Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering og karakterisering av en optogenetisk modell av det menneskelige nevromuskulære krysset

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Vi beskriver et reproduserbart, automatisert og objektivt bildebehandlingssystem for karakterisering av nevromuskulær kryssfunksjon ved bruk av humant konstruert skjelettmuskulaturvev og optogenetiske motoneuroner. Dette systemet muliggjør funksjonell kvantifisering av nevromuskulær tilkobling over tid og oppdager redusert nevromuskulær funksjon forårsaket av nevrotoksiner og myasthenia gravis pasientserum.

Abstract

Mange nevromuskulære sykdommer, som myasthenia gravis (MG), er forbundet med dysfunksjon av det nevromuskulære krysset (NMJ), som er vanskelig å karakterisere i dyremodeller på grunn av fysiologiske forskjeller mellom dyr og mennesker. Tissue engineering tilbyr muligheter til å gi in vitro modeller av funksjonelle menneskelige NMJs som kan brukes til å diagnostisere og undersøke NMJ-patologier og teste potensielle terapier. Ved å inkorporere optogenetiske proteiner i induserte pluripotente stamceller (iPSCs), genererte vi nevroner som kan stimuleres med spesifikke bølgelengder av lys. Hvis NMJ er sunn og funksjonell, resulterer et nevrokjemisk signal fra motoneuronet i muskelkontraksjon. Gjennom integrering av optogenetikk og mikrofabrikasjon med vevsteknikk etablerte vi en objektiv og automatisert metodikk for karakterisering av NMJ-funksjon ved hjelp av videoanalyse. En standardisert protokoll ble utviklet for NMJ-dannelse, optisk stimulering med samtidig videoopptak og videoanalyse av vevskontraktilitet. Stimulering av optogenetiske motoneuroner ved lys for å indusere skjelettmuskelkontraksjoner rekapitulerer human NMJ-fysiologi og muliggjør gjentatte funksjonelle målinger av NMJ over tid og som respons på ulike innganger. Vi demonstrerer denne plattformens evne til å vise funksjonelle forbedringer i nevromuskulær tilkobling over tid og karakterisere de skadelige effektene av pasientens MG-antistoffer eller nevrotoksiner på NMJ-funksjonen.

Introduction

Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er den kjemiske synapsen mellom motoneuroner (MN) og skjelettmuskelceller (SkM) som muliggjør muskelkontraksjon. Toksiner, som nevrotoksin α-bungarotoxin (BTX), eller nevromuskulære sykdommer (NMD) som myasthenia gravis (MG) kan føre til degenerasjon av NMJ og reduksjoner i muskelkontroll1. Bioengineered humane vevsmodeller rekapitulerer bedre de funksjonelle og fysiologiske mekanismene til humane NMJ og gir større translasjonspotensial enn dyremodeller.

Mens dyremodeller har avansert forståelsen av dannelsen og funksjonen til NMJ, er det signifikante forskjeller mellom synapser mellom mennesker og dyr som begrenser oversettelsen av resultatene til mennesker og gjør in vivo karakterisering av NMJ utfordrende 2,3,4. Studier har vist tydelige fysiologiske forskjeller mellom mus og menneskelige NMJs. Mus har større NMJ og mindre aktive sonetettheter sammenlignet med humanNMJs 4. I tillegg gjenspeiler legemiddelstudier utført i dyremodeller ikke alltid effektene som finnes i kliniske studier på mennesker. Konstruerte menneskelige vevsmodeller gir mulighet til å studere den sunne utviklingen av NMJ og patologien til nevromuskulære sykdommer og tillate narkotika screenings. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs)5 kan differensieres til en rekke celletyper, inkludert skjelettmuskelceller 6,7 og motoneuroner 8,9. hiPSCs kan enkelt genereres fra pasientceller, noe som muliggjør bedre sykdomsmodellering10 og medikamentscreening 11,12 gjennom pasientspesifikke vevsmodeller.

Todimensjonale (2D) monolags samkulturer av SKMs og MNs mangler morfologi, fenotype, organisasjon og funksjonell oppførsel av fysiologiske NMJs. NMJs dannes tilfeldig i 2D-kultur, som hemmer isoleringen av motorenheter for analyse, begrenser nøyaktige funksjonelle målinger og forhindrer bruk for gjentatte, systematiske eksperimenter13 . Tredimensjonale (3D) vevsmodeller av NMJ overvinner mange av disse begrensningene, og rekapitulerer de morfologiske og funksjonelle egenskapene til fysiologiske NMJs 7,14,15,16,17. Ved hjelp av denne modellen utvikles de to vevstypene separat og integreres deretter ved å styre aksonal vekst, slik at mer organiserte NMJ-er kan utvikle seg sammenlignet med 2D-kultursystemer.

Vår tidligere studie viste at kombinasjon av optogenetikk med vevsteknikk kan tillate nøyaktig ikke-invasiv stimulering og evaluering av NMJ-funksjon 18,19. Gjennom genteknologi kan lysfølsomme proteiner integreres i genomet til hiPSCs. Integrering av channelrhodopsin-2 (ChR2), en ionkanal som åpnes som svar på blått lys, inn i membranen til spennende celler som nevroner tillater ikke-kontakt spatiotemporal kontroll over celleaktivering 20,21,22. hiPSC-er som bærer ChR2 kan differensieres til optogenetiske motoneuroner som er følsomme for blått lys, noe som fjerner behovet for typiske invasive elektroder som stimulerer nevroner og unngår uønsket stimulering av muskelcellene med elektroder23. Dette systemet bruker optogenetiske motoneuroner for å stimulere sammentrekninger i ikke-optogenetiske skjelettmuskelceller. Ved å kombinere videoinnhenting og kontrollert blålysbelysning kan de samdyrkede vevene samtidig stimuleres og registreres for NMJ-funksjon.

MG er forårsaket av autoantistoffer rettet mot nikotin acetylkolinreseptorer (AChR), noe som resulterer i redusert NMJ-funksjon og muskel svakhet24. Det diagnostiseres basert på presenterte symptomer, elektrodiagnose og påvisning av autoantistoffer via serologiske blodprøver. Imidlertid er ikke alle autoantistoffer involvert i MG identifisert, og noen seronegative pasienter er diagnostisert med MG, men uten anerkjente antistoffer25,26. Vårt system muliggjør gjentatt funksjonsvurdering av NMJ før og etter tilsetning av serum fra MG-pasienter, noe som gir uvurderlig innsikt i de funksjonelle og biokjemiske endringene forårsaket av MG-antistoffene18. Vår protokoll illustrerer hvordan man produserer 3D in vitro-modeller av funksjonell human NMJ som kan brukes til å diagnostisere og undersøke NMJ-patologier og teste potensielle terapier. Vi demonstrerer allsidigheten til systemet i to plattformer, en mikrofluidisk enhet og en større bioreaktorplattform med åpen brønn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle cellelinjer for dette arbeidet ble opprettet og brukt i samsvar med de institusjonelle retningslinjene fra Columbia University, NY, USA.

1. Bioreaktor forberedelse

  1. Lag bioreaktorformer
    1. Last ned en BIOREAKTOR CAD-fil fra den supplerende CAD-filen , eller lag et tilpasset eget design.
    2. Generer en CNC-verktøybane fra 3D-modellen ved hjelp av CAM-programvare.
    3. Maskin acetalformer ved hjelp av en CNC-fresemaskin.
  2. Fabrikasjon av bioreaktorer
    1. Bland en 10: 1 base til herdemiddelblanding av polydimetylsiloksan (PDMS, 77 g blanding per 4 plattformer / mugg).
    2. Plasser blandingen i et vakuumkammer, lukk alle ventiler, slå på vakuumet og avgass blandingen i minst 30 minutter til ingen luftbobler forblir. Hell blandingen i former og avgass formene i vakuumkammeret i 1 time.
    3. Lukk formene med den øverste halvdelen av formen i riktig retning. Plasser en sekskantet stålstang over midten og klem på begge sider.
    4. Fyll på toppen med PDMS.
    5. Herd formene i en 65 °C ovn i minst 4 timer.
    6. Fjern plattformene fra formene etter avkjøling til romtemperatur.
    7. Rengjør enhetene i et ultralydbad med 1 times sykluser av oppvaskmiddel, 400 ml 100% isopropanol og destillert vann.
    8. Tørk over natten ved 65 °C.
    9. Bløtlegg glassdeksler i 1% ikke-ionisk overflateaktivt middel polyol i 30 minutter, og sørg for at dekslene ikke stables slik at de alle er riktig belagt.
    10. Skyll godt med destillert vann og tørk over natten ved 65 °C.
    11. Bruk en plasma renere på høy med 6 L / min oksygen i 1-2 min til behandle glass coverlips og PDMS plattform. Når de er behandlet, lim de to sammen ved å trykke PDMS ned på dekslippen i minst 30 s.
    12. Autoklav de bundne enhetene før du legger til celler.

2. Bygge et optisk stimuleringsoppsett

  1. Bruk et 30 mm burkubesystem til å feste et 573 nm dikroisk speil i midten. Par en rød 627 nm LED med et 594 nm langpass eksitasjonsfilter og fest det til oversiden av kuben, med LED-lampen vendt mot speilet. Fest deretter en blå 488 nm LED med et 546 nm kortpass eksitasjonsfilter til den tilstøtende siden av kuben, med LED-lampen vendt mot speilet som vist i skjemaet i figur 3A.
  2. Fest en ringaktivert irismembran til bunnen av burkuben for å kontrollere størrelsen på det opplyste området.
  3. Strøm hver LED med en T-Cube LED-driver og kontroller via et Arduino Uno Rev3-kort. Koble sideinngangen til LED-driveren til en strømkildeplugg, koble den midterste utgangen til Arduino, og koble sideutgangen direkte til lysdiodene.
  4. Koble Arduino Uno til en PC med en USB-kabel.
  5. Last ned filer fra GitHub-koblingen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Åpne filen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" fra GitHub-mappen.
  7. Angi startparametere: Trinn = 30; startFrekvens = 0,5; sluttFrekvens = 3; pulseLength = 100.
  8. Forsikre deg om at pin-utgang 4 er tilordnet den blå LED-driveren og at pin-utgang 2 er tilordnet den røde LED-driveren. Kontroller at de midterste ledningene til LED-driveren er koblet til bakken og til den respektive pinneutgangen.
  9. Kompiler og last inn "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" -programmet til Arduino.
  10. Koble hver LED-driver til den tilsvarende kanalen.

3. Cellekulturoppsett (dag -21-0)

  1. Primære skjelettmuskelceller
    1. Tine og ekspandere primære skjelettmyoblaster (hentet fra Cook Myosite) i maksimalt seks passasjer ved bruk av myotonisk vekstmedium (+ supplement). Vedlikehold celler i en inkubator satt til 37 ° C og 5% CO2.
    2. Bytt media hver 2.
    3. Når cellene er omtrent 60% sammenflytende, passasje dem ved hjelp av 0,05% Trypsin-EDTA (1x, i 5 minutter ved 37 ° C). Samle de dissosierte cellene og tilsett friske medier for å nøytralisere trypsinet.
    4. Spinn ned cellene ved 300 x g og aspirer supernatanten over cellepelleten.
    5. Resuspender cellene med MGM og frø 1:3 med 60 ml per trippellags kolbe.
  2. ChR2-hiPSC
    MERK: Alle cellelinjer for dette arbeidet ble opprettet og brukt i samsvar med de institusjonelle retningslinjene fra Columbia University, NY, USA. I denne protokollen ble ChR2-uttrykkende hiPSCer generert via CRISPR-Cas9 genomredigering ved hjelp av tidligere beskrevne metoder18, men eventuelle stabile optogenetiske cellelinjer (lentivirale, piggyBac, etc.) kan brukes på samme måte. Konstitutive promotorer uttrykt i både iPSCs og motoneurons ble valgt (CAG). Cellene ble funnet å ha sunn karyotype, som nevnt i tidligere publikasjoner18,19.
    1. Coat 6-brønns plater med 1 ml / brønn av solubilisert kjellermembranmatrise fortynnet i DMEM / F12 (1: 80) og inkuber platene ved romtemperatur i 1 time.
    2. Frø-iPSC-er på belagte 6-brønnsplater med 2 ml materfritt cellekulturmedium (iPSC-medier), utveksling av 2 ml media annenhver dag og passerer hver 5-7 dag. Vedlikehold celler i en inkubator satt til 37 ° C og 5% CO2.
    3. Bestått
      1. Dissosiere stamcellene ved å inkubere med 1 ml enzymfritt stamcellefrigjørende reagens i 4 minutter og skjære mekanisk med en bred spiss P1000 pipette.
      2. Frøceller i forholdet 1:24 eller 1:48 i iPSC-medier med 2 μM Y-27632 dihydroklorid i 2 ml / godt på belagte 6-brønns plater.

4. Skjelettmuskelvevsåing (dag -3)

  1. Isoler og tell 30 x 106 myoblaster ved hjelp av en automatisert celleteller.
  2. Resuspender myoblastene i en 4:1 blanding av 3 mg/ml kollagen I og solubilisert kjellermembranmatrise (800 μL kollagenblanding + 200 μL kjellermembranmatrise for å nå et endelig volum på 1 ml). For kollagenkomponenten tilsettes det medfølgende nøytraliserende middel (9: 1 blanding av kollagen til nøytraliserende middel) og fortynne blandingen med 1x PBS for å oppnå et volum på 800 μL.
  3. Tilsett 15 μL cellekollagen suspensjon til hvert muskelkammer i bioreaktoren, og sørg for å spre suspensjonen over begge stolpene ved hjelp av pipettespissen (figur 2).
  4. La celle-gel-blandingen polymerisere ved 37 °C i 30 minutter, og fyll deretter hver bioreaktorbrønn med 450 μL myotonisk vekstmedium.
  5. Etter 3 dager (når gelen har komprimert), begynn myotube differensiering.

5. Myotube differensiering (dag 0-14)

  1. Begynn myotubeinfusjonen ved å bytte vev til 450 μL fusjonsinduserende medier (FS, tabell 1) i 7 dager, og bytt media annenhver dag.
    MERK: Prøv å begynne myotube differensiering på samme dag som motoneuron differensiering fra hiPSCs for å frø motoneurons på slutten av begge celletyper 'differensiering tidsplaner.
  2. På dag 7 endres mediet til 450 μL modningsmedium Ia (MMIa, tabell 1).
  3. På dag 9 endres til 450 μL modningsmedier Ib (MMIb, tabell 1).
  4. På dag 11 bytter du media til 450 μL NbActiv4. Fortsett å bytte media hver 2. dag til motonevronene er sådd (trinn 7).

6. Motoneuron differensiering (dag 0-14)

MERK: Vår motoneuron differensieringsprotokoll ble tilpasset fra Maury et al8.

  1. På dag 0, overfør 4 x 106 ChR2- hiPSC-er til en petriskål med ultralavt feste med 15 ml motoneuron suspensjonskulturmedium (MSCM, tabell 1). Supplement MSCM med 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat og 5 μM Y-27632 dihydroklorid.
  2. På dag 2 isolerer du nevrosfærene (NS) med en 37 μM reversibel sil og replate i 15 ml MSCM med 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat og 0,1 μM retinsyre. NS skal være synlig i petriskålen uten å bruke mikroskop etter dag 2.
  3. På dag 4 overfører du cellene og mediet til et rør på 50 ml og lar nevrosfærene legge seg til bunnen (5 minutter). Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 15 ml MSCM supplert med 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 og 0,1 μM retinsyre.
  4. På dag 7 gjentar du trinn 6.3. men resuspender cellene i 15 ml MSCM supplert med 0,5 μM SAG og 0,1μM retinsyre.
  5. På dag 9 gjentar du trinn 6.3. men resuspendceller i 15 ml MSCM supplert med 10 μM DAPT.
  6. På dag 11 gjentar du trinn 6.3. men resuspender cellene i 15 ml MSCM supplert med 20 ng/ml BDNF og 10 ng/ml GDNF.
  7. På dag 14 frøer du motoneuronene inn i plattformen.

7. Såing av motoneuroner i bioreaktor (dag 14)

  1. Forbered en 4:1 gelblanding på 2 mg/ml kollagen I og Matrigel (800 μL kollagenblanding + 200 μL Matrigel for å nå et endelig volum på 1 ml). For kollagenkomponenten tilsettes det medfølgende nøytraliserende middel (9: 1 blanding av kollagen til nøytraliserende middel) og fortynner blandingen med 1x PBS for å oppnå et endelig volum på 800 μL.
  2. Bruk en 400 nm celle sil for å velge store nevrosfærer og resuspendere dem i gelblandingen.
  3. Aspirer media fra reservoaret og forsiktig fra nevrosfærebrønnen (figur 2).
  4. Tilsett 15 μL gelblanding i nevrosfærekanalen.
  5. Legg en 10 μL pipette med 10 μL gel og velg deretter en nevrosfære.
  6. Deponer NS i nevrosfærekanalen og sørg for at NS er i kammeret. Løft pipetten sakte mens du slipper den gjenværende gelen når NS er avsatt. Hvis du er usikker på om NS ble riktig deponert, sjekk plasseringen ved hjelp av et mikroskop.
  7. La gelen polymerisere i 30 minutter ved 37 °C.
  8. Tilsett 450 μL NbActiv4 supplert med 20 ng/ml BDNF og 10 ng/ml GDNF i reservoarene.
  9. Bytt media annenhver dag for å tillate aksonal vekst fra NS til muskelvev.

8. Samtidig optisk stimulering og videoopptak av NMJ-funksjon (dag 24+)

  1. For bildebehandling, bruk et omvendt fluorescerende mikroskop med et vitenskapelig komplementært metalloksid-halvleder (sCMOS) kamera.
  2. Sett kameraets programvare binning til 2x2, eksponering til 20 ms, rullende lukker PÅ, avlesningshastighet til 540 MHz, dynamisk område: 12-bits forsterkning 1, og sensormodus: overlapping.
  3. Bruk 2x mål på mikroskopet for å avbilde mikrotissuene.
  4. Fest et levende cellekammer (37 °C, 5 % CO2) til mikroskopstadiet.
  5. Velg interesseområdet (ROI) som inneholder det innerverte skjelettvevet for å minimere filstørrelsen og behandlingstiden.
  6. Plasser et 594 nm langpasserende utslippsfilter mellom prøven og bildemålet for å filtrere ut blålyspulser fra kameraet.
  7. Plasser en rektangulær 4-brønns plate som inneholder 4 bioreaktorer (24 vev) inn i levende cellekammer.
  8. Klikk på Live View. Midtstill og fokuser bildet med ønsket avkastning.
  9. Last opp den egendefinerte makrokoden fra GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) for å kontrollere sceneposisjonen, Arduino-kortet og videoinnhentingen.
  10. Sett utgangsfilm som: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Kjør makrokoden med de ønskede X,Y-koordinatene satt på scenen og skaff deg et raskt tidsforløp med 1700 bilder ved 50 bilder/s.
  12. Bytt ut mediet etter bildebehandling og returner prøvene til inkubatoren. Tillat minst 24 timer mellom bildeinnhentingsøkter for å unngå vevstretthet.

9. Batchbehandling og analyse (dag 24+)

  1. Behandling av filmer
    1. Bruk den egendefinerte MATLAB-koden til å behandle videoene i batchanalyse. Filene kan lastes ned fra GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Funksjonene er listet opp og forklart i tabell 2.
      MERK: Koden er kompatibel med formatene .nd2 og .czi. Det krever parallell prosessering for å aktiveres i MATLAB og trenger bioformatpakken.
    2. Kjør det rekursiveOSAnalysis-skriptet for å analysere filmene gjennom parallell behandling. Ha alle de anskaffede videoene i samme mappe og velg den mappen når du kjører koden.
    3. Juster parametrene etter analyse etter behov.
      1. Endre baselinetime (alternativ 1) hvis spontankontraksjon fanges opp ved begynnelsen av registreringen. Dette vil vise en innledende lesing langt over 0 og må rammen skiftes for å kompensere.
      2. Endre peakThreshold (alternativ 2) hvis riene ikke registreres. Koden vil oppdage sammentrekninger som er over 25 % av den høyeste toppen som standard, slik at denne verdien kan endres.
      3. Endre minMinProminence og minMinWidth for å justere følsomheten når du oppdager starten på hver topp.
    4. Generer video- og grafutgang.
      1. Kjør rekursivOSMovie for å generere en videofil for hvert vev med sitt respektive kontraktilitetsspor.

10. Forstyrrelse av NMJ-funksjonen (dag 24+)

  1. Klargjør behandlingsmedier ved å legge til ekstern effektor til NbActiv4 basalmedier supplert med 20 ng/ml BDNF og 10 ng/ml GDNF.
    1. For MG sera-eksperimentet, bruk 20% MG pasient sera i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. For BTX-eksperimentet, bruk 5 μg / ml BTX i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimuler/ta bilder ved hjelp av trinn 3.2. for å registrere grunnlinjen.
  3. Erstatt mediet i vev med behandlingsmedier (450 μL/vev).
  4. Inkubere for ønsket tid (48 timer for pasient sera, 20 min for BTX).
  5. Stimuler/ta bilder igjen ved hjelp av trinn 3.2. for å registrere funksjon etter behandling.
  6. Fjern behandlingsmediet og la vevet hvile i ønsket tid (48 timer etter serafjerning)
    MERK: Tillat minst 24 timer mellom stimulering og bildebehandling for å unngå vevstretthet

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nevromuskulære veikryss ble generert ved samdyrking av optogenetiske hiPSC-avledede motonevroner med ikke-optogenetisk skjelettmuskulaturvev. Humane primære skjelettmyoblaster (SkM) ble sådd inn i plattformene og differensiert i multinukleerte myotuber ved hjelp av 2-ukers protokollen. De optogenetiske motonevronene ble differensiert separat, men parallelt med myotubedifferensieringen, og deretter sådd inn i plattformen (figur 1). Vevet begynte å trekke seg sammen som svar på stimulering av blått lys 7-12 dager etter MN-såing, noe som indikerer vellykket utvikling og modning av NMJ-ene. NMJ-ene kan dyrkes, stimuleres og avbildes i opptil 40 dager etter motoneuronsåing, men det optimale tidspunktet oppstår på dag 1619. Den morfologiske og biokjemiske valideringen av differensieringene og tilstedeværelsen av de optogenetiske proteinene er vist i supplerende figur 1 og er validert i tidligere studier18,19.

For å demonstrere at protokollen lett kan tilpasses forskjellige kultursystemer, ble strategien testet ved hjelp av to forskjellige compartmentalized reaktorer: en mikrofluidisk enhet og en åpen brønn bioreaktor. Begge systemene har en lignende design, med ett kammer utstyrt med søyler for generering av skjelettmuskelvev og et andre kammer for kulturen av 3D motoneuronaggregater som kan forlenge aksoner for å innervere skjelettvevet (figur 2A, B). Imidlertid har de to systemene forskjellige skalaer, med den mikrofluidiske enheten som gir 1 mm langt skjelettmuskelvev som består av ca. 20 000 myoblaster (figur 2C) og det åpne bioreaktorsystemet som resulterer i 4 mm lange muskelvev som består av ca. 450 000 myoblaster (figur 2D).

For å muliggjøre kontrollert stimulering av de optogenetiske NMJ-ene ble det bygget et optisk oppsett, bestående av en rød 637 nm LED for brightfield-belysning, en blå 488 nm LED for aktivering av ChR2-MNs, og et blått lysfilter mellom vevsprøven og målet for å forhindre at blått lys forstyrrer bildeanalysen (figur 3A). Lysdiodene ble drevet av LED-drivere og styrt nøyaktig via en Arduino mikroprosessor. NMJ-funksjonen ble evaluert ved samtidig å anskaffe time-lapse-videoer mens de stimulerte MNs med blått lys ved hjelp av et tilpasset mikroskopmakroskript parret med Arduino-koden (figur 3B). Protokollen økte stimuleringsfrekvensen fra 0,2 Hz til 2 Hz i 30 trinn. Når filmene var anskaffet, ble vevsfunksjonen analysert ved hjelp av en tilpasset MATLAB-pakke (figur 3C). Analysen målte vevsforskyvning, genererte et kontraktilitetsspor og synkroniserte det med lysstimuleringsprotokollen. Den bestemte deretter fraksjonen av effektive pulser (F) og en forventet brøkdel av effektive pulser (E) for å ta hensyn til potensielle ustimulerte sammentrekninger. Den forventede fraksjonen (E) ble beregnet som den brøkdelen av pulser som ville bli merket som effektive hvis sammentrekningene var tilfeldig fordelt innen 30 s. Vevsskåren ble deretter beregnet som (F-E)/(1-E), med en verdi mellom 0 og 1 (figur 3C). Koden bestemmer om en sammentrekning utløses basert på tiden mellom en lyspuls og starten på kontraktilitetstoppen, som vist i figur 3D. Denne automatiserte, objektive metoden tillater gjentatt karakterisering av NMJ-funksjonen i store utvalgsstørrelser og over tid. Koden inneholder justerbare parametere som kan justeres etter behandling for å sikre korrekt skåring (supplerende figur 2).

Systemets evne til kvantitativt å karakterisere NMJ-funksjonen over tid ble demonstrert ved å avbilde en gruppe vev i 11 dager (dag 9 til dag 20 etter motoneuronsåing). Systemet fanget opp forbedring av NMJ-funksjonen i vev, og viste en økning i utløst respons 1 uke etter vevsfabrikasjon (figur 4A), etterfulgt av en stabil funksjon i ytterligere en uke (figur 4B). For å verifisere at elektrostimulering skjedde gjennom NMJs, ble en annen gruppe vev analysert før og etter 20 minutters inkubasjon med 5 μg / ml av nevrotoksinet α-bungarotoxin (BTX), som binder seg spesifikt og irreversibelt til acetylkolinreseptorer. BTX stoppet alle utløste og spontane sammentrekninger, resulterte i en fullstendig forstyrrelse av NMJ-funksjonen, og viste at lysstimulering av vevet krever en funksjonell NMJ (figur 4C, D). Serielle fortynninger av BTX ble først testet for å identifisere optimal BTX-konsentrasjon (resultater ikke vist).

For å evaluere systemets translasjonsevne ble NMJ-funksjonen vurdert før og etter tilsetning av serum fra fem myasthenia gravis-pasienter. Analyse av vev behandlet med 20% MG serum i 48 timer viste redusert funksjon sammenlignet med kontrollvev behandlet med serum fra friske givere (figur 4E, F). De konstruerte NMJ-ene ble også evaluert igjen 48 timer etter fjerning og utvasking av serumet og viste gjenoppretting av funksjon (figur 4F). I tillegg ble økende konsentrasjoner av pasientserum og normal human serumkontroll (5%, 20%, 40%) testet for å identifisere den optimale konsentrasjonen som påvirket vevsfunksjonen. Resultatene viste systemets evne til å karakterisere og kvantifisere NMJ-funksjon og til å modellere myasthenia gravis in vitro.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentell design og tidslinje. Tidslinje (dager) for differensiering og såing til plattformer. SKM = skjelettmuskulatur, ChR2 = optogenetiske motonevroner, NMJ = nevromuskulært veikryss. Dette tallet er modifisert med tillatelse fra Vila et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Samkultursystemer for generering av 3D NMJ-er. (A) Skjematisk av den mikrofluidiske plattformen. (B) Skjematisk av PDMS-bioreaktoren med åpen brønn. (C) Innervert skjelettmuskelvev i den mikrofluidiske plattformen. (D) Innervert vev i åpen brønn bioreaktor. Vektstang 0,5 mm. Dette tallet er modifisert med tillatelse fra Vila et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Stimulering, registrering og analyse av NMJ-funksjon. (A) Skjematisk av LED-oppsett og lysbane. (B) Optisk oppsett med et omvendt mikroskop, levende cellekammer, automatisert scene og sCMOS-kamera. (C) Algoritme for batchbehandling av optiske stimuleringsvideoer av NMJ-kulturer. (D) Representativ ramme av videoen generert av MATLAB-koden og den tilsvarende kontraktilitetssporingsgrafen. Den blinkende blå boksen i videoen og de vertikale linjene i grafen indikerer når stimuleringen av blått lys oppstår. Dette tallet er modifisert med tillatelse fra Vila et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. NMJ-funksjon. (A) Kontraktilitetsspor for 3D-konstruerte humane NMJ-er. (B) Score for NMJs som respons på lys, som viser forbedring av funksjon over 11 dager (n = 47, enveis ANOVA p = 1 x 10-8). Feilstaver = MM (C) Kontraktilitet spores etter 20 minutters behandling med 5 mg/ml av nevrotoksinet α-bungarotoxin (BTX). (D) Kvantifisering av NMJ-funksjon (skår) før og etter behandling med BTX (n = 6; enveis ANOVA F = 9 x 10-8). (E) Spor av kontraktilitet av vev med 20 % MG sera etter 48 timers behandling. (F) NMJ-funksjonsvurdering for behandlede og kontrollgrupper før og etter behandling og etter restitusjon (n = 12; etter behandling post hoc ANOVA F = 0,0002; *indikerer p = 0,0015 **indikerer p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS = normalt humant serum). n angir antall biologiske replikasjoner. Dette tallet er endret med tillatelse fra Vila et al.18,19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Myogene og nevrale medieformuleringer. Organisert liste over vekstfaktorer og kosttilskudd for media. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2. Liste over MATLAB-funksjoner. Korte forklaringer av MATLAB-funksjoner som brukes til bildeanalyse. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Vila et al.18. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfiler

Supplerende figur 1. Myotube og motoneuron differensieringer. (A) Myotube differensieringsprotokoll (MM = modningsmedier). (B) Immunofluorescens (IF) bilder som viser uttrykk for skjelettmuskelmarkører myosin tung kjede (MHC), α-aktinin og desmin i differensierte myotubes. (C) Motoneuron differensieringsprotokoll. (D) Lokalisering av kanalrhodopsin-2 med YFP (ChR2-YFP) til membran i optogenetiske iPSCer og (E) MNs som bekrefter vellykket infeksjon. (F) Samuttrykk av kolin acetyltransferase (ChAT, rød) og ChR2 (grønn) i optogenetiske MNs. Skalastenger 100 μm. Gjengitt med tillatelse fra Vila et al.18. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Feil behandling som krever justering av parametere. (A) Feil grunnlinjetid resulterer i topper med feil form. (B) En toppterskel som er for høy, resulterer i at topper blir uoppdaget. (C) For milde forhold for påvisning av minima (dvs. for lave verdier valgt for minMinProminence og/eller minMinWidth) resulterer i at minima blir merket i midten eller til og med toppen av toppene, og blir derfor regnet som "untriggered" fordi de starter for langt fra den foregående lyspulsen. (D) For strenge forhold for påvisning av minima resulterer i at starten av toppen blir merket før lyspulsen eller til og med mangler, som i dette eksemplet. Gjengitt med tillatelse fra Vila et al.18. Fil som viser 3D-modell av bioreaktorplattform som kan redigeres og eksporteres for å lage former for bioreaktorproduksjon ved hjelp av PDMS. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Supplerende CAD-fil. Fil som viser 3D-modell av bioreaktorplattform som kan redigeres og eksporteres for å lage former for bioreaktorproduksjon ved hjelp av PDMS. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette systemet er en konstruert 3D menneskelig vevsmodell som kombinerer optogenetikk og videobehandling for å muliggjøre automatisert og upartisk evaluering av NMJ-funksjonen. Ved hjelp av en standardisert protokoll har vi vist evne til å måle endringer i NMJ-funksjon under fysiologisk utvikling og karakterisere de skadelige effektene av patologier som nevrotoksineksponering og myasthenia gravis patient sera.

Tidligere studier har rapportert evnen til å modellere MG med optogenetiske hPSC-avledede motoneuroner i kokultur med skjelettmyotuber ved bruk av MG pasient sera22. Systemet var imidlertid i 2D og registrerte sammentrekninger på tilfeldige steder, og begrenset dermed reproduserbarheten og reduserte modellens kvantitative evne. En av de største fordelene med systemet vårt, sammenlignet med et 2D-system, er at det lar oss etterligne 3D-miljøet, noe som mer nøyaktig letter cellulær og morfologisk utvikling mellom MNs og SkMs. Det er gode bevis som støtter at de biomekaniske signalene som kreves for at et vev skal oppføre seg som sin opprinnelige fysiologi, er overlegent etterlignet i et 3D-system 13,14,15,16. I tillegg tillater ulike aspekter av 3D-systemet et mer kontrollert miljø: rettet dannelse av synapser, mindre heterogenitet mellom prøver, økt romlig-temporal kontroll av stimulering via optogenetikk og et automatisert høy gjennomstrømningssystem som reduserer subjektiviteten til hver prøves analyse.

Det utviklede systemet kan brukes til å modellere andre nevromuskulære sykdommer (NMD), som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Duchenne muskeldystrofi (DMD) og andre. Selv om ALS-patofysiologi innebærer dysfunksjon av selve motorneuronet i stedet for det nevromuskulæreveikrysset 17,27, har systemet vårt evnen til å rekapitulere sykdomstilstanden til ALS ved å vise redusert muskelkontraksjon etter nevrondegenerasjon eller skade. DMD er en muskulær degenerativ sykdom forårsaket av mangel på dystrofinprotein, noe som fører til muskel svakhet og til slutt degenerasjon28. Systemet kan modellere DMD ved å inkorporere genetisk konstruert skjelettmuskulatur som bærer en dystrofinhemmer eller syke muskelceller som mangler dystrofin. Samlet sett har systemet fleksibilitet og kraft til å rekapitulere ulike NMD-er i en in vitro 3D-plattform.

For en protokoll som krever ulike kilder til celler, hver med bestemte nivåer av samløp, er en av de mest kritiske aspektene timing. Under utvidelsen av primære skjelettmuskelceller er det viktig å ikke la dem bli for sammenflytende (65% -70%) på grunn av fusjon. Til tider, selv når du bruker trypsin for å bryte opp klumpene, har det blitt observert at dette betyr lavere effektiv såing i bioreaktorene. Et annet kritisk aspekt er produksjonen av bioreaktorplattform med åpen brønn. For å øke homogeniteten mellom PDMS-plattformene, bør tiden de bruker i ovnen holdes jevn på tvers av alle plattformer for å unngå svingninger i de mekaniske egenskapene til plattformstolpene. I tillegg, under såing av muskelcellene inn i reaktorene, for å opprettholde konsistensen av såtettheten, er det fornuftig å virvle røret forsiktig (1-1,5 s) mellom hvert to til tre rom i bioreaktorene. Til slutt ble suksessraten for NMJ-utvikling sett på å være avhengig i stor grad av suksessen til motoneuronsåing siden tilsetningen av nevrosfærer er så delikat og varierer fra person til person. Med såingspraksis øker suksessraten, slik at omtrent 90% av initierte kulturer kan stimuleres og avbildes.

For tiden er noen begrensninger som kan løses i nær fremtid inkorporering og validering av andre optogenetiske proteiner enn ChR2 diskutert. Spesifikk kontroll over både celletyper og optogenetiske sensorer for spennings- / kalsiumavbildning eller muskelmetabolisme kan legges til systemet for økt avlesning og analyse. Da blått lys induserer fototoksisitet ved høye doser, var stimuleringsregimet begrenset til 30 s. Denne effekten kan forbedres ved å inkorporere et rødforskjøvet kanalrhodopsin for stimuleringsstudier med lengre varighet. I tillegg er en annen begrensning som kan forbedres i fremtidige iterasjoner av modellen, mangelen på nevronstøttende celler som Schwann-celler. Allsidigheten til denne plattformen og analysekoden gjør det imidlertid mulig å innlemme en rekke optogenetiske konstruksjoner og celletyper. Mens vår ChR2-hiPSC-linje ble opprettet ved hjelp av CRISPR, kan andre metoder brukes til å implementere en optogenetisk respons i hiPSCs. Videre, med tilpasningsevnen til hiPSC, kan NMJ-modellen utvikles fra en enkeltcellekilde, slik at pasientspesifikke modeller kan brukes til å studere nevromuskulære sykdommer18.

Denne plattformen gir gjentatt, automatisert og upartisk analyse av menneskelig NMJ-funksjon over tid og kan oppdage kvantifiserbare endringer i funksjon på grunn av eksterne effektorer, som nevrotoksiner eller MG pasientserum. Samlet sett tillater vårt 3D-system undersøkelse av menneskelig NMJ-funksjon tidlig i sykdomspatologi, gir mulighet for narkotikascreening og legger grunnlaget for et robust system for å fremme presisjonsmedisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkjenner takknemlig finansieringsstøtte fra NIH [tilskuddsnummer EB025765 og EB027062], DOD [tildelingsnummer W81XWH-18-1-0095] og UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Vi takker Columbia University Stem Cell Core for deres hjelp og veiledning med celle omprogrammering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Bioteknologi utgave 182
Engineering og karakterisering av en optogenetisk modell av det menneskelige nevromuskulære krysset
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter