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Bioengineering

Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Descrevemos um sistema de imagem reprodutível, automatizado e imparcial para caracterizar a função de junção neuromuscular usando tecido muscular esquelético projetado por humanos e motoneurons optogenéticos. Este sistema permite a quantificação funcional da conectividade neuromuscular ao longo do tempo e detecta a função neuromuscular diminuída causada por neurotoxinas e soro do paciente myasthenia gravis.

Abstract

Muitas doenças neuromusculares, como a miasthenia gravis (MG), estão associadas à disfunção da junção neuromuscular (NMJ), difícil de caracterizar em modelos animais devido a diferenças fisiológicas entre animais e humanos. A engenharia de tecidos oferece oportunidades para fornecer modelos in vitro de NMJs humanos funcionais que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Ao incorporar proteínas optogenéticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), geramos neurônios que podem ser estimulados com comprimentos de onda específicos de luz. Se o NMJ estiver saudável e funcional, um sinal neuroquímico do motoneuron resulta em contração muscular. Através da integração da optogenética e microfabagem com a engenharia de tecidos, estabelecemos uma metodologia imparcial e automatizada para caracterização da função NMJ utilizando análise de vídeo. Foi desenvolvido um protocolo padronizado para formação de NMJ, estimulação óptica com gravação simultânea de vídeo e análise de vídeo da contratude tecidual. A estimulação de motoneurons optogenéticos pela luz para induzir contrações musculares esqueléticas recapitula a fisiologia do NMJ humano e permite medições funcionais repetidas de NMJ ao longo do tempo e em resposta a várias entradas. Demonstramos a capacidade desta plataforma de mostrar melhorias funcionais na conectividade neuromuscular ao longo do tempo e caracterizar os efeitos nocivos dos anticorpos do paciente MG ou neurotoxinas na função NMJ.

Introduction

A junção neuromuscular (NMJ) é a sinapse química entre motoneurons (MNs) e células musculares esqueléticas (TLM) que permite contração muscular. Toxinas, como neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), ou doenças neuromusculares (DNM) como a miasthenia gravis (MG) podem levar à degeneração do NMJ e reduções no controle muscular1. Modelos de tecido humano bioengenharia melhor recapituam melhor os mecanismos funcionais e fisiológicos dos NMJs humanos e oferecem maior potencial translacional do que os modelos animais.

Embora os modelos animais tenham avançado o entendimento da formação e função do NMJ, há diferenças significativas entre sinapses humanas e animais que limitam a tradução dos resultados para humanos e fazem com que a caracterização in vivo do NMJ desafie 2,3,4. Estudos têm mostrado diferenças fisiológicas distintas entre NMJs de camundongos e humanos. Os ratos têm NMJs maiores e densidades de zonas ativas menores quando comparados aos NMJshumanos 4. Além disso, estudos medicamentosos realizados em modelos animais nem sempre refletem os efeitos encontrados em ensaios clínicos em humanos. Modelos de tecido humano projetados proporcionam a oportunidade de estudar o desenvolvimento saudável do NMJ e a patologia das doenças neuromusculares e permitir a triagem de medicamentos. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs)5 podem ser diferenciadas em uma variedade de tipos de células, incluindo células musculares esqueléticas 6,7 e motoneurons 8,9. hiPSCs podem ser gerados facilmente a partir de células do paciente, permitindo uma melhor modelagem da doença10 e triagem de medicamentos11,12 através de modelos de tecido específicos do paciente.

As co-culturas monocamadas bidimensionais (2D) de SkMs e MNs carecem da morfologia, fenótipo, organização e comportamento funcional de NMJs fisiológicos. Os NMJs formam aleatoriamente na cultura 2D, o que inibe o isolamento de unidades motoras para análise, limita medições funcionais precisas e impede seu uso para experimentos repetidos e sistemáticos13 . Modelos tridimensionais (3D) de tecidos de NMJs superam muitas dessas limitações, recapitulando as características morfológicas e funcionais dos NMJs fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, os dois tipos de tecidos são desenvolvidos separadamente e depois integrados direcionando o crescimento axonal, permitindo que NMJs mais organizados se desenvolvam em comparação com sistemas de cultura 2D.

Nosso estudo anterior demonstrou que a combinação da optogenética com a engenharia de tecidos pode permitir uma estimulação e avaliação precisas não invasivas da função NMJ18,19. Através da engenharia genética, proteínas sensíveis à luz podem ser integradas ao genoma dos hiPSCs. A integração do canalrhodopsin-2 (ChR2), um canal de íons que se abre em resposta à luz azul, na membrana de células excitáveis, como neurônios, permite o controle espostetemporal não-contato sobre a ativaçãocelular 20,21,22. hiPSCs portadores de ChR2 podem ser diferenciados em motoneurons optogenéticos sensíveis à luz azul, removendo a necessidade de eletrodos invasivos típicos que estimulam neurônios e evitando estimulação indesejada das células musculares por eletrodos23. Este sistema usa motoneurons optogenéticos para estimular contrações em células musculares esqueléticas não optogenéticas. A combinação de aquisição de vídeo e iluminação de luz azul controlada permite que os tecidos co-cultivados sejam simultaneamente estimulados e gravados para a função NMJ.

MG é causada por autoanticorpos direcionados aos receptores de acetilcolina nicotínica (AChR), o que resulta na diminuição da função NMJ e fraqueza muscular24. É diagnosticado com base em sintomas apresentados, eletrodiagnósmo e detecção de autoanticorpos através de exames de sangue sorológicos. No entanto, nem todos os autoanticorpos envolvidos em MG foram identificados, e alguns pacientes seronegativos são diagnosticados com MG, mas sem anticorpos reconhecidos25,26. Nosso sistema permite uma avaliação funcional repetida do NMJ antes e depois da adição de soro de pacientes de MG, fornecendo uma visão inestimável das alterações funcionais e bioquímicas causadas pelos anticorposMG 18. Nosso protocolo ilustra como produzir modelos in vitro 3D de NMJ humano funcional que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Demonstramos a versatilidade do sistema em duas plataformas, um dispositivo microfluido e uma plataforma bioreatorial de poço aberto maior.

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Protocol

Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA.

1. Preparação do bioreator

  1. Faça moldes bioreatores
    1. Baixe um arquivo CAD bioreator do Arquivo CAD Suplementar ou crie um design próprio personalizado.
    2. Gere um caminho de ferramentas CNC a partir do modelo 3D usando o software CAM.
    3. Moldes acetal da máquina usando uma máquina de fresagem CNC.
  2. Fabricação de bioreatores
    1. Misture uma base de 10:1 para curar a mistura de agente de polidimtilsiloxano (PDMS, 77 g de mistura por 4 plataformas/moldes).
    2. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo, feche todas as válvulas, ligue o vácuo e desaprova a mistura por pelo menos 30 minutos até que não permaneçam bolhas de ar. Despeje a mistura em moldes e desafose os moldes na câmara de vácuo por 1h.
    3. Feche os moldes com a metade superior do molde na orientação correta. Coloque uma haste hexagonal de aço sobre o centro e aperte em ambos os lados.
    4. Reabastecer a parte superior com PDMS.
    5. Cure os moldes em um forno de 65 °C por pelo menos 4 h.
    6. Remova as plataformas dos moldes depois de esfriar até a temperatura ambiente.
    7. Limpe os dispositivos em um banho ultrassônico usando ciclos de 1h de sabão de prato, 400 mL de isopropanol 100% isopropanol e água destilada.
    8. Seque durante a noite a 65 °C.
    9. Mergulhe as tampas de vidro em poliol surfactante noniônico de 1% por 30 minutos, e certifique-se de que as tampas não empilham para que todas estejam devidamente revestidas.
    10. Enxágüe bem com água destilada e seque durante a noite a 65 °C.
    11. Use um limpador de plasma no alto com 6 L/min de oxigênio durante 1-2 min para as tampas de vidro e plataforma PDMS. Uma vez tratado, unindo os dois pressionando o PDMS para baixo na tampa por pelo menos 30 s.
    12. Autoclave os dispositivos ligados antes de adicionar células.

2. Construindo uma configuração de estimulação óptica

  1. Usando um sistema de cubos de gaiola de 30 mm, conecte um espelhodicróico de 573 nm no centro. Junte um LED vermelho de 627 nm com um filtro de excitação de passagem longa de 594 nm e conecte-o na parte superior do cubo, com o LED voltado para o espelho. Em seguida, conecte um LED azul de 488 nm com um filtro de excitação de passe curto de 546 nm ao lado adjacente do cubo, com o LED voltado para o espelho como mostrado no esquema na Figura 3A.
  2. Conecte um diafragma de íris acionado a anel ao fundo do cubo da gaiola para controlar o tamanho da área iluminada.
  3. Ligue cada LED por um driver LED T-Cube e controle através de uma placa Arduino Uno Rev3. Conecte a entrada lateral do driver LED a um plugue de fonte de alimentação, conecte a saída média ao Arduino e conecte a saída lateral diretamente aos LEDs.
  4. Conecte o Arduino Uno a um PC por um cabo USB.
  5. Baixe arquivos do link do GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Abra o arquivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" da pasta GitHub.
  7. Definir parâmetros de partida: Passos = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulsoLength = 100.
  8. Certifique-se de que a saída do pino 4 seja atribuída ao driver LED Azul e a saída do pino 2 seja atribuída ao driver LED vermelho. Verifique se os fios médios do driver LED estão conectados ao solo e à respectiva saída do pino.
  9. Compilar e carregar o programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" para Arduino.
  10. Conecte cada driver LED ao canal correspondente.

3. Configuração da cultura celular (dia -21-0)

  1. Células musculares esqueléticas primárias
    1. Descongele e expanda os myoblasts esqueléticos primários (obtidos de Cook Myosite) para um máximo de seis passagens usando meio de crescimento miotônico (+ suplemento). Manter as células em uma incubadora definidas a 37 °C e 5% de CO2.
    2. Mude a mídia a cada 2 dias.
    3. Uma vez que as células são cerca de 60% confluentes, passá-las usando 0,05% Trypsin-EDTA (1x, por 5 min a 37 °C). Colete as células dissociadas e adicione mídia fresca para neutralizar a trippsina.
    4. Gire as células a 300 x g e aspire o supernatante acima da pelota celular.
    5. Resuspenque as células com MGM e sementes 1:3 com 60 mL por frasco de camada tripla.
  2. ChR2-hiPSC
    NOTA: Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA. Neste protocolo, os hiPSCs expressos chr2 foram gerados através da edição do genoma CRISPR-Cas9 usando métodos descritos anteriormente18, mas quaisquer linhas celulares optogenéticas estáveis (lentiviral, piggyBac, etc.) podem ser usadas da mesma forma. Foram escolhidos promotores constitutivos expressos tanto em iPSCs quanto em motoneurons (CAG). Verificou-se que as células possuem karyótipo saudável, conforme observado em publicações anteriores18,19.
    1. Cubra placas de 6 poços com 1 mL/poço de matriz de membrana de porão solubilizada diluída em DMEM/F12 (1:80) e incubar as placas em temperatura ambiente por 1h.
    2. IPSCs de sementes em placas revestidas de 6 poços com 2 mL de meio de cultura celular sem alimentador (mídia iPSC), trocando 2 mL de mídia a cada dois dias e passeando a cada 5-7 dias. Manter as células em uma incubadora definidas para 37°C e 5% de CO2.
    3. Passaging
      1. Dissociar as células-tronco incubando com 1 mL de células-tronco livres de enzimas liberando reagente por 4 min e cisalhamento mecanicamente com uma pipeta P1000 de ponta larga.
      2. Células de sementes em uma proporção de 1:24 ou 1:48 em mídia iPSC com 2 μM de dihidrocloide Y-27632 em 2 mL/bem em placas revestidas de 6 poços.

4. Semeadura do tecido muscular esquelético (dia -3)

  1. Isole e conte 30 x 106 myoblasts usando um contador automático de células.
  2. Resuspenda os míbios em uma mistura de 4:1 de 3 mg/mL de colágeno I e matriz de membrana de porão solubilizada (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de matriz de membrana de porão para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizador que acompanha (mistura 9:1 de colágeno para agente neutralizante) e diluir a mistura com 1x PBS para atingir um volume de 800 μL.
  3. Adicione 15 μL de suspensão de colágeno celular a cada câmara muscular do bioreator, sendo certo que espalhará a suspensão em ambos os pilares usando a ponta pipeta (Figura 2).
  4. Deixe a mistura de gel celular polimerizar a 37 °C por 30 min e depois encha bem cada bioreator com 450 μL de mídia de crescimento miotônico.
  5. Depois de 3 dias (uma vez que o gel tenha compactado), comece a diferenciação do miotube.

5. Diferenciação do Myotube (dias 0-14)

  1. Inicie a infusão do miotube mudando os tecidos para 450 μL de mídia indutora de fusão (FS, Tabela 1) por 7 dias, mudando a mídia a cada dois dias.
    NOTA: Tente iniciar a diferenciação do miotube no mesmo dia da diferenciação do motoneuron dos hiPSCs, a fim de seear motoneurons no final dos horários de diferenciação de ambos os tipos de células.
  2. No dia 7, mude a mídia para 450 μL de mídia de maturação Ia (MMIa, Tabela 1).
  3. No dia 9, mude para 450 μL de mídia de maturação Ib (MMIb, Tabela 1).
  4. No dia 11, mude a mídia para 450 μL de NbActiv4. Continue mudando a mídia a cada 2 dias até que os motoneurons sejam semeados (Passo 7).

6. Diferenciação de Motoneuron (dias 0-14)

NOTA: Nosso protocolo de diferenciação de motoneuron foi adaptado de Maury et al8.

  1. No dia 0, transfira 4 x 106 ChR2- hiPSCs para uma placa Petri de ligação ultra-baixa com 15 mL de meio de cultura de suspensão de motoneuron (MSCM, Tabela 1). Suplemento MSCM com 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidratado e 5 μM Y-27632 dihidrocloide.
  2. No dia 2, isole as neurosferas (NS) com um coador reversível de 37 μM e relate em 15 mL de MSCM com 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidratado e 0,1 μM ácido retinóico. NS deve ser visível na placa de Petri sem usar um microscópio após o dia 2.
  3. No dia 4, transfira as células e a mídia para um tubo de 50 mL e permita que as neuroesferas se acomodem até o fundo (5 min). Aspire o supernasciente e resuspense as células em 15 mL de MSCM suplementado com 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e ácido retinóico de 0,1 μM.
  4. No dia 7, repita o passo 6.3. mas resuspensar as células em 15 mL de MSCM suplementadas com 0,5 μM SAG e ácido retinóico de 0,1μM.
  5. No dia 9, repita o passo 6.3. mas células resuspend em 15 mL de MSCM suplementadas com 10 μM DAPT.
  6. No dia 11, repita o passo 6.3. mas resuspensar as células em 15 mL de MSCM complementadas com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
  7. No dia 14, semeou os motoneurons na plataforma.

7. A semeadura de motoneurons agrega em bioreator (dia 14)

  1. Prepare uma mistura de gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I e Matrigel (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de Matrigel para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizante que acompanha (9:1 mistura de colágeno para agente neutralizante) e dilua a mistura com 1x PBS para alcançar um volume final de 800 μL.
  2. Use um coador de células de 400 nm para selecionar grandes neuroesferas e resuspensá-las na mistura de gel.
  3. Aspirar a mídia do reservatório e cuidadosamente do poço neurosfera (Figura 2).
  4. Adicione 15 μL de mistura de gel no canal da neurosfera.
  5. Carregue uma pipeta de 10 μL com 10 μL de gel e, em seguida, escolha uma neurosfera.
  6. Deposite o NS no canal da neurosfera e certifique-se de que o NS está na câmara. Levante lentamente a pipeta enquanto libera o gel restante assim que o NS for depositado. Se não tiver certeza de que o NS foi corretamente depositado, verifique sua localização usando um microscópio.
  7. Deixe o gel polimerizar por 30 min a 37 °C.
  8. Adicione 450 μL de NbActiv4 complementado com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF aos reservatórios.
  9. Mude a mídia dia sim, dia não para permitir o crescimento axonal da NS para o tecido muscular.

8. Estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo da função NMJ (dia 24+)

  1. Para imagem, use um microscópio fluorescente invertido com uma câmera científica complementar de metal-óxido-semicondutor (sCMOS).
  2. Ajuste o software da câmera binning para 2x2, exposição a 20 ms, obturador de rolamento ON, taxa de leitura para 540 MHz, alcance dinâmico: 12 bits & gain 1, e modo sensor: sobreposição.
  3. Use 2x objetivo no microscópio para imagem dos microtissues.
  4. Conecte uma câmara de célula viva (37 °C, 5% CO2) ao estágio do microscópio.
  5. Selecione a região de interesse (ROI) que contém o tecido de tecidos esqueléticos inervados para minimizar o tamanho do arquivo e o tempo de processamento.
  6. Coloque um filtro de emissão de passo longo de 594 nm entre a amostra e o objetivo de imagem para filtrar pulsos de luz azul da câmera.
  7. Coloque uma placa retangular de 4 poços contendo 4 bioreatores (24 tecidos) na câmara de células vivas.
  8. Clique em Live View. Centralizar e focar a imagem com o ROI desejado.
  9. Carregue o código macro personalizado da pasta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar a posição do palco, a placa Arduino e a aquisição de vídeo.
  10. Definir filme de saída como: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Execute o código macro com as coordenadas X,Y desejadas definidas no palco e adquira um lapso de tempo rápido com 1700 quadros a 50 quadros/s.
  12. Substitua a mídia após a imagem e devolva as amostras para a incubadora. Permita pelo menos 24 horas entre as sessões de aquisição de imagens para evitar a fadiga tecidual.

9. Processamento e análise em lote (dia 24+)

  1. Processamento de filmes
    1. Use o código MATLAB personalizado para processar os vídeos em análise em lote. Os arquivos podem ser baixados da pasta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). As funções estão listadas e explicadas na Tabela 2.
      NOTA: O código é compatível com formatos .nd2 e .czi. Requer processamento paralelo para ser ativado no MATLAB e precisa do pacote bioformats.
    2. Execute o script REcursiveOSAnalysis para analisar os filmes através de processamento paralelo. Tenha todos os vídeos adquiridos na mesma pasta e selecione essa pasta ao executar o código.
    3. Ajuste os parâmetros pós-análise conforme necessário.
      1. Altere a linha de baseTime (opção 1) se a contração espontânea for captada no início da gravação. Isso mostrará uma leitura inicial muito acima de 0 e precisará que o quadro seja deslocado para compensar.
      2. Alterar picoStensão (opção 2) se as contrações não estiverem sendo registradas. O código detectará contrações acima de 25% do pico mais alto por padrão para que esse valor possa ser alterado.
      3. Altere minMinProminence e minMinWidth para ajustar a sensibilidade ao detectar o início de cada pico.
    4. Gerar saída de vídeo e gráfico.
      1. Execute o OSMOvie recursivo para gerar um arquivo de vídeo para cada tecido com seu respectivo traço de contralução.

10. Perturbação da função NMJ (dia 24+)

  1. Prepare a mídia de tratamento adicionando efeito externo à mídia basal NbActiv4 complementada com 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
    1. Para o experimento de soro mg, utilize 20% mg paciente sera em NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Para o experimento BTX, use 5 μg/mL BTX em NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Estimular/imagem usando o Passo 3.2. para gravar a linha de base.
  3. Substitua a mídia em tecidos por mídia de tratamento (450 μL/tecido).
  4. Incubar pelo tempo desejado (48 h para sera paciente, 20 min para BTX).
  5. Estimule/imagem novamente usando o Passo 3.2. para registrar função após o tratamento.
  6. Remova a mídia de tratamento e deixe os tecidos descansarem pelo tempo desejado (48 h após a remoção da soro)
    NOTA: Permitir pelo menos 24 h entre estimulação e imagem para evitar fadiga tecidual

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Representative Results

As junções neuromusculares foram geradas por motoneurons optogenéticos derivados do hiPSC com tecido muscular esquelético não optogenético. Myoblasts esqueléticos primários humanos (SkM) foram semeados nas plataformas e diferenciados em mosbos multinucleados usando o protocolo de 2 semanas. Os motoneurons optogenéticos foram diferenciados separadamente, mas em paralelo com a diferenciação do miotube, e depois semeados na plataforma (Figura 1). Os tecidos começaram a se contrair em resposta à estimulação da luz azul 7-12 dias após a semeadura da MN, indicando o desenvolvimento bem-sucedido e o amadurecimento dos NMJs. Os NMJs podem ser cultivados, estimulados e imagens por até 40 dias após a semeadura do motoneuron, mas o ponto de tempo ideal ocorre no dia 1619. A validação morfológica e bioquímica das diferenciações e presença das proteínas optogenéticas são mostradas na Figura Suplementar 1 e foram validadas em estudos anteriores18,19.

Para demonstrar que o protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes sistemas de cultura, a estratégia foi testada usando dois reatores compartimentalizados diferentes: um dispositivo microfluido e um bioreator de poço aberto. Ambos os sistemas têm um design semelhante, com uma câmara fornecida com pilares para a geração de tecidos musculares esqueléticos e uma segunda câmara para a cultura de agregados de motoneuron 3D que podem estender axônios para inervar os tecidos esqueléticos (Figura 2A,B). No entanto, os dois sistemas possuem escalas diferentes, com o dispositivo microfluido produzindo tecidos musculares esqueléticos de 1 mm de comprimento, compreendendo aproximadamente 20.000 míobios (Figura 2C) e o sistema bioreator de poço aberto resultando em tecidos musculares longos de 4 mm, compreendendo aproximadamente 450.000 míobios (Figura 2D).

Para permitir a estimulação controlada dos NMJs optogenéticos, foi construída uma configuração óptica, composta por um LED vermelho de 637 nm para iluminação de campo brilhante, um LED azul de 488 nm para ativação de ChR2-MNs e um filtro de luz azul entre a amostra de tecido e objetivo de evitar que a luz azul interfira na análise da imagem (Figura 3A). Os LEDs eram alimentados por drivers de LED e controlados precisamente através de um microprocessador Arduino. A função NMJ foi avaliada pela aquisição simultânea de vídeos de lapso de tempo enquanto estimulava MNs com luz azul usando um macro-script de microscópio personalizado emparelhado com o código Arduino (Figura 3B). O protocolo aumentou a frequência de estimulação de 0,2 Hz para 2 Hz em 30 etapas. Uma vez adquiridos os filmes, a função tecidual foi analisada utilizando um pacote MATLAB personalizado (Figura 3C). A análise mediu o deslocamento do tecido, gerou um traço de contrailidade e o sincronizou com o protocolo de estimulação da luz. Em seguida, determinou a fração de pulsos eficazes (F) e uma fração esperada de pulsos eficazes (E) para explicar possíveis contrações não estimuladas. A fração esperada (E) foi calculada como a fração de pulsos que seriam rotulados como eficazes se as contrações fossem distribuídas aleatoriamente dentro dos anos 30. O escore tecidual foi então calculado como (F-E)/(1-E), com um valor entre 0 e 1 (Figura 3C). O código determina se uma contração é desencadeada com base no tempo entre um pulso de luz e o início do pico de contração, como mostrado na Figura 3D. Este método automatizado e imparcial permite a caracterização repetida da função NMJ em grandes tamanhos de amostra e ao longo do tempo. O código inclui parâmetros tunable que podem ser ajustados após o processamento para garantir a pontuação correta (Figura Suplementar 2).

A capacidade do sistema de caracterizar quantitativamente a função NMJ ao longo do tempo foi demonstrada por meio de imagens de um grupo de tecidos por 11 dias (dia 9 a dia 20 após a semeadura do motoneuron). O sistema capturou a melhora da função NMJ nos tecidos, mostrando um aumento nas respostas desencadeadas 1 semana após a fabricação do tecido (Figura 4A), seguida por uma função estável por uma semana adicional (Figura 4B). Para verificar se a estimulação muscular ocorreu através dos NMJs, outro grupo de tecidos foi analisado antes e depois de 20 minutos de incubação com 5 μg/mL da neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), que se liga especificamente e irreversivelmente aos receptores de acetilcolina. O BTX parou todas as contrações desencadeadas e espontâneas, resultou em uma interrupção completa da função NMJ, e demonstrou que a estimulação leve dos tecidos requer um NMJ funcional (Figura 4C,D). Diluições seriais de BTX foram inicialmente testadas para identificar a concentração ótima de BTX (resultados não mostrados).

Para avaliar a capacidade translacional do sistema, a função NMJ foi avaliada antes e depois da adição de soro de cinco pacientes com myasthenia gravis. A análise dos tecidos tratados com soro mg de 20% por 48 h mostrou diminuição da função em relação aos tecidos de controle tratados com soro de doadores saudáveis (Figura 4E,F). Os NMJs projetados também foram avaliados novamente 48h após a remoção e lavagem do soro e mostraram recuperação da função (Figura 4F). Além disso, foram testadas concentrações crescentes de soro do paciente e controle normal do soro humano (5%, 20%, 40%) para identificar a concentração ideal que afetou a função tecidual. Os resultados mostraram a capacidade do sistema de caracterizar e quantificar a função NMJ e modelar miasthenia gravis in vitro.

Figure 1
Figura 1. Design experimental e cronograma. Linha do tempo (dias) de diferenciação e semeadura em plataformas. SkM = músculo esquelético, ChR2 = motoneurons optogenéticos, NMJ = junção neuromuscular. Este valor foi modificado com autorização da Vila et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Sistemas de cocultura para a geração de NMJs 3D. (A) Esquema da plataforma microfluidica. (B) Esquema do bioreator PDMS de poço aberto. (C) Tecido muscular esquelético inervado na plataforma microfluidica. (D) Tecido invatado no bioreator de poço aberto. Barra de escala 0,5 mm. Este valor foi modificado com autorização da Vila et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Estimulação, gravação e análise da função NMJ. (A) Esquema de configuração de LED e caminho de luz. (B) Configuração óptica com microscópio invertido, câmara de células vivas, estágio automatizado e câmera sCMOS. (C) Algoritmo para o processamento em lote de vídeos de estimulação óptica das culturas NMJ. (D) Quadro representativo do vídeo gerado pelo código MATLAB e pelo gráfico de traços de contractilidade correspondentes. A caixa azul piscando no vídeo e as linhas verticais no gráfico indicam quando ocorre a estimulação da luz azul. Este valor foi modificado com autorização da Vila et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Função NMJ. (A) Traço de contractilidade para NMJs humanos projetados em 3D. (B) Pontuação de NMJs em resposta à luz, mostrando melhora da função ao longo de 11 dias (n = 47, ANOVA p unidirecional = 1 x 10-8). Barras de erro = SEM. (C) Traço de contractilidade após 20 min de tratamento com 5 mg/mL da neurotoxina α-bungarotoxina (BTX). (D) Quantificação da função NMJ (escore) antes e depois do tratamento com BTX (n = 6; ANOVA F unidirecional = 9 x 10-8). (E) Traço de contractilidade de tecidos com soro de 20% MG após 48h de tratamento. (F) Avaliação da função NMJ para grupos tratados e de controle antes e depois do tratamento e pós-recuperação (n = 12; após o tratamento pós-hoc ANOVA F = 0,0002; *indica p = 0,0015 **indica p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS=soro humano normal). n indica o número de réplicas biológicas. Este valor foi modificado com autorização da Vila et al.18,19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mesa 1. Formulações miogênicas e neurais. Lista organizada de fatores de crescimento e suplementos para a mídia. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Mesa 2. Lista de funções MATLAB. Breves explicações das funções MATLAB utilizadas para análise de imagens. Esta tabela foi modificada com permissão da Vila et al.18. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivos Suplementares

Figura suplementar 1. Diferenciações de myotube e motoneuron. (A) Protocolo de diferenciação do Myotube (MM = mídia de maturação). (B) Imagens de imunofluorescência (IF) que mostram a expressão dos marcadores musculares esqueléticos myosin heavy chain (MHC), α-actinin e desmin em miotubes diferenciados. (C) Protocolo de diferenciação do Motoneuron. (D) Localização de channelrhodopsin-2 com YFP (ChR2-YFP) para membrana em iPSCs optogenéticas e (E) MNs confirmando infecção bem sucedida. (F) Co-expressão de acetiltransferase de colina (ChAT, vermelho) e ChR2 (verde) em MNs optogenéticas. Barras de escala 100 μm. Reproduzido com permissão de Vila et al.18. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2. Processamento incorreto que requer ajuste de parâmetros. (A) O tempo de linha de base incorreto resulta em picos da forma errada. (B) Um limiar de pico muito alto resulta em picos não detectados. (C) Condições muito brandas para a detecção de minima (ou seja, valores muito baixos escolhidos para minMinProminence e/ou minMinWidth) resultam em minima sendo rotulado no meio ou mesmo no topo dos picos, sendo assim contado como "inexerido" porque eles começam muito longe do pulso de luz anterior. (D) Condições muito rigorosas para a detecção de minima resultam no início do pico sendo rotulado antes do pulso de luz ou mesmo faltando, como neste exemplo. Reproduzido com permissão de Vila et al.18. Arquivo mostrando modelo 3D de plataforma bioreatorial que pode ser editado e exportado para fazer moldes para fabricação de bioreatores usando PDMS. Clique aqui para baixar este Arquivo.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Arquivo CAD suplementar. Arquivo mostrando modelo 3D de plataforma bioreatorial que pode ser editado e exportado para fazer moldes para fabricação de bioreatores usando PDMS. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Este sistema é um modelo de tecido humano 3D projetado que combina optogenética e processamento de vídeo para permitir uma avaliação automatizada e imparcial da função NMJ. Utilizando um protocolo padronizado, demonstramos a capacidade de medir mudanças na função NMJ durante o desenvolvimento fisiológico e caracterizar os efeitos nocivos de patologias como exposição a neurotoxinas e myasthenia gravis paciente sera.

Estudos anteriores relataram a capacidade de modelar MG com motoneurons optogenéticos derivados de hPSC em co-cultura com miótubos esqueléticos utilizando sera22 paciente de MG. No entanto, o sistema esteve em 2D e registrou contrações em locais aleatórios, limitando assim a reprodutibilidade e diminuindo a capacidade quantitativa do modelo. Uma das maiores vantagens do nosso sistema, em comparação com um sistema 2D, é que ele nos permite emular o ambiente 3D, o que facilita mais precisamente o desenvolvimento celular e morfológico entre MNs e SkMs. Há grandes evidências que sustentam que as pistas biomecânicas necessárias para que um tecido se comporte como sua fisiologia nativa são superiormente imitados em um sistema 3D 13,14,15,16. Além disso, vários aspectos do sistema 3D permitem um ambiente mais controlado: formação direcionada de sinapses, menor heterogeneidade entre amostras, aumento do controle espaço-temporal da estimulação via optogenética e um sistema automatizado de alta produtividade que diminui a subjetividade da análise de cada amostra.

O sistema desenvolvido pode ser usado para modelar outras doenças neuromusculares (DMDs), como esclerose lateral amiotrófica (ELA), distrofia muscular de Duchenne (DMD), entre outras. Embora a fisiopatologia da ALS envolva a disfunção do neurônio motor em si em vez da junção neuromuscular17,27, nosso sistema tem a capacidade de recapitular o estado da doença da ELA, mostrando contração muscular diminuída após degeneração ou dano do neurônio. DMD é uma doença degenerativa muscular causada pela falta de proteína de distrofina, que leva à fraqueza muscular e eventual degeneração28. O sistema poderia modelar DMD incorporando músculo esquelético geneticamente modificado que carrega um inibidor de distrofina ou células musculares doentes que não possuem distrofina. No geral, o sistema tem a flexibilidade e o poder de recapitular vários NMDs em uma plataforma 3D in vitro.

Para um protocolo que requer várias fontes de células, cada uma com níveis particulares de confluência, um dos aspectos mais críticos é o tempo. Durante a expansão das células musculares esqueléticas primárias, é importante não permitir que elas se tornem muito confluentes (65%-70%) devido à fusão. Às vezes, mesmo usando trippsina para quebrar os aglomerados, observa-se que isso se traduz em menor semeadura eficaz para os bioreatores. Outro aspecto crítico é a produção de plataformas bioreatoriais de poço aberto. A fim de aumentar a homogeneidade entre as plataformas PDMS, a quantidade de tempo que passam no forno deve ser mantida uniforme em todas as plataformas para evitar quaisquer flutuações nas propriedades mecânicas dos pilares da plataforma. Além disso, durante a semeadura das células musculares nos reatores, a fim de manter a consistência da densidade de semeadura, é sensato vórtice do tubo suavemente (1-1,5 s) entre cada dois ou três compartimentos dentro dos bioreatores. Por fim, a taxa de sucesso para o desenvolvimento do NMJ foi vista como dependente em grande parte do sucesso da semeadura de motoneuron, uma vez que a adição de neurosferas é tão delicada e varia de pessoa para pessoa. Com a prática de semeadura, a taxa de sucesso aumenta, permitindo que cerca de 90% das culturas iniciadas sejam estimuladas e imagens.

Atualmente, algumas limitações que poderiam ser abordadas em um futuro próximo são a incorporação e validação de proteínas optogenéticas diferentes das discutidas pelo ChR2. Um controle específico sobre os tipos de células e sensores optogenéticos para imagem de tensão/cálcio ou metabolismo muscular poderia ser adicionado ao sistema para maiores leituras e análises. Como a luz azul induz a fototoxicidade em altas doses, o regime de estimulação foi limitado a 30 s. Esse efeito pode ser amenizado incorporando uma canalrhodopsina deslocada para estudos de estimulação de maior duração. Além disso, outra limitação que poderia ser melhorada em iterações futuras do modelo é a falta de células de suporte neuronais como as células Schwann. A versatilidade desta plataforma e código de análise, no entanto, permite que uma variedade de construtos optogenéticos e tipos de células sejam incorporados. Enquanto nossa linha ChR2-hiPSC foi criada usando CRISPR, outros métodos poderiam ser usados para implementar uma resposta optogenética em hiPSCs. Além disso, com a adaptabilidade dos hiPSCs, o modelo NMJ pode ser desenvolvido a partir de uma única fonte celular, permitindo que modelos específicos do paciente sejam usados para estudar mais doenças neuromusculares18.

Esta plataforma fornece análises repetidas, automatizadas e imparcial da função NMJ humana ao longo do tempo e pode detectar alterações quantificáveis na função devido a efeitos externos, como neurotoxinas ou soro do paciente mg. No geral, nosso sistema 3D permite a investigação da função de NMJ humano no início da patologia da doença, fornece a oportunidade para o rastreamento de medicamentos, e estabelece as bases para um sistema robusto para avançar a medicina de precisão.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos o apoio ao financiamento do NIH [números de subvenção EB025765 e EB027062], doD [número de prêmio W81XWH-18-1-0095], e da UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos a ajuda e orientação do Núcleo de Células-Tronco da Universidade de Columbia por sua ajuda e orientação com a reprogramação celular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengenharia Edição 182
Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana
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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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