Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

هندسة وتوصيف نموذج بصري وراثي للوصلة العصبية العضلية البشرية

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

نحن نصف نظام تصوير قابل للتكرار ومؤتمت وغير متحيز لتوصيف وظيفة الوصلة العصبية العضلية باستخدام الأنسجة العضلية الهيكلية البشرية المهندسة والخلايا العصبية الضوئية الوراثية. يسمح هذا النظام بالقياس الكمي الوظيفي للاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت ويكتشف تناقص الوظيفة العصبية العضلية الناجمة عن السموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.

Abstract

ترتبط العديد من الأمراض العصبية العضلية ، مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) ، بخلل وظيفي في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) ، والتي يصعب توصيفها في النماذج الحيوانية بسبب الاختلافات الفسيولوجية بين الحيوانات والبشر. توفر هندسة الأنسجة فرصا لتوفير نماذج في المختبر من NMJs البشرية الوظيفية التي يمكن استخدامها لتشخيص والتحقيق في أمراض NMJ واختبار العلاجات المحتملة. من خلال دمج البروتينات البصرية الجينية في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، قمنا بتوليد الخلايا العصبية التي يمكن تحفيزها بأطوال موجية محددة من الضوء. إذا كان NMJ صحيا ووظيفيا ، فإن الإشارة الكيميائية العصبية من motoneuron تؤدي إلى تقلص العضلات. من خلال دمج علم البصريات الوراثي والتصنيع الدقيق مع هندسة الأنسجة ، أنشأنا منهجية غير متحيزة وآلية لتوصيف وظيفة NMJ باستخدام تحليل الفيديو. تم تطوير بروتوكول موحد لتشكيل NMJ ، والتحفيز البصري مع تسجيل الفيديو في وقت واحد ، وتحليل الفيديو لانقباض الأنسجة. تحفيز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية عن طريق الضوء للحث على تقلصات العضلات الهيكلية يلخص فسيولوجيا NMJ البشرية ويسمح بالقياسات الوظيفية المتكررة ل NMJ بمرور الوقت واستجابة للمدخلات المختلفة. نحن نظهر قدرة هذه المنصة على إظهار التحسينات الوظيفية في الاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت وتوصيف الآثار الضارة للأجسام المضادة MG للمريض أو السموم العصبية على وظيفة NMJ.

Introduction

التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك الكيميائي بين الخلايا العصبية المتحركة (MNs) وخلايا العضلات الهيكلية (SkM) التي تسمح بتقلص العضلات. السموم ، مثل السموم العصبية α بونغاروتوكسين (BTX) ، أو الأمراض العصبية العضلية (NMD) مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) يمكن أن تؤدي إلى انحطاط NMJ وانخفاض في السيطرة على العضلات1. تلخص نماذج الأنسجة البشرية المهندسة بيولوجيا بشكل أفضل الآليات الوظيفية والفسيولوجية ل NMJs البشرية وتوفر إمكانات انتقالية أكبر من النماذج الحيوانية.

في حين أن النماذج الحيوانية قد تقدمت في فهم تكوين ووظيفة NMJ ، هناك اختلافات كبيرة بين نقاط الاشتباك العصبي البشرية والحيوانية التي تحد من ترجمة النتائج إلى البشر وتجعل في الجسم الحي توصيف NMJ تحديا2،3،4. وقد أظهرت الدراسات اختلافات فسيولوجية متميزة بين NMJs الفئران والإنسان. الفئران لديها NMJs أكبر وكثافات منطقة نشطة أصغر بالمقارنة مع NMJs البشرية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعكس دراسات الأدوية التي أجريت في النماذج الحيوانية دائما الآثار الموجودة في التجارب السريرية البشرية. توفر نماذج الأنسجة البشرية الهندسية الفرصة لدراسة التطور الصحي ل NMJ وأمراض الأمراض العصبية العضلية والسماح بإجراء فحوصات الأدوية. يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs)5 إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الهيكلية 6,7 والخلايا العصبية المتحركة 8,9. يمكن توليد hiPSCs بسهولة من خلايا المريض ، مما يسمح بنمذجة أفضل للأمراض10 وفحص الأدوية11,12 من خلال نماذج الأنسجة الخاصة بالمريض.

تفتقر الثقافات المشتركة ثنائية الأبعاد (2D) أحادية الطبقة من SkMs و MNs إلى المورفولوجيا والنمط الظاهري والتنظيم والسلوك الوظيفي ل NMJs الفسيولوجية. NMJs تتشكل بشكل عشوائي في ثقافة ثنائية الأبعاد ، مما يمنع عزل الوحدات الحركية للتحليل ، ويحد من القياسات الوظيفية الدقيقة ، ويمنع استخدامها للتجارب المتكررة والمنهجية13 . تتغلب نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) من NMJs على العديد من هذه القيود ، وتلخص الخصائص المورفولوجية والوظيفية ل NMJs الفسيولوجية7،14،15،16،17. باستخدام هذا النموذج ، يتم تطوير نوعي الأنسجة بشكل منفصل ثم يتم دمجهما عن طريق توجيه النمو المحوري ، مما يسمح بتطوير NMJs أكثر تنظيما مقارنة بأنظمة زراعة 2D.

أظهرت دراستنا السابقة أن الجمع بين علم البصريات الوراثي وهندسة الأنسجة يمكن أن يسمح بالتحفيز الدقيق غير الغازي وتقييم وظيفة NMJ18,19. من خلال الهندسة الوراثية ، يمكن دمج البروتينات الحساسة للضوء في جينوم hiPSCs. إن دمج قناة رودوبسين-2 (ChR2) ، وهي قناة أيونية تفتح استجابة للضوء الأزرق ، في غشاء الخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية يسمح بالتحكم الزماني المكاني غير المتصل في تنشيط الخلية 20،21،22. يمكن تمييز hiPSCs التي تحمل ChR2 إلى خلايا عصبية حركية بصرية حساسة للضوء الأزرق ، مما يزيل الحاجة إلى أقطاب كهربائية غازية نموذجية تحفز الخلايا العصبية وتجنب التحفيز غير المرغوب فيه لخلايا العضلات بواسطة الأقطاب الكهربائية23. يستخدم هذا النظام الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية لتحفيز الانقباضات في خلايا العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. يسمح الجمع بين الحصول على الفيديو وإضاءة الضوء الأزرق التي يتم التحكم فيها بتحفيز الأنسجة المستزرعة وتسجيلها في وقت واحد لوظيفة NMJ.

يحدث MG بسبب الأجسام المضادة الذاتية التي تستهدف مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AChR) ، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة NMJ وضعف العضلات24. يتم تشخيصه بناء على الأعراض المقدمة والتشخيص الكهربائي والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية عن طريق اختبارات الدم المصلية. ومع ذلك ، لم يتم تحديد جميع الأجسام المضادة الذاتية المشاركة في MG ، ويتم تشخيص بعض المرضى سلبيي المصل مع MG ولكن مع عدم وجود أجسام مضادة معترف بها25,26. يسمح نظامنا بإجراء تقييم وظيفي متكرر ل NMJ قبل وبعد إضافة المصل من مرضى MG ، مما يوفر نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن على التغيرات الوظيفية والكيميائية الحيوية التي تسببها الأجسام المضادة MG18. يوضح بروتوكولنا كيفية إنتاج نماذج 3D في المختبر من NMJ البشري الوظيفي الذي يمكن استخدامه لتشخيص أمراض NMJ والتحقيق فيها واختبار العلاجات المحتملة. نحن نظهر براعة النظام في منصتين ، جهاز الموائع الدقيقة ، ومنصة مفاعل حيوي أكبر مفتوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة كولومبيا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. إعداد المفاعل الحيوي

  1. جعل قوالب المفاعلات الحيوية
    1. قم بتنزيل ملف CAD الخاص بالمفاعل الحيوي من ملف CAD التكميلي أو قم بإنشاء تصميم خاص مخصص.
    2. إنشاء مسار أدوات CNC من نموذج 3D باستخدام برنامج CAM.
    3. آلة قوالب الأسيتال باستخدام آلة طحن CNC.
  2. تصنيع المفاعلات الحيوية
    1. امزج قاعدة 10: 1 إلى خليط عامل المعالجة من polydimethylsiloxane (PDMS ، 77 جم من الخليط لكل 4 منصات / قوالب).
    2. ضع الخليط في غرفة فراغ ، وأغلق جميع الصمامات ، وقم بتشغيل الفراغ ، وقم بإزالة الغاز من الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى لا تبقى فقاعات الهواء. صب الخليط في قوالب وإزالة الغاز من القوالب في غرفة التفريغ لمدة 1 ساعة.
    3. أغلق القوالب مع النصف العلوي من القالب في الاتجاه الصحيح. ضع قضيبا سداسيا فولاذيا فوق المركز وقم بالمشبك على كلا الجانبين.
    4. أعد ملء الجزء العلوي باستخدام PDMS.
    5. عالج القوالب في فرن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل.
    6. قم بإزالة المنصات من القوالب بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
    7. تنظيف الأجهزة في حمام بالموجات فوق الصوتية باستخدام دورات 1 ساعة من صابون الأطباق ، 400 مل من 100 ٪ isopropanol ، والماء المقطر.
    8. يجف طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
    9. انقع الغطاء الزجاجي في 1٪ من البوليول غير الأيوني الفاعل بالسطح لمدة 30 دقيقة ، وتأكد من عدم تكديس الأغطية بحيث تكون جميعها مغلفة بشكل صحيح.
    10. شطف جيدا بالماء المقطر وجفف بين عشية وضحاها على حرارة 65 درجة مئوية.
    11. استخدم منظف البلازما على ارتفاع عال مع 6 لتر / دقيقة من الأكسجين لمدة 1-2 دقيقة لعلاج أغطية الزجاج ومنصة PDMS. بمجرد معالجتهما ، اربطا الاثنين معا عن طريق الضغط على PDMS لأسفل على الغطاء لمدة 30 ثانية على الأقل.
    12. قم بتعقيم الأجهزة المستعبدة قبل إضافة الخلايا.

2. بناء إعداد التحفيز البصري

  1. باستخدام نظام مكعب قفص 30 مم ، قم بإرفاق مرآة ثنائية اللون 573 نانومتر في الوسط. قم بإقران LED أحمر 627 نانومتر مع مرشح إثارة طويل التمرير 594 نانومتر وإرفاقه بالجانب العلوي من المكعب ، مع مواجهة LED للمرآة. ثم قم بتوصيل LED أزرق 488 نانومتر مع مرشح إثارة قصير 546 نانومتر إلى الجانب المجاور من المكعب ، مع مواجهة LED للمرآة كما هو موضح في المخطط في الشكل 3A.
  2. قم بتوصيل غشاء القزحية الذي يتم تشغيله بالحلقة إلى أسفل مكعب القفص للتحكم في حجم المنطقة المضاءة.
  3. قم بتشغيل كل مصباح LED بواسطة برنامج تشغيل T-Cube LED والتحكم فيه عبر لوحة Arduino Uno Rev3. قم بتوصيل الإدخال الجانبي لبرنامج تشغيل LED بقابس مصدر الطاقة ، وقم بتوصيل الإخراج الأوسط ب Arduino ، وقم بتوصيل الإخراج الجانبي مباشرة بمصابيح LED.
  4. قم بتوصيل Arduino Uno بجهاز كمبيوتر عن طريق كبل USB.
  5. قم بتنزيل الملفات من رابط GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. افتح الملف "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" من مجلد GitHub.
  7. تعيين معلمات البداية: الخطوات = 30 ؛ startFrequency = 0.5; نهاية التردد = 3; نبض الطول = 100.
  8. تأكد من تعيين خرج الدبوس 4 لبرنامج تشغيل LED الأزرق وتعيين إخراج الدبوس 2 لبرنامج تشغيل LED الأحمر. تحقق من توصيل الأسلاك الوسطى لبرنامج تشغيل LED بالأرض وبمخرج الدبوس المعني.
  9. قم بتجميع وتحميل برنامج "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" إلى Arduino.
  10. قم بتوصيل كل برنامج تشغيل LED بالقناة المقابلة له.

3. إعداد زراعة الخلايا (اليوم -21-0)

  1. خلايا العضلات الهيكلية الأولية
    1. قم بإذابة وتوسيع الأرومات العضلية الهيكلية الأولية (التي تم الحصول عليها من Cook Myosite) لمدة أقصاها ستة ممرات باستخدام وسط نمو Myotonic (+ ملحق). الحفاظ على الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. تغيير وسائل الإعلام كل 2 أيام.
    3. بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 60٪ تقريبا ، قم بمرورها باستخدام 0.05٪ Trypsin-EDTA (1x ، لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية). جمع الخلايا المنفصلة وإضافة وسائط جديدة لتحييد التربسين.
    4. قم بتدوير الخلايا عند 300 × g وقم بشفط supernatant فوق حبيبة الخلية.
    5. أعد تعليق الخلايا باستخدام MGM والبذور 1: 3 مع 60 مل لكل قارورة ثلاثية الطبقات.
  2. ChR2-hiPSC
    ملاحظة: تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. في هذا البروتوكول ، تم إنشاء hiPSCs المعبر عن ChR2 عبر تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام الطرق الموصوفة سابقا18 ، ولكن يمكن استخدام أي خطوط خلايا بصرية وراثية مستقرة (lentiviral ، piggyBac ، إلخ) بنفس الطريقة. تم اختيار المروجين التأسيسيين الذين تم التعبير عنهم في كل من iPSCs و motoneurons (CAG). تم العثور على الخلايا لديها نمط نووي صحي ، كما لوحظ في المنشورات السابقة18,19.
    1. قم بتغطية ألواح 6 آبار ب 1 مل / بئر من مصفوفة الغشاء السفلي المذاب المخفف في DMEM / F12 (1:80) واحتضن الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    2. بذور iPSCs على ألواح مغلفة من 6 آبار مع 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من التغذية (iPSC media) ، وتبادل 2 مل من الوسائط كل يومين ويمر كل 5-7 أيام. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. المرور
      1. قم بفصل الخلايا الجذعية عن طريق الحضانة باستخدام 1 مل من كاشف إطلاق الخلايا الجذعية الخالية من الإنزيم لمدة 4 دقائق والقص ميكانيكيا باستخدام ماصة P1000 ذات الطرف العريض.
      2. خلايا البذور بنسبة 1:24 أو 1:48 في وسائط iPSC مع 2 ميكرومتر من Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد في 2 مل / بئر على ألواح 6 آبار مغلفة.

4. بذر الأنسجة العضلية الهيكلية (اليوم -3)

  1. عزل وحساب 30 × 106 myoblasts باستخدام عداد خلية آلي.
  2. أعد تعليق الأرومات العضلية في مزيج 4: 1 من 3 ملغم / مل من الكولاجين I ومصفوفة الغشاء السفلي المذاب (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي للوصول إلى حجم نهائي قدره 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم 800 ميكرولتر.
  3. أضف 15 ميكرولتر من تعليق الكولاجين الخلوي إلى كل غرفة عضلية في المفاعل الحيوي ، مع التأكد من نشر التعليق عبر كلا العمودين باستخدام طرف الماصة (الشكل 2).
  4. دع خليط هلام الخلية يتبلمر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم املأ كل مفاعل حيوي جيدا ب 450 ميكرولتر من وسائط النمو العضلي.
  5. بعد 3 أيام (بمجرد ضغط الجل) ، ابدأ في تمايز الأنبوب العضلي.

5. تمايز Myotube (أيام 0-14)

  1. ابدأ ضخ الأنبوب العضلي عن طريق تبديل الأنسجة إلى 450 ميكرولتر من الوسائط المحفزة للاندماج (FS ، الجدول 1) لمدة 7 أيام ، مع تغيير الوسائط كل يومين.
    ملاحظة: حاول أن تبدأ تمايز الأنبوب العضلي في نفس اليوم الذي يتم فيه تمايز موتونيورون من hiPSCs من أجل زرع الخلايا العصبية المتحركة في نهاية جداول تمايز كلا النوعين من الخلايا.
  2. في اليوم 7 ، قم بتغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ia (MMIa ، الجدول 1).
  3. في اليوم 9 ، قم بالتغيير إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ib (MMIb ، الجدول 1).
  4. في اليوم 11 ، قم بتغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من NbActiv4. استمر في تغيير الوسائط كل 2 أيام حتى يتم زرع الخلايا العصبية المتحركة (الخطوة 7).

6. تمايز Motoneuron (أيام 0-14)

ملاحظة: تم تكييف بروتوكول التمايز motoneuron الخاص بنا من Maury et al8.

  1. في اليوم 0 ، انقل 4 × 106 ChR2- hiPSCs إلى طبق بتري منخفض للغاية مع 15 مل من وسط ثقافة تعليق موتونيورون (MSCM ، الجدول 1). تكملة MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات و 5 ميكرومتر Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
  2. في اليوم الثاني ، اعزل الأغلفة العصبية (NS) بمصفاة قابلة للانعكاس 37 ميكرومتر وقم بتكرارها في 15 مل من MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك. يجب أن يكون NS مرئيا في طبق Petri دون استخدام المجهر بعد اليوم 2.
  3. في اليوم 4 ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب 50 مل واسمح للغلاف العصبي بالاستقرار في القاع (5 دقائق). شفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 0.5 ميكرومتر SAG ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431541 ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك.
  4. في اليوم 7، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 0.5 ميكرومتر SAG و 0.1μM حمض الريتينويك.
  5. في اليوم 9، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 10 ميكرومتر DAPT.
  6. في اليوم 11، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
  7. في اليوم 14 ، قم بزرع الخلايا العصبية المتحركة في المنصة.

7. بذر مجاميع الخلايا العصبية المتحركة في المفاعل الحيوي (اليوم 14)

  1. تحضير خليط هلام 4: 1 من 2 ملغ / مل من الكولاجين I و Matrigel (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من Matrigel للوصول إلى حجم نهائي من 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم نهائي قدره 800 ميكرولتر.
  2. استخدم مصفاة خلايا 400 نانومتر لاختيار الأغلفة العصبية الكبيرة وإعادة تعليقها في خليط الهلام.
  3. استنشاق الوسائط من الخزان وبعناية من بئر الغلاف العصبي (الشكل 2).
  4. أضف 15 ميكرولتر من خليط الجل إلى قناة الغلاف العصبي.
  5. قم بتحميل ماصة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من الجل ثم اختر غلافا عصبيا واحدا.
  6. قم بإيداع NS في قناة الغلاف العصبي وتأكد من أن NS في الغرفة. ارفع الماصة ببطء مع إطلاق الجل المتبقي بمجرد إيداع NS. إذا لم تكن متأكدا من أن NS قد تم إيداعه بشكل صحيح ، فتحقق من موقعه باستخدام المجهر.
  7. اسمح للهلام بالبلمرة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. أضف 450 ميكرولتر من NbActiv4 مكملة ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF إلى الخزانات.
  9. قم بتغيير الوسائط كل يومين للسماح بالنمو المحوري من NS إلى الأنسجة العضلية.

8. التحفيز البصري المتزامن وتسجيل الفيديو لوظيفة NMJ (اليوم 24+)

  1. للتصوير، استخدم مجهر فلورسنت مقلوب مع كاميرا علمية تكميلية لأشباه الموصلات المعدنية (sCMOS).
  2. اضبط مثبت برنامج الكاميرا على 2x2 ، والتعرض ل 20 مللي ثانية ، وتشغيل الغالق المتداول ، ومعدل القراءة إلى 540 ميجاهرتز ، والنطاق الديناميكي: 12 بت وكسب 1 ، ووضع المستشعر: التداخل.
  3. استخدم هدف 2x على المجهر لتصوير الأنسجة الدقيقة.
  4. قم بتوصيل غرفة خلية حية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) بمرحلة المجهر.
  5. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على أنسجة الأنسجة الهيكلية المعصبة لتقليل حجم الملف ووقت المعالجة.
  6. ضع مرشح انبعاث طويل التمرير 594 نانومتر بين العينة وهدف التصوير لتصفية نبضات الضوء الأزرق من الكاميرا.
  7. ضع صفيحة مستطيلة من 4 آبار تحتوي على 4 مفاعلات حيوية (24 نسيج) في غرفة الخلايا الحية.
  8. انقر على طريقة العرض المباشر. قم بتوسيط الصورة وتركيزها باستخدام عائد الاستثمار المطلوب.
  9. قم بتحميل رمز الماكرو المخصص من مجلد GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) للتحكم في موضع المرحلة ولوحة Arduino واكتساب الفيديو.
  10. قم بتعيين فيلم الإخراج على النحو التالي: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. قم بتشغيل رمز الماكرو باستخدام إحداثيات X و Y المطلوبة على المسرح واحصل على فاصل زمني سريع مع إطارات 1700 بمعدل 50 إطارا / ثانية.
  12. استبدال الوسائط بعد التصوير وإعادة العينات إلى الحاضنة. اسمح ب 24 ساعة على الأقل بين جلسات التقاط الصور لتجنب إرهاق الأنسجة.

9. معالجة وتحليل الدفعات (اليوم 24+)

  1. معالجة الأفلام
    1. استخدم رمز MATLAB المخصص لمعالجة مقاطع الفيديو في تحليل الدفعات. يمكن تنزيل الملفات من مجلد GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). وترد قائمة بالوظائف وشرحها في الجدول 2.
      ملاحظة: التعليمات البرمجية متوافقة مع تنسيقات .nd2 و .czi. يتطلب تنشيطه معالجة متوازية في MATLAB ويحتاج إلى حزمة التنسيقات الحيوية.
    2. قم بتشغيل البرنامج النصي recursiveOSAnalysis لتحليل الأفلام من خلال المعالجة المتوازية. اجعل جميع مقاطع الفيديو المكتسبة في نفس المجلد وحدد هذا المجلد عند تشغيل التعليمة البرمجية.
    3. اضبط معلمات ما بعد التحليل حسب الحاجة.
      1. تغيير وقت خط الأساس (الخيار 1) إذا تم التقاط الانقباض التلقائي في بداية التسجيل. سيظهر هذا طريقة قراءة أولية أعلى من 0 وسيحتاج إلى تغيير الإطار للتعويض.
      2. تغيير peakThreshold (الخيار 2) إذا لم يتم تسجيل الانقباضات. سيكتشف الرمز الانقباضات التي تزيد عن 25٪ من أعلى قمة بشكل افتراضي بحيث يمكن تغيير هذه القيمة.
      3. قم بتغيير minMinProminHighlight و minMinWidth لضبط الحساسية عند اكتشاف بداية كل ذروة.
    4. توليد إخراج الفيديو والرسم البياني.
      1. قم بتشغيل recursiveOSMovie لإنشاء ملف فيديو لكل نسيج مع تتبع الانقباض الخاص به.

10. اضطراب وظيفة NMJ (اليوم 24+)

  1. قم بإعداد وسائط العلاج عن طريق إضافة مستجيب خارجي إلى الوسائط القاعدية NbActiv4 المكملة ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
    1. بالنسبة لتجربة مصل MG ، استخدم 20٪ من أمصال مرضى MG في NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. بالنسبة لتجربة BTX ، استخدم 5 ميكروغرام / مل BTX في NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. التحفيز / الصورة باستخدام الخطوة 3.2. لتسجيل خط الأساس.
  3. استبدل الوسائط الموجودة في الأنسجة بوسائط العلاج (450 ميكرولتر / أنسجة).
  4. احتضان للوقت المطلوب (48 ساعة لمصل المريض ، 20 دقيقة ل BTX).
  5. التحفيز / الصورة مرة أخرى باستخدام الخطوة 3.2. لتسجيل الوظيفة بعد العلاج.
  6. إزالة وسائط العلاج والسماح للأنسجة بالراحة في الوقت المطلوب (48 ساعة بعد إزالة الأمصال)
    ملاحظة: اترك 24 ساعة على الأقل بين التحفيز والتصوير لتجنب إجهاد الأنسجة

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء التقاطعات العصبية العضلية عن طريق المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الضوئية المشتقة من hiPSC مع أنسجة العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. تم زرع الخلايا العضلية الهيكلية الأولية البشرية (SkM) في المنصات وتمييزها إلى أنابيب عضلية متعددة النوى باستخدام بروتوكول 2 أسبوع. تم تمييز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية بشكل منفصل ، ولكن بالتوازي مع تمايز الأنبوب العضلي ، ثم زرعت في المنصة (الشكل 1). بدأت الأنسجة في الانكماش استجابة لتحفيز الضوء الأزرق بعد 7-12 يوما من بذر MN ، مما يشير إلى التطور الناجح ونضج NMJs. يمكن استزراع NMJs وتحفيزها وتصويرها لمدة تصل إلى 40 يوما بعد بذر الموتونيورون ، ولكن النقطة الزمنية المثلى تحدث في اليوم 1619. يظهر التحقق المورفولوجي والكيميائي الحيوي من التمايزات ووجود البروتينات البصرية الجينية في الشكل التكميلي 1 وتم التحقق من صحته في الدراسات السابقة18,19.

ولإثبات أن البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة مع أنظمة الاستزراع المختلفة، تم اختبار الاستراتيجية باستخدام مفاعلين مختلفين مجزأين: جهاز الموائع الدقيقة والمفاعل الحيوي المفتوح البئر. كلا النظامين لهما تصميم مماثل ، مع غرفة واحدة مزودة بأعمدة لتوليد الأنسجة العضلية الهيكلية وغرفة ثانية لزراعة مجاميع motoneuron ثلاثية الأبعاد التي يمكن أن تمتد المحاور العصبية لتعصيب الأنسجة الهيكلية (الشكل 2A ، B). ومع ذلك، فإن النظامين لهما مقاييس مختلفة، حيث ينتج عن جهاز الموائع الدقيقة أنسجة عضلية هيكلية طولها 1 مم تضم حوالي 20000 أرومة عضلية (الشكل 2C) ونظام المفاعل الحيوي المفتوح ينتج عنه أنسجة عضلية طولها 4 مم تضم حوالي 450000 من الأرومات العضلية (الشكل 2D).

للسماح بالتحفيز المتحكم فيه ل NMJs البصرية الجينية ، تم بناء إعداد بصري ، يتكون من LED أحمر 637 نانومتر للإضاءة الساطعة ، و LED أزرق 488 نانومتر لتنشيط ChR2-MNs ، ومرشح ضوء أزرق بين عينة الأنسجة والهدف لمنع الضوء الأزرق من التدخل في تحليل الصورة (الشكل 3A). تم تشغيل مصابيح LED بواسطة برامج تشغيل LED وتم التحكم فيها بدقة عبر معالج Arduino الدقيق. تم تقييم وظيفة NMJ من خلال الحصول في وقت واحد على مقاطع فيديو بفاصل زمني مع تحفيز MNs بالضوء الأزرق باستخدام برنامج نصي ماكرو مخصص للمجهر مقترن برمز Arduino (الشكل 3B). زاد البروتوكول من وتيرة التحفيز من 0.2 هرتز إلى 2 هرتز في 30 خطوة. بمجرد الحصول على الأفلام ، تم تحليل وظيفة الأنسجة باستخدام حزمة MATLAB مخصصة (الشكل 3C). قام التحليل بقياس إزاحة الأنسجة ، وخلق أثر الانقباض ، ومزامنته مع بروتوكول تحفيز الضوء. ثم حدد جزء النبضات الفعالة (F) والجزء المتوقع من النبضات الفعالة (E) لحساب الانقباضات المحتملة غير المحفزة. تم حساب الكسر المتوقع (E) على أنه جزء من النبضات التي سيتم تصنيفها على أنها فعالة إذا تم توزيع الانقباضات عشوائيا داخل 30 s. ثم تم حساب درجة الأنسجة على أنها (F-E)/(1-E)، بقيمة تتراوح بين 0 و1 (الشكل 3C). يحدد الرمز ما إذا كان يتم تشغيل الانكماش بناء على الوقت بين نبضة الضوء وبداية ذروة الانقباض ، كما هو موضح في الشكل 3D. تسمح هذه الطريقة الآلية وغير المتحيزة بالتوصيف المتكرر لوظيفة NMJ في أحجام العينات الكبيرة ومع مرور الوقت. يتضمن الرمز معلمات قابلة للضبط يمكن تعديلها بعد المعالجة لضمان تسجيل النقاط الصحيحة (الشكل التكميلي 2).

وقد أثبتت قدرة النظام على توصيف وظيفة NMJ كميا بمرور الوقت من خلال تصوير مجموعة من الأنسجة لمدة 11 يوما (من اليوم 9 إلى اليوم 20 بعد بذر الموتونيورون). التقط النظام تحسنا في وظيفة NMJ في الأنسجة ، مما يدل على زيادة في الاستجابات المثيرة بعد 1 أسبوع من تصنيع الأنسجة (الشكل 4A) ، تليها وظيفة مستقرة لمدة أسبوع إضافي (الشكل 4B). للتحقق من أن تحفيز العضلات حدث من خلال NMJs ، تم تحليل مجموعة أخرى من الأنسجة قبل وبعد 20 دقيقة من الحضانة مع 5 ميكروغرام / مل من السم العصبي α-bungarotoxin (BTX) ، والذي يرتبط على وجه التحديد وبشكل لا رجعة فيه بمستقبلات الأسيتيل كولين. أوقفت BTX جميع الانقباضات المثارة والتلقائية ، وأدت إلى اضطراب كامل في وظيفة NMJ ، وأظهرت أن التحفيز الضوئي للأنسجة يتطلب NMJ وظيفيا (الشكل 4C ، D). تم اختبار التخفيفات التسلسلية ل BTX في البداية لتحديد تركيز BTX الأمثل (لم تظهر النتائج).

لتقييم القدرة الانتقالية للنظام ، تم تقييم وظيفة NMJ قبل وبعد إضافة المصل من خمسة مرضى بالوهن العضلي الوبيل. أظهر تحليل الأنسجة المعالجة بمصل MG بنسبة 20٪ لمدة 48 ساعة انخفاضا في الوظيفة مقارنة بالأنسجة الضابطة المعالجة بالمصل من متبرعين أصحاء (الشكل 4E ، F). كما تم تقييم NMJs المهندسة مرة أخرى بعد 48 ساعة من إزالة المصل وغسله وأظهرت استعادة الوظيفة (الشكل 4F). بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار تركيزات متزايدة من مصل المريض والتحكم الطبيعي في المصل البشري (5٪ ، 20٪ ، 40٪) لتحديد التركيز الأمثل الذي يؤثر على وظيفة الأنسجة. أظهرت النتائج قدرة النظام على توصيف وقياس دالة NMJ ونمذجة الوهن العضلي الوبيل في المختبر.

Figure 1
الشكل 1. التصميم التجريبي والجدول الزمني. الجدول الزمني (أيام) من التمايز والبذر في المنصات. SkM = العضلات الهيكلية ، ChR2 = الخلايا العصبية المتحركة البصرية ، NMJ = التقاطع العصبي العضلي. وقد عدل هذا الرقم بإذن من Vila et al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. أنظمة الثقافة المشتركة لتوليد NMJs 3D. (أ) مخطط منصة الموائع الدقيقة. (ب) مخطط المفاعل الحيوي PDMS المفتوح الآبار. (ج) الأنسجة العضلية الهيكلية المعصبة في منصة الموائع الدقيقة. (د) الأنسجة المعصبة في المفاعل الحيوي المفتوح البئر. شريط الميزان 0.5 مم. وقد عدل هذا الرقم بإذن من Vila et al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. تحفيز وتسجيل وتحليل وظيفة NMJ. (أ) مخطط إعداد LED ومسار الضوء. (ب) الإعداد البصري باستخدام مجهر مقلوب ، وغرفة خلية حية ، ومرحلة آلية ، وكاميرا sCMOS. (ج) خوارزمية لمعالجة دفعات مقاطع فيديو التحفيز البصري لثقافات NMJ. (د) الإطار التمثيلي للفيديو الذي تم إنشاؤه بواسطة رمز MATLAB والرسم البياني المقابل لتتبع الانقباض. يشير المربع الأزرق الوامض في الفيديو والخطوط الرأسية في الرسم البياني إلى وقت حدوث تحفيز الضوء الأزرق. وقد عدل هذا الرقم بإذن من Vila et al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. وظيفة NMJ. (أ) تتبع الانقباض ل NMJs البشرية 3D المهندسة. (B) درجة NMJs استجابة للضوء ، مما يدل على تحسن الوظيفة على مدى 11 يوما (n = 47 ، ANOVA p أحادي الاتجاه = 1 × 10-8). أشرطة الخطأ = SEM. (C) تتبع الانقباض بعد 20 دقيقة من العلاج مع 5 ملغ / مل من السموم العصبية α-bungarotoxin (BTX). (د) القياس الكمي لدالة NMJ (النتيجة) قبل وبعد المعالجة باستخدام BTX (n = 6 ؛ ANOVA F أحادي الاتجاه = 9 × 10-8). (ه) أثر انقباض الأنسجة مع 20٪ MG الأمصال بعد 48 ساعة من العلاج. (و) تقييم وظيفة NMJ للمجموعات المعالجة والضابطة قبل وبعد العلاج وبعد الشفاء (n = 12؛ بعد العلاج بعد العلاج المخصص ANOVA F = 0.0002؛ * يشير p = 0.0015 ** يشير p = 3.5 x10−6) (MG = الوهن العضلي الوبيل؛ NHS = مصل بشري طبيعي). n يشير إلى عدد النسخ المتماثلة البيولوجية. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Vila et al.18,19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تركيبات الوسائط العضلية والعصبية. قائمة منظمة بعوامل النمو والمكملات الغذائية لوسائل الإعلام. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2. قائمة وظائف MATLAB. تفسيرات موجزة لوظائف MATLAB المستخدمة لتحليل الصور. عدل هذا الجدول بإذن من Vila et al.18. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملفات التكميلية

الشكل التكميلي 1. التمايز Myotube و motoneuron. (أ) بروتوكول تمايز الأنبوب العضلي (MM = وسائط النضج). (ب) صور التألق المناعي (IF) التي تظهر التعبير عن علامات العضلات الهيكلية سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، α-أكتينين ، وديسمين في أنابيب عضلية متباينة. (ج) بروتوكول تمايز الخلايا العصبية المتنقلة. (د) توطين قناة رودوبسين-2 مع YFP (ChR2-YFP) إلى غشاء في iPSCs البصرية الوراثية و (E) MNs التي تؤكد نجاح العدوى. (F) التعبير المشترك عن أستيل ترانسفيراز الكولين (ChAT، أحمر) و ChR2 (أخضر) في MNs البصرية الوراثية. مستنسخة بإذن من فيلا وآخرين.18. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2. معالجة غير صحيحة تتطلب تعديل المعلمات. (أ) يؤدي وقت خط الأساس غير الصحيح إلى قمم الشكل الخاطئ. (ب) تؤدي عتبة الذروة المرتفعة جدا إلى عدم اكتشاف القمم. (ج) تؤدي الشروط المتساهلة جدا للكشف عن الحد الأدنى (أي القيم المنخفضة جدا المختارة ل minMinProminence و / أو minWidth) إلى وضع علامة مصغرة في منتصف أو حتى أعلى القمم ، وبالتالي يتم احتسابها على أنها "غير محفزة" لأنها تبدأ بعيدا جدا عن نبضة الضوء السابقة. (دال) تؤدي الشروط الصارمة للغاية للكشف عن الحد الأدنى إلى وضع علامة على بداية الذروة قبل نبضة الضوء أو حتى فقدانها، كما في هذا المثال. مستنسخة بإذن من فيلا وآخرين.18. ملف يعرض نموذج 3D لمنصة المفاعل الحيوي التي يمكن تحريرها وتصديرها لصنع قوالب لتصنيع المفاعلات الحيوية باستخدام PDMS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

ملف CAD التكميلي. ملف يعرض نموذج 3D لمنصة المفاعل الحيوي التي يمكن تحريرها وتصديرها لصنع قوالب لتصنيع المفاعلات الحيوية باستخدام PDMS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا النظام هو نموذج الأنسجة البشرية 3D هندسيا الذي يجمع بين علم البصريات ومعالجة الفيديو لتمكين التقييم الآلي وغير المتحيز لوظيفة NMJ. باستخدام بروتوكول موحد ، أثبتنا القدرة على قياس التغيرات في وظيفة NMJ أثناء التطور الفسيولوجي وتوصيف الآثار الضارة للأمراض مثل التعرض للسموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.

وقد أفادت دراسات سابقة عن القدرة على نمذجة MG مع الخلايا العصبية المتحركة المشتقة من hPSC البصرية في الزراعة المشتركة مع الأنابيب العضلية الهيكلية باستخدام مصل مريض MG22. ومع ذلك ، كان النظام في 2D وسجل تقلصات في مواقع عشوائية ، مما يحد من قابلية التكرار ويقلل من القدرة الكمية للنموذج. واحدة من أعظم مزايا نظامنا ، مقارنة بنظام 2D ، هو أنه يسمح لنا بمحاكاة بيئة 3D ، مما يسهل بدقة أكبر التطور الخلوي والمورفولوجي بين MNs و SkMs. هناك أدلة كبيرة تدعم أن الإشارات الميكانيكية الحيوية المطلوبة للنسيج ليتصرف مثل فسيولوجيته الأصلية يتم تقليدها بشكل متفوق في نظام ثلاثي الأبعاد13،14،15،16. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجوانب المختلفة لنظام 3D ببيئة أكثر تحكما فيها: تشكيل موجه للنقاط العصبية ، وانخفاض عدم التجانس بين العينات ، وزيادة التحكم المكاني والزماني في التحفيز عبر علم البصريات الوراثي ، ونظام آلي عالي الإنتاجية يقلل من ذاتية تحليل كل عينة.

يمكن استخدام النظام المطور لنمذجة الأمراض العصبية العضلية الأخرى (NMDs) ، مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ، وضمور العضلات دوشين (DMD) ، وغيرها. على الرغم من أن الفيزيولوجيا المرضية ALS تنطوي على خلل وظيفي في الخلايا العصبية الحركية نفسها بدلا من التقاطع العصبي العضلي 17,27 ، فإن نظامنا لديه القدرة على تلخيص الحالة المرضية ل ALS من خلال إظهار تقلص العضلات المتناقص بعد تنكس الخلايا العصبية أو تلفها. DMD هو مرض تنكسي عضلي ناجم عن نقص بروتين الديستروفين ، مما يؤدي إلى ضعف العضلات والتنكس في نهاية المطاف28. يمكن للنظام نمذجة DMD من خلال دمج العضلات الهيكلية المعدلة وراثيا التي تحمل مثبط الديستروفين أو خلايا العضلات المريضة التي تفتقر إلى الديستروفين. بشكل عام ، يتمتع النظام بالمرونة والقوة لتلخيص مختلف NMDs في منصة 3D في المختبر.

بالنسبة للبروتوكول الذي يتطلب مصادر مختلفة للخلايا ، لكل منها مستويات معينة من الالتقاء ، فإن أحد الجوانب الأكثر أهمية هو التوقيت. أثناء توسع خلايا العضلات الهيكلية الأولية ، من المهم عدم السماح لها بأن تصبح ملتقاة للغاية (65٪ -70٪) بسبب الانصهار. في بعض الأحيان ، حتى عند استخدام التربسين لتفتيت الكتل ، لوحظ أن هذا يترجم إلى انخفاض فعالية البذر في المفاعلات الحيوية. جانب حاسم آخر هو إنتاج منصة المفاعل الحيوي المفتوح الآبار. من أجل زيادة التجانس بين منصات PDMS ، يجب الحفاظ على مقدار الوقت الذي تقضيه في الفرن موحدا عبر جميع المنصات لتجنب أي تقلبات في الخواص الميكانيكية لأعمدة المنصة. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء بذر خلايا العضلات في المفاعلات ، من أجل الحفاظ على اتساق كثافة البذر ، من المنطقي دوامة الأنبوب بلطف (1-1.5 ثانية) بين كل مقصورتين إلى ثلاث مقصورات داخل المفاعلات الحيوية. وأخيرا ، كان ينظر إلى معدل نجاح تطوير NMJ على أنه يعتمد إلى حد كبير على نجاح بذر motoneuron لأن إضافة الكرات العصبية حساسة للغاية وتختلف من شخص لآخر. مع ممارسة البذر ، يزداد معدل النجاح ، مما يسمح بتحفيز وتصوير حوالي 90٪ من الثقافات المبادرة.

حاليا ، بعض القيود التي يمكن معالجتها في المستقبل القريب هي دمج والتحقق من صحة البروتينات البصرية الوراثية بخلاف ChR2 التي تمت مناقشتها. يمكن إضافة تحكم محدد في كل من أنواع الخلايا وأجهزة الاستشعار البصرية الجينية لتصوير الجهد / الكالسيوم أو استقلاب العضلات إلى النظام لزيادة القراءات والتحليل. نظرا لأن الضوء الأزرق يحفز السمية الضوئية بجرعات عالية ، فقد اقتصر نظام التحفيز على 30 ثانية. يمكن تحسين هذا التأثير عن طريق دمج قناة حمراء الانزياح لدراسات التحفيز طويلة الأمد. بالإضافة إلى ذلك ، هناك قيد آخر يمكن تحسينه في التكرارات المستقبلية للنموذج وهو عدم وجود خلايا داعمة للخلايا العصبية مثل خلايا شوان. ومع ذلك ، فإن تعدد استخدامات هذه المنصة ورمز التحليل يسمح بدمج مجموعة متنوعة من التركيبات البصرية الجينية وأنواع الخلايا. في حين تم إنشاء خط ChR2-hiPSC الخاص بنا باستخدام كريسبر ، يمكن استخدام طرق أخرى لتنفيذ استجابة بصرية وراثية في hiPSCs. علاوة على ذلك ، مع القدرة على التكيف مع hiPSCs ، يمكن تطوير نموذج NMJ من مصدر خلية واحدة ، مما يسمح باستخدام نماذج خاصة بالمريض لمواصلة دراسة الأمراض العصبية العضلية18.

توفر هذه المنصة تحليلا متكررا وآليا وغير متحيز لوظيفة NMJ البشرية بمرور الوقت ويمكنها اكتشاف التغيرات القابلة للقياس الكمي في الوظيفة بسبب المستجيبات الخارجية ، مثل السموم العصبية أو مصل مريض MG. بشكل عام ، يسمح نظامنا 3D بالتحقيق في وظيفة NMJ البشرية في وقت مبكر من أمراض الأمراض ، ويوفر الفرصة لفحص الأدوية ، ويضع الأساس لنظام قوي لتطوير الطب الدقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نقدر بامتنان الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة [أرقام المنح EB025765 و EB027062] ، ووزارة الدفاع [رقم الجائزة W81XWH-18-1-0095] ، و UCSF Health Innovation via Engineering (زمالة فيروس نقص المناعة البشرية). نحن نقدر بامتنان مركز الخلايا الجذعية بجامعة كولومبيا لمساعدته وتوجيهه في إعادة برمجة الخلايا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 182،
هندسة وتوصيف نموذج بصري وراثي للوصلة العصبية العضلية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter