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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Ingénierie et caractérisation d’un modèle optogénétique de la jonction neuromusculaire humaine

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Nous décrivons un système d’imagerie reproductible, automatisé et impartial pour caractériser la fonction de la jonction neuromusculaire à l’aide de tissus musculaires squelettiques et de motoneurones optogénétiques. Ce système permet la quantification fonctionnelle de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et détecte la diminution de la fonction neuromusculaire causée par les neurotoxines et la myasthénie grave du sérum du patient.

Abstract

De nombreuses maladies neuromusculaires, telles que la myasthénie grave (MG), sont associées à un dysfonctionnement de la jonction neuromusculaire (NMJ), qui est difficile à caractériser dans les modèles animaux en raison des différences physiologiques entre les animaux et les humains. L’ingénierie tissulaire offre la possibilité de fournir des modèles in vitro de NMJ humains fonctionnels qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. En incorporant des protéines optogénétiques dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), nous avons généré des neurones qui peuvent être stimulés avec des longueurs d’onde de lumière spécifiques. Si le NMJ est sain et fonctionnel, un signal neurochimique du motoneurone entraîne une contraction musculaire. Grâce à l’intégration de l’optogénétique et de la microfabrication à l’ingénierie tissulaire, nous avons établi une méthodologie impartiale et automatisée pour caractériser la fonction NMJ à l’aide de l’analyse vidéo. Un protocole standardisé a été développé pour la formation de NMJ, la stimulation optique avec enregistrement vidéo simultané et l’analyse vidéo de la contractilité tissulaire. La stimulation des motoneurones optogénétiques par la lumière pour induire des contractions musculaires squelettiques récapitule la physiologie humaine du NMJ et permet des mesures fonctionnelles répétées du NMJ au fil du temps et en réponse à divers intrants. Nous démontrons la capacité de cette plateforme à montrer des améliorations fonctionnelles de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et à caractériser les effets néfastes des anticorps MG ou des neurotoxines des patients sur la fonction NMJ.

Introduction

La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse chimique entre les motoneurones (MN) et les cellules musculaires squelettiques (SkM) qui permet la contraction musculaire. Les toxines, telles que la neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), ou les maladies neuromusculaires (NMD) comme la myasthénie grave (MG) peuvent entraîner une dégénérescence de la NMJ et des réductions du contrôle musculaire1. Les modèles de tissus humains issus de la bioingénierie récapitulent mieux les mécanismes fonctionnels et physiologiques des NMJ humains et offrent un plus grand potentiel de traduction que les modèles animaux.

Bien que les modèles animaux aient fait progresser la compréhension de la formation et de la fonction du NMJ, il existe des différences significatives entre les synapses humaines et animales qui limitent la traduction des résultats chez l’homme et rendent la caractérisation in vivo du NMJ difficile 2,3,4. Des études ont montré des différences physiologiques distinctes entre les NMJ de souris et les NMJ humains. Les souris ont des NMJ plus importants et des densités de zone active plus petites par rapport aux NMJ humains4. De plus, les études sur les médicaments menées sur des modèles animaux ne reflètent pas toujours les effets observés dans les essais cliniques chez l’homme. Les modèles de tissus humains modifiés offrent la possibilité d’étudier le développement sain de la NMJ et la pathologie des maladies neuromusculaires et permettent des dépistages de médicaments. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs)5 peuvent être différenciées en une variété de types de cellules, y compris les cellules musculaires squelettiques 6,7 et les motoneurones 8,9. Les CSHS peuvent être générés facilement à partir des cellules des patients, ce qui permet une meilleure modélisation de la maladie10 et un dépistage des médicaments11,12 grâce à des modèles tissulaires spécifiques au patient.

Les co-cultures monocouches bidimensionnelles (2D) de SkM et de MN n’ont pas la morphologie, le phénotype, l’organisation et le comportement fonctionnel des NMJ physiologiques. Les NMJ se forment aléatoirement en culture 2D, ce qui inhibe l’isolement des unités motrices pour l’analyse, limite les mesures fonctionnelles précises et empêche leur utilisation pour des expériences répétées et systématiques13 . Les modèles tissulaires tridimensionnels (3D) des NMJ surmontent bon nombre de ces limitations, récapitulant les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des NMJ physiologiques 7,14,15,16,17. À l’aide de ce modèle, les deux types de tissus sont développés séparément, puis intégrés en dirigeant la croissance axonale, ce qui permet aux NMJ plus organisés de se développer par rapport aux systèmes de culture 2D.

Notre étude précédente a démontré que la combinaison de l’optogénétique avec l’ingénierie tissulaire peut permettre une stimulation et une évaluation non invasives précises de la fonction NMJ18,19. Grâce au génie génétique, les protéines sensibles à la lumière peuvent être intégrées dans le génome des hiPSC. L’intégration de la channelrhodopsine-2 (ChR2), un canal ionique qui s’ouvre en réponse à la lumière bleue, dans la membrane des cellules excitables telles que les neurones permet un contrôle spatio-temporel sans contact de l’activation cellulaire 20,21,22. Les hiPSC porteurs de ChR2 peuvent être différenciés en motoneurones optogénétiques sensibles à la lumière bleue, éliminant ainsi le besoin d’électrodes invasives typiques qui stimulent les neurones et évitant la stimulation indésirable des cellules musculaires par des électrodes23. Ce système utilise des motoneurones optogénétiques pour stimuler les contractions dans les cellules musculaires squelettiques non optogénétiques. La combinaison de l’acquisition vidéo et de l’éclairage contrôlé de la lumière bleue permet aux tissus co-cultivés d’être simultanément stimulés et enregistrés pour la fonction NMJ.

La MG est causée par des auto-anticorps ciblant les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR), ce qui entraîne une diminution de la fonction NMJ et une faiblesse musculaire24. Il est diagnostiqué en fonction des symptômes présentés, de l’électrodiagnostic et de la détection d’auto-anticorps via des tests sanguins sérologiques. Cependant, tous les auto-anticorps impliqués dans la MG n’ont pas été identifiés, et certains patients séronégatifs reçoivent un diagnostic de MG mais sans anticorps reconnus25,26. Notre système permet une évaluation fonctionnelle répétée du NMJ avant et après l’ajout de sérum chez les patients atteints de MG, fournissant des informations inestimables sur les changements fonctionnels et biochimiques causés par les anticorps MG18. Notre protocole illustre comment produire des modèles 3D in vitro de NMJ humain fonctionnel qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. Nous démontrons la polyvalence du système en deux plates-formes, un dispositif microfluidique et une plus grande plate-forme de bioréacteur à puits ouvert.

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Protocol

Toutes les lignées cellulaires pour ce travail ont été créées et utilisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université Columbia, NY, États-Unis.

1. Préparation du bioréacteur

  1. Fabriquer des moules de bioréacteur
    1. Téléchargez un fichier CAO de bioréacteur à partir du fichier CAO supplémentaire ou créez votre propre conception personnalisée.
    2. Générez une trajectoire d’outil CNC à partir du modèle 3D à l’aide d’un logiciel de FAO.
    3. Machines à moules acétal à l’aide d’une fraiseuse CNC.
  2. Fabrication de bioréacteurs
    1. Mélanger un mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS, 77 g de mélange pour 4 plates-formes/moules) à base d’agent de durcissement.
    2. Placez le mélange dans une chambre à vide, fermez toutes les vannes, allumez le vide et désamorçez le mélange pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Versez le mélange dans des moules et dégazez les moules dans la chambre à vide pendant 1 h.
    3. Fermez les moules avec la moitié supérieure du moule dans la bonne orientation. Placez une tige hexagonale en acier sur le centre et serrez les deux côtés.
    4. Remplissez le dessus avec PDMS.
    5. Durcir les moules dans un four à 65 °C pendant au moins 4 h.
    6. Retirez les plates-formes des moules après refroidissement à la température ambiante.
    7. Nettoyez les appareils dans un bain à ultrasons en utilisant 1 h de cycles de savon à vaisselle, 400 mL d’isopropanol à 100% et de l’eau distillée.
    8. Sécher toute la nuit à 65 °C.
    9. Trempez les couvercles de verre dans du polyol de tensioactif non ionique à 1% pendant 30 minutes et assurez-vous que les couvercles ne s’empilent pas de sorte qu’ils soient tous correctement enduits.
    10. Bien rincer à l’eau distillée et sécher toute la nuit à 65 °C.
    11. Utilisez un nettoyeur plasma à haute température avec 6 L / min d’oxygène pendant 1 à 2 minutes pour traiter les couvercles en verre et la plate-forme PDMS. Une fois traités, collez les deux ensemble en appuyant sur le PDMS sur le couvercle pendant au moins 30 s.
    12. Autoclavez les dispositifs liés avant d’ajouter des cellules.

2. Construire une installation de stimulation optique

  1. À l’aide d’un système de cube de cage de 30 mm, fixez un miroir dichroïque de 573 nm au centre. Couplez une LED rouge de 627 nm avec un filtre d’excitation passe-long de 594 nm et fixez-la sur le côté supérieur du cube, la LED faisant face au miroir. Fixez ensuite une LED bleue de 488 nm avec un filtre d’excitation passe-court de 546 nm sur le côté adjacent du cube, la LED faisant face au miroir comme le montre le schéma de la figure 3A.
  2. Fixez un diaphragme d’iris actionné par anneau au fond du cube de la cage pour contrôler la taille de la zone éclairée.
  3. Alimentez chaque LED par un pilote LED T-Cube et contrôlez via une carte Arduino Uno Rev3. Connectez l’entrée latérale du pilote LED à une fiche de source d’alimentation, connectez la sortie centrale à l’Arduino et connectez la sortie latérale directement aux LED.
  4. Connectez l’Arduino Uno à un PC à l’aide d’un câble USB.
  5. Téléchargez des fichiers à partir du lien GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Ouvrez le fichier « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » à partir du dossier GitHub.
  7. Définissez les paramètres de départ: Étapes = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLongueur = 100.
  8. Assurez-vous que la sortie de broche 4 est affectée au pilote de LED bleue et que la sortie de broche 2 est affectée au pilote de LED rouge. Vérifiez que les fils du milieu du pilote LED sont connectés à la terre et à la sortie de broche respective.
  9. Compilez et chargez le programme « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » sur Arduino.
  10. Connectez chaque pilote LED à son canal correspondant.

3. Configuration de la culture cellulaire (jour -21-0)

  1. Cellules musculaires squelettiques primaires
    1. Décongeler et dilater les myoblastes squelettiques primaires (obtenus à partir de Cook Myosite) pour un maximum de six passages en utilisant un milieu de croissance myotonique (+ supplément). Maintenir les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Changez le média tous les 2 jours.
    3. Une fois que les cellules sont confluentes à environ 60 %, passez-les à l’aide de 0,05 % de trypsine-EDTA (1x, pendant 5 min à 37 °C). Recueillir les cellules dissociées et ajouter un milieu frais pour neutraliser la trypsine.
    4. Faites tourner les cellules à 300 x g et aspirez le surnageant au-dessus de la pastille de cellule.
    5. Remettre en suspension les cellules avec MGM et ensemencer 1:3 avec 60 mL par fiole à triple couche.
  2. ChR2-hiPSC
    REMARQUE: Toutes les lignées cellulaires pour ce travail ont été créées et utilisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université Columbia, NY, États-Unis. Dans ce protocole, les hiPSC exprimant ChR2 ont été générés via l’édition du génome CRISPR-Cas9 en utilisant les méthodes18 décrites précédemment, mais toutes les lignées cellulaires optogénétiques stables (lentiviral, piggyBac, etc.) peuvent être utilisées de la même manière. Les promoteurs constitutifs exprimés à la fois dans les CSPi et les motoneurones ont été choisis (CAG). Les cellules se sont avérées avoir un caryotype sain, comme indiqué dans les publications précédentes18,19.
    1. Enduire les plaques à 6 puits avec 1 mL/puits de matrice de membrane basale solubilisée diluée dans du DMEM/F12 (1:80) et incuber les plaques à température ambiante pendant 1 h.
    2. Ensemencez des CSPi sur des plaques enduites de 6 puits avec 2 mL de milieu de culture cellulaire sans mangeoire (milieux iPSC), échangeant 2 mL de milieu tous les deux jours et passant tous les 5 à 7 jours. Maintenir les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
    3. Le passage
      1. Dissocier les cellules souches en incubant avec 1 mL de réactif libérant des cellules souches sans enzyme pendant 4 min et en cisaillant mécaniquement avec une pipette P1000 à large pointe.
      2. Cellules de semences dans un rapport de 1:24 ou 1:48 dans des milieux iPSC avec 2 μM de dichlorhydrate Y-27632 dans 2 mL/puits sur des plaques revêtues de 6 puits.

4. Ensemencement du tissu musculaire squelettique (jour -3)

  1. Isolez et comptez 30 x 106 myoblastes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
  2. Remettre en suspension les myoblastes dans un mélange 4:1 de collagène I de 3 mg/mL et de matrice de membrane basale solubilisée (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de matrice de membrane basale pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajouter l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène à agent neutralisant) et diluer le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume de 800 μL.
  3. Ajouter 15 μL de suspension de collagène cellulaire à chaque chambre musculaire du bioréacteur, en veillant à étaler la suspension sur les deux piliers à l’aide de la pointe de la pipette (Figure 2).
  4. Laisser le mélange cellule-gel polymériser à 37 °C pendant 30 min, puis bien remplir chaque bioréacteur avec 450 μL de milieu de croissance myotonique.
  5. Après 3 jours (une fois que le gel s’est compacté), commencez la différenciation des myotubes.

5. Différenciation des myotubes (jours 0-14)

  1. Commencez la perfusion de myotubes en changeant les tissus en 450 μL de milieux inducteurs de fusion (FS, tableau 1) pendant 7 jours, en changeant les milieux tous les deux jours.
    REMARQUE: Essayez de commencer la différenciation des myotubes le même jour que la différenciation des motoneurones des hiPSC afin d’ensemencer les motoneurones à la fin des calendriers de différenciation des deux types de cellules.
  2. Le jour 7, changez le milieu à 450 μL de milieu de maturation Ia (MMIa, tableau 1).
  3. Le jour 9, passer à 450 μL de milieu de maturation Ib (MMIb, tableau 1).
  4. Le jour 11, changez le média à 450 μL de NbActiv4. Continuez à changer le média tous les 2 jours jusqu’à ce que les motoneurones soient ensemencés (étape 7).

6. Différenciation des motoneurones (jours 0-14)

NOTE: Notre protocole de différenciation des motoneurones a été adapté de Maury et al8.

  1. Le jour 0, transférez 4 x 106 ChR2- hiPSC dans une boîte de Petri à fixation ultra-faible avec 15 mL de milieu de culture en suspension de motoneurone (MSCM, Tableau 1). Complétez MSCM avec 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 5 μM Y-27632 dichlorhydrate.
  2. Le jour 2, isolez les neurosphères (NS) avec une passoire réversible de 37 μM et replaquez dans 15 mL de MSCM avec 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 0,1 μM d’acide rétinoïque. NS devrait être visible dans la boîte de Petri sans utiliser de microscope après le jour 2.
  3. Le jour 4, transférez les cellules et les milieux dans un tube de 50 mL et laissez les neurosphères s’installer au fond (5 min). Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
  4. Le jour 7, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 0,5 μM DE SAG et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
  5. Le jour 9, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension des cellules dans 15 mL de MSCM complété par 10 μM de DAPT.
  6. Le jour 11, répétez l’étape 6.3. mais remettre en suspension les cellules dans 15 mL de MSCM complété par 20 ng/mL BDNF et 10 ng/mL GDNF.
  7. Le jour 14, ensemencez les motoneurones dans la plate-forme.

7. Ensemencement d’agrégats de motoneurones dans un bioréacteur (jour 14)

  1. Préparer un mélange de gel 4:1 de 2 mg/mL de collagène I et de Matrigel (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de Matrigel pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajouter l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène à agent neutralisant) et diluer le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume final de 800 μL.
  2. Utilisez une passoire cellulaire de 400 nm pour sélectionner de grandes neurosphères et les remettre en suspension dans le mélange de gel.
  3. Aspirer les milieux du réservoir et soigneusement de la neurosphère (Figure 2).
  4. Ajouter 15 μL de mélange de gel dans le canal de la neurosphère.
  5. Chargez une pipette de 10 μL avec 10 μL de gel, puis choisissez une neurosphère.
  6. Déposez le NS dans le canal de la neurosphère et assurez-vous que le NS est dans la chambre. Soulevez lentement la pipette tout en libérant le gel restant une fois que le NS est déposé. Si vous n’êtes pas sûr que le NS a été correctement déposé, vérifiez son emplacement à l’aide d’un microscope.
  7. Laisser le gel polymériser pendant 30 min à 37 °C.
  8. Ajouter 450 μL de NbActiv4 complété par 20 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF aux réservoirs.
  9. Changez le média tous les deux jours pour permettre la croissance axonale de la NS au tissu musculaire.

8. Stimulation optique simultanée et enregistrement vidéo de la fonction NMJ (jour 24+)

  1. Pour l’imagerie, utilisez un microscope fluorescent inversé avec une caméra scientifique complémentaire métal-oxyde-semi-conducteur (sCMOS).
  2. Réglez le binning du logiciel de l’appareil photo sur 2x2, l’exposition à 20 ms, l’obturateur roulant allumé, le taux de lecture à 540 MHz, la plage dynamique: 12 bits et le gain 1, et le mode capteur: chevauchement.
  3. Utilisez un objectif 2x sur le microscope pour imager les microtissus.
  4. Fixez une chambre à cellules vivantes (37 °C, 5 % de CO2) à l’étage du microscope.
  5. Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) qui contient le tissu tissulaire squelettique innervé afin de minimiser la taille du fichier et le temps de traitement.
  6. Placez un filtre d’émission passe-long de 594 nm entre l’échantillon et l’objectif d’imagerie pour filtrer les impulsions de lumière bleue de la caméra.
  7. Placez une plaque rectangulaire de 4 puits contenant 4 bioréacteurs (24 tissus) dans la chambre des cellules vivantes.
  8. Cliquez sur Affichage en direct. Centrez et concentrez l’image avec le retour sur investissement souhaité.
  9. Téléchargez le code de macro personnalisé à partir du dossier GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) pour contrôler la position de la scène, la carte Arduino et l’acquisition vidéo.
  10. Définissez le film de sortie comme suit : day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Exécutez le code macro avec les coordonnées X,Y souhaitées définies sur la scène et acquérez un laps de temps rapide avec 1700 images à 50 images / s.
  12. Remplacez le support après l’imagerie et retournez les échantillons à l’incubateur. Prévoyez au moins 24 heures entre les séances d’acquisition d’images pour éviter la fatigue des tissus.

9. Traitement et analyse par lots (jour 24+)

  1. Traitement de films
    1. Utilisez le code MATLAB personnalisé pour traiter les vidéos en analyse par lots. Les fichiers peuvent être téléchargés à partir du dossier GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Les fonctions sont énumérées et expliquées dans le tableau 2.
      REMARQUE: Le code est compatible avec les formats .nd2 et .czi. Il nécessite un traitement parallèle pour être activé dans MATLAB et nécessite le package de bioformats.
    2. Exécutez le script récursifOSAnalysis pour analyser les films via un traitement parallèle. Ayez toutes les vidéos acquises dans le même dossier et sélectionnez ce dossier lors de l’exécution du code.
    3. Ajustez les paramètres de post-analyse selon vos besoins.
      1. Modifiez l’heure de référence (option 1) si la contraction spontanée est détectée au début de l’enregistrement. Cela montrera une lecture initiale bien au-dessus de 0 et nécessitera que le cadre soit déplacé pour compenser.
      2. Modifiez peakThreshold (option 2) si les contractions ne sont pas enregistrées. Le code détectera par défaut les contractions supérieures à 25 % du pic le plus élevé afin que cette valeur puisse être modifiée.
      3. Modifiez minMinProminence et minMinWidth pour ajuster la sensibilité lors de la détection du début de chaque pic.
    4. Générez une sortie vidéo et graphique.
      1. Exécutez recursiveOSMovie pour générer un fichier vidéo pour chaque tissu avec sa trace de contractilité respective.

10. Perturbation de la fonction NMJ (jour 24+)

  1. Préparer les milieux de traitement en ajoutant un effecteur externe au milieu basal NbActiv4 complété par 20 ng/mL BDNF et 10 ng/mL GDNF.
    1. Pour l’expérience de sérum MG, utilisez 20% de sérum de patient MG dans NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Pour l’expérience BTX, utilisez 5 μg/mL BTX dans NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimuler/imager à l’aide de l’étape 3.2. pour enregistrer la ligne de base.
  3. Remplacer les milieux dans les tissus par des milieux de traitement (450 μL/tissu).
  4. Incuber pendant le temps souhaité (48 h pour le sérum du patient, 20 min pour le BTX).
  5. Stimuler/imager à nouveau à l’aide de l’étape 3.2. pour enregistrer la fonction après le traitement.
  6. Retirer le milieu de traitement et laisser reposer les tissus pendant le temps souhaité (48 h après l’élimination du sérum)
    REMARQUE: Prévoyez au moins 24 heures entre la stimulation et l’imagerie pour éviter la fatigue des tissus

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Representative Results

Les jonctions neuromusculaires ont été générées par la co-culture de motoneurones optogénétiques dérivés de hiPSC avec du tissu musculaire squelettique non optogénétique. Les myoblastes squelettiques primaires humains (SkM) ont été ensemencés dans les plates-formes et différenciés en myotubes multinucléés en utilisant le protocole de 2 semaines. Les motoneurones optogénétiques ont été différenciés séparément, mais en parallèle avec la différenciation des myotubes, puis ensemencés dans la plate-forme (Figure 1). Les tissus ont commencé à se contracter en réponse à la stimulation de la lumière bleue 7 à 12 jours après l’ensemencement du MN, indiquant un développement et une maturation réussis des NMJ. Les NMJ peuvent être cultivés, stimulés et imagés jusqu’à 40 jours après l’ensemencement du motoneurone, mais le point de temps optimal se produit le jour 16à 19. La validation morphologique et biochimique des différenciations et de la présence des protéines optogénétiques est illustrée dans la figure supplémentaire 1 et a été validée dans des études antérieures18,19.

Pour démontrer que le protocole peut être facilement adapté à différents systèmes de culture, la stratégie a été testée à l’aide de deux réacteurs compartimentés différents : un dispositif microfluidique et un bioréacteur à puits ouvert. Les deux systèmes ont une conception similaire, avec une chambre dotée de piliers pour la génération de tissus musculaires squelettiques et une deuxième chambre pour la culture d’agrégats de motoneurones 3D qui peuvent étendre les axones pour innerver les tissus squelettiques (Figure 2A, B). Cependant, les deux systèmes ont des échelles différentes, le dispositif microfluidique produisant des tissus musculaires squelettiques de 1 mm de long comprenant environ 20 000 myoblastes (Figure 2C) et le système de bioréacteur à puits ouvert résultant en des tissus musculaires de 4 mm de long comprenant environ 450 000 myoblastes (Figure 2D).

Pour permettre une stimulation contrôlée des NMJ optogénétiques, une configuration optique a été construite, comprenant une LED rouge de 637 nm pour l’éclairage en champ lumineux, une LED bleue de 488 nm pour l’activation des ChR2-MN et un filtre de lumière bleue entre l’échantillon de tissu et l’objectif pour empêcher la lumière bleue d’interférer avec l’analyse de l’image (Figure 3A). Les LED étaient alimentées par des pilotes LED et contrôlées avec précision via un microprocesseur Arduino. La fonction NMJ a été évaluée en acquérant simultanément des vidéos time-lapse tout en stimulant les MN avec de la lumière bleue à l’aide d’un macro-script de microscope personnalisé associé au code Arduino (Figure 3B). Le protocole a augmenté la fréquence de stimulation de 0,2 Hz à 2 Hz en 30 étapes. Une fois les films acquis, la fonction tissulaire a été analysée à l’aide d’un package MATLAB personnalisé (Figure 3C). L’analyse a mesuré le déplacement des tissus, généré une trace de contractilité et l’a synchronisée avec le protocole de stimulation lumineuse. Il a ensuite déterminé la fraction d’impulsions effectives (F) et une fraction attendue d’impulsions efficaces (E) pour tenir compte des contractions potentielles non stimulées. La fraction attendue (E) a été calculée comme la fraction d’impulsions qui serait étiquetée comme efficace si les contractions étaient distribuées aléatoirement dans les 30 s. Le score tissulaire a ensuite été calculé comme (F-E)/(1-E), avec une valeur comprise entre 0 et 1 (Figure 3C). Le code détermine si une contraction est déclenchée en fonction du temps entre une impulsion lumineuse et le début du pic de contractilité, comme le montre la figure 3D. Cette méthode automatisée et impartiale permet une caractérisation répétée de la fonction NMJ dans des échantillons de grande taille et au fil du temps. Le code comprend des paramètres réglables qui peuvent être ajustés après le traitement pour assurer une notation correcte (Figure supplémentaire 2).

La capacité du système à caractériser quantitativement la fonction NMJ au fil du temps a été démontrée par imagerie d’un groupe de tissus pendant 11 jours (du jour 9 au jour 20 après l’ensemencement du motoneurone). Le système a capturé l’amélioration de la fonction NMJ dans les tissus, montrant une augmentation des réponses déclenchées 1 semaine après la fabrication des tissus (Figure 4A), suivie d’une fonction stable pendant une semaine supplémentaire (Figure 4B). Pour vérifier que la stimulation musculaire s’est produite à travers les NMJ, un autre groupe de tissus a été analysé avant et après 20 minutes d’incubation avec 5 μg / mL de la neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), qui se lie spécifiquement et irréversiblement aux récepteurs de l’acétylcholine. BTX a arrêté toutes les contractions déclenchées et spontanées, a entraîné une perturbation complète de la fonction NMJ et a démontré que la stimulation lumineuse des tissus nécessite une NMJ fonctionnelle (Figure 4C, D). Les dilutions en série de BTX ont d’abord été testées pour identifier la concentration optimale de BTX (résultats non présentés).

Pour évaluer la capacité translationnelle du système, la fonction NMJ a été évaluée avant et après l’ajout de sérum de cinq patients atteints de myasthénie grave. L’analyse des tissus traités avec du sérum MG à 20 % pendant 48 h a montré une diminution de la fonction par rapport aux tissus témoins traités avec du sérum provenant de donneurs sains (figure 4E, F). Les NMJ d’ingénierie ont également été évalués à nouveau 48 heures après l’ablation et le lavage du sérum et ont montré une récupération de la fonction (Figure 4F). De plus, des concentrations croissantes de sérum de patient et un contrôle normal du sérum humain (5%, 20%, 40%) ont été testés pour identifier la concentration optimale qui affectait la fonction tissulaire. Les résultats ont montré la capacité du système à caractériser et à quantifier la fonction NMJ et à modéliser la myasthénie grave in vitro.

Figure 1
Graphique 1. Conception expérimentale et chronologie. Chronologie (jours) de différenciation et d’ensemencement dans les plateformes. SkM = muscle squelettique, ChR2 = motoneurones optogénétiques, NMJ = jonction neuromusculaire. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Vila et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Systèmes de co-culture pour la génération de NMJ 3D. (A) Schéma de la plateforme microfluidique. (B) Schéma du bioréacteur PDMS à puits ouvert. (C) Tissu musculaire squelettique innervé dans la plate-forme microfluidique. (D) Tissu innervé dans le bioréacteur à puits ouvert. Barre d’échelle 0,5 mm. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Vila et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Stimulation, enregistrement et analyse de la fonction NMJ. (A) Schéma de la configuration de la LED et du chemin de la lumière. (B) Configuration optique avec un microscope inversé, une chambre à cellules vivantes, un étage automatisé et une caméra sCMOS. (C) Algorithme pour le traitement par lots de vidéos de stimulation optique de cultures NMJ. (D) Image représentative de la vidéo générée par le code MATLAB et le graphique de trace de contractilité correspondant. La boîte bleue clignotante dans la vidéo et les lignes verticales dans le graphique indiquent quand la stimulation de la lumière bleue se produit. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Vila et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Fonction NMJ. (A) Trace de contractilité pour les NMJ humains conçus en 3D. (B) Score des NMJ en réponse à la lumière, montrant une amélioration de la fonction sur 11 jours (n = 47, ANOVA unidirectionnelle p = 1 x 10-8). Barres d’erreur = MEB. (C) Trace de contractilité après 20 min de traitement avec 5 mg/mL de neurotoxine α-bungarotoxine (BTX). (D) Quantification de la fonction NMJ (score) avant et après le traitement par BTX (n = 6; ANOVA unidirectionnelle F = 9 x 10-8). (E) Trace de contractilité des tissus avec 20% de sérum MG après 48 h de traitement. (F) Évaluation de la fonction NMJ pour les groupes traités et témoins avant et après le traitement et après la récupération (n = 12; après traitement ANOVA post-hoc F = 0,0002; *indique p = 0,0015 **indique p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthénie grave; NHS = sérum humain normal). n indique le nombre de répliques biologiques. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Vila et al.18,19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Formulations de milieux myogènes et neuronaux. Liste organisée des facteurs de croissance et des suppléments pour les médias. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2. Liste des fonctions MATLAB. Brève explication des fonctions MATLAB utilisées pour l’analyse d’images. Ce tableau a été modifié avec la permission de Vila et al.18. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichiers supplémentaires

Figure supplémentaire 1. Différenciations des myotubes et des motoneurones. (A) Protocole de différenciation des myotubes (MM = milieu de maturation). (B) Images d’immunofluorescence (FI) montrant l’expression de marqueurs musculaires squelettiques myosine chaîne lourde (CMH), α-actinine et desmine dans des myotubes différenciés. (C) Protocole de différenciation des motoneurones. (D) Localisation de la channelrhodopsine-2 avec YFP (ChR2-YFP) à la membrane dans les CSPi optogénétiques et les MN (E) confirmant une infection réussie. (F) Coexpression de la choline acétyltransférase (ChAT, rouge) et ChR2 (vert) dans les MN optogénétiques. Barres d’échelle 100 μm. Reproduit avec la permission de Vila et al.18. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2. Traitement incorrect qui nécessite un ajustement des paramètres. (A) Un temps de référence incorrect entraîne des pics de mauvaise forme. (B) Un seuil de crête trop élevé a pour conséquence que les pics ne sont pas détectés. (C) Des conditions trop clémentes pour la détection des minima (c’est-à-dire des valeurs trop faibles choisies pour minMinProminence et/ou minMinWidth) entraînent l’étiquetage des minima au milieu ou même au sommet des pics, donc comptés comme « non déclenchés » parce qu’ils commencent trop loin de l’impulsion lumineuse précédente. (D) Des conditions trop strictes pour la détection des minima ont pour conséquence que le début du pic est étiqueté avant l’impulsion lumineuse ou même manquant, comme dans cet exemple. Reproduit avec la permission de Vila et al.18. Fichier montrant un modèle 3D de plate-forme de bioréacteur qui peut être édité et exporté pour fabriquer des moules pour la fabrication de bioréacteurs à l’aide de PDMS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Fichier CAO supplémentaire. Fichier montrant un modèle 3D de plate-forme de bioréacteur qui peut être édité et exporté pour fabriquer des moules pour la fabrication de bioréacteurs à l’aide de PDMS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ce système est un modèle de tissu humain 3D qui combine l’optogénétique et le traitement vidéo pour permettre une évaluation automatisée et impartiale de la fonction NMJ. En utilisant un protocole standardisé, nous avons démontré la capacité de mesurer les changements dans la fonction NMJ au cours du développement physiologique et de caractériser les effets néfastes de pathologies telles que l’exposition aux neurotoxines et la myasthénie grave des sérums de patients.

Des études antérieures ont rapporté la capacité de modéliser la MG avec des motoneurones optogénétiques dérivés de hPSC en co-culture avec des myotubes squelettiques en utilisant le sérum de patient MG22. Cependant, le système était en 2D et enregistrait des contractions dans des endroits aléatoires, limitant ainsi la reproductibilité et diminuant la capacité quantitative du modèle. L’un des plus grands avantages de notre système, par rapport à un système 2D, est qu’il nous permet d’émuler l’environnement 3D, ce qui facilite plus précisément le développement cellulaire et morphologique entre les MN et les SKM. Il existe de nombreuses preuves qui soutiennent que les signaux biomécaniques nécessaires pour qu’un tissu se comporte comme sa physiologie native sont imités de manière supérieure dans un système 3D 13,14,15,16. De plus, divers aspects du système 3D permettent un environnement plus contrôlé : formation dirigée de synapses, moins d’hétérogénéité entre les échantillons, contrôle spatio-temporel accru de la stimulation via l’optogénétique et système automatisé à haut débit qui diminue la subjectivité de l’analyse de chaque échantillon.

Le système développé peut être utilisé pour modéliser d’autres maladies neuromusculaires (NMD), telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et d’autres. Bien que la physiopathologie de la SLA implique le dysfonctionnement du motoneurone lui-même plutôt que de la jonction neuromusculaire17,27, notre système a la capacité de récapituler l’état pathologique de la SLA en montrant une diminution de la contraction musculaire après une dégénérescence ou des dommages neuronaux. La DMD est une maladie dégénérative musculaire causée par un manque de protéine dystrophine, ce qui entraîne une faiblesse musculaire et une dégénérescence éventuelle28. Le système pourrait modéliser la DMD en incorporant du muscle squelettique génétiquement modifié qui porte un inhibiteur de la dystrophine ou des cellules musculaires malades qui manquent de dystrophine. Dans l’ensemble, le système a la flexibilité et la puissance nécessaires pour récapituler divers NMD dans une plate-forme 3D in vitro.

Pour un protocole qui nécessite diverses sources de cellules, chacune avec des niveaux particuliers de confluence, l’un des aspects les plus critiques est le timing. Lors de l’expansion des cellules musculaires squelettiques primaires, il est important de ne pas les laisser devenir trop confluentes (65% à 70%) en raison de la fusion. Parfois, même lors de l’utilisation de la trypsine pour briser les amas, il a été observé que cela se traduit par un ensemencement moins efficace dans les bioréacteurs. Un autre aspect critique est la production de plates-formes de bioréacteurs à puits ouvert. Afin d’accroître l’homogénéité entre les plates-formes PDMS, le temps qu’elles passent dans le four doit être maintenu uniforme sur toutes les plates-formes afin d’éviter toute fluctuation des propriétés mécaniques des piliers de la plate-forme. De plus, lors de l’ensemencement des cellules musculaires dans les réacteurs, afin de maintenir la cohérence de la densité d’ensemencement, il est judicieux de vortexer doucement le tube (1-1,5 s) entre deux ou trois compartiments dans les bioréacteurs. Enfin, le taux de réussite du développement du NMJ dépendait en grande partie du succès de l’ensemencement des motoneurones, car l’ajout de neurosphères est si délicat et varie d’une personne à l’autre. Avec la pratique de l’ensemencement, le taux de réussite augmente, ce qui permet à environ 90% des cultures initiées d’être stimulées et imagées.

Actuellement, certaines limites qui pourraient être abordées dans un proche avenir sont l’incorporation et la validation de protéines optogénétiques autres que le ChR2 discuté. Un contrôle spécifique des deux types de cellules et des capteurs optogénétiques pour l’imagerie tension/calcium ou le métabolisme musculaire pourrait être ajouté au système pour des lectures et des analyses accrues. Comme la lumière bleue induit une phototoxicité à fortes doses, le régime de stimulation a été limité à 30 s. Cet effet pourrait être amélioré en incorporant une channelrhodopsine décalée vers le rouge pour des études de stimulation de plus longue durée. En outre, une autre limitation qui pourrait être améliorée dans les futures itérations du modèle est le manque de cellules de soutien neuronales comme les cellules de Schwann. La polyvalence de cette plate-forme et de ce code d’analyse permet toutefois d’incorporer une variété de constructions optogénétiques et de types de cellules. Bien que notre gamme ChR2-hiPSC ait été créée à l’aide de CRISPR, d’autres méthodes pourraient être utilisées pour implémenter une réponse optogénétique dans les hiPSC. En outre, grâce à l’adaptabilité des hiPSC, le modèle NMJ peut être développé à partir d’une source cellulaire unique, ce qui permet d’utiliser des modèles spécifiques au patient pour étudier plus avant les maladies neuromusculaires18.

Cette plate-forme fournit une analyse répétée, automatisée et impartiale de la fonction HUMAINE NMJ au fil du temps et peut détecter des changements quantifiables de la fonction dus à des effecteurs externes, comme les neurotoxines ou le sérum de patient MG. Dans l’ensemble, notre système 3D permet d’étudier la fonction humaine nmJ au début de la pathologie de la maladie, offre la possibilité de dépister les médicaments et jette les bases d’un système robuste pour faire progresser la médecine de précision.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions chaleureusement le nih [numéros de subvention EB025765 et EB027062], le DOD [numéro de bourse W81XWH-18-1-0095] et l’UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Nous remercions chaleureusement le noyau de cellules souches de l’Université Columbia pour son aide et ses conseils en matière de reprogrammation cellulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

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References

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Bioingénierie numéro 182
Ingénierie et caractérisation d’un modèle optogénétique de la jonction neuromusculaire humaine
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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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