Summary
我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。
Abstract
重症筋無力症(MG)などの多くの神経筋疾患は、神経筋接合部(NMJ)の機能不全と関連しており、動物とヒトの生理学的差異のために動物モデルで特徴付けることは困難である。組織工学は、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの in vitro モデルを提供する機会を提供します。誘導多能性幹細胞(iPSC)に光遺伝学的タンパク質を組み込むことで、特定の波長の光で刺激できるニューロンを作製しました。NMJが健康で機能的である場合、運動ニューロンからの神経化学的シグナルは筋肉収縮をもたらす。光遺伝学と微細加工を組織工学と統合することにより、ビデオ解析を使用してNMJ機能を特徴付けるための偏りのない自動化された方法論を確立しました。NMJ形成、同時ビデオ録画による光刺激、および組織収縮性のビデオ分析のために標準化されたプロトコルが開発された。骨格筋収縮を誘導するための光による光遺伝学的運動ニューロンの刺激は、ヒトNMJ生理学を反復し、時間の経過とともに様々な入力に応答してNMJの反復機能測定を可能にする。我々は、このプラットフォームの能力が時間の経過とともに神経筋接続性の機能的改善を示し、NMJ機能に対する患者のMG抗体または神経毒の有害な影響を特徴付ける能力を実証します。
Introduction
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロン(MN)と骨格筋細胞(SkM)との間の化学シナプスであり、筋肉の収縮を可能にする。神経毒α - バンガロトキシン(BTX)などの毒素、または重症筋無力症(MG)のような神経筋疾患(NMD)は、NMJの変性および筋肉制御の低下をもたらし得る1。バイオエンジニアリングされたヒト組織モデルは、ヒトNMJの機能的および生理学的メカニズムをよりよく再現し、動物モデルよりも大きな翻訳可能性を提供する。
動物モデルはNMJの形成と機能の理解を進めてきたが、ヒトと動物のシナプスの間には、ヒトへの結果の翻訳を制限し、NMJのインビボ特性評価を困難にする有意な違いがある2,3,4。研究では、マウスとヒトのNMJの間に明確な生理学的違いが示されています。マウスは、ヒトNMJと比較してNMJが大きく、活性ゾーン密度が小さくなっています4。さらに、動物モデルで実施された薬物研究は、ヒト臨床試験で見出された効果を必ずしも反映しているとは限らない。操作されたヒト組織モデルは、NMJの健全な発達および神経筋疾患の病理を研究する機会を提供し、薬物スクリーニングを可能にする。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)5は、骨格筋細胞6,7および運動ニューロン8,9を含む様々な細胞型に分化させることができる。hiPSCは患者細胞から容易に生成することができ、患者固有の組織モデルを通じて、より良い疾患モデリング10および薬物スクリーニング11,12を可能にする。
SkMsとMNの2次元(2D)単層共培養は、生理学的NMJの形態、表現型、組織、および機能的挙動を欠いている。 NMJは2D培養においてランダムに形成され、分析のための運動ユニットの単離を阻害し、正確な機能測定を制限し、反復的で体系的な実験のためのそれらの使用を妨げる13.NMJの3次元(3D)組織モデルは、これらの制限の多くを克服し、生理学的NMJの形態学的および機能的特徴を反復する7、14、15、16、17。このモデルを使用して、2つの組織タイプを別々に開発し、軸索成長を導くことによって統合し、2D培養システムと比較してより組織化されたNMJを発達させることを可能にする。
我々の以前の研究は、光遺伝学と組織工学を組み合わせることで、NMJ機能の正確な非侵襲的刺激および評価を可能にすることを実証した18,19。遺伝子工学を通じて、光感受性タンパク質をhiPSCのゲノムに組み込むことができます。青色光に応答して開くイオンチャネルであるチャネルロドプシン-2(ChR2)をニューロンなどの興奮性細胞の膜に統合することで、細胞活性化に対する非接触時空間制御が可能になる20、21、22。ChR2を担持するhiPSCは、青色光に敏感な光遺伝学的運動ニューロンに分化することができ、ニューロンを刺激する典型的な侵襲的電極の必要性を排除し、電極23による筋細胞の望ましくない刺激を回避する。このシステムは、光遺伝学的運動ニューロンを使用して、非光遺伝学的骨格筋細胞の収縮を刺激する。ビデオ取得と制御された青色光照明を組み合わせることで、共培養組織を同時に刺激し、NMJ機能のために記録することができます。
MGは、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)を標的とする自己抗体によって引き起こされ、NMJ機能の低下および筋力低下をもたらす24。これは、提示された症状、電気診断、および血清学的血液検査による自己抗体の検出に基づいて診断される。しかし、MGに関与するすべての自己抗体が同定されているわけではなく、一部の血清陰性患者はMGと診断されているが、認識された抗体はない25,26。我々のシステムは、MG患者からの血清の添加前後のNMJの繰り返しの機能評価を可能にし、MG抗体によって引き起こされる機能的および生化学的変化に関する非常に貴重な洞察を提供する18。当社のプロトコルは、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの3Dインビトロモデルを作成する方法を示しています。我々は、マイクロ流体デバイスとより大きなオープンウェルバイオリアクタープラットフォームの2つのプラットフォームでシステムの汎用性を実証しています。
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Protocol
この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の制度的ガイドラインに準拠して作成され、使用された。
1. バイオリアクターの準備
- バイオリアクター金型を作る
- 補足CADファイルからバイオ リアクターCADファイル をダウンロードするか、カスタム独自の設計を作成します。
- CAM ソフトウェアを使用して、3D モデルから CNC ツールパスを生成します。
- CNCフライス盤を使用してアセタール金型を加工します。
- バイオリアクターの製作
- ポリジメチルシロキサンの10:1のベースと硬化剤の混合物(PDMS、4つのプラットフォーム/金型あたり77gの混合物)を混合する。
- 混合物を真空チャンバーに入れ、すべてのバルブを閉じ、真空をオンにして、気泡が残らなくなるまで混合物を少なくとも30分間脱気する。混合物を金型に注ぎ、真空チャンバ内の金型を1時間脱気する。
- 金型の上半分を正しい向きにして金型を閉じます。スチール製の六角形の棒を中央に置き、両側にクランプします。
- 上部をPDMSで補充します。
- 金型を65°Cのオーブンで少なくとも4時間硬化させます。
- 室温まで冷却した後、プラットフォームを金型から取り外します。
- 1時間のサイクルの食器用石鹸、400mLの100%イソプロパノール、および蒸留水を使用して、超音波浴中で装置を洗浄する。
- 65°Cで一晩乾燥させる。
- ガラスカバースリップを1%非イオン性界面活性剤ポリオールに30分間浸し、カバースリップがすべて適切にコーティングされるように重ならないことを確認します。
- 蒸留水でよくすすぎ、65°Cで一晩乾燥させます。
- 6 L/分の酸素を含む高い場所でプラズマクリーナーを1〜2分間使用して、ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームを処理します。治療が完了したら、PDMSをカバースリップに少なくとも30秒間押し下げて、2つを接着します。
- セルを追加する前に、接着したデバイスをオートクレーブします。
2. 光刺激セットアップの構築
- 30 mm ケージ キューブ システムを使用して、中央に 573 nm ダイクロイックミラーを取り付けます。赤色の 627 nm LED と 594 nm ロングパス励起フィルターを結合し、LED を鏡に向けるように立方体の上側に取り付けます。次に、 図3Aの回路図に示すように、546nmのショートパス励起フィルタを備えた青色の488nmのLEDを立方体の隣接側に取り付け、LEDをミラーに向けます。
- リング作動式アイリスダイヤフラムをケージキューブの底部に取り付けて、照明領域のサイズを制御します。
- T-Cube LEDドライバで各LEDに電力を供給し、ArduinoのUno Rev3ボードを介して制御します。LEDドライバのサイド入力を電源プラグに接続し、中央出力をArduinoに接続し、サイド出力をLEDに直接接続します。
- Arduino宇野をUSBケーブルでPCに接続します。
- GitHub リンク(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)からファイルをダウンロードします。
- GitHubフォルダから「Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino」ファイルを開きます。
- 開始パラメータを設定する: ステップ = 30;開始周波数 = 0.5;終了周波数 = 3;パルス長 = 100。
- ピン出力 4 が青色 LED ドライバに割り当てられ、ピン出力 2 が赤色 LED ドライバに割り当てられていることを確認します。LEDドライバの中央のワイヤがグランドとそれぞれのピン出力に接続されていることを確認します。
- "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" プログラムをコンパイルして Arduino にロードします。
- 各LEDドライバを対応するチャネルに接続します。
細胞培養セットアップ(-21-0日目)
- 初代骨格筋細胞
- 筋緊張性増殖培地(+サプリメント)を用いて、一次骨格筋芽細胞(クックミオサイトから得られた)を最大6継代まで解凍し、展開する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内で維持する。
- メディアは 2 日ごとに交換します。
- 細胞が約60%コンフルエントになったら、0.05%トリプシン-EDTA(1x、37°Cで5分間)を用いてそれらを継代する。解離した細胞を収集し、トリプシンを中和するために新鮮な培地を加える。
- 細胞を300 x g でスピンダウンし、細胞ペレットの上の上清を吸引します。
- 細胞をMGMで再懸濁し、三重層フラスコあたり60mLで1:3にシードする。
- ChR2-hiPSC
注:この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の機関ガイドラインに準拠して作成され、使用されました。このプロトコールでは、ChR2発現hiPSCを前述の方法18を使用してCRISPR-Cas9ゲノム編集を介して生成しましたが、任意の安定な光遺伝学的細胞株(レンチウイルス、ピギーバックなど)を同じ方法で使用できます。iPS細胞および運動ニューロンの両方において発現される構成的プロモーター(CAG)を選択した。この細胞は、以前の刊行物18、19に記されているように、健康な核型を有することが見出された。- 6ウェルプレートをDMEM/F12(1:80)で希釈した1mL/ウェルの可溶化基底膜マトリックスでコーティングし、プレートを室温で1時間インキュベートする。
- 2 mLのフィーダーフリー細胞培養培地(iPSC培地)でコーティングした6ウェルプレート上の種iPSCを、1日おきに2 mLの培地を交換し、5〜7日ごとに継代する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内に維持する。
- 継代
- 1mLの酵素非含有幹細胞放出試薬と共に4分間インキュベートし、広いチップP1000ピペットで機械的に剪断することにより、幹細胞を解離させる。
- iPSC培地中に1:24または1:48の比率で細胞を2mL/ウェルのY-27632二塩酸塩2μMとともにコーティングされた6ウェルプレート上にシードします。
骨格筋組織播種(-3日目)
- 自動セルカウンターを使用して、30 x 106 筋芽細胞を単離してカウントします。
- 筋芽細胞を、3mg/mLコラーゲンIと可溶化した基底膜マトリックスの4:1混合物に再懸濁する(800μLのコラーゲン混合物+200μLの基底膜マトリックスを最終容量1mLに達する)。コラーゲン成分については、付随する中和剤(中和剤に対するコラーゲンの9:1混合物)を加え、混合物を1x PBSで希釈して800μLの体積を達成する。
- バイオリアクターの各筋肉チャンバーに15 μLの細胞コラーゲン懸濁液を加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方のピラーに広げるようにします(図2)。
- 細胞とゲルの混合物を37°Cで30分間重合させ、次に各バイオリアクターウェルに450μLの筋緊張性増殖培地を充填する。
- 3日後(ゲルが圧縮されたら)、筋管分化を開始する。
5.筋管分化(0-14日目)
- 組織を450μLの融合誘導培地(FS、表1)に7日間切り替え、 1日おきに培地を交換することにより、筋管注入を開始する。
注:両方の細胞型の分化スケジュールの最後に運動ニューロンを播種するために、hiPSCからの運動ニューロン分化と同じ日に筋管分化を開始してみてください。 - 7日目に培地を450 μLの成熟培地Iaに変更する(MMIa、 表1)。
- 9日目に、450 μLの成熟培地Ibに変更する(MMIb、 表1)。
- 11日目に、培地を450 μLのNbActiv4に変更します。運動ニューロンが播種されるまで2日ごとに培地を交換し続ける(ステップ7)。
6. 元ニューロン分化(0~14日目)
注:我々の運動ニューロン分化プロトコルは、Maury et al8から適応された。
- 0日目に、4 x106 ChR2-hiPSCsを、15 mLの運動ニューロン浮遊培養培地(MSCM、 表1)を含む超低付着シャーレに移す。MSCMを3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物および5 μM Y-27632二塩酸塩で補います。
- 2日目に、37 μM 可逆ストレーナーでニューロスフェア(NS)を単離し、3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物、および0.1 μM レチノイン酸を含む15 mLのMSCMに再プレートします。NSは、2日目以降に顕微鏡を使用せずにペトリ皿に見えるはずです。
- 4日目に、細胞と培地を50mLチューブに移し、ニューロスフェアが底に沈降するのを待ちます(5分)。上清を吸引し、0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541、および0.1 μM レチノイン酸を添加した 15 mL の MSCM に細胞を再懸濁します。
- 7 日目に、ステップ 6.3 を繰り返します。しかし、0.5 μM SAGおよび0.1μMレチノイン酸を添加した15 mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
- 9 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、10μM DAPTを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
- 11 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、20ng/mLのBDNFおよび10ng/mLのGDNFを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。
- 14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種する。
7. バイオリアクターに運動ニューロン凝集体を播種する(14日目)
- 2 mg/mL のコラーゲン I とマトリゲルの 4:1 ゲル混合物を調製します (800 μL のコラーゲン混合物 + 200 μL のマトリゲルで最終容量が 1 mL に達するまで)。コラーゲン成分については、付属の中和剤(中和剤にコラーゲンを9:1ミックス)を加え、混合物を1x PBSで希釈して、最終容量800μLにします。
- 400 nmの細胞ストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、それらをゲル混合物に再懸濁します。
- リザーバから媒体を吸引し、神経圏ウェルから慎重に吸引します(図2)。
- 15μLのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加える。
- 10 μLのピペットに10 μLのゲルをロードし、1つのニューロスフェアを選択します。
- NSをニューロスフェアチャネルに沈着させ、NSがチャンバー内にあることを確認する。NSが沈着したら、残りのゲルを解放しながらゆっくりとピペットを持ち上げます。NSが正しく堆積したかどうかわからない場合は、顕微鏡を使用してNSの位置を確認してください。
- ゲルを37°Cで30分間重合させる。
- 20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 を 450 μL リザーバーに加えます。
- NSから筋肉組織への軸索成長を可能にするために、1日おきに培地を交換する。
8. NMJ機能の同時光刺激とビデオ録画(24日目以上)
- イメージングには、科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用してください。
- カメラソフトウェアのビニングを2x2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターON、読み出しレートを540MHz、ダイナミックレンジ:12ビット&ゲイン1、センサーモード:オーバーラップに設定します。
- 顕微鏡で2倍の対物レンズを使用して、微小組織を画像化します。
- 生細胞チャンバー(37°C、5%CO2)を顕微鏡ステージに取り付けます。
- 神経支配された骨格組織組織を含む関心領域(ROI)を選択して、ファイルサイズと処理時間を最小限に抑えます。
- サンプルとイメージング対物レンズの間に594nmのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。
- 4つのバイオリアクター(24組織)を含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに入れる。
- [ ライブ ビュー] をクリックします。画像を中央に配置し、目的のROIに焦点を合わせます。
- GitHub フォルダー (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からカスタムマクロコードをアップロードして、ステージの位置、Arduinoボード、およびビデオ集録を制御します。
- 出力ムービーを day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 に設定します。
- ステージ上で設定した目的のX、Y座標でマクロコードを実行し、50フレーム/秒で1700フレームの高速タイムラプスを取得します。
- イメージング後に培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間かかります。
9. バッチ処理と分析(24日目以降)
- 動画処理
- カスタムMATLABコードを使用して、バッチ分析でビデオを処理します。ファイルは GitHub フォルダ (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からダウンロードできます。これらの機能を表 2 にリストし、説明します。
注: このコードは、.nd2 および .czi 形式と互換性があります。MATLABでアクティブ化するには並列処理が必要であり、バイオフォーマットパッケージが必要です。 - 再帰的OSAnalysis スクリプトを実行して、並列処理によってムービーを分析します。取得したすべてのビデオを同じフォルダに保存し、コードの実行時にそのフォルダを選択します。
- 必要に応じて、解析後のパラメータを調整します。
- 記録の開始時に自発的な収縮が拾われた場合は、 baselineTime (オプション 1) を変更します。これは0を超える最初の読み取り方法を示し、補正するためにフレームをシフトする必要があります。
- 収縮が登録されていない場合は、 peakThreshold (オプション 2) を変更します。このコードは、デフォルトで最高ピークの 25% を超える収縮を検出し、この値を変更できるようにします。
- minMinProminence と minMinWidth を変更して、各ピークの開始を検出するときの感度を調整します。
- ビデオとグラフの出力を生成します。
- recursiveOSMovieを実行して、それぞれの収縮性トレースを持つ各組織のビデオファイルを生成します。
- カスタムMATLABコードを使用して、バッチ分析でビデオを処理します。ファイルは GitHub フォルダ (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からダウンロードできます。これらの機能を表 2 にリストし、説明します。
10. NMJ関数の摂動(24日目以降)
- 20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 基礎培地に外部エフェクターを添加して、治療培地を調製します。
- MG血清実験のために、NbActiv4 + BDNF + GDNF中の20%MG患者血清を使用する。
- BTX 実験には、NbActiv4 + BDNF + GDNF で 5 μg/mL の BTX を使用します。
- ステップ3.2を使用して刺激/画像化する。をクリックしてベースラインを記録します。
- 組織内の培地を治療培地(450 μL/組織)と交換します。
- 所望の時間(患者血清の場合は48時間、BTXの場合は20時間)インキュベートする。
- ステップ3.2を使用して再び刺激/イメージします。治療後の機能を記録する。
- 治療培地を除去し、組織を所望の時間(血清除去後48時間)休ませる
注:組織の疲労を避けるために、刺激とイメージングの間に少なくとも24時間かかります
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Representative Results
神経筋接合部は、光遺伝学的hiPSC由来運動ニューロンを非光遺伝学的骨格筋組織と共培養することによって生成された。ヒト原発性骨格筋芽細胞(SkM)をプラットフォームに播種し、2週間のプロトコールを用いて多核筋管に分化させた。光遺伝学的運動ニューロンを別々に分化させたが、筋管分化と並行して、次いでプラットフォームに播種した(図1)。組織は、MN播種後7〜12日目に青色光刺激に応答して収縮し始め、NMJの発達および成熟が成功したことを示している。NMJは、運動ニューロン播種後最大40日間培養、刺激、および画像化することができるが、最適な時点は16〜19日目に生じる。光遺伝学的タンパク質の分化および存在の形態学的および生化学的検証は、補足図1に示されており、以前の研究18,19で検証されている。
プロトコルが異なる培養系に容易に適応できることを実証するために、この戦略は、マイクロ流体装置とオープンウェルバイオリアクターの2つの異なる区画化反応器を使用して試験された。どちらのシステムも同様の設計で、1つのチャンバには骨格筋組織を生成するための柱が設けられ、2番目のチャンバには骨格組織を神経支配するために軸索を拡張できる3D運動ニューロン凝集体の培養が設けられています(図2A、B)。しかし、2つのシステムはスケールが異なり、マイクロ流体デバイスは、約20,000の筋芽細胞を含む長さ1mmの骨格筋組織(図2C)と、オープンウェルバイオリアクターシステムは、約450,000の筋芽細胞を含む長さ4mmの筋肉組織(図2D)をもたらす。
光遺伝学的NMJの制御された刺激を可能にするために、明視野照明用の赤色637 nm LED、ChR2-MNの活性化用の青色488 nm LED、および青色光が画像解析に干渉するのを防ぐための組織サンプルと対物レンズの間の青色光フィルタからなる光学セットアップが構築された(図3A)。LEDはLEDドライバによって駆動され、Arduinoマイクロプロセッサを介して正確に制御されました。NMJ機能は、Arduinoコードと組み合わせたカスタム顕微鏡マクロスクリプトを使用して、青色光でMNを刺激しながらタイムラプスビデオを同時に取得することによって評価されました(図3B)。このプロトコルは、刺激の周波数を0.2Hzから2Hzに30ステップで増加させた。動画が取得されると、カスタムMATLABパッケージを使用して組織機能を解析しました(図3C)。この分析では、組織の変位を測定し、収縮性トレースを生成し、それを光刺激プロトコルと同期させた。次に、潜在的な非刺激収縮を説明するために、有効パルスの割合(F)と有効パルスの予想される割合(E)を決定しました。期待される分率(E)は、収縮が30秒以内にランダムに分布した場合に有効とラベル付けされるパルスの割合として計算されました。次に、組織スコアを(F-E)/(1-E)として計算し、0~1の値で計算しました(図3C)。このコードは、 図3Dに示すように、光パルスと収縮性ピークの開始との間の時間に基づいて収縮がトリガされるかどうかを判定します。この自動化された不偏法は、大きなサンプルサイズで、そして時間の経過とともにNMJ関数の繰り返し特性評価を可能にします。このコードには、正しいスコアリングを保証するために処理後に調整できる調整可能なパラメーターが含まれています (補足図 2)。
NMJ機能を経時的に定量的に特徴付けるシステムの能力は、11日間(運動ニューロン播種後9日目から20日目)の組織群を画像化することによって実証された。このシステムは、組織におけるNMJ機能の改善を捉え、組織作製後1週間でトリガー応答の増加を示し(図4A)、続いてさらに1週間安定した機能を示した(図4B)。NMJを介して筋肉刺激が発生したことを確認するために、アセチルコリン受容体に特異的かつ不可逆的に結合する神経毒α-バンガロトキシン(BTX)の5μg/mLとのインキュベーションの20分前後に別の組織群を分析した。BTXは、すべてのトリガーおよび自発的な収縮を停止し、NMJ機能の完全な破壊をもたらし、組織の光刺激が機能的なNMJを必要とすることを実証した(図4C、D)。BTXの段階希釈は、最適なBTX濃度を同定するために最初に試験された(結果は示さず)。
系の翻訳能力を評価するために、NMJ機能を、5人の重症筋無力症患者からの血清の添加前後で評価した。20%MG血清で48時間処理した組織の分析は、健康なドナーからの血清で処理した対照組織と比較して機能の低下を示した(図4E、F)。操作されたNMJはまた、血清の除去および洗い流しの48時間後に再度評価され、機能の回復を示した(図4F)。さらに、患者血清および正常ヒト血清対照の濃度の増加(5%、20%、40%)を試験し、罹患した組織が機能する最適濃度を同定した。結果は、NMJ機能を特徴付けおよび定量化し、 インビトロで重症筋無力症をモデル化するシステムの能力を示した。
図1.実験計画とタイムライン。 プラットフォームへの差別化とシードのタイムライン(日数)。SkM = 骨格筋、ChR2 = 光遺伝学的運動ニューロン、NMJ = 神経筋接合部。この図は、Vilaらの許可を得て修正されています18。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.3D NMJを生成するための共培養システム。 (A)マイクロ流体プラットフォームの概略図。(b)オープンウェルPDMSバイオリアクターの概略図。(c)マイクロ流体プラットフォームにおける神経支配骨格筋組織。(d)オープンウェルバイオリアクター内の神経支配組織。スケールバー0.5ミリメートル。この図は、Vilaらの許可を得て修正されています18。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.NMJ機能の刺激、記録、解析 (A)LEDのセットアップと光路の概略図。(B)倒立顕微鏡、生細胞室、自動ステージ、sCMOSカメラによる光学セットアップ。(C)NMJ培養物の光刺激ビデオのバッチ処理のためのアルゴリズム。(d)MATLABコードおよび対応する収縮性トレースグラフによって生成されたビデオの代表フレーム。ビデオの点滅する青いボックスとグラフの縦線は、青色光刺激がいつ発生したかを示します。この図は、Vilaらの許可を得て修正されています18。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.NMJ 関数。(A)3D操作されたヒトNMJの収縮性トレース(B)光に応答したNMJのスコア、11日間にわたる機能の改善を示す(n = 47、一元配置分散分析p = 1 x 10-8)。エラーバー = SEM. (C) 神経毒α-バンガロトキシン(BTX)の5mg/mLによる20分処理後の収縮性痕跡。(d)BTXによる処理前後のNMJ機能(スコア)の定量化(n=6;一元配置分散分析F=9×10-8)。(E)治療の48時間後の20%MG血清による組織の収縮性痕跡。(f)治療前後および回復後の治療群および対照群のNMJ機能評価(n = 12;治療後ホック分散分析 F = 0.0002;*はp = 0.0015を示す**p = 3.5 x10−6を示す)(MG = Gravis;NHS=正常なヒト血清)。nは生物学的複製数を示す。この図は、Vila et al.18,19の許可を得て修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.筋原性および神経媒体製剤。 メディアのための成長因子とサプリメントの整理されたリスト. この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2.MATLAB 関数のリスト。 画像解析に使用するMATLAB関数の簡単な説明。この表は、Vila et al.18 の許可を得て修正されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル
補足図1.筋管および運動ニューロン分化。 (a)筋管分化プロトコール(MM=成熟培地)。(b)分化した筋管における骨格筋マーカーミオシン重鎖(MHC)、αアクチニン、およびデスミンの発現を示す免疫蛍光(IF)画像。(C)モトニューロン分化プロトコル。(D)YFP(ChR2-YFP)によるチャネルロドプシン-2の光遺伝学的iPSCおよび(E)MNの膜への局在化は、感染の成功を確認する。(f)光遺伝学的MNにおけるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT、赤)およびChR2(緑)の共発現。Vila et al.18の許可を得て複製。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2.パラメーターの調整を必要とする誤った処理。 (A) ベースライン時間が間違っていると、間違った形状のピークになります。(B) ピークしきい値が高すぎると、ピークが検出されない。(C)最小値を検出するための条件が寛大すぎる(すなわち、minMinProminenceおよび/またはminMinWidthに選択された値が低すぎる)と、ピークの中央または上部に最小値がラベル付けされ、したがって、それらが先行する光パルスからあまりにも遠くに始まるため、「トリガーなし」としてカウントされる。(d)最小値の検出のための条件が厳しすぎると、この例のように、ピークの開始が光パルスの前に標識されるか、または欠落することさえある。Vila et al.18の許可を得て複製。PDMSを使用してバイオリアクター製造用の金型を作るために編集およびエクスポートできるバイオリアクタープラットフォームの3Dモデルを示すファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis
補助 CAD ファイル。 PDMSを使用してバイオリアクター製造用の金型を作るために編集およびエクスポートできるバイオリアクタープラットフォームの3Dモデルを示すファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このシステムは、光遺伝学とビデオ処理を組み合わせて、NMJ機能の自動的かつ偏りのない評価を可能にする、設計された3Dヒト組織モデルです。標準化されたプロトコールを用いて、生理学的発達中のNMJ機能の変化を測定し、神経毒曝露および重症筋無力症患者血清などの病状の有害な影響を特徴付ける能力を実証した。
以前の研究は、MG患者血清を用いた骨格筋管との共培養において、光遺伝学的hPSC由来運動ニューロンを有するMGをモデル化する能力を報告している22。しかし、システムは2Dにあり、ランダムな場所で収縮を記録したため、再現性が制限され、モデルの定量的能力が低下しました。2Dシステムと比較して、私たちのシステムの最大の利点の1つは、MNとSkMsの間の細胞的および形態学的発達をより正確に促進する3D環境をエミュレートできることです。組織がその本来の生理学のように振る舞うために必要な生体力学的手がかりが、3Dシステムにおいて優れて模倣されていることを裏付ける大きな証拠がある13,14,15,16。さらに、3Dシステムのさまざまな側面により、シナプスの指向性の形成、サンプル間の不均一性の低下、光遺伝学による刺激の時空間制御の増加、各サンプルの分析の主観性を低下させる自動ハイスループットシステムなど、より制御された環境が可能になります。
開発されたシステムは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)などの他の神経筋疾患(NMD)をモデル化するために使用することができる。ALSの病態生理学は、神経筋接合部ではなく運動ニューロン自体の機能不全を伴うが、17,27、我々のシステムは、ニューロンの変性または損傷後の筋肉収縮の減少を示すことによってALSの疾患状態を再現する能力を有する。DMDは、ジストロフィンタンパク質の欠乏によって引き起こされる筋肉変性疾患であり、これは筋力低下および最終的な変性をもたらす28。このシステムは、ジストロフィン阻害剤を運ぶ遺伝子操作された骨格筋またはジストロフィンを欠く罹患筋細胞を組み込むことによってDMDをモデル化することができる。全体として、このシステムは、in vitro 3DプラットフォームでさまざまなNMDを再現する柔軟性とパワーを備えています。
それぞれが特定のレベルのコンフルエンシーを持つさまざまな細胞源を必要とするプロトコルの場合、最も重要な側面の1つはタイミングです。初代骨格筋細胞の拡張中は、融合のためにそれらがあまりにもコンフルエント(65%〜70%)にならないようにすることが重要です。時には、トリプシンを使用して凝集塊を分解する場合でも、これはバイオリアクターへの効果的な播種を低下させることを意味することが観察されている。もう1つの重要な側面は、オープンウェルバイオリアクタープラットフォームの生産です。PDMSプラットフォーム間の均質性を高めるためには、プラットフォームピラーの機械的特性の変動を避けるために、オーブンで過ごす時間をすべてのプラットフォームで均一に保つ必要があります。さらに、筋細胞をリアクターに播種する際には、播種密度の一貫性を維持するために、バイオリアクター内の2〜3区画ごとにチューブを穏やかに(1〜1.5秒)渦を巻くことが賢明である。最後に、NMJ開発の成功率は、ニューロスフィアの追加が非常に繊細で人によって異なるため、運動ニューロン播種の成功に大きく依存していると見られました。播種練習では、成功率が向上し、開始された培養の約90%が刺激され、イメージ化されるようになります。
現在、近い将来に対処できるいくつかの制限は、議論されたChR2以外の光遺伝学的タンパク質の組み込みおよび検証である。電圧/カルシウムイメージングまたは筋肉代謝のための細胞型と光遺伝学的センサーの両方に対する特定の制御をシステムに追加して、読み出しと分析を増やすことができます。青色光が高用量で光毒性を誘導するので、刺激レジメンは30秒に制限された。この効果は、より長い期間の刺激研究のために赤方偏移チャネルロドプシンを組み込むことによって改善することができた。さらに、モデルの将来の反復で改善できるもう1つの制限は、Schwann細胞のようなニューロン支持細胞の欠如です。しかし、このプラットフォームと分析コードの汎用性により、さまざまな光遺伝学的構築物と細胞型を組み込むことができます。当社のChR2-hiPSCラインはCRISPRを使用して作成されましたが、他の方法を使用してhiPSCに光遺伝学的応答を実装することもできます。さらに、hiPSCの適応性により、NMJモデルは単一の細胞源から開発することができ、患者固有のモデルを使用して神経筋疾患をさらに研究することができます18。
このプラットフォームは、ヒトNMJ機能の経時的な反復的、自動化された、偏りのない分析を提供し、神経毒やMG患者血清などの外部エフェクターによる定量化可能な機能変化を検出することができます。全体として、当社の3Dシステムは、疾患病理の早期におけるヒトNMJ機能の調査を可能にし、薬物スクリーニングの機会を提供し、精密医療を進歩させるための堅牢なシステムの基礎を築く。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
我々は、NIH[助成金番号EB025765及びEB027062]、国防総省[受賞番号W81XWH-18-1-0095]及びUCSFヘルス・イノベーション・バイ・エンジニアリング(HIVEフェローシップ)による資金支援に感謝する。コロンビア大学幹細胞コアの細胞リプログラミングに関する支援と指導に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NbActiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25x36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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