Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

Abstract

Myastenia gravis (MG) gibi birçok nöromüsküler hastalık, hayvanlar ve insanlar arasındaki fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinde karakterize edilmesi zor olan nöromüsküler kavşağın (NMJ) işlev bozukluğu ile ilişkilidir. Doku mühendisliği, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'lerinin in vitro modellerini sağlama fırsatları sunar. Optogenetik proteinleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dahil ederek, ışığın belirli dalga boylarıyla uyarılabilen nöronlar ürettik. NMJ sağlıklı ve işlevsel ise, motonörondan gelen nörokimyasal bir sinyal kas kasılmasıyla sonuçlanır. Optogenetik ve mikrofabrikasyonun doku mühendisliği ile entegrasyonu sayesinde, video analizi kullanarak NMJ fonksiyonunu karakterize etmek için tarafsız ve otomatik bir metodoloji oluşturduk. NMJ oluşumu, eşzamanlı video kaydı ile optik stimülasyon ve doku kontraktilitesinin video analizi için standartlaştırılmış bir protokol geliştirilmiştir. İskelet kası kasılmalarını indüklemek için optogenetik motonöronların ışıkla uyarılması, insan NMJ fizyolojisini özetler ve zaman içinde ve çeşitli girdilere yanıt olarak NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel ölçümlerine izin verir. Bu platformun zaman içinde nöromüsküler bağlantıda fonksiyonel iyileşmeler gösterme yeteneğini gösteriyoruz ve hasta MG antikorlarının veya nörotoksinlerin NMJ fonksiyonu üzerindeki zararlı etkilerini karakterize ediyoruz.

Introduction

Nöromüsküler kavşak (NMJ), kas kasılmasına izin veren motonöronlar (MN'ler) ve iskelet kası hücreleri (SkM) arasındaki kimyasal sinapstır. Nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) gibi toksinler veya myastenia gravis (MG) gibi nöromüsküler hastalıklar (NMD) NMJ'nin dejenerasyonuna ve kas kontrolünde azalmaya neden olabilir1. Biyomühendislik ürünü insan doku modelleri, insan NMJ'lerinin fonksiyonel ve fizyolojik mekanizmalarını daha iyi özetler ve hayvan modellerinden daha fazla translasyonel potansiyel sunar.

Hayvan modelleri, NMJ'nin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasını ilerletirken, insan ve hayvan sinapsları arasında, sonuçların insanlara çevirisini sınırlayan ve NMJ'nin in vivo karakterizasyonunuzorlaştıran önemli farklılıklar vardır. 2,3,4. Fareler, insan NMJ'leri4 ile karşılaştırıldığında daha büyük NMJ'lere ve daha küçük aktif bölge yoğunluklarına sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde yapılan ilaç çalışmaları her zaman insan klinik çalışmalarında bulunan etkileri yansıtmamaktadır. Tasarlanmış insan doku modelleri, NMJ'nin sağlıklı gelişimini ve nöromüsküler hastalıkların patolojisini inceleme fırsatı sunar ve ilaç taramalarına izin verir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler)5, iskelet kası hücreleri6,7 ve motonöronlar 8,9 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayrılabilir. hiPSC'ler hasta hücrelerinden kolayca üretilebilir, bu da hastaya özgü doku modelleri aracılığıyla daha iyi hastalıkmodellemesi 10 ve ilaç taraması 11,12 sağlar.

SkM'lerin ve MN'lerin iki boyutlu (2B) tek katmanlı ortak kültürleri, fizyolojik NMJ'lerin morfolojisi, fenotipi, organizasyonu ve fonksiyonel davranışından yoksundur. NMJ'ler, analiz için motor birimlerin izolasyonunu engelleyen, doğru fonksiyonel ölçümleri sınırlayan ve tekrarlanan, sistematik deneyler için kullanımlarını önleyen 2D kültürde rastgeleoluşur13 . NMJ'lerin üç boyutlu (3D) doku modelleri, fizyolojik NMJ'lerin 7,14,15,16,17'nin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini özetleyerek bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelir. Bu modeli kullanarak, iki doku tipi ayrı ayrı geliştirilir ve daha sonra aksonal büyümeyi yönlendirerek entegre edilir ve 2D kültür sistemlerine kıyasla daha organize NMJ'lerin gelişmesine izin verilir.

Önceki çalışmamız, optogenetiğin doku mühendisliği ile birleştirilmesinin doğru non-invaziv stimülasyona ve NMJ fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verebileceğini göstermiştir18,19. Genetik mühendisliği sayesinde, ışığa duyarlı proteinler hiPSC'lerin genomuna entegre edilebilir. Mavi ışığa tepki olarak açılan bir iyon kanalı olan channelrhodopsin-2'yi (ChR2), nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin zarına entegre etmek, hücre aktivasyonu20,21,22 üzerinde temassız mekansal zamansal kontrol sağlar. ChR2 taşıyan hiPSC'ler, mavi ışığa duyarlı optogenetik motonöronlara ayrılabilir, nöronları uyaran tipik invaziv elektrotlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve kas hücrelerinin elektrotlar tarafından istenmeyen şekilde uyarılmasını önler23. Bu sistem, optogenetik olmayan iskelet kası hücrelerinde kasılmaları uyarmak için optogenetik motonöronları kullanır. Video yakalama ve kontrollü mavi ışık aydınlatmasını birleştirmek, ko-kültürlü dokuların aynı anda uyarılmasını ve NMJ işlevi için kaydedilmesini sağlar.

MG, nikotinik asetilkolin reseptörlerini (AChR) hedef alan otoantikorlardan kaynaklanır ve bu da NMJ fonksiyonunun azalmasına ve kas güçsüzlüğüne neden olur24. Sunulan semptomlara, elektro tanıya ve serolojik kan testleri ile otoantikorların saptanmasına dayanarak teşhis edilir. Bununla birlikte, MG'de rol oynayan tüm otoantikorlar tanımlanmamıştır ve bazı seronegatif hastalara MG tanısı konmuştur, ancak tanınmış antikorları yoktur25,26. Sistemimiz, MG hastalarından serum eklenmesinden önce ve sonra NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmesine izin vererek, MG antikorlarının neden olduğu fonksiyonel ve biyokimyasal değişiklikler hakkında paha biçilmez bir fikir verir18. Protokolümüz, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'nin 3D in vitro modellerinin nasıl üretileceğini göstermektedir. Sistemin çok yönlülüğünü iki platformda, bir mikroakışkan cihazda ve daha büyük bir açık kuyulu biyoreaktör platformunda gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır.

1. Biyoreaktör hazırlığı

  1. Biyoreaktör kalıpları yapın
    1. Ek CAD Dosyasından bir biyoreaktör CAD dosyası indirin veya özel bir tasarım oluşturun.
    2. CAM yazılımını kullanarak 3B modelden bir CNC takım yolu oluşturun.
    3. CNC freze makinesi kullanarak asetal kalıpları işleyin.
  2. Biyoreaktörlerin imalatı
    1. Polidimetilsiloksanın kürleyici ajan karışımına 10: 1'lik bir baz karıştırın (PDMS, 4 platform / kalıp başına 77 g karışım).
    2. Karışımı bir vakum odasına yerleştirin, tüm vanaları kapatın, vakumu açın ve hava kabarcıkları kalmayana kadar karışımı en az 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Karışımı kalıplara dökün ve kalıpları vakum odasında 1 saat boyunca gazdan arındırın.
    3. Kalıpları, kalıbın üst yarısı doğru yönde olacak şekilde kapatın. Merkeze çelik altıgen bir çubuk yerleştirin ve her iki tarafa da kelepçeleyin.
    4. Üst kısmı PDMS ile doldurun.
    5. Kalıpları 65 °C fırında en az 4 saat kürleyin.
    6. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra platformları kalıplardan çıkarın.
    7. Ultrasonik bir banyodaki cihazları 1 saatlik bulaşık sabunu döngüsü, 400 mL% 100 izopropanol ve damıtılmış su kullanarak temizleyin.
    8. 65 °C'de gece boyunca kurutun.
    9. Cam kapakları 30 dakika boyunca% 1 iyonik olmayan yüzey aktif madde polyoluna batırın ve örtülerin istiflenmediğinden emin olun, böylece hepsi düzgün bir şekilde kaplanır.
    10. Damıtılmış suyla iyice durulayın ve 65 ° C'de gece kurutun.
    11. Tedavi cam kapaklarına ve PDMS platformuna 1-2 dakika boyunca 6 L / dak oksijen içeren yüksek bir plazma temizleyici kullanın. Tedavi edildikten sonra, PDMS'yi en az 30 saniye boyunca kapak kapağına bastırarak ikisini birbirine bağlayın.
    12. Hücre eklemeden önce bağlı cihazları otoklav yapın.

2. Optik stimülasyon kurulumu oluşturma

  1. 30 mm'lik bir kafes küp sistemi kullanarak, merkeze 573 nm dikroik ayna takın. Kırmızı bir 627 nm LED'i 594 nm uzun geçişli uyarma filtresi ile birleştirin ve LED aynaya bakacak şekilde küpün üst tarafına takın. Ardından, küpün bitişik tarafına 546 nm kısa geçişli uyarma filtreli mavi bir 488 nm LED takın ve LED, Şekil 3A'daki şemada gösterildiği gibi aynaya bakar.
  2. Aydınlatılmış alanın boyutunu kontrol etmek için kafes küpünün altına halka tahrikli bir iris diyaframı takın.
  3. Her LED'e bir T-Cube LED sürücüsü ile güç verin ve bir Arduino Uno Rev3 kartı ile kontrol edin. LED sürücüsünün yan girişini bir güç kaynağı fişine bağlayın, orta çıkışı Arduino'ya bağlayın ve yan çıkışı doğrudan LED'lere bağlayın.
  4. Arduino Uno'yu bir USB kablosuyla bir PC'ye bağlayın.
  5. GitHub bağlantısından dosya indirin (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. GitHub klasöründen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dosyasını açın.
  7. Başlangıç parametrelerini ayarlayın: Adımlar = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. Pin çıkışı 4'ün Mavi LED sürücüsüne, pin çıkışının 2'nin Kırmızı LED sürücüsüne atandığından emin olun. LED sürücüsünün orta kablolarının toprağa ve ilgili pim çıkışına bağlı olduğunu kontrol edin.
  9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" programını Arduino'ya derleyin ve yükleyin.
  10. Her LED sürücüsünü karşılık gelen kanala bağlayın.

3. Hücre kültürü kurulumu (gün -21-0)

  1. Birincil iskelet kası hücreleri
    1. Miyotonik büyüme ortamı (+ takviyesi) kullanılarak maksimum altı pasaj için birincil iskelet miyoblastlarını (Cook Miyozit'ten elde edilen) çözün ve genişletin. Hücreleri 37 ° C'ye ve% 5 CO2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
    2. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.
    3. Hücreler yaklaşık% 60 birleştiğinde,% 0.05 Tripsin-EDTA (1x, 37 ° C'de 5 dakika boyunca) kullanarak bunları geçirin. Ayrışmış hücreleri toplayın ve tripsini nötralize etmek için taze medya ekleyin.
    4. Hücreleri 300 x g'da döndürün ve süpernatantı hücre peletinin üzerine aspire edin.
    5. MGM ve tohum 1: 3 ile hücreleri üç katmanlı şişe başına 60 mL ile yeniden askıya alın.
  2. ChR2-hiPSC
    NOT: Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır. Bu protokolde, ChR2 eksprese eden hiPSC'ler, daha önce tarif edilen yöntemler18 kullanılarak CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi yoluyla üretildi, ancak herhangi bir kararlı optogenetik hücre hattı (lentiviral, piggyBac, vb.) aynı şekilde kullanılabilir. Hem iPSC'lerde hem de motonöronlarda eksprese edilen kurucu promotörler seçildi (CAG). Hücrelerin, önceki yayınlarda belirtildiği gibi sağlıklı karyotipe sahip olduğu bulundu18,19.
    1. 6 delikli plakaları DMEM/F12'de (1:80) seyreltilmiş 1 mL/kuyucuk çözünür bazal membran matrisi ile kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    2. 2 mL besleyicisiz hücre kültürü ortamına (iPSC medya) sahip kaplamalı 6 delikli plakalar üzerinde tohum iPSC'leri, her gün 2 mL ortam alışverişi yapar ve her 5-7 günde bir geçer. Hücreleri 37 ° C'ye ve% 5 CO 2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
    3. Pasaj
      1. 1 mL enzimsiz kök hücre salgılayıcı reaktif ile 4 dakika boyunca inkübe ederek ve geniş uçlu P1000 pipetle mekanik olarak keserek kök hücreleri ayırın.
      2. Kaplanmış 6 delikli plakalar üzerine 2 mL/kuyucuk içinde 2 μM Y-27632 dihidroklorür ile iPSC ortamında 1:24 veya 1:48 oranında tohum hücreleri.

4. İskelet kası dokusu tohumlaması (gün -3)

  1. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 30 x 106 miyoblastı izole edin ve sayın.
  2. Miyoblastları 4:1 karışım 3 mg/mL kollajen I ve çözünür bazal membran matrisinde (800 μL kollajen karışımı + 200 μL bazal membran matrisi 1 mL'lik son hacme ulaşmak için) yeniden askıya alın. Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
  3. Biyoreaktörün her kas odasına 15 μL hücre-kollajen süspansiyonu ekleyin ve pipet ucunu kullanarak süspansiyonu her iki direğe de yaydığınızdan emin olun (Şekil 2).
  4. Hücre-jel karışımının 30 dakika boyunca 37 ° C'de polimerize olmasına izin verin ve ardından her bir biyoreaktörü 450 μL Miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun.
  5. 3 gün sonra (jel sıkıştırıldıktan sonra), miyotüp farklılaşmasına başlayın.

5. Miyotüp farklılaşması (gün 0-14)

  1. Dokuları 7 gün boyunca 450 μL füzyon indükleyici ortama (FS, Tablo 1) geçirerek ve medyayı her geçen gün değiştirerek miyotüp infüzyonuna başlayın.
    NOT: Her iki hücre tipinin farklılaşma programlarının sonunda motonöronları tohumlamak için hiPSC'lerden motonöron farklılaşması ile aynı gün miyotüp farklılaşmasına başlamaya çalışın.
  2. 7. günde ortamı 450 μL olgunlaşma ortamı Ia olarak değiştirin (MMIa, Tablo 1).
  3. 9. günde, 450 μL olgunlaşma ortamı Ib olarak değiştirin (MMIb, Tablo 1).
  4. 11. günde, medyayı 450 μL NbActiv4 olarak değiştirin. Motonöronlar tohumlanana kadar her 2 günde bir medyayı değiştirmeye devam edin (Adım 7).

6. Motonöron farklılaşması (gün 0-14)

NOT: Motonöron farklılaşma protokolümüz Maury ve ark.8'den uyarlanmıştır.

  1. 0. günde, 4 x 106 ChR2- hiPSC'leri, 15 mL motonöron süspansiyon kültürü ortamına sahip ultra düşük bağlantılı bir Petri kabına aktarın (MSCM, Tablo 1). 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 5 μM Y-27632 dihidroklorür ile MSCM takviyesi.
  2. 2. günde, nörosferleri (NS) 37 μM geri dönüşümlü süzgeç ile izole edin ve 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 0.1 μM retinoik asit ile 15 mL MSCM'de yeniden plakalayın. NS, 2. günden sonra mikroskop kullanmadan Petri kabında görünür olmalıdır.
  3. 4. günde, hücreleri ve medyayı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve nörosferlerin dibe çökmesine izin verin (5 dakika). Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 ve 0.1 μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  4. 7. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 0.5 μM SAG ve 0.1μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  5. 9. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak 10 μM LAPT ile desteklenen 15 mL MSCM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
  6. 11. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  7. 14. günde, motonöronları platforma tohumlayın.

7. Biyoreaktörde motonöronların toplanması (14. gün)

  1. 2 mg / mL kollajen I ve Matrigel'den oluşan 4: 1 jel karışımı hazırlayın (1 mL'lik bir son hacme ulaşmak için 800 μL kollajen karışımı + 200 μL Matrigel). Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir son hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
  2. Büyük nörosferleri seçmek ve jel karışımında yeniden askıya almak için 400 nm hücre süzgeci kullanın.
  3. Rezervuardan ve dikkatlice nörosferden gelen ortamları aspire edin (Şekil 2).
  4. Nörosfer kanalına 15 μL jel karışımı ekleyin.
  5. 10 μL'lik bir pipeti 10 μL jel ile doldurun ve ardından bir nörosfer seçin.
  6. NS'yi nörosfer kanalına yatırın ve NS'nin odada olduğundan emin olun. NS biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın. NS'nin doğru şekilde yatırıldığından emin değilseniz, bir mikroskop kullanarak yerini kontrol edin.
  7. Jelin 37 °C'de 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
  8. Rezervuarlara 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 450 μL NbActiv4 ekleyin.
  9. NS'den kas dokusuna aksonal büyümeye izin vermek için medyayı her geçen gün değiştirin.

8. NMJ fonksiyonunun eşzamanlı optik stimülasyonu ve video kaydı (24+ gün)

  1. Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (sCMOS) kameraya sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanın.
  2. Kamera yazılımı gruplamasını 2x2'ye, pozlamayı 20 ms'ye, panjuru AÇIK, okuma hızını 540 MHz'e, dinamik aralık: 12 bit ve kazanç 1'e ve sensör modu: üst üste binmeye ayarlayın.
  3. Mikrodokuları görüntülemek için mikroskopta 2x objektif kullanın.
  4. Mikroskop aşamasına bir canlı hücre odası (37 °C, % 5 CO2) takın.
  5. Dosya boyutunu ve işleme süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokuları dokusunu içeren ilgili bölgeyi (ROI) seçin.
  6. Fotoğraf makinesinden gelen mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme hedefi arasına 594 nm uzunluğunda bir emisyon filtresi yerleştirin.
  7. Canlı hücre odasına 4 biyoreaktör (24 doku) içeren dikdörtgen 4 delikli bir plaka yerleştirin.
  8. Live View'ı (Canlı Görünüm) tıklayın. Görüntüyü istediğiniz yatırım getirisi ile ortalayın ve odaklayın.
  9. Sahne alanı konumunu, Arduino panosunu ve video alımını denetlemek için GitHub klasöründen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) özel makro kodunu yükleyin.
  10. Çıkış filmini şu şekilde ayarlayın: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Makro kodunu sahne alanında ayarlanmış istenen X,Y koordinatlarıyla çalıştırın ve 50 kare/sn'de 1700 kare ile hızlı bir zaman atlaması elde edin.
  12. Görüntülemeden sonra ortamı değiştirin ve numuneleri inkübatöre geri gönderin. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü yakalama oturumları arasında en az 24 saat bekleyin.

9. Toplu işleme ve analiz (24. gün)

  1. Film işleme
    1. Toplu analizde videoları işlemek için özel MATLAB kodunu kullanın. Dosyalar GitHub klasöründen indirilebilir (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). İşlevler Tablo 2'de listelenmiş ve açıklanmıştır.
      NOT: Kod .nd2 ve .czi biçimleriyle uyumludur. MATLAB'da paralel işlemenin etkinleştirilmesini gerektirir ve biyoformat paketine ihtiyaç duyar.
    2. Filmleri paralel işleme yoluyla analiz etmek için recursiveOSAnalysis komut dosyasını çalıştırın. Edinilen tüm videoları aynı klasörde bulundurun ve kodu çalıştırırken bu klasörü seçin.
    3. Analiz sonrası parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
      1. Kayıt başlangıcında kendiliğinden kasılma yakalanırsa taban çizgisini değiştirinTime (seçenek 1). Bu, 0'ın üzerinde bir ilk okuma yolu gösterecek ve telafi etmek için çerçevenin kaydırılmasını gerektirecektir.
      2. Kasılmalar kaydedilmiyorsa peakThreshold'i (seçenek 2) değiştirin. Kod, varsayılan olarak en yüksek tepe noktasının %25'inin üzerinde olan kasılmaları algılar, böylece bu değer değiştirilebilir.
      3. Her tepe noktasının başlangıcını algılarken hassasiyeti ayarlamak için minMinProminence ve minMinWidth değerlerini değiştirin.
    4. Video ve grafik çıktısı oluşturun.
      1. RecursiveOSMovie komutunu çalıştırarak her doku için kendi kontraktilitesi izine sahip bir video dosyası oluşturun.

10. NMJ fonksiyonunun bozulması (24. gün+)

  1. 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenen NbActiv4 bazal ortama harici efektör ekleyerek tedavi ortamı hazırlayın.
    1. MG sera deneyi için, NbActiv4 + BDNF + GDNF'de% 20 MG hasta serumunu kullanın.
    2. BTX deneyi için NbActiv4 + BDNF + GDNF'de 5 μg/mL BTX kullanın.
  2. Adım 3.2'yi kullanarak uyarın/görüntüleyin. tıklayarak taban çizgisini kaydedin.
  3. Dokulardaki ortamı tedavi ortamı (450 μL/doku) ile değiştirin.
  4. İstenilen süre boyunca inkübe edin (hasta serumları için 48 saat, BTX için 20 dakika).
  5. Adım 3.2'yi kullanarak tekrar uyarın/görüntüleyin. tedaviden sonra fonksiyonu kaydetmek için.
  6. Tedavi ortamını çıkarın ve dokuların istenen süre dinlenmesine izin verin (serumların çıkarılmasından 48 saat sonra)
    NOT: Doku yorgunluğunu önlemek için stimülasyon ve görüntüleme arasında en az 24 saat bekleyin

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nöromüsküler kavşaklar, optogenetik hiPSC türevi motonöronların optogenetik olmayan iskelet kası dokusu ile birlikte kültürlenmesiyle oluşturuldu. İnsan primer iskelet miyoblastları (SkM) platformlara tohumlandı ve 2 haftalık protokol kullanılarak çok çekirdekli miyotüplere farklılaştırıldı. Optogenetik motonöronlar ayrı ayrı, ancak miyotüp farklılaşmasına paralel olarak farklılaştırıldı ve daha sonra platforma tohumlandı (Şekil 1). Dokular, MN tohumlamasından 7-12 gün sonra mavi ışık stimülasyonuna yanıt olarak kasılmaya başladı ve NMJ'lerin başarılı bir şekilde geliştiğini ve olgunlaştığını gösterdi. NMJ'ler, motonöron tohumlamasından sonra 40 güne kadar kültürlenebilir, uyarılabilir ve görüntülenebilir, ancak en uygun zaman noktası 16. gündegerçekleşir. Optogenetik proteinlerin farklılaşmalarının ve varlığının morfolojik ve biyokimyasal validasyonu Ek Şekil 1'de gösterilmiştir ve önceki çalışmalardadoğrulanmıştır 18,19.

Protokolün farklı kültür sistemlerine kolayca uyarlanabileceğini göstermek için, strateji iki farklı bölümlenmiş reaktör kullanılarak test edildi: bir mikroakışkan cihaz ve bir açık kuyulu biyoreaktör. Her iki sistem de benzer bir tasarıma sahiptir, bir oda iskelet kas dokularının üretimi için sütunlarla donatılmıştır ve iskelet dokularını innerve etmek için aksonları uzatabilen 3D motonöron agregalarının kültürü için ikinci bir oda vardır (Şekil 2A, B). Bununla birlikte, iki sistem farklı ölçeklere sahiptir; mikroakışkan cihaz, yaklaşık 20.000 miyoblast içeren 1 mm uzunluğunda iskelet kası dokuları (Şekil 2C) ve açık kuyulu biyoreaktör sistemi, yaklaşık 450.000 miyoblasttan oluşan 4 mm uzunluğunda kas dokuları ile sonuçlanır (Şekil 2D).

Optogenetik NMJ'lerin kontrollü bir şekilde uyarılmasına izin vermek için, parlak alan aydınlatması için kırmızı bir 637 nm LED, ChR2-MN'lerin aktivasyonu için mavi bir 488 nm LED ve doku örneği ile mavi ışığın görüntü analizine müdahale etmesini önlemek için objektif arasında bir mavi ışık filtresinden oluşan bir optik kurulum inşa edilmiştir (Şekil 3A). LED'ler LED sürücüler tarafından desteklendi ve bir Arduino mikroişlemcisi aracılığıyla hassas bir şekilde kontrol edildi. NMJ fonksiyonu, Arduino kodu ile eşleştirilmiş özel bir mikroskop makro komut dosyası kullanılarak MN'leri mavi ışıkla uyarırken aynı anda hızlandırılmış videolar elde edilerek değerlendirildi (Şekil 3B). Protokol, stimülasyon frekansını 30 adımda 0,2 Hz'den 2 Hz'e yükseltti. Filmler elde edildikten sonra, doku fonksiyonu özel bir MATLAB paketi kullanılarak analiz edildi (Şekil 3C). Analiz, doku yer değiştirmesini ölçtü, bir kontraktilite izi oluşturdu ve ışık stimülasyon protokolü ile senkronize etti. Daha sonra, potansiyel uyarılmamış kasılmaları hesaba katmak için etkili darbelerin (F) fraksiyonunu ve etkili darbelerin (E) beklenen bir fraksiyonunu belirledi. Beklenen fraksiyon (E), kasılmalar 30 s içinde rastgele dağıtılırsa etkili olarak etiketlenecek darbelerin fraksiyonu olarak hesaplandı. Doku skoru daha sonra (F-E)/(1-E) olarak hesaplandı ve 0 ile 1 arasında bir değer elde edildi (Şekil 3C). Kod, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, bir ışık darbesi ile kontraktilite zirvesinin başlangıcı arasındaki süreye dayanarak bir büzülmenin tetiklenip tetiklenmeyeceğini belirler. Bu otomatik, tarafsız yöntem, NMJ fonksiyonunun büyük örneklem boyutlarında ve zaman içinde tekrar tekrar karakterize edilmesini sağlar. Kod, doğru puanlamayı sağlamak için işlemden sonra ayarlanabilen ayarlanabilir parametreler içerir (Ek Şekil 2).

Sistemin zaman içinde NMJ fonksiyonunu kantitatif olarak karakterize etme yeteneği, 11 gün boyunca (motonöron tohumlamasından sonraki 9. günden 20. güne kadar) bir grup doku görüntülenerek gösterilmiştir. Sistem, dokulardaki NMJ fonksiyonunun iyileşmesini yakaladı ve doku imalatından 1 hafta sonra tetiklenen yanıtlarda bir artış gösterdi (Şekil 4A), ardından bir hafta daha stabil bir fonksiyon izledi (Şekil 4B). Kas stimülasyonunun NMJ'ler yoluyla gerçekleştiğini doğrulamak için, 20 dakikalık inkübasyondan önce ve sonra, asetilkolin reseptörlerine spesifik ve geri dönüşümsüz olarak bağlanan nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) 5 μg / mL ile başka bir doku grubu analiz edildi. BTX, tetiklenen ve spontan tüm kasılmaları durdurdu, NMJ fonksiyonunun tamamen bozulmasına neden oldu ve dokuların ışık stimülasyonunun fonksiyonel bir NMJ gerektirdiğini gösterdi (Şekil 4C, D). BTX'in seri dilüsyonları başlangıçta optimal BTX konsantrasyonunu tanımlamak için test edildi (sonuçlar gösterilmedi).

Sistemin translasyonel kapasitesini değerlendirmek için, beş myastenia gravis hastasından serum eklenmesinden önce ve sonra NMJ fonksiyonu değerlendirildi. 48 saat boyunca %20 MG serum ile tedavi edilen dokuların analizi, sağlıklı donörlerden serum ile tedavi edilen kontrol dokularına kıyasla fonksiyon bozukluğu göstermiştir (Şekil 4E,F). Tasarlanan NMJ'ler ayrıca serumun çıkarılmasından ve yıkanmasından 48 saat sonra tekrar değerlendirildi ve fonksiyonun geri kazanıldığını gösterdi (Şekil 4F). Ek olarak, artan hasta serumu konsantrasyonları ve normal insan serum kontrolü (% 5,% 20,% 40), doku fonksiyonunu etkileyen optimal konsantrasyonu belirlemek için test edildi. Sonuçlar, sistemin NMJ fonksiyonunu karakterize etme ve ölçme ve myastenia gravis'i in vitro olarak modelleme yeteneğini gösterdi.

Figure 1
Şekil 1. Deneysel tasarım ve zaman çizelgesi. Platformlara farklılaşma ve tohumlama zaman çizelgesi (günleri). SkM = iskelet kası, ChR2 = optogenetik motonöronlar, NMJ = nöromüsküler kavşak. Bu rakam Vila ve ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. 3D NMJ'lerin üretimi için ortak kültür sistemleri. (A) Mikroakışkan platformun şeması. (B) Açık kuyulu PDMS biyoreaktörünün şeması. (C) Mikroakışkan platformda doğuştan iskelet kası dokusu. (D) Açık kuyulu biyoreaktördeki iç doku. Ölçek çubuğu 0,5 mm. Bu rakam Vila ve ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. NMJ fonksiyonunun uyarılması, kaydedilmesi ve analizi. (A) LED kurulumunun ve ışık yolunun şeması. (B) Ters çevrilmiş mikroskop, canlı hücre odası, otomatik sahne ve sCMOS kamera ile optik kurulum. (C) NMJ kültürlerinin optik stimülasyon videolarının toplu işlenmesi için algoritma. (D) MATLAB kodu tarafından oluşturulan videonun temsili karesi ve ilgili kontraktilite izleme grafiği. Videodaki yanıp sönen mavi kutu ve grafikteki dikey çizgiler, mavi ışık uyarımının ne zaman gerçekleştiğini gösterir. Bu rakam Vila ve ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. NMJ işlevi. (A) 3D mühendislik ürünü insan NMJ'leri için kontraktilite izlemesi. (B) NMJ'lerin ışığa tepki olarak skoru, 11 gün boyunca fonksiyonun iyileşmesini gösteren skor (n = 47, tek yönlü ANOVA p = 1 x 10-8). Hata çubukları = SEM. (C) 5 mg / mL nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) ile 20 dakikalık tedaviden sonra kontraktilite izi. (D) BTX ile tedaviden önce ve sonra NMJ fonksiyonunun (skor) nicelleştirilmesi (n = 6; tek yönlü ANOVA F = 9 x 10-8). (E) 48 saatlik tedaviden sonra %20 MG serumlu dokuların kontraktilitesi izi. (F) Tedavi öncesi ve sonrası ve sonrası tedavi ve kontrol grupları için NMJ fonksiyon değerlendirmesi (n = 12; tedaviden sonra post-hoc ANOVA F = 0.0002; *p = 0.0015 **p = 3.5 x10−6'yı gösterir) (MG = Myastenia Gravis; NHS = normal insan serumu). n, biyolojik replikasyonların sayısını gösterir. Bu rakam Vila ve ark.18,19'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Miyojenik ve nöral ortam formülasyonları. Medya için büyüme faktörlerinin ve takviyelerinin organize listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2. MATLAB işlevlerinin listesi. Görüntü analizi için kullanılan MATLAB fonksiyonlarının kısa açıklamaları. Bu tablo Vila ve ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosyalar

Ek Şekil 1. Miyotüp ve motonöron farklılaşmaları. (A) Miyotüp farklılaşma protokolü (MM = olgunlaşma ortamı). (B) Diferansiye miyotüplerde iskelet kası belirteçleri miyozin ağır zinciri (MHC), α-aktinin ve desmin ekspresyonunu gösteren immünofloresan (IF) görüntüleri. (C) Motonöron farklılaşma protokolü. (D) Optogenetik iPSC'lerde ve (E) MN'lerde kanalrodopsin-2'nin YFP (ChR2-YFP) ile membrana lokalizasyonu başarılı enfeksiyonu doğrular. (F) Kolin asetiltransferaz (ChAT, kırmızı) ve ChR2'nin (yeşil) optogenetik MN'lerde birlikte ekspresyonu. Ölçek çubukları 100 μm. Vila ve ark.18'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2. Parametrelerin ayarlanmasını gerektiren yanlış işleme. (A) Yanlış taban çizgisi zamanı, yanlış şekilde zirvelere neden olur. (B) Çok yüksek bir tepe eşiği, zirvelerin tespit edilmemesine neden olur. (C) Minimanın algılanması için çok yumuşak koşullar (yani, minMinProminence ve / veya minMinWidth için seçilen çok düşük değerler), minimanın zirvelerin ortasında veya hatta üstünde etiketlenmesine neden olur, bu nedenle önceki ışık darbesinden çok uzakta başladıkları için "tetiklenmemiş" olarak sayılırlar. (D) Minimumun tespiti için çok katı koşullar, bu örnekte olduğu gibi, zirvenin ışık darbesinden önce etiketlenmesine veya hatta eksik olmasına neden olur. Vila ve ark.18'in izniyle çoğaltılmıştır. PDMS kullanarak biyoreaktör üretimi için kalıplar yapmak üzere düzenlenebilen ve dışa aktarılabilen biyoreaktör platformunun 3D modelini gösteren dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Ek CAD Dosyası. PDMS kullanarak biyoreaktör üretimi için kalıplar yapmak üzere düzenlenebilen ve dışa aktarılabilen biyoreaktör platformunun 3D modelini gösteren dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu sistem, NMJ fonksiyonunun otomatik ve tarafsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için optogenetik ve video işlemeyi birleştiren tasarlanmış bir 3D insan dokusu modelidir. Standartlaştırılmış bir protokol kullanarak, fizyolojik gelişim sırasında NMJ fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme ve nörotoksin maruziyeti ve myastenia gravis hasta serumları gibi patolojilerin zararlı etkilerini karakterize etme yeteneğini gösterdik.

Önceki çalışmalar, MG hastası sera22 kullanılarak iskelet miyotüpleri ile ko-kültürde optogenetik hPSC türevi motonöronlarla MG'yi modelleme yeteneğini bildirmiştir. Bununla birlikte, sistem 2B'deydi ve rastgele konumlarda kasılmalar kaydetti, böylece tekrarlanabilirliği sınırladı ve modelin nicel yeteneğini azalttı. Sistemimizin en büyük avantajlarından biri, bir 2D sisteme kıyasla, MN'ler ve SkM'ler arasındaki hücresel ve morfolojik gelişimi daha doğru bir şekilde kolaylaştıran 3D ortamı taklit etmemize izin vermesidir. Bir dokunun doğal fizyolojisi gibi davranması için gereken biyomekanik ipuçlarının bir 3D sistemde13,14,15,16 üstün bir şekilde taklit edildiğini destekleyen büyük kanıtlar vardır. Ek olarak, 3D sistemin çeşitli yönleri daha kontrollü bir ortama izin verir: yönlendirilmiş sinaps oluşumu, örnekler arasında daha az heterojenlik, optogenetik yoluyla stimülasyonun mekansal-zamansal kontrolünün artması ve her numunenin analizinin öznelliğini azaltan otomatik bir yüksek verimli sistem.

Geliştirilen sistem, amiyotrofik lateral skleroz (ALS), Duchenne musküler distrofisi (DMD) ve diğerleri gibi diğer nöromüsküler hastalıkları (NMD'ler) modellemek için kullanılabilir. ALS patofizyolojisi, nöromüsküler bileşke17,27'den ziyade motor nöronun kendisinin işlev bozukluğunu içermesine rağmen, sistemimiz nöron dejenerasyonu veya hasarından sonra azalmış kas kasılması göstererek ALS hastalık durumunu özetleme yeteneğine sahiptir. DMD, distrofin proteini eksikliğinden kaynaklanan, kas güçsüzlüğüne ve nihayetinde dejenerasyona yol açan kas dejeneratif bir hastalıktır28. Sistem, bir distrofin inhibitörü taşıyan genetik olarak tasarlanmış iskelet kasını veya distrofin içermeyen hastalıklı kas hücrelerini dahil ederek DMD'yi modelleyebilir. Genel olarak, sistem çeşitli NMD'leri in vitro 3D platformda özetleme esnekliğine ve gücüne sahiptir.

Her biri belirli akıcılık seviyelerine sahip çeşitli hücre kaynakları gerektiren bir protokol için, en kritik yönlerden biri zamanlamadır. Primer iskelet kası hücrelerinin genişlemesi sırasında, füzyon nedeniyle çok fazla kaynaşmalarına (% 65-70) izin vermemek önemlidir. Bazen, kümeleri parçalamak için tripsin kullanırken bile, bunun biyoreaktörlere daha az etkili tohumlama anlamına geldiği gözlenmiştir. Bir diğer kritik husus ise açık kuyulu biyoreaktör platformu üretimidir. PDMS platformları arasında homojenliği artırmak için, platform sütunlarının mekanik özelliklerinde herhangi bir dalgalanmayı önlemek için fırında geçirdikleri süre tüm platformlarda eşit tutulmalıdır. Ek olarak, kas hücrelerinin reaktörlere tohumlanması sırasında, tohumlama yoğunluğunun tutarlılığını korumak için, tüpün biyoreaktörler içindeki her iki ila üç bölme arasında yavaşça (1-1.5 s) vorteks yapması mantıklıdır. Son olarak, NMJ gelişimi için başarı oranının büyük ölçüde motonöron tohumlamasının başarısına bağlı olduğu görülmüştür, çünkü nörosferlerin eklenmesi çok hassastır ve kişiden kişiye değişir. Tohumlama uygulamasıyla, başarı oranı artar ve başlatılan kültürlerin yaklaşık% 90'ının uyarılmasına ve görüntülenmesine izin verir.

Şu anda, yakın gelecekte ele alınabilecek bazı sınırlamalar, tartışılan ChR2 dışındaki optogenetik proteinlerin dahil edilmesi ve doğrulanmasıdır. Voltaj / kalsiyum görüntüleme veya kas metabolizması için hem hücre tipleri hem de optogenetik sensörler üzerinde spesifik kontrol, daha fazla okuma ve analiz için sisteme eklenebilir. Mavi ışık yüksek dozlarda fototoksisiteyi indüklediğinden, stimülasyon rejimi 30 s ile sınırlıydı. Bu etki, daha uzun süreli stimülasyon çalışmaları için kırmızıya kaymış bir kanalrodopsin dahil edilerek iyileştirilebilir. Ek olarak, modelin gelecekteki yinelemelerinde geliştirilebilecek bir başka sınırlama, Schwann hücreleri gibi nöronal destekleyici hücrelerin eksikliğidir. Bununla birlikte, bu platformun ve analiz kodunun çok yönlülüğü, çeşitli optogenetik yapıların ve hücre tiplerinin dahil edilmesine izin verir. ChR2-hiPSC hattımız CRISPR kullanılarak oluşturulurken, hiPSC'lere optogenetik bir yanıt uygulamak için başka yöntemler de kullanılabilir. Ayrıca, hiPSC'lerin uyarlanabilirliği ile NMJ modeli tek bir hücre kaynağından geliştirilebilir ve nöromüsküler hastalıkları daha fazla incelemek için hastaya özgü modellerin kullanılmasına izin verir18.

Bu platform, zaman içinde insan NMJ fonksiyonunun tekrarlanan, otomatik ve tarafsız analizini sağlar ve nörotoksinler veya MG hasta serumu gibi dış efektörler nedeniyle fonksiyondaki ölçülebilir değişiklikleri tespit edebilir. Genel olarak, 3D sistemimiz, hastalık patolojisinin başlarında insan NMJ fonksiyonunun araştırılmasına izin verir, ilaç taraması için fırsat sağlar ve hassas tıbbı ilerletmek için sağlam bir sistemin temelini atar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

NIH [hibe numaraları EB025765 ve EB027062], DOD [ödül numarası W81XWH-18-1-0095] ve UCSF Mühendislik Yoluyla Sağlık İnovasyonu (HIVE Bursu) tarafından sağlanan finansman desteğini minnetle kabul ediyoruz. Columbia Üniversitesi Kök Hücre Çekirdeğine, hücre yeniden programlamadaki yardımları ve rehberlikleri için minnetle teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Biyomühendislik Sayı 182
İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter