Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering og karakterisering af en optogenetisk model af det humane neuromuskulære kryds

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Vi beskriver et reproducerbart, automatiseret og upartisk billeddannelsessystem til karakterisering af neuromuskulær krydsfunktion ved hjælp af humant konstrueret skeletmuskelvæv og optogenetiske motoneuroner. Dette system muliggør funktionel kvantificering af neuromuskulær forbindelse over tid og detekterer formindsket neuromuskulær funktion forårsaget af neurotoksiner og myasthenia gravis patient serum.

Abstract

Mange neuromuskulære sygdomme, såsom myasthenia gravis (MG), er forbundet med dysfunktion af det neuromuskulære kryds (NMJ), hvilket er vanskeligt at karakterisere i dyremodeller på grund af fysiologiske forskelle mellem dyr og mennesker. Vævsteknik giver mulighed for at levere in vitro-modeller af funktionelle humane NMJ'er, der kan bruges til at diagnosticere og undersøge NMJ-patologier og teste potentielle terapier. Ved at inkorporere optogenetiske proteiner i inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) genererede vi neuroner, der kan stimuleres med specifikke bølgelængder af lys. Hvis NMJ er sund og funktionel, resulterer et neurokemisk signal fra motoneuronen i muskelkontraktion. Gennem integrationen af optogenetik og mikrofabrikation med vævsteknik etablerede vi en upartisk og automatiseret metode til karakterisering af NMJ-funktion ved hjælp af videoanalyse. En standardiseret protokol blev udviklet til NMJ-dannelse, optisk stimulering med samtidig videooptagelse og videoanalyse af vævskontraktilitet. Stimulering af optogenetiske motoneuroner med lys for at inducere skeletmuskelkontraktioner rekapitulerer human NMJ-fysiologi og giver mulighed for gentagne funktionelle målinger af NMJ over tid og som reaktion på forskellige input. Vi demonstrerer denne platforms evne til at vise funktionelle forbedringer i neuromuskulær forbindelse over tid og karakterisere de skadelige virkninger af patient MG-antistoffer eller neurotoksiner på NMJ-funktionen.

Introduction

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er den kemiske synapse mellem motoneuroner (MNs) og skeletmuskelceller (SkM), der giver mulighed for muskelkontraktion. Toksiner, såsom neurotoksin α-bungarotoxin (BTX), eller neuromuskulære sygdomme (NMD) som myasthenia gravis (MG) kan føre til degeneration af NMJ og reduktioner i muskel kontrol1. Bioteknologiske humane vævsmodeller rekapitulerer bedre de funktionelle og fysiologiske mekanismer i humane NMJ'er og tilbyder større translationelt potentiale end dyremodeller.

Mens dyremodeller har avanceret forståelsen af dannelsen og funktionen af NMJ, er der betydelige forskelle mellem menneskelige og animalske synapser, der begrænser oversættelsen af resultater til mennesker og gør in vivo-karakterisering af NMJ udfordrende 2,3,4. Mus har større NMJ'er og mindre aktive zonetætheder sammenlignet med humane NMJ'er4. Derudover afspejler lægemiddelundersøgelser udført i dyremodeller ikke altid de virkninger, der findes i humane kliniske forsøg. Konstruerede humane vævsmodeller giver mulighed for at studere den sunde udvikling af NMJ og patologien af neuromuskulære sygdomme og give mulighed for lægemiddelscreeninger. Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er)5 kan differentieres i en række celletyper, herunder skeletmuskelceller 6,7 og motoneuroner 8,9. hiPSC'er kan let genereres fra patientceller, hvilket giver mulighed for bedre sygdomsmodellering10 og lægemiddelscreening 11,12 gennem patientspecifikke vævsmodeller.

Todimensionelle (2D) monolagskokulturer af SKMs og MNs mangler morfologi, fænotype, organisation og funktionel opførsel af fysiologiske NMJ'er. NMJ'er dannes tilfældigt i 2D-kultur, hvilket hæmmer isoleringen af motorenheder til analyse, begrænser nøjagtige funktionelle målinger og forhindrer deres anvendelse til gentagne, systematiske eksperimenter13 . Tredimensionelle (3D) vævsmodeller af NMJ'er overvinder mange af disse begrænsninger og opsummerer de morfologiske og funktionelle egenskaber ved fysiologiske NMJ'er 7,14,15,16,17. Ved hjælp af denne model udvikles de to vævstyper separat og integreres derefter ved at styre aksonal vækst, hvilket giver mulighed for mere organiserede NMJ'er at udvikle sig sammenlignet med 2D-kultursystemer.

Vores tidligere undersøgelse viste, at kombination af optogenetik med vævsteknik kan muliggøre nøjagtig ikke-invasiv stimulering og evaluering af NMJ-funktion18,19. Gennem genteknologi kan lysfølsomme proteiner integreres i genomet af hiPSC'er. Integrering af channelrhodopsin-2 (ChR2), en ionkanal, der åbner som reaktion på blåt lys, i membranen i excitable celler såsom neuroner muliggør ikke-kontakt spatiotemporal kontrol over celleaktivering 20,21,22. hiPSC'er, der bærer ChR2, kan differentieres til optogenetiske motoneuroner, der er følsomme over for blåt lys, hvilket fjerner behovet for typiske invasive elektroder, der stimulerer neuroner og undgår uønsket stimulering af muskelcellerne med elektroder23. Dette system bruger optogenetiske motoneuroner til at stimulere sammentrækninger i ikke-optogenetiske skeletmuskelceller. Kombination af videooptagelse og kontrolleret blåt lysbelysning gør det muligt for det samkulturerede væv at blive stimuleret og optaget samtidigt til NMJ-funktion.

MG er forårsaget af autoantistoffer rettet mod nikotinacetylcholinreceptorer (AChR), hvilket resulterer i nedsat NMJ-funktion og muskelsvaghed24. Det diagnosticeres baseret på præsenterede symptomer, elektrodiagnose og påvisning af autoantistoffer via serologiske blodprøver. Imidlertid er ikke alle autoantistoffer involveret i MG blevet identificeret, og nogle seronegative patienter diagnosticeres med MG, men uden anerkendte antistoffer25,26. Vores system giver mulighed for gentagen funktionel vurdering af NMJ før og efter tilsætning af serum fra MG-patienter, hvilket giver uvurderlig indsigt i de funktionelle og biokemiske ændringer forårsaget af MG-antistofferne18. Vores protokol illustrerer, hvordan man producerer 3D in vitro-modeller af funktionel human NMJ, der kan bruges til at diagnosticere og undersøge NMJ patologier og teste potentielle terapier. Vi demonstrerer systemets alsidighed i to platforme, en mikrofluidisk enhed og en større bioreaktorplatform med åben brønd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle cellelinjer til dette arbejde blev oprettet og brugt i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Columbia University, NY, USA.

1. Forberedelse af bioreaktor

  1. Lav bioreaktorforme
    1. Download en BIOREAKTOR CAD-fil fra den supplerende CAD-fil, eller opret et brugerdefineret eget design.
    2. Generer en CNC-værktøjssti fra 3D-modellen ved hjælp af CAM-software.
    3. Maskine acetal forme ved hjælp af en CNC fræsemaskine.
  2. Fremstilling af bioreaktorer
    1. Bland en 10: 1 base til hærdningsmiddelblanding af polydimethylsiloxan (PDMS, 77 g blanding pr. 4 platforme / forme).
    2. Anbring blandingen i et vakuumkammer, luk alle ventiler, tænd for vakuumet, og afgas blandingen i mindst 30 minutter, indtil der ikke er luftbobler tilbage. Hæld blandingen i forme og afgas formene i vakuumkammeret i 1 time.
    3. Luk formene med den øverste halvdel af formen i den rigtige retning. Placer en sekskantet stålstang over midten og klem på begge sider.
    4. Genopfyld toppen med PDMS.
    5. Hærd formene i en ovn på 65 °C i mindst 4 timer.
    6. Fjern platformene fra formene efter afkøling til stuetemperatur.
    7. Rengør enhederne i et ultralydsbad ved hjælp af 1 timers cyklusser af opvaskemiddel, 400 ml 100% isopropanol og destilleret vand.
    8. Tør natten over ved 65 °C.
    9. Blødgør glasovertræk i 1% nonionisk overfladeaktivt stof polyol i 30 minutter, og sørg for, at dækslipsene ikke stables, så de alle er ordentligt belagt.
    10. Skyl godt med destilleret vand og tør natten over ved 65 °C.
    11. Brug en plasmarenser på høj med 6 l / min ilt i 1-2 min til behandle glasovertræk og PDMS-platform. Når de er behandlet, skal du binde de to sammen ved at trykke PDMS ned på dækslen i mindst 30 s.
    12. Autoklave de bundne enheder, før du tilføjer celler.

2. Opbygning af en optisk stimuleringsopsætning

  1. Brug et 30 mm burterningssystem til at fastgøre et 573 nm dikroisk spejl i midten. Par en rød 627 nm LED med et 594 nm langpas excitationsfilter, og fastgør det til oversiden af terningen, med LED'en vendt mod spejlet. Fastgør derefter en blå 488 nm LED med et 546 nm kortpas excitationsfilter til den tilstødende side af terningen, hvor LED'en vender mod spejlet som vist i skemaet i figur 3A.
  2. Fastgør en ringaktiveret irismembran til bunden af burterningen for at kontrollere størrelsen på det belyste område.
  3. Strømforsyn hver LED med en T-Cube LED-driver, og styr via et Arduino Uno Rev3-kort. Tilslut LED-driverens sideindgang til et strømkildestik, tilslut den midterste udgang til Arduino, og tilslut sideudgangen direkte til LYSDIO'erne.
  4. Tilslut Arduino Uno til en pc med et USB-kabel.
  5. Download filer fra GitHub-linket (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Åbn filen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" fra GitHub-mappen.
  7. Indstil startparametre: Trin = 30; startFrekvens = 0,5; slutFrekvens = 3; pulsLængde = 100.
  8. Sørg for, at pin-output 4 er tildelt den blå LED-driver, og at pin-output 2 er tildelt den røde LED-driver. Kontroller, at LED-driverens midterste ledninger er forbundet til jorden og til den respektive pin-udgang.
  9. Kompiler og indlæs programmet "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" til Arduino.
  10. Tilslut hver LED-driver til den tilsvarende kanal.

3. Opsætning af cellekultur (dag -21-0)

  1. Primære skeletmuskelceller
    1. Optø og udvid primære skeletmyoblaster (opnået fra Cook Myosite) i højst seks passager ved hjælp af myotonisk vækstmedium (+ supplement). Vedligehold celler i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2.
    2. Skift medie hver 2. dag.
    3. Når cellerne er ca. 60% sammenløbende, skal du passere dem ved hjælp af 0,05% Trypsin-EDTA (1x, i 5 minutter ved 37 ° C). Saml de dissocierede celler og tilsæt friske medier for at neutralisere trypsin.
    4. Spin cellerne ned ved 300 x g og aspirer supernatanten over cellepillen.
    5. Cellerne resuspenderes med MGM og frø 1:3 med 60 ml pr. trelagskolbe.
  2. ChR2-hiPSC
    BEMÆRK: Alle cellelinjer til dette arbejde blev oprettet og brugt i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Columbia University, NY, USA. I denne protokol blev ChR2-ekspressive hiPSC'er genereret via CRISPR-Cas9 genomredigering ved hjælp af tidligere beskrevne metoder18, men alle stabile optogenetiske cellelinjer (lentiviral, piggyBac osv.) kan bruges på samme måde. Konstituerende promotorer udtrykt i både iPSC'er og motoneuroner blev valgt (CAG). Cellerne viste sig at have sund karyotype, som nævnt i tidligere publikationer18,19.
    1. Overtræk 6-brønds plader med 1 ml/brønd opløselig kældermembranmatrix fortyndet i DMEM/F12 (1:80) og inkuber pladerne ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Frø-iPSC'er på belagte 6-brønds plader med 2 ml feederfrit cellekulturmedium (iPSC-medier), udveksling af 2 ml medier hver anden dag og passaging hver 5-7 dage. Vedligehold celler i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2.
    3. Passaging
      1. Dissocier stamcellerne ved at inkubere med 1 ml enzymfrit stamcellefrigørende reagens i 4 minutter og mekanisk klipning med en bred spids P1000 pipette.
      2. Frøceller i et forhold på 1:24 eller 1:48 i iPSC-medier med 2 μM Y-27632 dihydrochlorid i 2 ml/brønd på coatede 6-brøndplader.

4. Såning af skeletmuskelvæv (dag -3)

  1. Isoler og tæl 30 x 106 myoblaster ved hjælp af en automatiseret celletæller.
  2. Resuspender myoblasterne i en 4: 1 blanding af 3 mg / ml kollagen I og opløselig kældermembranmatrix (800 μL kollagenblanding + 200 μL kældermembranmatrix for at nå et endeligt volumen på 1 ml). Til kollagenkomponenten tilsættes det ledsagende neutraliserende middel (9:1 blanding af kollagen til neutraliseringsmiddel) og blandingen fortyndes med 1x PBS for at opnå et volumen på 800 μL.
  3. Der tilsættes 15 μL cellekollagensuspension til hvert muskelkammer i bioreaktoren, og sørg for at sprede suspensionen over begge søjler ved hjælp af pipettespidsen (figur 2).
  4. Celle-gelblandingen polymeriseres ved 37 °C i 30 minutter, og hver bioreaktor fyldes derefter godt med 450 μL myotonisk vækstmedie.
  5. Efter 3 dage (når gelen er komprimeret), skal du begynde myotube-differentiering.

5. Myotube differentiering (dag 0-14)

  1. Begynd myotube-infusion ved at skifte væv til 450 μL fusionsfremkaldende medier (FS, tabel 1) i 7 dage, skift medie hver anden dag.
    BEMÆRK: Prøv at begynde myotube-differentiering samme dag som motoneurondifferentiering fra hiPSC'er for at frø motoneuroner i slutningen af begge celletypers differentieringsplaner.
  2. På dag 7 ændres mediet til 450 μL modningsmedie Ia (MMIa, tabel 1).
  3. På dag 9 ændres til 450 μL modningsmedie Ib (MMIb, tabel 1).
  4. På dag 11 skal du ændre mediet til 450 μL NbActiv4. Bliv ved med at skifte medie hver 2. dag, indtil motoneuronerne er seedet (trin 7).

6. Motoneuron differentiering (dag 0-14)

BEMÆRK: Vores motoneurondifferentieringsprotokol blev tilpasset fra Maury et al8.

  1. På dag 0 overføres 4 x 106 ChR2- hiPSC'er til en ultralav fastgørelsesstel med 15 ml motoneuronophængskulturmedium (MSCM, tabel 1). Suppler MSCM med 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat og 5 μM Y-27632 dihydrochlorid.
  2. På dag 2 isoleres neurosfærerne (NS) med en 37 μM reversibel sil og omformuleres i 15 ml MSCM med 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat og 0,1 μM retinsyre. NS skal være synlig i petriskålen uden brug af mikroskop efter dag 2.
  3. På dag 4 overføres cellerne og medierne til et 50 ml rør og lader neurosfærerne slå sig ned til bunden (5 min). Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 15 ml MSCM suppleret med 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 og 0,1 μM retinsyre.
  4. På dag 7 gentages trin 6.3. men resuspender cellerne i 15 ml MSCM suppleret med 0,5 μM SAG og 0,1μM retinsyre.
  5. På dag 9 gentages trin 6.3. men resuspend celler i 15 ml MSCM suppleret med 10 μM DAPT.
  6. På dag 11 gentages trin 6.3. men resuspend cellerne i 15 ml MSCM suppleret med 20 ng / ml BDNF og 10 ng / ml GDNF.
  7. På dag 14 frø motoneuronerne i platformen.

7. Såning af motoneuronaggregater i bioreaktor (dag 14)

  1. Forbered en 4: 1 gelblanding af 2 mg / ml kollagen I og Matrigel (800 μL kollagenblanding + 200 μL Matrigel for at nå et endeligt volumen på 1 ml). Til kollagenkomponenten tilsættes det ledsagende neutraliserende middel (9:1 blanding af kollagen til neutraliseringsmiddel) og blandingen fortyndes med 1x PBS for at opnå et endeligt volumen på 800 μL.
  2. Brug en 400 nm cellesi til at vælge store neurosfærer og resuspend dem i gelblandingen.
  3. Aspirere medier fra reservoiret og omhyggeligt fra neurosfærebrønden (figur 2).
  4. Tilsæt 15 μL gelblanding i neurosfærekanalen.
  5. Læg en 10 μL pipette med 10 μL gel, og vælg derefter en neurosfære.
  6. Indsæt NS i neurosfærekanalen og sørg for, at NS er i kammeret. Hæv pipetten langsomt, mens du frigiver den resterende gel, når NS er deponeret. Hvis du er usikker på, om NS blev deponeret korrekt, skal du kontrollere dens placering ved hjælp af et mikroskop.
  7. Gelen polymeriseres i 30 minutter ved 37 °C.
  8. Der tilsættes 450 μL NbActiv4 suppleret med 20 ng/ml BDNF og 10 ng/ml GDNF til reservoirerne.
  9. Skift medie hver anden dag for at give mulighed for aksonal vækst fra NS til muskelvæv.

8. Samtidig optisk stimulering og videooptagelse af NMJ-funktion (dag 24+)

  1. Til billeddannelse skal du bruge et omvendt fluorescerende mikroskop med et videnskabeligt komplementært metaloxid-halvleder (sCMOS) kamera.
  2. Indstil kamerasoftwaren binning til 2x2, eksponering til 20 ms, rullende lukker ON, udlæsningshastighed til 540 MHz, dynamisk område: 12-bit &gain 1 og sensortilstand: overlapning.
  3. Brug 2x mål på mikroskopet til at afbilde mikrotissuerne.
  4. Fastgør et levende cellekammer (37 °C, 5% CO2) til mikroskopstadiet.
  5. Vælg det område af interesse (ROI), der indeholder det innerverede skeletvævsvæv for at minimere filstørrelsen og behandlingstiden.
  6. Anbring et 594 nm langpas emissionsfilter mellem prøven og billedmålet for at filtrere blå lysimpulser fra kameraet.
  7. Anbring en rektangulær 4-brønds plade indeholdende 4 bioreaktorer (24 væv) i levende cellekammeret.
  8. Klik på Live View. Centrer og fokuser billedet med det ønskede investeringsafkast.
  9. Upload den brugerdefinerede makrokode fra GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) for at styre scenepositionen, Arduino-kortet og videooptagelsen.
  10. Indstil outputfilm som: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Kør makrokoden med de ønskede X,Y-koordinater indstillet på scenen, og få et hurtigt tidsforløb med 1700 billeder ved 50 billeder/s.
  12. Udskift mediet efter billeddannelse og returner prøverne til inkubatoren. Tillad mindst 24 timer mellem billedoptagelsessessioner for at undgå vævstræthed.

9. Batchbehandling og analyse (dag 24+)

  1. Film behandling
    1. Brug den brugerdefinerede MATLAB-kode til at behandle videoerne i batchanalyse. Filerne kan downloades fra GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Funktionerne er anført og forklaret i tabel 2.
      BEMÆRK: Koden er kompatibel med .nd2- og .czi-formaterne. Det kræver parallel behandling for at blive aktiveret i MATLAB og har brug for bioformatpakken.
    2. Kør det rekursiveOSAnalyse-script for at analysere filmene gennem parallel behandling. Har alle de erhvervede videoer i den samme mappe, og vælg den mappe, når du kører koden.
    3. Juster parametrene efter analyse efter behov.
      1. Skift baselineTime (mulighed 1), hvis spontan sammentrækning opfanges i begyndelsen af optagelsen. Dette viser en indledende aflæsning langt over 0 og skal rammen skiftes for at kompensere.
      2. Skift peakThreshold (mulighed 2), hvis veerne ikke registreres. Koden registrerer sammentrækninger, der som standard er over 25% af den højeste top, så denne værdi kan ændres.
      3. Skift minMinProminence og minMinWidth for at justere følsomheden, når du registrerer starten af hver top.
    4. Generer video- og grafoutput.
      1. Kør rekursivOSMovie for at generere en videofil for hvert væv med dets respektive kontraktilitetsspor.

10. Forstyrrelse af NMJ-funktion (dag 24+)

  1. Forbered behandlingsmedier ved at tilføje ekstern effektor til NbActiv4 basalmedier suppleret med 20 ng / ml BDNF og 10 ng / ml GDNF.
    1. Til MG-sera-eksperimentet skal du bruge 20% MG-patientsera i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Til BTX-eksperimentet skal du bruge 5 μg/ml BTX i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimuler/billede ved hjælp af trin 3.2. for at registrere grundlinjen.
  3. Udskift mediet i væv med behandlingsmedier (450 μL/væv).
  4. Inkuberes i den ønskede tid (48 timer for patientsera, 20 minutter for BTX).
  5. Stimuler/afbild igen ved hjælp af trin 3.2. at registrere funktion efter behandling.
  6. Fjern behandlingsmediet og lad vævene hvile i den ønskede tid (48 timer efter fjernelse af sera)
    BEMÆRK: Tillad mindst 24 timer mellem stimulering og billeddannelse for at undgå vævstræthed

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neuromuskulære kryds blev genereret ved co-dyrkning af optogenetiske hiPSC-afledte motoneuroner med ikke-optogenetisk skeletmuskelvæv. Humane primære skeletmyoblaster (SkM) blev podet i platformene og differentieret til multinukleerede myotubes ved hjælp af 2-ugers protokollen. De optogenetiske motoneuroner blev differentieret separat, men parallelt med myotube-differentieringen og derefter podet i platformen (figur 1). Vævene begyndte at trække sig sammen som reaktion på stimulering af blåt lys 7-12 dage efter MN-såning, hvilket indikerer en vellykket udvikling og modning af NMJ'erne. NMJ'erne kan dyrkes, stimuleres og afbildes i op til 40 dage efter såning af motoneuron, men det optimale tidspunkt forekommer på dag 1619. Den morfologiske og biokemiske validering af differentieringerne og tilstedeværelsen af de optogenetiske proteiner er vist i supplerende figur 1 og er valideret i tidligere undersøgelser18,19.

For at demonstrere, at protokollen let kan tilpasses forskellige kultursystemer, blev strategien testet ved hjælp af to forskellige rumdelte reaktorer: en mikrofluidisk enhed og en bioreaktor med åben brønd. Begge systemer har et lignende design, med et kammer forsynet med søjler til dannelse af skeletmuskelvæv og et andet kammer til dyrkning af 3D motoneuronaggregater, der kan udvide axoner til at innervere skeletvævene (figur 2A, B). De to systemer har imidlertid forskellige skalaer, hvor den mikrofluidiske enhed giver 1 mm lange skeletmuskelvæv bestående af ca. 20.000 myoblaster (figur 2C) og det åbne bioreaktorsystem, der resulterer i 4 mm lange muskelvæv bestående af ca. 450.000 myoblaster (figur 2D).

For at muliggøre kontrolleret stimulering af de optogenetiske NMJ'er blev der bygget en optisk opsætning bestående af en rød 637 nm LED til brightfield-belysning, en blå 488 nm LED til aktivering af ChR2-MNs og et blåt lysfilter mellem vævsprøven og målet for at forhindre blåt lys i at forstyrre billedanalysen (figur 3A). LED'erne blev drevet af LED-drivere og styret præcist via en Arduino mikroprocessor. NMJ-funktionen blev evalueret ved samtidig at erhverve time-lapse-videoer, mens du stimulerede MN'er med blåt lys ved hjælp af et brugerdefineret mikroskopmakroscript parret med Arduino-koden (figur 3B). Protokollen øgede stimuleringsfrekvensen fra 0, 2 Hz til 2 Hz i 30 trin. Når filmene var erhvervet, blev vævsfunktionen analyseret ved hjælp af en brugerdefineret MATLAB-pakke (figur 3C). Analysen målte vævsforskydning, genererede et kontraktilitetsspor og synkroniserede det med lysstimuleringsprotokollen. Det bestemte derefter fraktionen af effektive impulser (F) og en forventet brøkdel af effektive impulser (E) for at tage højde for potentielle ustimulerede sammentrækninger. Den forventede fraktion (E) blev beregnet som den brøkdel af impulser, der ville blive mærket som effektiv, hvis sammentrækningerne blev tilfældigt fordelt inden for 30 s. Vævsscoren blev derefter beregnet som (F-E)/(1-E) med en værdi mellem 0 og 1 (figur 3C). Koden bestemmer, om en sammentrækning udløses baseret på tiden mellem en lyspuls og starten af kontraktilitetstoppen, som vist i figur 3D. Denne automatiserede, upartiske metode giver mulighed for gentagen karakterisering af NMJ-funktionen i store prøvestørrelser og over tid. Koden indeholder justerbare parametre, der kan justeres efter behandling for at sikre korrekt scoring (supplerende figur 2).

Systemets evne til kvantitativt at karakterisere NMJ-funktion over tid blev demonstreret ved billeddannelse af en gruppe væv i 11 dage (dag 9 til dag 20 efter motoneuronsåning). Systemet fangede forbedring af NMJ-funktion i væv, der viste en stigning i udløste reaktioner 1 uge efter vævsfremstilling (figur 4A) efterfulgt af en stabil funktion i yderligere en uge (figur 4B). For at verificere, at muskelstimulering opstod gennem NMJ'erne, blev en anden gruppe væv analyseret før og efter 20 minutters inkubation med 5 μg / ml af neurotoksinet α-bungarotoxin (BTX), som binder specifikt og irreversibelt til acetylcholinreceptorer. BTX stoppede alle udløste og spontane sammentrækninger, resulterede i en fuldstændig forstyrrelse af NMJ-funktionen og viste, at lysstimulering af vævene kræver en funktionel NMJ (figur 4C, D). Serielle fortyndinger af BTX blev oprindeligt testet for at identificere den optimale BTX-koncentration (resultater ikke vist).

For at evaluere systemets translationelle evne blev NMJ-funktionen vurderet før og efter tilsætning af serum fra fem myasthenia gravis-patienter. Analyse af væv behandlet med 20% MG serum i 48 timer viste nedsat funktion sammenlignet med kontrolvæv behandlet med serum fra raske donorer (figur 4E, F). De konstruerede NMJ'er blev også evalueret igen 48 timer efter fjernelse og udvaskning af serumet og viste genopretning af funktion (figur 4F). Derudover blev stigende koncentrationer af patientserum og normal human serumkontrol (5%, 20%, 40%) testet for at identificere den optimale koncentration, der påvirkede vævsfunktionen. Resultaterne viste systemets evne til at karakterisere og kvantificere NMJ-funktion og modellere myasthenia gravis in vitro.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelt design og tidslinje. Tidslinje (dage) for differentiering og såning i platforme. SkM = skeletmuskulatur, ChR2 = optogenetiske motoneuroner, NMJ = neuromuskulært kryds. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Vila et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Samkultursystemer til generering af 3D NMJ'er. (A) Skematisk af den mikrofluidiske platform. (B) Skematisk af PDMS-bioreaktoren i åben brønd. (C) Innerveret skeletmuskelvæv i den mikrofluidiske platform. (D) Innerveret væv i bioreaktoren med åben brønd. Skala bar 0,5 mm. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Vila et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Stimulering, optagelse og analyse af NMJ-funktion. (A) Skematisk over LED-opsætning og lyssti. (B) Optisk opsætning med et inverteret mikroskop, levende cellekammer, automatiseret scene og sCMOS-kamera. (C) Algoritme til batchbehandling af optiske stimuleringsvideoer af NMJ-kulturer. (D) Repræsentativ ramme for videoen genereret af MATLAB-koden og den tilsvarende kontraktilitetssporgraf. Den blinkende blå boks i videoen og de lodrette linjer i grafen angiver, hvornår stimuleringen af blåt lys finder sted. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Vila et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. NMJ-funktion. (A) Kontraktilitetsspor for 3D-konstruerede humane NMJ'er. (B) Score af NMJ'er som reaktion på lys, der viser forbedring af funktionen over 11 dage (n = 47, envejs ANOVA p = 1 x 10-8). Fejlstænger = SEM. (C) Kontraktilitetsspor efter 20 minutters behandling med 5 mg/ml af neurotoksinet α-bungarotoxin (BTX). (D) Kvantificering af NMJ-funktion (score) før og efter behandling med BTX (n = 6; envejs ANOVA F = 9 x 10-8). (E) Kontraktilitetsspor af væv med 20% MG sera efter 48 timers behandling. (F) NMJ-funktionsvurdering for behandlede og kontrolgrupper før og efter behandling og efter genopretning (n = 12; efter behandling post-hoc ANOVA F = 0,0002; *angiver p = 0,0015 ** angiver p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS = normalt humant serum). n angiver antallet af biologiske replikater. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Vila et al.18,19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Myogene og neurale medieformuleringer. Organiseret liste over vækstfaktorer og kosttilskud til medier. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2. Liste over MATLAB-funktioner. Korte forklaringer af MATLAB-funktioner, der bruges til billedanalyse. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Vila et al.18. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende filer

Supplerende figur 1. Myotube og motoneuron differentieringer. (A) Myotube differentieringsprotokol (MM = modningsmedie). (B) Immunofluorescens (IF) billeder, der viser ekspression af skeletmuskelmarkører myosin tung kæde (MHC), α-actinin og desmin i differentierede myotubes. (C) Motoneuron differentiering protokol. (D) Lokalisering af channelrhodopsin-2 med YFP (ChR2-YFP) til membran i optogenetiske iPSC'er og (E) MN'er, der bekræfter vellykket infektion. (F) Co-ekspression af cholin acetyltransferase (ChAT, rød) og ChR2 (grøn) i optogenetiske MNs. Skala barer 100 μm. Gengivet med tilladelse fra Vila et al.18. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Forkert behandling, der kræver justering af parametre. (A) Forkert baseline tid resulterer i toppe af den forkerte form. (B) En for høj toptærskel resulterer i, at toppe ikke opdages. (C) For lempelige betingelser for påvisning af minima (dvs. for lave værdier valgt for minMinProminence og/eller minMinWidth) resulterer i, at minima mærkes i midten eller endda toppen af toppe og derfor tælles som "untriggered", fordi de starter for langt fra den foregående lyspuls. (D) For strenge betingelser for påvisning af minima resulterer i, at starten af toppen mærkes før lyspulsen eller endda mangler, som i dette eksempel. Gengivet med tilladelse fra Vila et al.18. Fil, der viser 3D-model af bioreaktorplatform, der kan redigeres og eksporteres for at fremstille forme til bioreaktorfremstilling ved hjælp af PDMS. Klik her for at downloade denne fil.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Supplerende CAD-fil. Fil, der viser 3D-model af bioreaktorplatform, der kan redigeres og eksporteres for at fremstille forme til bioreaktorfremstilling ved hjælp af PDMS. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette system er en konstrueret 3D human vævsmodel, der kombinerer optogenetik og videobehandling for at muliggøre automatiseret og upartisk evaluering af NMJ-funktionen. Ved hjælp af en standardiseret protokol har vi demonstreret evnen til at måle ændringer i NMJ-funktion under fysiologisk udvikling og karakterisere de skadelige virkninger af patologier såsom neurotoksineksponering og myasthenia gravis patient sera.

Tidligere undersøgelser har rapporteret evnen til at modellere MG med optogenetiske hPSC-afledte motoneuroner i co-kultur med skeletmyotubes ved hjælp af MG patient sera22. Systemet var imidlertid i 2D og registrerede sammentrækninger på tilfældige steder, hvorved reproducerbarheden blev begrænset og modellens kvantitative evne reduceret. En af de største fordele ved vores system sammenlignet med et 2D-system er, at det giver os mulighed for at efterligne 3D-miljøet, hvilket mere præcist letter cellulær og morfologisk udvikling mellem MN'er og SKMs. Der er store beviser, der understøtter, at de biomekaniske signaler, der kræves for at et væv kan opføre sig som dets oprindelige fysiologi, efterlignes overlegent i et 3D-system 13,14,15,16. Derudover giver forskellige aspekter af 3D-systemet mulighed for et mere kontrolleret miljø: rettet dannelse af synapser, mindre heterogenitet mellem prøver, øget rumlig-tidsmæssig kontrol af stimulering via optogenetik og et automatiseret system med høj kapacitet, der reducerer subjektiviteten af hver prøves analyse.

Det udviklede system kan bruges til at modellere andre neuromuskulære sygdomme (NMD'er), såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Duchenne muskeldystrofi (DMD) og andre. Selvom ALS patofysiologi involverer dysfunktionen af selve motorneuronen snarere end det neuromuskulære kryds 17,27, har vores system evnen til at rekapitulere sygdomstilstanden af ALS ved at vise formindsket muskelkontraktion efter neurondegeneration eller skade. DMD er en muskulær degenerativ sygdom forårsaget af mangel på dystrofinprotein, hvilket fører til muskelsvaghed og eventuel degeneration28. Systemet kunne modellere DMD ved at inkorporere genetisk manipuleret skeletmuskulatur, der bærer en dystrofinhæmmer eller syge muskelceller, der mangler dystrofin. Samlet set har systemet fleksibilitet og magt til at rekapitulere forskellige NMD'er i en in vitro 3D-platform.

For en protokol, der kræver forskellige kilder til celler, hver med bestemte niveauer af sammenløb, er et af de mest kritiske aspekter timing. Under udvidelsen af primære skeletmuskelceller er det vigtigt ikke at lade dem blive for sammenflydende (65% -70%) på grund af fusion. Til tider, selv når man bruger trypsin til at bryde klumperne op, er det blevet observeret, at dette oversættes til lavere effektiv såning i bioreaktorerne. Et andet kritisk aspekt er produktionen af bioreaktorplatformen med åben brønd. For at øge homogeniteten blandt PDMS-platformene skal den tid, de bruger i ovnen, holdes ensartet på tværs af alle platforme for at undgå udsving i platformsøjlernes mekaniske egenskaber. Derudover er det fornuftigt at vortexe røret forsigtigt (1-1,5 s) mellem hvert andet til tre rum i bioreaktorerne for at opretholde konsistensen af frøtætheden. Endelig blev succesraten for NMJ-udvikling anset for at være meget afhængig af succesen med motoneuron-såning, da tilsætningen af neurosfærer er så delikat og varierer fra person til person. Med såningspraksis øges succesraten, hvilket gør det muligt for ca. 90% af de initierede kulturer at blive stimuleret og afbildet.

I øjeblikket er nogle begrænsninger, der kan løses i den nærmeste fremtid, inkorporering og validering af andre optogenetiske proteiner end den diskuterede ChR2. Specifik kontrol over både celletyper og optogenetiske sensorer til spændings- / calciumbilleddannelse eller muskelmetabolisme kan føjes til systemet for øget aflæsning og analyse. Da blåt lys inducerer fototoksicitet ved høje doser, stimuleringsregimet var begrænset til 30 s. Denne effekt kan afhjælpes ved at inkorporere et rødforskudt channelrhodopsin til længerevarende stimuleringsundersøgelser. Derudover er en anden begrænsning, der kan forbedres i fremtidige iterationer af modellen, manglen på neuronale understøttende celler som Schwann-celler. Alsidigheden af denne platform og analysekode gør det imidlertid muligt at inkorporere en række optogenetiske konstruktioner og celletyper. Mens vores ChR2-hiPSC-linje blev oprettet ved hjælp af CRISPR, kunne andre metoder bruges til at implementere et optogenetisk respons i hiPSC'er. Desuden kan NMJ-modellen med hiPSC'ernes tilpasningsevne udvikles fra en enkelt cellekilde, hvilket gør det muligt at anvende patientspecifikke modeller til yderligere undersøgelse af neuromuskulære sygdomme18.

Denne platform giver gentagen, automatiseret og upartisk analyse af human NMJ-funktion over tid og kan detektere kvantificerbare ændringer i funktion på grund af eksterne effektorer, som neurotoksiner eller MG-patientserum. Samlet set giver vores 3D-system mulighed for undersøgelse af human NMJ-funktion tidligt i sygdomspatologi, giver mulighed for lægemiddelscreening og lægger grundlaget for et robust system til at fremme præcisionsmedicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt finansieringsstøtte fra NIH [tilskudsnumre EB025765 og EB027062], DOD [tildelingsnummer W81XWH-18-1-0095] og UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Vi anerkender taknemmeligt Columbia University Stem Cell Core for deres hjælp og vejledning med celleomprogrammering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Bioengineering udgave 182
Engineering og karakterisering af en optogenetisk model af det humane neuromuskulære kryds
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter