटिना में होने की संभावना थी। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या स्पष्टता-संसाधित रेटिना इन एंटीबॉडी को इम्यूनोदाता सिनैप्टिक प्रोटीन की अनुमति देते हैं, हमने सबयूनिट ग्लूए2 और पीएसडी-95 के साथ टीएच को ट्रिपल लेबल किया है। ग्लूए2 और पीएसडी-95 के खिलाफ इम्यूनोस्टेटिंग ने क्रमशः व्यक्तिगत ग्लूए 2-युक्त एम्पा रिसेप्टर्स(चित्रा 4B)और ख्यात पोस्टसिनैप्टिक साइटों(चित्रा 4 सी) काखुलासा करते हुए अलग-अलग समय टीसी दिखाया। एक ओवरले छवि ने डीएसी प्रक्रियाओं(चित्र 4डी)पर कुछ समय तक स्पष्ट दिखाया। हमने तीनों दागों के साथ ख्यात कोलोकैलाइजेशन के एक बिंदु को चित्रित किया और इसे 3 डी दृश्यों(चित्रा 5)में प्रस्तुत किया। तीनों दृश्यों से, टीएच ने ग्लूए2 और पीएसडी-95(चित्रा 5 ए-सी)दोनों के साथ स्पष्ट रूप से कोलोकैलाइज्ड किया। पूरे माउंट रेटिना से ये 3 डी परिप्रेक्ष्य परिणाम ऊर्ध्वाधर रेटिना स्लाइस5,6में डीएसी प्रक्रियाओं पर ग्लूए 2-युक्त एम्पा रिसेप्टर्स की सिनैप्टिक अभिव्यक्ति की हमारी पिछली रिपोर्टों को मान्य करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1। स्पष्टता ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी ऊतक प्रदान करता है। पूरे माउंट माउस रेटिना को संशोधित स्पष्टता विधि (प्रोटोकॉल देखें) और पूरे रेटिना को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ संसाधित किया गया था, जो पैमाने को दिखाने के लिए 0.67 सेमी वर्ग ग्रिड पर मढ़ा गया था। एक: स्पष्टता-संसाधित पूरे माउंट रेटिना, ग्रिड लाइनों के साथ स्पष्ट रूप से पारदर्शी ऊतक के बावजूद दिखाई देता है । तीर रेटिना के प्लेसमेंट को चित्रित करते हैं। बी: गैर-स्पष्टता-प्रसंस्कृत नियंत्रण रेटिना, पीएफए में 1 एच के लिए तय किया गया और पीबीएस में इनक्यूबेटेड किया गया। ग्रिड लाइनों ऊतक के सापेक्ष अस्पष्टता से अस्पष्ट हैं। स्केल बार: लगभग 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। स्पष्टता-संसाधित रेटिना में रेटिना की मोटाई में न्यूरॉन्स की बेहतर 3डी इमेजिंग। पूरे माउंट स्पष्टता रेटिना शंकु गिरफ्तारी, TH, और RBPMS के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांडा हुआ था । छवि एक जेड-स्टैक्ड कॉन्फोकल छवि के 3डी वॉल्यूम प्रतिपादन का प्रतिनिधित्व करती है, जो एक्स-जेड अभिविन्यास में देखी जाती है। एक: शंकु फोटोरिसेप्टर (तीर) शंकु गिरफ्तारी (नीला) द्वारा लेबल। पृष्ठभूमि धुंधला होने के कारण आंतरिक रेटिना (एरोहेड) में एक मामूली धब्बा दिखाई देता है। बी: डैक सोमा और डेंड्राइट्स (तीर) टीएच (लाल) द्वारा लेबल किया गया। एरोहेड आंतरिक रेटिना में रेटिना रक्त वाहिकाओं का संकेत देते हैं, जो मल्टी-लेबल इम्यूनोस्टेपिंग के कारण दिखाई देते हैं। सी: आरजीसी सोमता (तीर) आरबीपीएसएस (ग्रीन) द्वारा लेबल किया गया। एरोहेड रक्त वाहिकाओं के ऑटोफ्लोरेसेंस और गैर-विशिष्ट धुंधला होने के कारण रेटिना रक्त वाहिकाओं को इंगित करता है। डी: ट्रिपल लेबल धुंधला की विलय छवि, रेटिना की मोटाई भर में इन न्यूरॉन्स के सापेक्ष प्लेसमेंट का खुलासा, बाहरी परमाणु परत में स्थित शंकु फोटोरिसेप्टर के साथ, भीतरी परमाणु परत में DACs, और गैंगलियन सेल परत में आरजीसी । वॉल्यूम व्यू का पैमाना 20 माइक्रोन की वेतन वृद्धि में चिह्नित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। स्पष्टता डीएसी आकृति विज्ञान की ठीक संरचनाओं का पता चलता है। टीएच इम्यूनोस्टेपिंग स्पष्टता-संसाधित(ए और बी)और मानक(सी और डी)रेटिना में किया गया था। जेड-स्टैक्ड छवियों को कॉन्फोकल(ए और सी)और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(बी और डी)का उपयोग करके लिया गया था। प्रत्येक छवि में एक ऑप्टिकल विमान से एक डालें संभवतः अक्षतंश जैसी प्रक्रियाओं द्वारा गठित अंगूठी की तरह संरचनाओं पर प्रकाश डाला गया । एरोहेड डैक सोमाता को इंगित करते हैं, और कई रिंग जैसी संरचनाएं दिखाई देती हैं (उदाहरण तीर द्वारा इंगित किए जाते हैं) डेन्ड्रिट्स के घने जाल और एक्सॉन जैसी प्रक्रियाओं में स्पष्टता-संसाधित रेटिना(ए और बी)में प्रकट होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। संशोधित स्पष्टता ठीक डेंड्रिटिक संरचनाओं और सिनैप्टिक प्रोटीन का बेहतर 3डी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। ट्रिपल इम्यूनोस्टेपिंग टीएच, ग्लूए2 और पीएसडी-95 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ स्पष्टता-संसाधित पूरे माउंट रेटिना में किया गया था। एक वॉल्यूम रेंडरिंग को जेड-स्टैक्ड कॉन्फोकल इमेजिंग से खंगाला गया और एक कोण वाले एक्स-जेड ओरिएंटेशन में प्रस्तुत किया गया। एक: आंतरिक परमाणु परत और प्रक्रियाओं (पीले तीर) में टीएच-लेबल डैक सोमाटा (तीर) डिस्टल इनर प्लेक्सिफॉर्म परत (लाल) में स्तरीकरण करते हैं। सफेद तीर बाहरी रेटिना की ओर विस्तार अपकेंद्रित्र प्रक्रियाओं का संकेत देते हैं। बी: आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत (हरे रंग) में ग्लूआ 2 युक्त एम्पा रिसेप्टर्स की घनी पंचाट अभिव्यक्ति। तीर रेटिना रक्त वाहिका से ऑटोफ्लोरेसेंस को इंगित करता है। सी: पुनः पताका खुलासा पोस्ट-सिनेप्टिक साइटों को आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म लेयर (ब्लू) में PSD-95 द्वारा लेबल किया गया है। तीर रक्त वाहिकाओं को इंगित करते हैं, जो पीएसडी-95 के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग के कारण स्पष्ट है। डी: ग्लूए2 और पीएसडी-95 की अभिव्यक्ति के साथ टीएच-लेबल डैक प्रक्रियाओं के ओवरलैप का प्रदर्शन करने वाली छवि ओवरले। वॉल्यूम व्यू का पैमाना 20 माइक्रोन की वेतन वृद्धि में चिह्नित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। DACs पर ग्लूए 2 युक्त एम्पा रिसेप्टर्स की सिनैप्टिक अभिव्यक्ति। चित्रा 4 में दिखाए गए टीएच, ग्लूए2 और पीएसडी-95 के ख्यात ट्रिपल कोलोकैलाइजेशन के एक बिंदु का चयन किया गया था और 3 डी में जांच की गई थी। A1 एक्स-जेड ओरिएंटेशन (A5) में डीएसी प्रक्रिया (लाल) के एक खंड का प्रतिनिधित्व करता है। A2 और A3 एक ही अभिविन्यास में क्रमशः एक ग्लूआ2 स्मेटम (ग्रीन) और PSD-95 punctum (नीला) दिखाते हैं। विलय छवि (A4) TH, ग्लूआ2 और PSD-95 (तीर) के ट्रिपल कोलोकैलाइजेशन को दर्शाता है। B1-B4 वाई-जेड ओरिएंटेशन (B5) में कोलोकैलाइजेशन (तीर) का एक ही बिंदु दिखाते हैं। C1-C4 एक्स-वाई विमान (C5) में एक ही बिंदु (तीर) का कोलोकैलाइजेशन दिखाते हैं। प्रत्येक अभिविन्यास में ट्रिपल कोलोकैलाइजेशन स्पष्ट रूप से स्पष्ट है। स्केल बार: 2 माइक्रोन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घोल संयोजन नोट्स
0.1 M PBS 137 एमएमएल एनएसीएल पीएच को समायोजित करें 7.4
26.8 एमएम केसीएल
10.1 mM Na2HPO4
17.6 m KH2PO4
A4P0 4% एक्रिलैमाइड बर्फ, aliquot पर तैयार है, और -20 ºC पर स्टोर
0.25% VA-044
0.1 M PBS
पीबीस्ट 0.1% (v/v) ट्राइटन-एक्स-100
0.1 M PBS
समाधान अवरुद्ध करना 2% एनडीएस या 1% बीएसए
0.01% NaN3
पीबीस्ट
0.1 एम फॉस्फेट बफर 11.93 ग्राम Na2HPO4/लीटर पीएच को 7.5 पर समायोजित करें
15.34 ग्राम NaH2PO4/
ddH2O
एसआरआईएमएस 70% सोर्बिटोल नाओएच के साथ पीएच को 7.5 पर समायोजित करें
0.1% ट्वीन-20
0.01% NaN3
0.02 एम फॉस्फेट बफर

तालिका 1. समाधान की संरचना।

रोग-प्रतिकारक आईएचसी मेज़बान तनूकरण कैटलॉग # आपूर्तिकर्ता एबी रजिस्ट्री आईडी लक्ष्य
ब्लू-सेंसिटिव ऑप्सिन +3 बकरी पॉलीक्लोनल 1:1000 एससी-14363 सांताक्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी AB_2158332 एस-शंकु
शंकु गिरफ्तार +2 खरगोश पॉलीक्लोनल 1:1000 एबी15282 ईएमडी मिलिपोर AB_1163387 शंकु
प्रोटीन किनेज़ सी अल्फा (पीकेसी-α) +3 खरगोश पॉलीक्लोनल 1:1000 एससी-208 सांताक्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी AB_2168668 रॉड बाइपोलर सेल
ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) +3 बकरी पॉलीक्लोनल 1:500 एससी-6170 सांताक्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी AB_641021 एस्ट्रोसाइट
टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) +3 भेड़ पॉलीक्लोनल 1:500 एबी1542 ईएमडी मिलिपोर AB_90755 डोपामिनेर्गिक आमाक्रीन सेल
टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) +2 खरगोश पॉलीक्लोनल 1:500 OPA1-04050 थर्मोफिशर AB_325653 डोपामिनेर्गिक आमाक्रीन सेल
कोलीन एसीटिलट्रांसफेरेज (ChAT) +1 बकरी पॉलीक्लोनल 1:500 AB144P ईएमडी मिलिपोर AB_2079751 स्टारबर्स्ट अमैक्रिन सेल
आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के साथ कई स्प्लिसिंग (RBPMS) +1 गिनी पिग पॉलीक्लोनल 1:2000 एबीएन1376 ईएमडी मिलिपोर AB_2687403 रेटिना गैंगलियन सेल
ग्लूए2 +3 खरगोश पॉलीक्लोनल 1:500 AB1768-I ईएमडी मिलिपोर AB_2247874 Ca2 +-अभेद्य AMPA रिसेप्टर
ग्लूए2 +2 माउस मोनोक्लोनल 1:250 एमएबीएन1189 ईएमडी मिलिपोर AB_2737079 Ca2 +-अभेद्य AMPA रिसेप्टर
पोस्टसिनैप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (पीएसडी-95) +3 माउस मोनोक्लोनल 1:1000 75-028 न्यूरोमैब AB_2877189 सिनैप्टिक साइटें
फॉस्फो-S6 (PS6) 0 खरगोश पॉलीक्लोनल 1:500 44-923G थर्मोफिशर AB_2533798 सेल गतिविधि मार्कर

तालिका 2. प्राथमिक एंटीबॉडी का सारांश परीक्षण किया गया। आईएचसी किंवदंती: +3 = सुसंगत, अत्यधिक विशिष्ट धुंधला; +2 = लगातार अच्छा धुंधला, न्यूनतम पृष्ठभूमि; +1 = अच्छा धुंधला, कुछ पृष्ठभूमि; 0 = स्पष्टता के साथ असंगत।

मेज़बान लक्ष्य प्रजातियां संयुग्मी तनूकरण आपूर्तिकर्ता
गधा भेड़ विरोधी एलेक्सा फ्लोर 568 1:500 इनविटरोजन
गधा भेड़ विरोधी एलेक्सा फ्लोर 594 1:500 इनविटरोजन
गधा खरगोश विरोधी एलेक्सा फ्लोर 488 1:500 इनविटरोजन
गधा खरगोश विरोधी एलेक्सा फ्लोर 594 1:500 इनविटरोजन
बकरी खरगोश विरोधी एलेक्सा फ्लोर 647 1:500 इनविटरोजन
गधा एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 488 1:500 इनविटरोजन
गधा एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 647 1:500 इनविटरोजन
गधा बकरी विरोधी एलेक्सा फ्लोर 568 1:500 इनविटरोजन
गधा बकरी विरोधी एलेक्सा फ्लोर 594 1:500 इनविटरोजन
बकरी एंटी गिनी पिग एलेक्सा फ्लोर 488 1:500 इनविटरोजन

तालिका 3. माध्यमिक एंटीबॉडी का सारांश परीक्षण किया गया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पूरे माउंट रेटिना के लिए स्पष्टता प्रोटोकॉल का संशोधन।
हमने वैक्यूम निकासी या इंडिकेशन चैंबर की आवश्यकता के बिना पर्याप्त बहुलीकरण प्राप्त करने के लिए स्पष्टता प्रोटोकॉल को सरल बनाया है, जैसा कि पिछले अधिकांशअध्ययनों 7,9,11में किया जाता है। बहुलकीकरण प्रक्रिया ऑक्सीजन द्वारा बाधित है, आवश्यकता है कि नमूना प्रोटोकॉल के बहुलकीकरण कदम के दौरान हवा से अलग किया जा सकता है । हालांकि, नाइट्रोजन के साथ डीगैसिंग के बजाय, हमने पाया कि तेल के साथ नमूने को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए एक पूरी तरह से कुल्ला के बाद प्रोटोकॉल के शेष को प्रतिकूल रूप से प्रभावित किए बिना बहुलीकरण की अनुमति देने के लिए नमूना को कवर करना, जैसा कि पहले12दस्तावेज किया गया था। हमने इलेक्ट्रोफोरेटिक क्लीयरिंग11से जुड़े ऊतकों की संरचना को नुकसान पहुंचाने और ऊतकों के खतरे को सीमित करने के लिए एक निष्क्रिय समाशोधन विधि के साथ प्रोटोकॉल को और सरल बनाया । निष्क्रिय समाशोधन कोमल आंदोलन और ऊंचा तापमान से त्वरित है, केवल दो दिनों में पूर्ण ऊतक समाशोधन की अनुमति । इस समय अवधि के दौरान, सेलुलर संरचना और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला करने के अभिन्न प्रोटीन और अन्य जैव अणुओं के नुकसान को कम करते हुए ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी ऊतक के परिणामस्वरूप पर्याप्त परिसीमन प्राप्त किया जाता है।

स्पष्टता पूरे माउंट तैयारी में रेटिना न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के प्रोटीन को बरकरार रखता है।
हमारे परिणाम बताते हैं कि लगभग सभी एंटीबॉडी ने स्पष्टता संसाधित रेटिना में काम किया। ये एंटीबॉडी फोटोरिसेप्टर, बाइपोलर कोशिकाओं, अमैक्रिन कोशिकाओं, आरजीसी और ग्लियल कोशिकाओं को चिह्नित करते हैं। यद्यपि हम रेटिना न्यूरॉन्स के प्रत्येक वर्ग के उपप्रकारों के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण करने में सक्षम नहीं थे, हमारे परिणामों का मतलब है कि रेटिना में अधिकांश सेलुलर मार्कर के लिए स्पष्टता संसाधित रेटिना का उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि हमने जिन एंटीबॉडी का परीक्षण किया है, वे गैर-स्पष्टता संसाधित रेटिना में रेटिना न्यूरॉन्स को भी इम्यूनोदाता कर सकते हैं, हमने पाया कि स्पष्टता ने रेटिना के गहरे ऊतक में पर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति दी, रेटिना की मध्य परत में धुंधला होने की अच्छी विशिष्टता प्रदान की। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि स्पष्टता रेटिना की मोटाई भर में प्रकाश प्रवेश में सुधार, प्रकाश बिखरने को कम करने और यहां तक कि गहरी परतों के माध्यम से उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति । ये कारक गैर-स्पष्टता मानक पूरे-माउंट आईएचसी13की तुलना में स्पष्टता-संसाधित पूरे माउंट रेटिना में धुंधला और इमेजिंग दोनों में सुधार करने में योगदान देते हैं। कम पृष्ठभूमि और बेहतर 3 डी इमेजिंग और वॉल्यूम रेंडरिंग रेटिना की मोटाई में सभी परतों में सेलुलर संरचनाओं की पूरी जांच की अनुमति देते हैं।

स्पष्टता पूरे माउंट रेटिना में DACs की ठीक प्रक्रियाओं और सिनैप्टिक संरचना का पता चलता है।
हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि डीएसी की रिंग जैसी संरचनाओं और अपकेंद्रित्र प्रक्रियाओं को गैर-स्पष्टता पूरे-माउंट रेटिना की तुलना में बेहतर स्पष्टता-संसाधित में प्रकट किया जाता है। विशेष रूप से, स्पष्टता-प्रसंस्कृत ऊतक के साथ इम्यूनोस्टेटिंग कॉन्फोकल इमेजिंग की आवश्यकता के बिना मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ भी इन ठीक संरचनाओं के अच्छे समाधान के लिए अनुमति देता है। दृश्य समारोह में DACs के महत्व को देखते हुए, स्पष्टता तैयारी का उपयोग रोगग्रस्त परिस्थितियों में सामान्य रेटिना और रूपात्मक परिवर्तनों में डीएसी की संरचनाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

मानक संपूर्ण ऊतक के साथ PSD-95 और ग्लूए 2 के लिए इम्यूनोस्टेटिंग पर, हमने रेटिना की गहरी परतों में इन उपकोशिकीय संरचनाओं की कोई लेबलिंग नहीं देखी, जो खराब एंटीबॉडी प्रवेश का संकेत देती है। स्पष्टता प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग आंतरिक रेटिना परतों में इन प्रोटीनों के अलग धुंधला करने की अनुमति देता है, जो गहरे ऊतकों में बेहतर एंटीबॉडी प्रवेश का संकेत देता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि स्पष्टता पूरे माउंट रेटिना में डैक प्रक्रियाओं पर सिनैप्टिक प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देती है, जो आम तौर पर ऊर्ध्वाधर स्लाइस तैयारी6में देखी जाती है। चूंकि अक्षतंप जैसी प्रक्रियाओं को ऊर्ध्वाधर स्लाइस में डेंड्राइट्स से अलग नहीं किया जा सकता है, इसलिए स्पष्टता पूरे-माउंट रेटिना यह निर्धारित करने का अवसर प्रदान करते हैं कि क्या अन्य न्यूरॉन्स जैसे द्विध्रुवी कोशिकाओं और आईपीजीसी से डीएसी को सिनैप्टिक इनपुट डेन्ड्रिट्स, एक्सॉन जैसी प्रक्रियाओं, या दोनों5,6में होते हैं। चूंकि एम्पा रिसेप्टर्स और पीएसडी-95 प्रोटीन पूरे आईपीएल में व्यापक रूप से वितरित किए जाते हैं, इसलिए डीएसी पर इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति ने अन्य रेटिना न्यूरॉन्स में सिनैप्टिक प्रोटीन की पहचान के लिए स्पष्टता रेटिना के लिए एक उत्कृष्ट उदाहरण स्थापित किया।

पूरे माउंट रेटिना के लिए स्पष्टता प्रोटोकॉल के विचार, सीमाएं, और भविष्य के अनुप्रयोग।
सबसे पहले, स्पष्टता-संसाधित पूरे माउंट रेटिना के लिए बहुलककरण और समाशोधन प्रोटोकॉल ऊतक तैयारी प्रक्रिया में कई दिन जोड़ते हैं। हालांकि, विधि अभी भी इस तथ्य से अत्यधिक व्यावहारिक बना दी गई है कि स्पष्ट रेटिना को सोडियम अज़ाइड युक्त पीबीएस में न्यूनतम ऊतक क्षरण के साथ दो सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। दूसरा, स्पष्टता 7,11के पिछले अनुप्रयोगों में प्रलेखित समाशोधन प्रक्रिया केदौरानऊतक का कुछ विस्तार देखा गया था। हालांकि, हमने पाया कि रेटिना अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान के साथ संतुलन पर लगभग मूल आकार में लौट आया। ऊतकों की मात्रा में संभावित मामूली परिवर्तनों से सेलुलर या उपकोशिकीय संरचना7,11की महत्वपूर्ण विकृति नहीं हो सकती है । तीसरा, जब मोटा मस्तिष्क के नमूनों इमेजिंग, माइक्रोस्कोप उद्देश्य अक्सर सीधे बढ़ते मीडिया में डूब जाता है करने के लिए ऊतक12के माध्यम से माइक्रोस्कोप लेंस से मिलान पूर्ण अपवर्तक सूचकांक की अनुमति है । रेटिना जैसे पतले नमूनों के साथ, हमने नमूनों को चापलूसी करने और इमेजिंग के लिए भी अधिक बनाने के लिए बढ़ते के लिए कवरस्लिप का उपयोग किया। कवरस्लिप के माध्यम से अपवर्तन का प्रभाव इमेजिंग पर कम दिखाई देता है। चौथा, हमारी कुछ छवियां गैर-विशिष्ट रक्त वाहिका को धुंधला दिखाती हैं क्योंकि हमने आंखों को बाहर करने से पहले इंट्राकार्डिएक परफ्यूजन (गैर-विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए उपयोग करने का सुझाव दिया) के साथ पूरे जानवर को संक्रमित नहीं किया था। अंत में, चूहों के लिए अनुकूलित वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य प्रजातियों के रेटिना के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, कुत्तों, सूअरों, घोड़ों और वानरों जैसे बड़े जानवरों के रेटिना चूहों की तुलना में बहुत मोटे होते हैं। यह स्पष्टता प्रोटोकॉल लिपिड को हटाने के बाद इन जानवरों के रेटिना को अधिक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बना सकता है और रेटिना न्यूरॉन्स की ठीक संरचनाओं और इम्यूनोदाता के लिए उनके प्रोटीन को संरक्षित कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए बिंग सुनो, नाथन स्पिक्स और हाओ लियू का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट EY022640 (D.-Q.Z.) और ओकलैंड यूनिवर्सिटी प्रोवोस्ट अंडरग्रेजुएट स्टूडेंट रिसर्च अवार्ड (ईजेए) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Fixative
Acrylamide Fisher Biotech BP170 Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2 Zeiss Fluorscence microscope
BSA Fisher Scientific BP1600 Blocking agent
Eclipse Ti Nikon Instruments Scanning confocal microscope
KCl VWR BDH0258 Buffer component
KH2PO4 Sigma P5655 Buffer component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763 Buffer component
NaCl Sigma Aldrich S7653 Buffer component
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751 Buffer component
NaN3 Sigma Aldrich S2002 Bacteriostatic preservative
NDS Aurion 900.122 Blocking agent
NIS Elements AR Nikon Image analysis software
SDS BioRad 1610301 Delipidation agent
Sorbitol Sigma Aldrich 51876 Buffer component
Triton-X-100 Sigma T8787 Surfactant
Tween-20 Fisher Scientific BP337 Surfactant
VA-044 Wako Chemicals 011-19365 Thermal initiator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
  2. McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
  3. Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
  4. Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
  5. Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
  6. Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
  7. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
  8. Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
  9. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  10. Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
  11. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  12. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
  13. Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 169
स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि के साथ पूरे माउंट रेटिना की इम्यूनोदाता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alessio, E. J., Zhang, D. Q.… More

Alessio, E. J., Zhang, D. Q. Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method. J. Vis. Exp. (169), e62178, doi:10.3791/62178 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter