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Bioengineering

मानव न्यूरोमस्कुलर जंक्शन के ऑप्टोजेनेटिक मॉडल की इंजीनियरिंग और विशेषता

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

हम मानव इंजीनियर कंकाल की मांसपेशी ऊतक और ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स का उपयोग करके न्यूरोमस्कुलर जंक्शन फ़ंक्शन की विशेषता के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्वचालित और निष्पक्ष इमेजिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं। यह प्रणाली समय के साथ न्यूरोमस्कुलर कनेक्टिविटी के कार्यात्मक परिमाणीकरण की अनुमति देती है और न्यूरोटॉक्सिन और मायस्थेनिया ग्रेविस रोगी सीरम के कारण कम न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन का पता लगाती है।

Abstract

कई न्यूरोमस्कुलर रोग, जैसे कि मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी), न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) की शिथिलता से जुड़े होते हैं, जो जानवरों और मनुष्यों के बीच शारीरिक अंतर के कारण पशु मॉडल में चिह्नित करना मुश्किल है। ऊतक इंजीनियरिंग कार्यात्मक मानव एनएमजे के इन विट्रो मॉडल प्रदान करने के अवसर प्रदान करता है जिसका उपयोग एनएमजे विकृतियों का निदान और जांच करने और संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) में शामिल करके, हमने न्यूरॉन्स उत्पन्न किए जिन्हें प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजित किया जा सकता है। यदि एनएमजे स्वस्थ और कार्यात्मक है, तो मोटोन्यूरॉन से एक न्यूरोकेमिकल सिग्नल के परिणामस्वरूप मांसपेशियों का संकुचन होता है। ऊतक इंजीनियरिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन के एकीकरण के माध्यम से, हमने वीडियो विश्लेषण का उपयोग करके एनएमजे फ़ंक्शन की विशेषता के लिए एक निष्पक्ष और स्वचालित पद्धति स्थापित की। एनएमजे गठन, एक साथ वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टिकल उत्तेजना, और ऊतक संकुचन के वीडियो विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। कंकाल की मांसपेशियों के संकुचन को प्रेरित करने के लिए प्रकाश द्वारा ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स की उत्तेजना मानव एनएमजे शरीर विज्ञान को दोहराती है और समय के साथ और विभिन्न इनपुट के जवाब में एनएमजे के दोहराए गए कार्यात्मक माप की अनुमति देती है। हम समय के साथ न्यूरोमस्कुलर कनेक्टिविटी में कार्यात्मक सुधार दिखाने के लिए इस मंच की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं और एनएमजे फ़ंक्शन पर रोगी एमजी एंटीबॉडी या न्यूरोटॉक्सिन के हानिकारक प्रभावों को चिह्नित करते हैं।

Introduction

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) मोटोन्यूरॉन्स (एमएन) और कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसकेएम) के बीच रासायनिक सिनैप्स है जो मांसपेशियों के संकुचन की अनुमति देता है। विषाक्त पदार्थ, जैसे न्यूरोटॉक्सिन α-बंगारोटॉक्सिन (बीटीएक्स), या मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी) जैसे न्यूरोमस्कुलर रोग (एनएमडी) एनएमजे के अध: पतन और मांसपेशियों के नियंत्रण में कमी का कारण बन सकते हैं1. बायोइंजीनियर्ड मानव ऊतक मॉडल मानव एनएमजे के कार्यात्मक और शारीरिक तंत्र को बेहतर ढंग से दोहराते हैं और पशु मॉडल की तुलना में अधिक ट्रांसलेशनल क्षमता प्रदान करते हैं।

जबकि पशु मॉडल ने एनएमजे के गठन और कार्य की समझ को उन्नत किया है, मानव और पशु सिनैप्स के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं जो मनुष्यों को परिणामों के अनुवाद को सीमित करते हैं और एनएमजे के विवो लक्षण वर्णन में 2,3,4 को चुनौती देते हैं। अध्ययनों ने माउस और मानव एनएमजे के बीच अलग-अलग शारीरिक अंतर दिखाए हैं। मानव एनएमजेकी तुलना में चूहों में बड़े एनएमजे और छोटे सक्रिय क्षेत्र घनत्व होते हैं। इसके अतिरिक्त, पशु मॉडल में किए गए दवा अध्ययन हमेशा मानव नैदानिक परीक्षणों में पाए जाने वाले प्रभावों को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इंजीनियर मानव ऊतक मॉडल एनएमजे के स्वस्थ विकास और न्यूरोमस्कुलर रोगों की विकृति का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग की अनुमति देने का अवसर प्रदान करते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 5 को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें कंकाल की मांसपेशी कोशिकाएं 6,7 और मोटोन्यूरॉन्स 8,9 शामिल हैं। एचआईपीएससी को रोगी कोशिकाओं से आसानी से उत्पन्न किया जा सकता है, जिससे रोगी-विशिष्ट ऊतक मॉडल के माध्यम से बेहतर रोग मॉडलिंग10 और ड्रग स्क्रीनिंग 11,12 की अनुमति मिलती है।

एसकेएम और एमएन की द्वि-आयामी (2 डी) मोनोलेयर सह-संस्कृतियों में शारीरिक एनएमजे की आकृति विज्ञान, फेनोटाइप, संगठन और कार्यात्मक व्यवहार की कमी होती है एनएमजे बेतरतीब ढंग से 2 डी संस्कृति में बनते हैं, जो विश्लेषण के लिए मोटर इकाइयों के अलगाव को रोकता है, सटीक कार्यात्मक माप को सीमित करता है, और दोहराया, व्यवस्थित प्रयोगों के लिए उनके उपयोग को रोकताहै 13 . एनएमजे के त्रि-आयामी (3 डी) ऊतक मॉडल इन सीमाओं में से कई को दूर करते हैं, शारीरिक एनएमजे 7,14,15,16,17 की रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को दोहराते हैं। इस मॉडल का उपयोग करते हुए, दो ऊतक प्रकारों को अलग-अलग विकसित किया जाता है और फिर अक्षतंतु विकास को निर्देशित करके एकीकृत किया जाता है, जिससे 2 डी संस्कृति प्रणालियों की तुलना में अधिक संगठित एनएमजे विकसित हो सकते हैं।

हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि ऊतक इंजीनियरिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स के संयोजन से एनएमजे फ़ंक्शन18,19 के सटीक गैर-इनवेसिव उत्तेजना और मूल्यांकन की अनुमति मिल सकती है। जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से, प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन को एचआईपीएससी के जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है। चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) को एकीकृत करना, एक आयन चैनल जो नीली रोशनी के जवाब में खुलता है, न्यूरॉन्स जैसे उत्तेजक कोशिकाओं की झिल्ली में सेल सक्रियण20,21,22 पर गैर-संपर्क स्थानिक नियंत्रण की अनुमति देता है। सीएचआर 2 ले जाने वाले एचआईपीएससी को नीली रोशनी के प्रति संवेदनशील ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है, विशिष्ट इनवेसिव इलेक्ट्रोड की आवश्यकता को दूर करता है जो न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है और इलेक्ट्रोड23 द्वारा मांसपेशियों की कोशिकाओं की अवांछित उत्तेजना से बचता है। यह प्रणाली गैर-ऑप्टोजेनेटिक कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं में संकुचन को उत्तेजित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स का उपयोग करती है। वीडियो अधिग्रहण और नियंत्रित नीली रोशनी रोशनी के संयोजन से सह-सुसंस्कृत ऊतकों को एनएमजे फ़ंक्शन के लिए एक साथ उत्तेजित और रिकॉर्ड किया जा सकता है।

एमजी निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) को लक्षित करने वाले ऑटोएंटिबॉडी के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप एनएमजे फ़ंक्शन और मांसपेशियों की कमजोरी कम हो जातीहै 24. इसका निदान प्रस्तुत लक्षणों, इलेक्ट्रोडायग्नोसिस और सीरोलॉजिकल रक्त परीक्षणों के माध्यम से ऑटोएंटिबॉडी का पता लगाने के आधार पर किया जाता है। हालांकि, एमजी में शामिल सभी ऑटोएंटिबॉडी की पहचान नहीं की गई है, और कुछ सीरोनिगेटिव रोगियों को एमजी का निदान किया जाता है लेकिन कोई मान्यता प्राप्त एंटीबॉडी25,26 नहीं है। हमारी प्रणाली एमजी रोगियों से सीरम के अलावा एनएमजे के बार-बार कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति देती है, जो एमजी एंटीबॉडी18 के कारण कार्यात्मक और जैव रासायनिक परिवर्तनों में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हमारा प्रोटोकॉल दिखाता है कि कार्यात्मक मानव एनएमजे के इन विट्रो मॉडल में 3 डी का उत्पादन कैसे किया जाए जिसका उपयोग एनएमजे विकृतियों का निदान और जांच करने और संभावित चिकित्सीय परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हम दो प्लेटफार्मों, एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस और एक बड़े ओपन-वेल बायोरिएक्टर प्लेटफॉर्म में सिस्टम की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करते हैं।

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Protocol

इस काम के लिए सभी सेल लाइनों को कोलंबिया विश्वविद्यालय, एनवाई, यूएसए के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में बनाया और उपयोग किया गया था।

1. बायोरिएक्टर तैयारी

  1. बायोरिएक्टर मोल्ड बनाएं
    1. पूरक सीएडी फ़ाइल से एक बायोरिएक्टर सीएडी फ़ाइल डाउनलोड करें या एक कस्टम स्वयं का डिज़ाइन बनाएं।
    2. सीएएम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3 डी मॉडल से एक सीएनसी टूलपाथ उत्पन्न करें।
    3. सीएनसी मिलिंग मशीन का उपयोग करके मशीन एसिटल मोल्ड्स।
  2. बायोरिएक्टरों का निर्माण
    1. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस, 77 ग्राम मिश्रण प्रति 4 प्लेटफार्मों / मोल्ड्स) के इलाज एजेंट मिश्रण के लिए 10: 1 आधार मिलाएं।
    2. मिश्रण को वैक्यूम चैंबर में रखें, सभी वाल्व बंद करें, वैक्यूम चालू करें, और मिश्रण को कम से कम 30 मिनट के लिए डी-गैस करें जब तक कि कोई हवा के बुलबुले न रहें। मिश्रण को सांचों में डालें और 1 घंटे के लिए वैक्यूम कक्ष में मोल्डों को डी-गैस करें।
    3. सही अभिविन्यास में मोल्ड के शीर्ष आधे हिस्से के साथ मोल्ड्स को बंद करें। केंद्र पर एक स्टील हेक्सागोनल रॉड रखें और दोनों तरफ क्लैंप करें।
    4. पीडीएमएस के साथ शीर्ष को फिर से भरें।
    5. कम से कम 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में मोल्ड्स का इलाज करें।
    6. कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद मोल्डों से प्लेटफार्मों को हटा दें।
    7. डिश साबुन के 1 घंटे चक्र, 100% आइसोप्रोपेनॉल के 400 एमएल और आसुत जल का उपयोग करके अल्ट्रासोनिक स्नान में उपकरणों को साफ करें।
    8. 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखें।
    9. 30 मिनट के लिए 1% नॉनियनिक सर्फेक्टेंट पॉलीओल में ग्लास कवरलिप्स भिगोएं, और सुनिश्चित करें कि कवरलिप्स ढेर न हों ताकि वे सभी ठीक से लेपित हों।
    10. आसुत जल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखी।
    11. इलाज ग्लास कवरलिप्स और पीडीएमएस प्लेटफॉर्म के लिए 1-2 मिनट के लिए ऑक्सीजन के 6 एल / मिनट के साथ उच्च पर प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करें। एक बार इलाज करने के बाद, पीडीएमएस को कम से कम 30 एस के लिए कवरस्लिप पर दबाकर दोनों को एक साथ बांधें।
    12. कोशिकाओं को जोड़ने से पहले बंधुआ उपकरणों को आटोक्लेव करें।

2. एक ऑप्टिकल उत्तेजना सेटअप का निर्माण

  1. 30 मिमी पिंजरे घन प्रणाली का उपयोग करके, केंद्र में 573 एनएम डाइक्रोइक दर्पण संलग्न करें। 594 एनएम लॉन्ग-पास उत्तेजना फिल्टर के साथ एक लाल 627 एनएम एलईडी जोड़ें और इसे घन के शीर्ष पक्ष में संलग्न करें, एलईडी दर्पण का सामना करना पड़ रहा है। फिर घन के आसन्न पक्ष में 546 एनएम शॉर्ट-पास उत्तेजना फिल्टर के साथ एक नीला 488 एनएम एलईडी संलग्न करें, एलईडी के साथ दर्पण का सामना करना पड़ रहा है जैसा कि चित्रा 3 ए में योजनाबद्ध में दिखाया गया है।
  2. प्रबुद्ध क्षेत्र के आकार को नियंत्रित करने के लिए पिंजरे घन के नीचे एक अंगूठी-सक्रिय आईरिस डायाफ्राम संलग्न करें।
  3. एक टी-क्यूब एलईडी ड्राइवर द्वारा प्रत्येक एलईडी को पावर करें और एक अरुडिनो यूनो रेव 3 बोर्ड के माध्यम से नियंत्रण करें। एलईडी ड्राइवर के साइड इनपुट को पावर सोर्स प्लग से कनेक्ट करें, मध्य आउटपुट को Arduino से कनेक्ट करें, और साइड आउटपुट को सीधे एलईडी से कनेक्ट करें।
  4. एक यूएसबी केबल द्वारा एक पीसी के लिए अरुडिनो ऊनो कनेक्ट करें।
  5. गिटहब लिंक (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) से फ़ाइलें डाउनलोड करें।
  6. गिटहब फ़ोल्डर से "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.इनो" फ़ाइल खोलें।
  7. प्रारंभिक पैरामीटर सेट करें: चरण = 30; प्रारंभ आवृत्ति = 0.5; अंत आवृत्ति = 3; पल्सलेंथ = 100।
  8. सुनिश्चित करें कि पिन आउटपुट 4 ब्लू एलईडी ड्राइवर को सौंपा गया है और पिन आउटपुट 2 लाल एलईडी ड्राइवर को सौंपा गया है। एलईडी ड्राइवर के मध्य तारों की जांच करें जमीन और संबंधित पिन आउटपुट से जुड़े हुए हैं।
  9. संकलित करें और Arduino के लिए "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" प्रोग्राम लोड करें।
  10. प्रत्येक एलईडी ड्राइवर को उसके संबंधित चैनल से कनेक्ट करें।

3. सेल संस्कृति सेटअप (दिन -21-0)

  1. प्राथमिक कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाएं
    1. मायोटोनिक विकास माध्यम (+ पूरक) का उपयोग करके अधिकतम छह मार्गों के लिए प्राथमिक कंकाल मायोब्लास्ट (कुक मायोसाइट से प्राप्त) को पिघलना और विस्तारित करना। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के लिए सेट एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें।
    2. हर 2 दिन में मीडिया बदलें।
    3. एक बार जब कोशिकाएं लगभग 60% संगम हो जाती हैं, तो उन्हें 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (1x, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए) का उपयोग करके पारित करें। पृथक कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए ताजा मीडिया जोड़ें।
    4. 300 एक्स जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें और सेल गोली के ऊपर सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
    5. एमजीएम और बीज 1: 3 के साथ कोशिकाओं को 60 मिलीलीटर प्रति ट्रिपल-लेयर फ्लास्क के साथ पुन: निलंबित करें।
  2. सीएचआर 2-एचआईपीएससी
    नोट: इस काम के लिए सभी सेल लाइनों को कोलंबिया विश्वविद्यालय, एनवाई, यूएसए के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में बनाया और उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, सीएचआर 2-एक्सप्रेसिंग एचआईपीएससी को सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन के माध्यम से पहले वर्णित विधियों18 का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, लेकिन किसी भी स्थिर ऑप्टोजेनेटिक सेल लाइनों (लेंटिवायरल, पिग्गीबैक, आदि) का उपयोग उसी तरह से किया जा सकता है। आईपीएससी और मोटोन्यूरॉन्स दोनों में व्यक्त संवैधानिक प्रमोटरों को चुना गया (सीएजी)। कोशिकाओं को स्वस्थ कैरियोटाइप पाया गया, जैसा कि पिछले प्रकाशनों18,19 में उल्लेख किया गया था।
    1. एफ 12 (1:80) में पतला घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 1 एमएल / अच्छी तरह से प्लेटों के साथ कोट 6-अच्छी तरह से प्लेटें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को सेते हैं।
    2. फीडर-फ्री सेल कल्चर मीडियम (आईपीएससी मीडिया) के 2 एमएल के साथ लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों पर बीज आईपीएससी, हर दूसरे दिन 2 एमएल मीडिया का आदान-प्रदान करना और हर 5-7 दिनों में गुजरना। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें।
    3. पासिंग
      1. 4 मिनट के लिए अभिकर्मक जारी एंजाइम मुक्त स्टेम सेल के 1 एमएल के साथ ऊष्मायन और यंत्रवत् एक विस्तृत टिप पी 1000 विंदुक के साथ कतरनी द्वारा स्टेम कोशिकाओं को अलग करें।
      2. लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर अच्छी तरह से 2 एमएल / अच्छी तरह से वाई -27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के 2 μM के साथ आईपीएससी मीडिया में 1: 24 या 1: 48 के अनुपात में बीज कोशिकाएं।

4. कंकाल की मांसपेशी ऊतक बोने (दिन -3)

  1. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके 30 x 106 मायोब्लास्ट को अलग और गिनें।
  2. एमएल कोलेजन मैं और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (कोलेजन मिश्रण के 800 μL + तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 200 μL 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए) के 4: 1 मिश्रण में मायोब्लास्ट को फिर से निलंबित करें। कोलेजन घटक के लिए, साथ में न्यूट्रलाइजिंग एजेंट (न्यूट्रलाइजिंग एजेंट के लिए कोलेजन का 9: 1 मिश्रण) जोड़ें और 800 μL की मात्रा प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के साथ मिश्रण को पतला करें।
  3. बायोरिएक्टर के प्रत्येक मांसपेशी कक्ष में सेल कोलेजन निलंबन के 15 μL जोड़ें, विंदुक टिप (चित्रा 2) का उपयोग कर दोनों स्तंभों में निलंबन फैलाने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है।
  4. सेल-जेल मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमराइज़ करने दें और फिर मायोटोनिक विकास मीडिया के 450 μL के साथ प्रत्येक बायोरिएक्टर को अच्छी तरह से भरें।
  5. 3 दिनों के बाद (एक बार जेल कॉम्पैक्ट हो जाने के बाद), मायोट्यूब भेदभाव शुरू करें।

5. मायोट्यूब भेदभाव (दिन 0-14)

  1. 7 दिनों के लिए संलयन उत्प्रेरण मीडिया (एफएस, तालिका 1) के 450 μL के लिए ऊतकों को स्विच करके मायोट्यूब जलसेक शुरू करें, हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें।
    नोट: दोनों सेल प्रकार के भेदभाव कार्यक्रमों के अंत में मोटोन्यूरॉन्स बीज मोटोन्यूरॉन्स के लिए एचआईपीएससी से मोटोन्यूरॉन भेदभाव के रूप में एक ही दिन मायोट्यूब भेदभाव शुरू करने का प्रयास करें।
  2. दिन 7 परिपक्वता मीडिया आईए (एमएमआईए, तालिका 1) के 450 μL करने के लिए मीडिया को बदलने के लिए।
  3. 9 वें दिन, परिपक्वता मीडिया आईबी (MMIb, तालिका 1) के 450 μL करने के लिए परिवर्तन।
  4. 11 वें दिन, मीडिया को एनबीएक्टिव 4 के 450 μL में बदलें। हर 2 दिनों में मीडिया को बदलते रहें जब तक कि मोटोन्यूरॉन्स को वरीयता नहीं दी जाती है (चरण 7)।

6. मोटोन्यूरॉन भेदभाव (दिन 0-14)

नोट: हमारे मोटोन्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल को मॉरी एट अल8 से अनुकूलित किया गया था।

  1. दिन 0 पर, मोटोन्यूरॉन निलंबन संस्कृति माध्यम (एमएससीएम, तालिका 1) के 15 मिलीलीटर के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट पेट्री डिश में 4 एक्स 106 सीएचआर 2- हाइपीएससी स्थानांतरित करें। 3 μM CHIR99021, 0.2 μM एलडीएन193189, 40 μM SB431542 हाइड्रेट और 5 μM Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के साथ एमएससीएम को पूरक करें।
  2. दिन 2 पर, 37 μM प्रतिवर्ती छलनी के साथ न्यूरोस्फीयर (एनएस) को अलग करें और 3 μM CHIR99021, 0.2 μM एलडीएन 193189, 40 μM SB431542 हाइड्रेट, और 0.1 μM रेटिनोइक एसिड के साथ एमएससीएम के 15 एमएल में रिप्लेट करें। एनएस दिन 2 के बाद माइक्रोस्कोप का उपयोग किए बिना पेट्री डिश में दिखाई देना चाहिए।
  3. दिन 4 पर, कोशिकाओं और मीडिया को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और न्यूरोस्फीयर को नीचे (5 मिनट) में बसने की अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और 0.5 μM एसएजी, 0.2 μM एलडीएन 193189, 40 μM SB431541, और 0.1 μM रेटिनोइक एसिड के साथ पूरक एमएससीएम के 15 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  4. 7 वें दिन, चरण 6.3 दोहराएँ। लेकिन 0.5 μM SAG और 0.1μM रेटिनोइक एसिड के साथ पूरक एमएससीएम के 15 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. 9 वें दिन, चरण 6.3 दोहराएँ। लेकिन 10 μM डीएपीटी के साथ पूरक एमएससीएम के 15 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
  6. 11 वें दिन, चरण 6.3 दोहराएँ। लेकिन 20 एनजी / एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी / एमएल जीडीएनएफ के साथ पूरक एमएससीएम के 15 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. 14 वें दिन, मोटोन्यूरॉन्स को प्लेटफ़ॉर्म में बीज दें।

7. बायोरिएक्टर में मोटोन्यूरॉन्स समुच्चय बोना (दिन 14)

  1. एमएल कोलेजन I और मैट्रिगेल (कोलेजन मिश्रण के 800 μL + 1 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए मैट्रिगेल के 200 μL) का 4: 1 जेल मिश्रण तैयार करें। कोलेजन घटक के लिए, साथ में न्यूट्रलाइजिंग एजेंट (न्यूट्रलाइजिंग एजेंट के लिए कोलेजन का 9: 1 मिश्रण) जोड़ें और 800 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के साथ मिश्रण को पतला करें।
  2. बड़े न्यूरोस्फीयर का चयन करने और जेल मिश्रण में उन्हें फिर से निलंबित करने के लिए 400 एनएम सेल छलनी का उपयोग करें।
  3. जलाशय से एस्पिरेट मीडिया और न्यूरोस्फीयर अच्छी तरह से ध्यान से (चित्रा 2)।
  4. न्यूरोस्फीयर चैनल में जेल मिश्रण के 15 μL जोड़ें।
  5. जेल के 10 μL के साथ एक 10 μL पिपेट लोड और फिर एक न्यूरोस्फीयर उठाओ।
  6. एनएस को न्यूरोस्फीयर चैनल में जमा करें और सुनिश्चित करें कि एनएस कक्ष में है। एनएस जमा होने के बाद शेष जेल जारी करते समय धीरे-धीरे पिपेट बढ़ाएं। यदि अनिश्चित है कि एनएस सही ढंग से जमा किया गया था, तो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसके स्थान की जांच करें।
  7. जेल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पोलीमराइज करने की अनुमति दें।
  8. जलाशयों में 20 एनजी/एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी/एमएल जीडीएनएफ के साथ पूरक एनबीएक्टिव4 के 450 μL जोड़ें।
  9. एनएस से मांसपेशियों के ऊतकों तक अक्षीय वृद्धि की अनुमति देने के लिए हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।

8. एनएमजे फ़ंक्शन की एक साथ ऑप्टिकल उत्तेजना और वीडियो रिकॉर्डिंग (दिन 24+)

  1. इमेजिंग के लिए, एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (एससीएमओएस) कैमरे के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. कैमरा सॉफ़्टवेयर बिनिंग को 2x2 पर सेट करें, 20 एमएस के संपर्क में, शटर ऑन रोलिंग, रीडआउट दर 540 मेगाहर्ट्ज, गतिशील रेंज: 12-बिट और लाभ 1, और सेंसर मोड: ओवरलैप।
  3. सूक्ष्म ऊतकों की छवि के लिए माइक्रोस्कोप पर 2x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. माइक्रोस्कोप चरण में एक लाइव-सेल चैंबर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) संलग्न करें।
  5. ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करें जिसमें फ़ाइल आकार और प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए आंतरिक कंकाल ऊतक ऊतक होते हैं।
  6. कैमरे से नीली रोशनी दालों को फ़िल्टर करने के लिए नमूना और इमेजिंग उद्देश्य के बीच 594 एनएम लंबे समय से पास उत्सर्जन फ़िल्टर रखें।
  7. लाइव-सेल चैंबर में 4 बायोरिएक्टर (24 ऊतक) युक्त एक आयताकार 4-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
  8. लाइव दृश्य क्लिक करें. वांछित आरओआई के साथ छवि को केंद्र और फोकस करें।
  9. स्टेज स्थिति, Arduino बोर्ड और वीडियो अधिग्रहण को नियंत्रित करने के लिए गिटहब फ़ोल्डर (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) से कस्टम मैक्रो कोड अपलोड करें।
  10. आउटपुट मूवी को इस रूप में सेट करें: day_tissue group_tissue name_experiment.एनडी 2।
  11. मंच पर सेट वांछित एक्स, वाई निर्देशांक के साथ मैक्रो कोड चलाएं और 50 फ्रेम / एस पर 1700 फ्रेम के साथ तेजी से समय चूक प्राप्त करें।
  12. इमेजिंग के बाद मीडिया को बदलें और इनक्यूबेटर को नमूने वापस करें। ऊतक थकान से बचने के लिए छवि अधिग्रहण सत्रों के बीच कम से कम 24 घंटे की अनुमति दें।

9. बैच प्रसंस्करण और विश्लेषण (दिन 24+)

  1. मूवी प्रोसेसिंग
    1. बैच विश्लेषण में वीडियो को संसाधित करने के लिए कस्टम MATLAB कोड का उपयोग करें। फ़ाइलों को गिटहब फ़ोल्डर (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) से डाउनलोड किया जा सकता है। कार्यों को तालिका 2 में सूचीबद्ध और समझाया गया है।
      नोट: कोड .nd2 और .czi स्वरूपों के साथ संगत है। इसे मैटलैब में सक्रिय करने के लिए समानांतर प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है और बायोफॉर्मेट पैकेज की आवश्यकता होती है।
    2. समानांतर प्रसंस्करण के माध्यम से फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए पुनरावर्तीओएस विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाएं। एक ही फ़ोल्डर में अधिग्रहित सभी वीडियो रखें और कोड चलाते समय उस फ़ोल्डर का चयन करें।
    3. आवश्यकतानुसार पोस्ट-विश्लेषण मापदंडों को समायोजित करें।
      1. रिकॉर्डिंग की शुरुआत में सहज संकुचन उठाया जाता है, तो बेसलाइन टाइम (विकल्प 1) बदलें। यह 0 से ऊपर एक प्रारंभिक पढ़ने का तरीका दिखाएगा और क्षतिपूर्ति के लिए फ्रेम को स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी।
      2. यदि संकुचन पंजीकृत नहीं किया जा रहा है, तो पीकथ्रेशोल्ड (विकल्प 2) बदलें। कोड उन संकुचनों का पता लगाएगा जो डिफ़ॉल्ट रूप से उच्चतम शिखर के 25% से ऊपर हैं ताकि इस मान को बदला जा सके।
      3. प्रत्येक चोटी की शुरुआत का पता लगाते समय संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए मिनमिनप्रमोटेंस और मिनमिनविड्थ बदलें।
    4. वीडियो और ग्राफ आउटपुट उत्पन्न करें।
      1. अपने संबंधित संकुचन ट्रेस के साथ प्रत्येक ऊतक के लिए एक वीडियो फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए पुनरावर्तीओएसमूवी चलाएं।

10. एनएमजे फ़ंक्शन की गड़बड़ी (दिन 24+)

  1. एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी / एमएल जीडीएनएफ के साथ पूरक एनबीएक्टिव 4 बेसल मीडिया में बाहरी प्रभावक जोड़कर उपचार मीडिया तैयार करें।
    1. एमजी सेरा प्रयोग के लिए, एनबीएक्टिव 4 + बीडीएनएफ + जीडीएनएफ में 20% एमजी रोगी सेरा का उपयोग करें।
    2. बीटीएक्स प्रयोग के लिए, एनबीएक्टिव 4 + बीडीएनएफ + जीडीएनएफ में 5 μg / एमएल बीटीएक्स का उपयोग करें।
  2. चरण 3.2 का उपयोग करके उत्तेजित / बेसलाइन रिकॉर्ड करने के लिए।
  3. उपचार मीडिया (450 μL / ऊतक) के साथ ऊतकों में मीडिया को बदलें।
  4. वांछित समय के लिए सेते हैं (रोगी सेरा के लिए 48 घंटे, बीटीएक्स के लिए 20 मिनट)।
  5. चरण 3.2 का उपयोग करके फिर से उत्तेजित / उपचार के बाद फ़ंक्शन रिकॉर्ड करने के लिए।
  6. उपचार मीडिया निकालें और ऊतकों को वांछित समय के लिए आराम करने की अनुमति दें (सेरा हटाने के बाद 48 घंटे)
    नोट: ऊतक थकान से बचने के लिए उत्तेजना और इमेजिंग के बीच कम से कम 24 घंटे की अनुमति दें

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Representative Results

गैर-ऑप्टोजेनेटिक कंकाल की मांसपेशी ऊतक के साथ ऑप्टोजेनेटिक हाईपीएससी-व्युत्पन्न मोटोन्यूरॉन्स को सह-संवर्धन द्वारा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन उत्पन्न किए गए थे। मानव प्राथमिक कंकाल मायोब्लास्ट्स (एसकेएम) को प्लेटफार्मों में वरीयता दी गई थी और 2 सप्ताह के प्रोटोकॉल का उपयोग करके मल्टीन्यूक्लिएटेड मायोट्यूब में विभेदित किया गया था। ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स को अलग से विभेदित किया गया था, लेकिन मायोट्यूब भेदभाव के समानांतर, और फिर मंच (चित्रा 1) में वरीयता प्राप्त थी। एमएन बोने के 7-12 दिनों बाद नीली रोशनी उत्तेजना के जवाब में ऊतकों ने अनुबंध करना शुरू कर दिया, जो एनएमजे के सफल विकास और परिपक्वता का संकेत देता है। एनएमजे को मोटोन्यूरॉन सीडिंग के बाद 40 दिनों तक सुसंस्कृत, उत्तेजित और इमेज किया जा सकता है, लेकिन इष्टतम समय बिंदु 1619 दिन पर होता है। ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन के भेदभाव और उपस्थिति के रूपात्मक और जैव रासायनिक सत्यापन को पूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है और पिछले अध्ययनों18,19 में मान्य किया गया है।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न संस्कृति प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, रणनीति का परीक्षण दो अलग-अलग कम्पार्टमेंटलाइज्ड रिएक्टरों का उपयोग करके किया गया था: एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस और एक ओपन-वेल बायोरिएक्टर। दोनों प्रणालियों में एक समान डिजाइन है, जिसमें कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों की पीढ़ी के लिए स्तंभों के साथ एक कक्ष प्रदान किया गया है और 3 डी मोटोन्यूरॉन समुच्चय की संस्कृति के लिए एक दूसरा कक्ष है जो कंकाल के ऊतकों (चित्रा 2 ए, बी) को आंतरिक बनाने के लिए अक्षतंतु का विस्तार कर सकता है। हालांकि, दो प्रणालियों में अलग-अलग तराजू होते हैं, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 1 मिमी लंबे कंकाल की मांसपेशी ऊतकों का उत्पादन करता है जिसमें लगभग 20,000 मायोब्लास्ट (चित्रा 2 सी) और ओपन-वेल बायोरिएक्टर सिस्टम होता है जिसके परिणामस्वरूप 4 मिमी लंबी मांसपेशियों के ऊतक होते हैं जिनमें लगभग 450,000 मायोब्लास्ट (चित्रा 2 डी) होते हैं।

ऑप्टोजेनेटिक एनएमजे की नियंत्रित उत्तेजना की अनुमति देने के लिए, एक ऑप्टिकल सेटअप बनाया गया था, जिसमें ब्राइटफील्ड रोशनी के लिए लाल 637 एनएम एलईडी, सीएचआर 2-एमएन के सक्रियण के लिए एक नीला 488 एनएम एलईडी, और छवि विश्लेषण (चित्रा 3 ए) के साथ हस्तक्षेप करने से नीली रोशनी को रोकने के लिए ऊतक नमूने और उद्देश्य के बीच एक नीली रोशनी फिल्टर शामिल था। एलईडी एलईडी ड्राइवरों द्वारा संचालित थे और एक अरुडिनो माइक्रोप्रोसेसर के माध्यम से ठीक से नियंत्रित किए गए थे। एनएमजे फ़ंक्शन का मूल्यांकन अरुडिनो कोड (चित्रा 3 बी) के साथ जोड़े गए कस्टम माइक्रोस्कोप मैक्रो-स्क्रिप्ट का उपयोग करके नीली रोशनी के साथ एमएन को उत्तेजित करते हुए एक साथ समय-चूक वीडियो प्राप्त करके किया गया था। प्रोटोकॉल ने 30 चरणों में उत्तेजना की आवृत्ति को 0.2 हर्ट्ज से 2 हर्ट्ज तक बढ़ा दिया। एक बार फिल्मों का अधिग्रहण किया गया था, ऊतक समारोह एक कस्टम MATLAB पैकेज (चित्रा 3 सी) का उपयोग करविश्लेषण किया गया था। विश्लेषण ने ऊतक विस्थापन को मापा, एक संकुचन ट्रेस उत्पन्न किया, और इसे प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ सिंक्रनाइज़ किया। इसके बाद इसने प्रभावी दालों (एफ) के अंश और प्रभावी दालों (ई) के अपेक्षित अंश को संभावित अनियंत्रित संकुचन के लिए निर्धारित किया। अपेक्षित अंश (ई) की गणना दालों के अंश के रूप में की गई थी जिसे प्रभावी के रूप में लेबल किया जाएगा यदि संकुचन 30 एस के भीतर बेतरतीब ढंग से वितरित किए गए थे। ऊतक स्कोर तब (एफ-ई) / (1-ई) के रूप में गणना की गई थी, जिसमें 0 और 1 (चित्रा 3 सी) के बीच मूल्य था। कोड निर्धारित करता है कि क्या एक संकुचन एक प्रकाश नाड़ी और संकुचन शिखर की शुरुआत के बीच के समय के आधार पर ट्रिगर किया जाता है, जैसा कि चित्रा 3 डी में दिखाया गया है। यह स्वचालित, निष्पक्ष विधि बड़े नमूना आकारों में और समय के साथ एनएमजे फ़ंक्शन के दोहराए गए लक्षण वर्णन की अनुमति देती है। कोड में ट्यून करने योग्य पैरामीटर शामिल हैं जिन्हें सही स्कोरिंग (पूरक चित्रा 2) सुनिश्चित करने के लिए प्रसंस्करण के बाद समायोजित किया जा सकता है।

समय के साथ एनएमजे फ़ंक्शन को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने की प्रणाली की क्षमता 11 दिनों के लिए ऊतकों के एक समूह की इमेजिंग द्वारा प्रदर्शित की गई थी (मोटोन्यूरॉन बोने के बाद दिन 9 से दिन 20 तक)। सिस्टम ऊतकों में एनएमजे समारोह के सुधार पर कब्जा कर लिया, ऊतक निर्माण (चित्रा 4 ए) के 1 सप्ताह बाद ट्रिगर प्रतिक्रियाओं में वृद्धि दिखा, एक अतिरिक्त सप्ताह (चित्रा 4 बी) के लिए एक स्थिर समारोह के बाद। यह सत्यापित करने के लिए कि मांसपेशियों की उत्तेजना एनएमजे के माध्यम से हुई, ऊतकों के एक अन्य समूह का विश्लेषण न्यूरोटॉक्सिन α-बंगरोटॉक्सिन (बीटीएक्स) के 5 μg / एमएल के साथ इनक्यूबेशन के 20 मिनट से पहले और बाद में किया गया था, जो विशेष रूप से और अपरिवर्तनीय रूप से एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स को बांधता है। बीटीएक्स ने सभी ट्रिगर और सहज संकुचन को रोक दिया, जिसके परिणामस्वरूप एनएमजे फ़ंक्शन का पूर्ण विघटन हुआ, और दिखाया कि ऊतकों की हल्की उत्तेजना के लिए एक कार्यात्मक एनएमजे (चित्रा 4 सी, डी) की आवश्यकता होती है। बीटीएक्स के धारावाहिक कमजोर पड़ने का परीक्षण शुरू में इष्टतम बीटीएक्स एकाग्रता (परिणाम नहीं दिखाए गए) की पहचान करने के लिए किया गया था।

सिस्टम की ट्रांसलेशनल क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, एनएमजे फ़ंक्शन का मूल्यांकन पांच मायस्थेनिया ग्रेविस रोगियों से सीरम के अलावा और बाद में किया गया था। 48 घंटे के लिए 20% एमजी सीरम के साथ इलाज किए गए ऊतकों के विश्लेषण ने स्वस्थ दाताओं (चित्रा 4 ई, एफ) से सीरम के साथ इलाज किए गए नियंत्रण ऊतकों की तुलना में कम कार्य दिखाया। इंजीनियर एनएमजे को सीरम को हटाने और धोने के बाद 48 घंटे फिर से मूल्यांकन किया गया था और फ़ंक्शन (चित्रा 4 एफ) की वसूली दिखाई गई थी। इसके अतिरिक्त, रोगी सीरम और सामान्य मानव सीरम नियंत्रण (5%, 20%, 40%) की बढ़ती सांद्रता का परीक्षण ऊतक समारोह को प्रभावित करने वाली इष्टतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए किया गया था। परिणामों ने एनएमजे फ़ंक्शन को चिह्नित करने और मापने और इन विट्रो में मायस्थेनिया ग्रेविस को मॉडल करने के लिए सिस्टम की क्षमता दिखाई।

Figure 1
चित्र 1. प्रायोगिक डिजाइन और समयरेखा। प्लेटफार्मों में भेदभाव और बोने की समयरेखा (दिन)। एसकेएम = कंकाल की मांसपेशी, सीएचआर 2 = ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स, एनएमजे = न्यूरोमस्कुलर जंक्शन। इस आंकड़े को विला एट अल 18 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. 3 डी एनएमजे की पीढ़ी के लिए सह-संस्कृति प्रणाली। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का योजनाबद्ध। (बी) ओपन-वेल पीडीएमएस बायोरिएक्टर की योजनाबद्ध। (सी) माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में कंकाल की मांसपेशी ऊतक। (डी) ओपन-वेल बायोरिएक्टर में इनरवेटेड ऊतक। स्केल बार 0.5 मिमी। इस आंकड़े को विला एट अल 18 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. एनएमजे फ़ंक्शन की उत्तेजना, रिकॉर्डिंग और विश्लेषण। (ए) एलईडी सेट अप और प्रकाश पथ की योजनाबद्ध। (बी) एक उल्टे माइक्रोस्कोप, लाइव सेल चैंबर, स्वचालित चरण और एससीएमओएस कैमरा के साथ ऑप्टिकल सेट-अप। (सी) एनएमजे संस्कृतियों के ऑप्टिकल उत्तेजना वीडियो के बैच प्रसंस्करण के लिए एल्गोरिथ्म। (डी) मैटलैब कोड और संबंधित संकुचन ट्रेस ग्राफ द्वारा उत्पन्न वीडियो का प्रतिनिधि फ्रेम। वीडियो में निमिष नीले बॉक्स और ग्राफ में ऊर्ध्वाधर रेखाएं इंगित करती हैं कि नीली रोशनी उत्तेजना कब होती है। इस आंकड़े को विला एट अल 18 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. एनएमजे फ़ंक्शन। (बी) प्रकाश के जवाब में एनएमजे का स्कोर, 11 दिनों में फ़ंक्शन में सुधार दिखा रहा है (एन = 47, एक तरफा एनोवा पी = 1 एक्स 10-8)। (सी) न्यूरोटॉक्सिन α-बंगरोटॉक्सिन (बीटीएक्स) के 5 मिलीग्राम / एमएल के साथ 20 मिनट के उपचार के बाद सिकुड़न ट्रेस। (डी) बीटीएक्स के साथ उपचार से पहले और बाद में एनएमजे फ़ंक्शन (स्कोर) का परिमाणीकरण (एन = 6; एक तरफा एनोवा एफ = 9 एक्स 10-8)। (ई) उपचार के 48 घंटे के बाद 20% एमजी सेरा के साथ ऊतकों का संकुचन ट्रेस। (एफ) उपचार से पहले और बाद में उपचार और नियंत्रण समूहों के लिए एनएमजे फ़ंक्शन मूल्यांकन और वसूली के बाद (एन = 12; उपचार के बाद पोस्ट-हॉक एनोवा एफ = 0.0002; * इंगित करता है पी = 0.0015 ** इंगित करता है पी = 3.5 एक्स 10−6) (एमजी = मायस्थेनिया ग्रेविस; एनएचएस = सामान्य मानव सीरम)। एन जैविक प्रतिकृतियों की संख्या को इंगित करता है। इस आंकड़े को विला एट अल .18,19 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. मायोजेनिक और तंत्रिका मीडिया योगों। मीडिया के लिए विकास कारकों और पूरक की संगठित सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2. मैटलैब कार्यों की सूची। छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले मैटलैब कार्यों का संक्षिप्त विवरण। इस तालिका को विला एट अल .18 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइलें

अनुपूरक चित्र 1. मायोट्यूब और मोटोन्यूरॉन भेदभाव। (ए) मायोट्यूब भेदभाव प्रोटोकॉल (एमएम = परिपक्वता मीडिया)। (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) छवियां कंकाल की मांसपेशी मार्कर मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी), α-एक्टिनिन और विभेदित मायोट्यूब में डेस्मिन की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। (सी) मोटोन्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल। (डी) ऑप्टोजेनेटिक आईपीएससी में झिल्ली के लिए वाईएफपी (सीएचआर 2-वाईएफपी) के साथ चैनलरोडोप्सिन -2 का स्थानीयकरण और सफल संक्रमण की पुष्टि करने वाले (ई) एमएन। (एफ) ऑप्टोजेनेटिक एमएन में कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (सीएचएटी, लाल) और सीएचआर 2 (हरा) की सह-अभिव्यक्ति। विला एट अल .18 से अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2. गलत संसाधन जिसके लिए पैरामीटर के समायोजन की आवश्यकता होती है. (ए) गलत आधारभूत समय गलत आकार की चोटियों में परिणाम। (बी) एक चोटी थ्रेसहोल्ड जो चोटियों में बहुत अधिक है, जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात हो जाते हैं। (सी) मिनिमा का पता लगाने के लिए बहुत उदार स्थितियां (यानी, मिनमिनप्रोमिनेंस और / या मिनमिनविड्थ के लिए चुने गए बहुत कम मूल्य) के परिणामस्वरूप मिनिमा को चोटियों के मध्य या यहां तक कि शीर्ष पर लेबल किया जाता है, इसलिए इसे "अनियंत्रित" के रूप में गिना जाता है क्योंकि वे पूर्ववर्ती प्रकाश नाड़ी से बहुत दूर शुरू होते हैं। (डी) मिनिमा का पता लगाने के लिए बहुत कठोर शर्तों के परिणामस्वरूप चोटी की शुरुआत को प्रकाश नाड़ी से पहले लेबल किया जा रहा है या यहां तक कि लापता भी है, जैसा कि इस उदाहरण में है। विला एट अल .18 से अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। बायोरिएक्टर प्लेटफॉर्म के 3 डी मॉडल को दिखाने वाली फ़ाइल जिसे पीडीएमएस का उपयोग करके बायोरिएक्टर विनिर्माण के लिए मोल्ड बनाने के लिए संपादित और निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

अनुपूरक सीएडी फाइल। बायोरिएक्टर प्लेटफॉर्म के 3 डी मॉडल को दिखाने वाली फ़ाइल जिसे पीडीएमएस का उपयोग करके बायोरिएक्टर विनिर्माण के लिए मोल्ड बनाने के लिए संपादित और निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रणाली एक इंजीनियर 3 डी मानव ऊतक मॉडल है जो एनएमजे फ़ंक्शन के स्वचालित और निष्पक्ष मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और वीडियो प्रोसेसिंग को जोड़ती है। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने शारीरिक विकास के दौरान एनएमजे फ़ंक्शन में परिवर्तन को मापने की क्षमता का प्रदर्शन किया है और न्यूरोटॉक्सिन एक्सपोजर और मायस्थेनिया ग्रेविस रोगी सेरा जैसे विकृतियों के हानिकारक प्रभावों को चिह्नित किया है।

पिछले अध्ययनों ने एमजी रोगी सेरा22 का उपयोग करके कंकाल मायोट्यूब के साथ सह-संस्कृति में ऑप्टोजेनेटिक एचपीएससी-व्युत्पन्न मोटोन्यूरॉन्स के साथ एमजी मॉडल करने की क्षमता की सूचना दी है। हालांकि, सिस्टम 2 डी में था और यादृच्छिक स्थानों में संकुचन दर्ज किया गया था, जिससे प्रजनन क्षमता सीमित हो गई और मॉडल की मात्रात्मक क्षमता कम हो गई। 2 डी सिस्टम की तुलना में हमारे सिस्टम के सबसे बड़े फायदों में से एक यह है कि यह हमें 3 डी वातावरण का अनुकरण करने की अनुमति देता है, जो एमएन और एसकेएम के बीच सेलुलर और रूपात्मक विकास को अधिक सटीक रूप से सुविधाजनक बनाता है। ऐसे महान सबूत हैं जो इस बात का समर्थन करते हैं कि ऊतक के लिए अपने मूल शरीर विज्ञान की तरह व्यवहार करने के लिए आवश्यक बायोमैकेनिकल संकेतों को 3 डी सिस्टम 13,14,15,16 में बेहतर तरीके से नकल किया जाता है। इसके अतिरिक्त, 3 डी प्रणाली के विभिन्न पहलू अधिक नियंत्रित वातावरण की अनुमति देते हैं: सिनैप्स का निर्देशित गठन, नमूनों के बीच कम विषमता, ऑप्टोजेनेटिक्स के माध्यम से उत्तेजना के स्थानिक-अस्थायी नियंत्रण में वृद्धि, और एक स्वचालित उच्च-थ्रूपुट प्रणाली जो प्रत्येक नमूने के विश्लेषण की व्यक्तिपरकता को कम करती है।

विकसित प्रणाली का उपयोग अन्य न्यूरोमस्कुलर रोगों (एनएमडी) को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), डचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), और अन्य। यद्यपि एएलएस पैथोफिजियोलॉजी में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन17,27 के बजाय मोटर न्यूरॉन की शिथिलता शामिल है, हमारी प्रणाली में न्यूरॉन अध: पतन या क्षति के बाद कम मांसपेशियों के संकुचन को दिखाकर एएलएस की रोग स्थिति को पुन: प्राप्त करने की क्षमता है। डीएमडी एक मांसपेशी अपक्षयी रोग है जो डिस्ट्रोफिन प्रोटीन की कमी के कारण होता है, जो मांसपेशियों की कमजोरी और अंतिम अध: पतन की ओर जाताहै 28. सिस्टम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कंकाल की मांसपेशियों को शामिल करके डीएमडी को मॉडल कर सकता है जो एक डिस्ट्रोफिन अवरोधक या रोगग्रस्त मांसपेशी कोशिकाओं को वहन करता है जिसमें डिस्ट्रोफिन की कमी होती है। कुल मिलाकर, सिस्टम में इन विट्रो 3 डी प्लेटफॉर्म में विभिन्न एनएमडी को पुन: पेश करने के लिए लचीलापन और शक्ति है।

एक प्रोटोकॉल है कि कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों की आवश्यकता होती है के लिए, संगम के विशेष स्तर के साथ प्रत्येक, सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक समय है। प्राथमिक कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं के विस्तार के दौरान, संलयन के कारण उन्हें बहुत संगम (65% -70%) बनने की अनुमति नहीं देना महत्वपूर्ण है। कभी-कभी, यहां तक कि गुच्छों को तोड़ने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करते समय, यह देखा गया है कि यह बायोरिएक्टरों में कम प्रभावशाली बोने का अनुवाद करता है। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू ओपन-वेल बायोरिएक्टर प्लेटफॉर्म उत्पादन है। पीडीएमएस प्लेटफार्मों के बीच एकरूपता बढ़ाने के लिए, प्लेटफ़ॉर्म स्तंभों के यांत्रिक गुणों में किसी भी उतार-चढ़ाव से बचने के लिए ओवन में बिताए गए समय की मात्रा को सभी प्लेटफार्मों पर समान रखा जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, रिएक्टरों में मांसपेशियों की कोशिकाओं के बोने के दौरान, बोने के घनत्व की स्थिरता बनाए रखने के लिए, बायोरिएक्टरों के भीतर हर दो से तीन डिब्बों के बीच ट्यूब को धीरे-धीरे (1-1.5 एस) भंवर करना समझदारी है। अंत में, एनएमजे विकास के लिए सफलता दर को मोटोन्यूरॉन सीडिंग की सफलता पर काफी हद तक निर्भर देखा गया था क्योंकि न्यूरोस्फीयर के अलावा इतना नाजुक है और व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति में भिन्न होता है। बीजारोपण अभ्यास के साथ, सफलता दर बढ़ जाती है, जिससे लगभग 90% शुरू की गई संस्कृतियों को उत्तेजित और इमेज किया जा सकता है।

वर्तमान में, कुछ सीमाएं जिन्हें निकट भविष्य में संबोधित किया जा सकता है, वे चर्चा किए गए सीएचआर 2 के अलावा ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन का समावेश और सत्यापन हैं। कैल्शियम इमेजिंग या मांसपेशियों के चयापचय के लिए सेल प्रकार और ऑप्टोजेनेटिक सेंसर दोनों पर विशिष्ट नियंत्रण बढ़े हुए रीडआउट और विश्लेषण के लिए सिस्टम में जोड़ा जा सकता है। चूंकि नीली रोशनी उच्च खुराक पर फोटोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करती है, इसलिए उत्तेजना आहार 30 एस तक सीमित था। लंबी अवधि के उत्तेजना अध्ययन के लिए लाल-स्थानांतरित चैनलरोडोप्सिन को शामिल करके इस प्रभाव को सुधारा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक और सीमा जिसे मॉडल के भविष्य के पुनरावृत्तियों में सुधार किया जा सकता है, वह श्वान कोशिकाओं जैसी न्यूरोनल सहायक कोशिकाओं की कमी है। हालांकि, इस प्लेटफ़ॉर्म और विश्लेषण कोड की बहुमुखी प्रतिभा विभिन्न प्रकार के ऑप्टोजेनेटिक निर्माणों और सेल प्रकारों को शामिल करने की अनुमति देती है। जबकि हमारी सीएचआर 2-एचआईपीएससी लाइन सीआरआईएसपीआर का उपयोग करके बनाई गई थी, अन्य तरीकों का उपयोग एचआईपीएससी में ऑप्टोजेनेटिक प्रतिक्रिया को लागू करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, एचआईपीएससी की अनुकूलनक्षमता के साथ, एनएमजे मॉडल को एक एकल कोशिका स्रोत से विकसित किया जा सकता है, जिससे रोगी-विशिष्ट मॉडल का उपयोग न्यूरोमस्कुलर रोगों का आगे अध्ययन करने के लिए किया जा सकताहै 18.

यह मंच समय के साथ मानव एनएमजे फ़ंक्शन का दोहराया, स्वचालित और निष्पक्ष विश्लेषण प्रदान करता है और न्यूरोटॉक्सिन या एमजी रोगी सीरम जैसे बाहरी प्रभावकों के कारण कार्य में मात्रात्मक परिवर्तनों का पता लगा सकता है। कुल मिलाकर, हमारी 3 डी प्रणाली रोग विकृति विज्ञान में मानव एनएमजे फ़ंक्शन की जांच के लिए अनुमति देती है, दवा स्क्रीनिंग का अवसर प्रदान करती है, और सटीक दवा को आगे बढ़ाने के लिए एक मजबूत प्रणाली की नींव रखती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम कृतज्ञतापूर्वक एनआईएच [अनुदान संख्या ईबी 025765 और ईबी 027062], डीओडी [पुरस्कार संख्या डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच -18-1-0095], और इंजीनियरिंग (हाइव फैलोशिप) के माध्यम से यूसीएसएफ हेल्थ इनोवेशन द्वारा वित्त पोषण समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम सेल रिप्रोग्रामिंग के साथ उनकी मदद और मार्गदर्शन के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय स्टेम सेल कोर को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

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References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 182
मानव न्यूरोमस्कुलर जंक्शन के ऑप्टोजेनेटिक मॉडल की इंजीनियरिंग और विशेषता
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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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