Summary
우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.
Abstract
중증 근무력증 (MG)과 같은 많은 신경 근육 질환은 동물과 인간 사이의 생리적 차이로 인해 동물 모델에서 특성화하기가 어려운 신경 근육 접합부 (NMJ)의 기능 장애와 관련이 있습니다. 조직 공학은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 제공 할 수있는 기회를 제공합니다. 광유전학 단백질을 유도만능줄기세포(iPSCs)에 통합함으로써, 우리는 특정 파장의 빛으로 자극될 수 있는 뉴런을 생성했다. NMJ가 건강하고 기능적이라면, 모토뉴론으로부터의 신경화학적 신호는 근육 수축을 초래한다. 광유전학과 미세 제작을 조직 공학과 통합함으로써 우리는 비디오 분석을 사용하여 NMJ 기능을 특성화하기위한 편견없는 자동화 된 방법론을 수립했습니다. NMJ 형성, 동시 비디오 녹화를 통한 광학 자극 및 조직 수축성의 비디오 분석을 위해 표준화 된 프로토콜이 개발되었습니다. 골격근 수축을 유도하기 위해 빛에 의한 광유전학적 모토뉴런의 자극은 인간 NMJ 생리학을 되풀이하고 시간에 따라 그리고 다양한 입력에 반응하여 NMJ의 반복적인 기능적 측정을 허용한다. 우리는 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결의 기능적 개선을 보여주고 NMJ 기능에 대한 환자 MG 항체 또는 신경 독소의 손상 효과를 특성화하는 이 플랫폼의 능력을 입증합니다.
Introduction
신경 근육 접합부 (NMJ)는 근육 수축을 허용하는 모토 뉴런 (MN)과 골격근 세포 (SkM) 사이의 화학적 시냅스입니다. 독소, 예컨대 신경독소 α-분가로톡신 (BTX), 또는 중증 근무력증 (MG)과 같은 신경근 질환 (NMD)은 NMJ의 변성 및 근육 조절의 감소를 야기할 수 있다1. 생체 공학 인간 조직 모델은 인간 NMJ의 기능적 및 생리적 메커니즘을 더 잘 재구성하고 동물 모델보다 더 큰 번역 잠재력을 제공합니다.
동물 모델이 NMJ의 형성과 기능에 대한 이해를 향상 시켰지만, 인간과 동물의 시냅스 사이에는 결과의 번역을 제한하고 NMJ의 생체 내 특성화를 도전하는 2,3,4에 도전하는 상당한 차이가 있습니다. 연구에 따르면 마우스와 인간 NMJ 사이에 뚜렷한 생리적 차이가 나타났습니다. 마우스는 인간 NMJs4와 비교할 때 더 큰 NMJ와 더 작은 활성 영역밀도를 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 수행 된 약물 연구가 인간 임상 시험에서 발견 된 효과를 항상 반영하는 것은 아닙니다. 조작 된 인간 조직 모델은 NMJ의 건강한 발달과 신경 근육 질환의 병리학을 연구하고 약물 검사를 허용 할 수있는 기회를 제공합니다. 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)5는 골격근세포(6,7) 및 모토뉴런(8,9)을 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hiPSC는 환자 세포로부터 쉽게 생성될 수 있어, 환자 특이적 조직 모델을 통해 더 나은 질병 모델링(10) 및 약물 스크리닝(11,12)을 가능하게 한다.
SkMs와 MN의 2차원(2D) 단층 공동 배양은 생리학적 NMJ의 형태, 표현형, 조직 및 기능적 거동이 부족합니다. NMJ는 분석을 위한 운동 유닛의 분리를 억제하고, 정확한 기능 측정을 제한하며, 반복적이고 체계적인 실험에 대한 사용을 방해하는 2D 배양물에서 무작위로 형성됩니다.13 . NMJs의 3차원(3D) 조직 모델은 이러한 많은 한계를 극복하여, 생리학적 NMJs 7,14,15,16,17의 형태학적 및 기능적 특성을 되풀이한다. 이 모델을 사용하여 두 가지 조직 유형을 별도로 개발 한 다음 축삭 성장을 지시하여 통합하여 2D 배양 시스템에 비해 더 체계적인 NMJ를 개발할 수 있습니다.
우리의 이전 연구는 광유전학과 조직 공학을 결합하면 NMJ 기능18,19의 정확한 비 침습적 자극 및 평가를 가능하게한다는 것을 보여주었습니다. 유전 공학을 통해 빛에 민감한 단백질은 hiPSC의 게놈에 통합 될 수 있습니다. 청색광에 반응하여 열리는 이온 채널인 채널로돕신-2(ChR2)를 뉴런과 같은 흥분성 세포의 막으로 통합하면 세포 활성화20,21,22에 대한 비접촉식 시공간 조절이 가능하다. ChR2를 운반하는 hiPSC는 청색광에 민감한 광유전학적 모토뉴런으로 분화될 수 있어, 뉴런을 자극하는 전형적인 침습성 전극의 필요성을 제거하고 전극(23)에 의한 근육 세포의 원치 않는 자극을 피한다. 이 시스템은 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 비광유전학적 골격근 세포의 수축을 자극합니다. 비디오 획득과 제어된 청색광 조명을 결합하면 NMJ 기능을 위해 공동 배양된 조직을 동시에 자극하고 기록할 수 있습니다.
MG는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (AChR)를 표적화하는 자가항체에 의해 유발되며, 이는 NMJ 기능 감소 및 근육 약화24를 초래한다. 그것은 제시된 증상, 전기 진단 및 혈청 학적 혈액 검사를 통해자가 항체의 검출을 기반으로 진단됩니다. 그러나 MG에 관여하는 모든 자가항체가 확인된 것은 아니며, 일부 혈청음성 환자는 MG로 진단되지만25,26개의 항체가 인정되지 않았다. 우리의 시스템은 MG 환자로부터의 혈청의 첨가 전후에 NMJ의 반복적 인 기능적 평가를 허용하여 MG 항체18에 의해 야기 된 기능적 및 생화학 적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 인 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 생산하는 방법을 보여줍니다. 우리는 두 개의 플랫폼, 미세 유체 장치 및 더 큰 오픈 웰 생물 반응기 플랫폼에서 시스템의 다양성을 보여줍니다.
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Protocol
이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다.
1. 생물반응기 준비
- 생물반응기 주형 만들기
- 보충 CAD 파일에서 생물반응기 CAD 파일을 다운로드하거나 사용자 정의 자체 설계를 작성하십시오.
- CAM 소프트웨어를 사용하여 3D 모델에서 CNC 공구 경로를 생성합니다.
- CNC 밀링 머신을 사용하여 기계 아세탈 금형.
- 생물반응기 제조
- 폴리디메틸실록산(PDMS, 4개의 플랫폼/몰드 당 77g의 혼합물)의 경화제 혼합물에 10:1 염기를 혼합한다.
- 혼합물을 진공 챔버에 넣고, 모든 밸브를 닫고, 진공을 켜고, 기포가 남지 않을 때까지 혼합물을 적어도 30 분 동안 탈기하십시오. 혼합물을 몰드에 붓고 진공 챔버에서 금형을 1 시간 동안 가스 제거합니다.
- 금형의 위쪽 절반을 올바른 방향으로 닫습니다. 강철 육각형 막대를 중앙에 놓고 양쪽에 클램프를 놓습니다.
- 상단을 PDMS로 다시 채웁니다.
- 몰드를 65°C 오븐에서 적어도 4시간 동안 경화시킨다.
- 실온으로 냉각한 후 금형에서 플랫폼을 제거하십시오.
- 1 시간 사이클의 접시 비누, 400 mL의 100 % 이소프로판올 및 증류수를 사용하여 초음파 욕조에서 장치를 청소하십시오.
- 65°C에서 하룻밤 동안 건조시킨다.
- 유리 커버슬립을 1% 비이온성 계면활성제 폴리올에 30분 동안 담그고 커버슬립이 모두 제대로 코팅되도록 쌓이지 않도록 하십시오.
- 증류수로 잘 헹구고 65°C에서 밤새 건조시킨다.
- 6 L/min의 산소와 함께 높은 곳에 플라스마 클리너를 1-2분 동안 사용하여 처리 유리 커버슬립 및 PDMS 플랫폼에 사용하십시오. 일단 처리되면, PDMS를 커버슬립 상으로 적어도 30초 동안 눌러서 둘을 함께 결합시킨다.
- 셀을 추가하기 전에 접합된 장치를 오토클레이브합니다.
2. 광학 자극 설정 구축
- 30mm 케이지 큐브 시스템을 사용하여 중앙에 573nm 이색성 거울을 부착합니다. 빨간색 627nm LED를 594nm 장역 여기 필터와 결합하고 LED가 거울을 향하도록 큐브의 위쪽에 연결합니다. 그런 다음 546nm 단거리 통과 여기 필터가 있는 파란색 488nm LED를 큐브의 인접한 측면에 부착하고 도 3A의 개략도에 표시된 것처럼 LED가 거울을 향하게 합니다.
- 링 작동 아이리스 다이어프램을 케이지 큐브의 하단에 부착하여 조명 영역의 크기를 제어합니다.
- T-큐브 LED 드라이버로 각 LED에 전원을 공급하고 Arduino Uno Rev3 보드를 통해 제어합니다. LED 드라이버의 측면 입력을 전원 플러그에 연결하고 중간 출력을 Arduino에 연결한 다음 측면 출력을 LED에 직접 연결합니다.
- USB 케이블로 아두 이노 우노를 PC에 연결하십시오.
- GitHub 링크에서 파일을 다운로드합니다(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
- GitHub 폴더에서 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 파일을 엽니다.
- 시작 매개 변수 설정: 단계 = 30; 시작 주파수 = 0.5; 끝 주파수 = 3; 펄스 길이 = 100.
- 핀 출력 4가 파란색 LED 드라이버에 할당되고 핀 출력 2가 빨간색 LED 드라이버에 할당되었는지 확인합니다. LED 드라이버의 중간 전선이 접지 및 각 핀 출력에 연결되어 있는지 확인합니다.
- "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino"프로그램을 컴파일하고 Arduino에로드하십시오.
- 각 LED 드라이버를 해당 채널에 연결합니다.
3. 세포 배양 셋업 (일-21-0일)
- 원발성 골격근 세포
- 해동 및 Myotonic 성장 배지 (+ 보충)를 사용하여 최대 여섯 계대 동안 일차 골격 근세포 (쿡 Myosite로부터 수득)를 확장한다. 세포를 37°C 및 5%CO2로 설정된 인큐베이터에서 유지한다.
- 2일마다 미디어를 변경합니다.
- 일단 세포가 약 60% 합류하면, 0.05% 트립신-EDTA(1x, 37°C에서 5분 동안)를 사용하여 이를 통과시킨다. 해리 된 세포를 수집하고 트립신을 중화시키기 위해 신선한 배지를 추가하십시오.
- 세포를 300 x g 에서 스핀 다운하고 세포 펠릿 위의 상청액을 흡인한다.
- 세포를 MGM으로 재현탁시키고 삼중층 플라스크 당 60 mL로 시드 1:3으로 재현탁시킨다.
- ChR2-hiPSC
참고 :이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, ChR2-발현 hiPSCs는 앞서 기술된 방법18을 사용하여 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 통해 생성되었지만, 임의의 안정한 광유전학적 세포주(렌티바이러스, piggyBac 등)는 동일한 방식으로 사용될 수 있다. iPSCs 및 모토뉴런 둘 다에서 발현되는 구성적 프로모터(CAG)를 선택하였다. 세포는 이전 간행물18,19에서 언급된 바와 같이 건강한 핵형을 갖는 것으로 밝혀졌다.- 6웰 플레이트를 DMEM/F12(1:80)에 희석된 가용화된 기저막 매트릭스 1mL/웰로 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 2mL의 피더프리 세포 배양 배지(iPSC 배지)로 코팅된 6-웰 플레이트 상에 시드된 iPSCs를 격일로 2mL의 배지를 교환하고 5-7일마다 통과시킨다. 세포를 37°C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 유지하십시오.
- 패시징
- 1 mL의 효소가 없는 줄기세포 방출시약과 함께 4분 동안 인큐베이션하고 넓은 팁 P1000 피펫으로 기계적으로 전단하여 줄기세포를 해리시킨다.
- 시드 세포를 iPSC 배지에서 1:24 또는 1:48의 비율로 2 mL/웰의 Y-27632 디하이드로클로라이드 2 μM과 코팅된 6-웰 플레이트 상에 상에.
4. 골격근 조직 파종 (-3 일째)
- 자동화된 셀 카운터를 사용하여 30 x 106 근모세포를 분리하고 계수합니다.
- 3 mg/mL 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스(콜라겐 혼합물 800 μL + 기저막 매트릭스 200 μL의 4:1 혼합물의 혼합물)에 근아세포를 재현탁시켜 최종 부피 1 mL에 도달한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 부피를 달성한다.
- 15μL의 세포-콜라겐 현탁액을 생물반응기의 각 근육 챔버에 첨가하고, 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 두 기둥 전체에 걸쳐 확산시킨다(그림 2).
- 세포-겔 혼합물을 37°C에서 30분 동안 중합시킨 다음, 각 생물반응기 웰을 450 μL의 근긴장성 성장 배지로 채운다.
- 3 일 후 (일단 젤이 압축되면), myotube 분화를 시작하십시오.
5. Myotube 분화 (0-14 일)
- 조직을 450 μL의 융합 유도 배지 (FS, 표 1)로 7일 동안 전환하고, 격일로 배지를 변경함으로써 근관 주입을 시작한다.
참고: 두 세포 유형의 분화 스케줄의 끝에 모토뉴런을 시드하기 위해 hiPSCs로부터의 모토뉴론 분화와 같은 날에 근관 분화를 시작하려고 노력한다. - 7일째에 배지를 450 μL의 성숙 배지 Ia로 변경한다(MMIa, 표 1).
- 9일째에, 450 μL의 성숙 배지 Ib로 변경한다(MMIb, 표 1).
- 11일째에, 배지를 450 μL의 NbActiv4로 변경한다. 모토뉴런이 시드될 때까지 2일마다 배지를 계속 바꿔 놓으십시오(단계 7).
6. 모토네론 분화 (0-14일)
참고 : 우리의 모토네론 차별화 프로토콜은 Maury et al8에서 채택되었습니다.
- 0일째에, 4 x 106 ChR2-hiPSCs를 15 mL의 모토뉴론 현탁액 배양 배지가 있는 초저 부착 페트리 디쉬에 옮긴다(MSCM, 표 1). MSCM을 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물 및 5 μM Y-27632 디하이드로클로라이드로 보충하십시오.
- 2일째에, 신경구(NS)를 37 μM 가역성 스트레이너로 분리하고, 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물, 및 0.1 μM 레티노산으로 15 mL의 MSCM에 재접종한다. NS는 2 일째 후에 현미경을 사용하지 않고 페트리 접시에서 볼 수 있어야합니다.
- 4 일째에 세포와 배지를 50 mL 튜브로 옮기고 신경 구가 바닥에 정착하도록하십시오 (5 분). 상청액을 흡인하고, 세포를 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541, 및 0.1 μM 레티노산으로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.
- 7일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 0.5 μM SAG 및 0.1μM 레티노산으로 보충된 MSCM 15 mL에 재현탁시켰다.
- 9일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 10 μM DAPT로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.
- 11일째에 6.3단계를 반복합니다. 그러나 세포를 20 ng / mL BDNF 및 10 ng / mL GDNF로 보충 된 MSCM 15 mL에 재현탁하십시오.
- 14 일째에 모토 뉴런을 플랫폼에 뿌립니다.
7. 생물 반응기에서 모토뉴런 응집체 시딩 (14 일째)
- 2 mg/mL 콜라겐 I과 마트리겔(800 μL의 콜라겐 혼합물 + 200 μL의 마트리겔을 1 mL의 최종 부피에 도달)의 4:1 겔 혼합물을 준비한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 최종 부피를 달성한다.
- 400nm 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경 구체를 선택하고 젤 혼합물에 재현탁하십시오.
- 저수지에서 배지를 흡인하고 신경권 우물에서 조심스럽게 흡인하십시오 (그림 2).
- 15 μL의 겔 혼합물을 신경구 채널에 첨가한다.
- 10 μL의 젤로 10 μL 피펫을 로딩한 다음 하나의 신경구를 선택하십시오.
- NS를 신경구 채널에 증착하고 NS가 챔버에 있는지 확인하십시오. NS가 증착되면 나머지 겔을 방출하면서 피펫을 천천히 올립니다. NS가 올바르게 침착되었는지 확실하지 않은 경우 현미경을 사용하여 위치를 확인하십시오.
- 겔을 37°C에서 30분 동안 중합시키도록 허용한다.
- 20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 450 μL를 저수지에 첨가하십시오.
- NS에서 근육 조직으로의 축삭 성장을 허용하기 위해 격일로 배지를 변경하십시오.
8. NMJ 기능의 동시 광학 자극 및 비디오 녹화 (24 +일)
- 이미징의 경우 과학적 상보성 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라와 함께 반전 형광 현미경을 사용하십시오.
- 카메라 소프트웨어 비닝을 2x2, 노출 20ms, 롤링 셔터 ON, 판독 속도 540MHz, 다이나믹 레인지: 12비트 및 게인 1, 센서 모드: 오버랩으로 설정합니다.
- 현미경에서 2x 대물렌즈를 사용하여 미세 조직을 이미지화하십시오.
- 라이브 셀 챔버(37°C, 5%CO2)를 현미경 스테이지에 부착한다.
- 신경 골격 조직 조직을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하여 파일 크기와 처리 시간을 최소화합니다.
- 샘플과 이미징 대상 사이에 594nm 장역 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.
- 4개의 생물반응기(24개 조직)가 들어있는 직사각형 4-웰 플레이트를 살아있는 세포 챔버에 넣는다.
- 라이브 뷰를 클릭합니다. 원하는 ROI로 이미지를 중심에 맞추고 초점을 맞춥니다.
- GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 사용자 지정 매크로 코드를 업로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 수집을 제어합니다.
- 출력 동영상을 day_tissue group_tissue name_experiment.nd2로 설정합니다.
- 스테이지에서 원하는 X,Y 좌표를 설정하여 매크로 코드를 실행하고 50 프레임 / s에서 1700 프레임으로 빠른 시간 경과를 얻습니다.
- 이미징 후 매체를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 획득 세션 사이에 최소 24시간을 허용하십시오.
9. 배치 처리 및 분석 (24 일 이상)
- 동영상 처리
- 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 파일을 다운로드할 수 있습니다. 이 기능은 표 2에 나열되고 설명되어 있습니다.
참고: 이 코드는 .nd2 및 .czi 형식과 호환됩니다. MATLAB에서 활성화하려면 병렬 처리가 필요하며 바이오 포맷 패키지가 필요합니다. - 재귀 OSAnalysis 스크립트를 실행하여 병렬 처리를 통해 동영상을 분석합니다. 획득 한 모든 비디오를 동일한 폴더에 넣고 코드를 실행할 때 해당 폴더를 선택하십시오.
- 필요에 따라 사후 분석 매개변수를 조정합니다.
- 녹음 시작 시 자발적인 수축이 포착되는 경우 기준선 시간 (옵션 1)을 변경합니다. 이렇게하면 0보다 큰 초기 판독 방법이 표시되며 보상하기 위해 프레임을 이동해야합니다.
- 수축이 등록되지 않은 경우 peakThreshold (옵션 2)를 변경합니다. 이 코드는 기본적으로 가장 높은 피크의 25%를 초과하는 수축을 감지하여 이 값을 변경할 수 있도록 합니다.
- minMinProminence 및 minMinWidth를 변경하여 각 피크의 시작을 감지할 때 감도를 조정합니다.
- 비디오 및 그래프 출력을 생성합니다.
- recursiveOSMovie를 실행하여 각각의 수축성 추적이 있는 각 조직에 대한 비디오 파일을 생성합니다.
- 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 파일을 다운로드할 수 있습니다. 이 기능은 표 2에 나열되고 설명되어 있습니다.
10. NMJ 기능의 교란 (24 일 이상)
- 20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 기초 배지에 외부 이펙터를 추가하여 치료 배지를 준비하십시오.
- MG 혈청 실험을 위해, NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 20% MG 환자 혈청을 사용하십시오.
- BTX 실험을 위해 NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 5 μg/mL BTX를 사용하십시오.
- 3.2단계를 사용하여 자극/이미지. 베이스라인을 기록합니다.
- 조직의 배지를 치료 배지 (450 μL / 조직)로 교체하십시오.
- 원하는 시간 동안 인큐베이션한다 (환자 혈청의 경우 48 시간, BTX의 경우 20 분).
- 3.2단계를 사용하여 다시 자극/이미지화합니다. 치료 후 기능을 기록합니다.
- 치료 배지를 제거하고 조직이 원하는 시간 동안 쉬도록하십시오 (혈청 제거 후 48 시간)
참고 : 조직의 피로를 피하기 위해 자극과 이미징 사이에 최소 24 시간을 허용하십시오.
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Representative Results
신경근 접합은 광유전학적 hiPSC 유래 모토뉴런을 비광유전학적 골격근 조직과 공동배양함으로써 생성되었다. 인간 일차 골격 근모세포(SkM)를 플랫폼 내로 시딩하고, 2주 프로토콜을 사용하여 다핵 근관으로 분화시켰다. 광유전학적 모토뉴런은 별도로 분화하되, 근관 분화와 병행하여, 플랫폼 내로 시딩하였다(도 1). 조직은 MN 시딩 후 7-12 일 후에 청색광 자극에 반응하여 수축하기 시작하여 NMJ의 성공적인 발달 및 성숙을 나타냅니다. NMJ는 모토네론 시딩 후 최대 40일 동안 배양, 자극 및 영상화될 수 있지만, 최적의 시점은 16일째19일에 발생한다. 광유전학적 단백질의 분화 및 존재에 대한 형태학적 및 생화학적 검증은 보충 도 1에 나타나 있으며 이전 연구18,19에서 검증되었다.
프로토콜이 상이한 배양 시스템에 쉽게 적응될 수 있다는 것을 입증하기 위해, 전략은 두 개의 상이한 구획화된 반응기, 즉 미세유체 장치 및 개방 웰 생물반응기를 사용하여 시험되었다. 두 시스템 모두 비슷한 디자인을 가지고 있으며, 하나의 챔버에는 골격근 조직의 생성을 위한 기둥이 제공되고 축색돌기를 확장하여 골격 조직을 신경질화할 수 있는 3D 모토뉴론 응집체의 배양을 위한 두 번째 챔버가 있습니다(그림 2A,B). 그러나, 두 시스템은 서로 다른 스케일을 가지며, 미세유체 장치는 약 20,000개의 근아세포(도 2C)를 포함하는 1mm 길이의 골격근 조직(도 2C)과 개방 웰 생물반응기 시스템을 생성하며, 그 결과 약 450,000개의 근모세포를 포함하는 4mm 길이의 근육 조직이 생성된다(도 2D).
광유전학적 NMJ의 제어된 자극을 허용하기 위해, 광장 조명을 위한 적색 637nm LED, ChR2-MN의 활성화를 위한 청색 488nm LED 및 청색광이 이미지 분석을 방해하는 것을 방지하기 위해 조직 샘플과 목적 사이의 청색광 필터로 구성된 광학 셋업이 구축되었다(도 3A). LED는 LED 드라이버로 구동되었으며 Arduino 마이크로프로세서를 통해 정밀하게 제어되었습니다. NMJ 기능은 Arduino 코드와 쌍을 이루는 사용자 지정 현미경 매크로 스크립트를 사용하여 청색광으로 MN을 자극하면서 동시에 타임랩스 비디오를 획득하여 평가되었습니다(그림 3B). 이 프로토콜은 30 단계에서 자극 빈도를 0.2Hz에서 2Hz로 증가시켰다. 일단 영화가 획득되면, 맞춤형 MATLAB 패키지를 사용하여 조직 함수를 분석하였다(그림 3C). 이 분석은 조직 변위를 측정하고, 수축성 추적을 생성하고, 이를 광 자극 프로토콜과 동기화하였다. 그런 다음 잠재적 인 자극되지 않은 수축을 설명하기 위해 유효 펄스 (F)의 분율과 유효 펄스 (E)의 예상 분율을 결정했습니다. 예상 분율(E)은 수축이 30초 내에 랜덤하게 분포되어 있는 경우 효과적인 것으로 라벨링될 펄스의 분율로 계산되었다. 그런 다음 조직 점수는 (F-E)/(1-E)로 계산되고 값은 0과 1 사이입니다(그림 3C). 이 코드는 그림 3D와 같이 광 펄스와 수축성 피크의 시작 사이의 시간을 기반으로 수축이 트리거되는지 여부를 결정합니다. 이 자동화되고 편향되지 않은 방법은 큰 샘플 크기와 시간이 지남에 따라 NMJ 기능을 반복적으로 특성화할 수 있습니다. 이 코드에는 올바른 점수 매기기를 보장하기 위해 처리 후 조정할 수 있는 조정 가능한 매개 변수가 포함되어 있습니다(그림 2 참조).
시간에 따라 NMJ 기능을 정량적으로 특성화하는 시스템의 능력은 11일 동안 조직 그룹을 이미징함으로써 입증되었다(모토뉴론 시딩 후 9일째 내지 20일째). 이 시스템은 조직에서의 NMJ 기능의 개선을 포착하여, 조직 제작 1주 후 촉발된 반응의 증가를 보여주고(도 4A), 이어서 추가적인 1주일 동안 안정한 기능을 나타내었다(도 4B). 근육 자극이 NMJ를 통해 발생했는지 확인하기 위해, 아세틸콜린 수용체에 특이적이고 돌이킬 수 없게 결합하는 신경독소 α-분가로톡신(BTX)의 5 μg/mL와 함께 20분 배양 전후에 또 다른 조직 그룹을 분석하였다. BTX는 모든 촉발 및 자발적 수축을 중단시키고, NMJ 기능의 완전한 중단을 초래하고, 조직의 광 자극이 기능적 NMJ를 필요로 한다는 것을 입증하였다(도 4C, D). BTX의 연속 희석은 최적의 BTX 농도를 확인하기 위해 초기에 시험되었다 (결과는 나타내지 않음).
시스템의 번역 능력을 평가하기 위해, NMJ 기능은 다섯 명의 중증 근무력증 환자로부터 혈청을 첨가하기 전과 후에 평가되었다. 48시간 동안 20% MG 혈청을 처리한 조직을 분석한 결과, 건강한 기증자로부터 혈청을 처리한 대조군 조직에 비해 기능이 감소한 것으로 나타났다(도 4E, F). 조작된 NMJs는 또한 혈청의 제거 및 세척 후 48시간 후에 다시 평가되었고, 기능의 회복을 나타내었다 (도 4F). 추가적으로, 환자 혈청 및 정상 인간 혈청 대조군(5%, 20%, 40%)의 증가 농도를 시험하여 조직 기능에 영향을 미치는 최적 농도를 확인하였다. 결과는 NMJ 기능을 특성화하고 정량화하고 시험관 내에서 중증 근무력증을 모델링하는 시스템의 능력을 보여주었다.
그림 1. 실험 디자인 및 타임 라인. 플랫폼으로의 차별화 및 시드의 타임 라인 (일). SkM = 골격근, ChR2 = 광유전학적 모토뉴런, NMJ = 신경근 접합부. 이 그림은 Vila et al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 3D NMJ의 생성을 위한 공동 배양 시스템. (a) 미세유체 플랫폼의 개략도. (b) 오픈 웰 PDMS 생물반응기의 개략도. (c) 미세유체 플랫폼 내의 신경화된 골격근 조직. (d) 개방 웰 생물반응기에서 신경화된 조직. 스케일 바 0.5 mm. 이 그림은 Vila et al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. NMJ 기능의 자극, 기록 및 분석. (A) LED 설정 및 조명 경로의 회로도. (B) 반전 현미경, 라이브 셀 챔버, 자동화 된 스테이지 및 sCMOS 카메라가있는 광학 설정. (c) NMJ 배양물의 광학 자극 비디오의 배치 처리를 위한 알고리즘. (D) MATLAB 코드에 의해 생성된 비디오의 대표 프레임과 대응하는 수축성 트레이스 그래프. 비디오에서 깜박이는 파란색 상자와 그래프의 세로선은 청색광 자극이 발생하는 시점을 나타냅니다. 이 그림은 Vila et al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. NMJ 기능. (A) 3D 조작된 인간 NMJ에 대한 수축성 추적. (B) 빛에 반응하여 11일 동안 기능의 개선을 보여주는 NMJ의 점수(n=47, 단방향 ANOVA p = 1 x 10-8). 에러 바 = SEM. (C) 신경독소 α-분가로톡신(BTX)의 5 mg/mL로 20분 처리 후 수축성 추적. (d) BTX로 처리하기 전과 후의 NMJ 함수(스코어)의 정량화(n=6; 편도 ANOVA F = 9 x 10-8). (E) 치료 48시간 후 20% MG 혈청을 사용한 조직의 수축성 흔적. (f) 치료 전후의 치료 및 대조군에 대한 NMJ 기능 평가 및 치료 후 및 회복 후 (n=12; 치료 후 ANOVA F = 0.0002; *indicates p = 0.0015 **indicates p = 3.5 x10-6) (MG = 중증 근무력증; NHS = 정상 인간 혈청). n은 생물학적 반복실험의 수를 나타낸다. 이 수치는 Vila et al.18,19의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 근형성 및 신경 매체 제형. 미디어를위한 성장 인자 및 보충제의 조직 된 목록. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2. MATLAB 함수 목록입니다. 이미지 분석에 사용되는 MATLAB 함수에 대한 간략한 설명입니다. 이 테이블은 Vila et al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 파일
보충 그림 1. Myotube와 motoneuron 분화. (a) Myotube 분화 프로토콜 (MM = 성숙 배지). (b) 분화된 근관에서 골격근 마커 미오신 중쇄(MHC), α-액티닌, 및 데스민의 발현을 나타내는 면역형광(IF) 이미지. (C) 모토뉴론 분화 프로토콜. (D) 광유전학적 iPSCs 및 (E) MNs에서 막으로의 YFP(ChR2-YFP)를 사용한 채널로돕신-2의 국소화 및 성공적인 감염을 확인하는 MNs. (f) 광유전학적 MNs에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT, 레드) 및 ChR2(녹색)의 공동발현. 스케일 바 100 μm. Vila et al.18의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2. 매개 변수를 조정해야 하는 잘못된 처리입니다. (A) 잘못된 기준 시간은 잘못된 모양의 피크를 초래합니다. (B) 피크 임계값이 너무 높으면 피크가 검출되지 않습니다. (C) 미니마의 검출을 위한 너무 관대한 조건들(즉, minMinProminence 및/또는 minMinWidth에 대해 선택된 너무 낮은 값들)은 피크들의 중간 또는 심지어 상부에 미니마가 라벨링되는 결과를 초래하고, 따라서 그들이 이전의 광 펄스로부터 너무 멀리 시작하기 때문에 "트리거되지 않은" 것으로 계산된다. (d) 미니마의 검출을 위한 너무 엄격한 조건은 이 예에서와 같이 피크가 광 펄스 전에 라벨링되거나 심지어 누락되는 것을 초래한다. Vila et al.18의 허가를 받아 복제되었습니다. PDMS를 사용하여 생물반응기 제조를 위한 주형을 만들기 위해 편집 및 내보낼 수 있는 생물반응기 플랫폼의 3D 모델을 보여주는 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis
보충 CAD 파일. PDMS를 사용하여 생물반응기 제조를 위한 주형을 만들기 위해 편집 및 내보낼 수 있는 생물반응기 플랫폼의 3D 모델을 보여주는 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 시스템은 광유전학과 비디오 처리를 결합하여 NMJ 기능에 대한 자동화되고 편견없는 평가를 가능하게하는 엔지니어링 된 3D 인간 조직 모델입니다. 표준화 된 프로토콜을 사용하여 우리는 생리 발달 동안 NMJ 기능의 변화를 측정하고 신경 독소 노출 및 중증 근무력증 환자 혈청과 같은 병리학의 해로운 영향을 특성화하는 능력을 입증했습니다.
이전의 연구들은 MG 환자 혈청22를 사용하여 골격 근관과 공동 배양에서 광유전학적 hPSC 유래 모토뉴런으로 MG를 모델링하는 능력을 보고하였다. 그러나 시스템은 2D로 되어 무작위 위치에 수축을 기록하여 재현성을 제한하고 모델의 양적 능력을 저하시켰습니다. 2D 시스템에 비해 우리 시스템의 가장 큰 장점 중 하나는 3D 환경을 에뮬레이트하여 MN과 SkMs간에 세포 및 형태 학적 개발을보다 정확하게 용이하게한다는 것입니다. 조직이 고유 생리학처럼 행동하는 데 필요한 생체 역학적 단서가 3D 시스템13,14,15,16에서 우월하게 모방된다는 것을 뒷받침하는 큰 증거가 있습니다. 또한, 3D 시스템의 다양한 측면은 시냅스의 지시된 형성, 샘플 간의 이질성 감소, 광유전학을 통한 자극의 공간적-시간적 제어 증가, 각 샘플 분석의 주관성을 감소시키는 자동화된 고처리량 시스템 등 보다 통제된 환경을 허용한다.
개발 된 시스템은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), Duchenne 근이영양증 (DMD) 등과 같은 다른 신경 근육 질환 (NMD)을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. ALS 병리 생리학은 신경 근육 접합부17,27이 아닌 운동 뉴런 자체의 기능 장애를 포함하지만, 우리 시스템은 뉴런 변성 또는 손상 후 감소 된 근육 수축을 보여줌으로써 ALS의 질병 상태를 되돌릴 수있는 능력을 가지고 있습니다. DMD는 디스트로핀 단백질의 부족으로 인한 근육 퇴행성 질환으로, 이는 근육 약화 및 최종 변성(28)을 초래한다. 이 시스템은 디스트로핀 억제제를 운반하는 유전자 조작 골격근 또는 디스트로핀이 부족한 병든 근육 세포를 통합하여 DMD를 모델링 할 수 있습니다. 전반적으로이 시스템은 시험관 내 3D 플랫폼에서 다양한 NMD를 재구성 할 수있는 유연성과 힘을 갖추고 있습니다.
다양한 세포 공급원을 필요로 하는 프로토콜의 경우, 각각은 특정 수준의 합류성을 가지며, 가장 중요한 측면 중 하나는 타이밍이다. 원발성 골격근 세포의 확장 동안, 융합으로 인해 너무 합류하지 않도록하는 것이 중요합니다 (65 % -70 %). 때때로, 트립신을 사용하여 덩어리를 분해하는 경우에도, 이것은 생물 반응기로의 더 낮은 효능 시딩으로 해석된다는 것이 관찰되었다. 또 다른 중요한 측면은 오픈 웰 생물 반응기 플랫폼 생산입니다. PDMS 플랫폼 간의 균질성을 높이려면 플랫폼 기둥의 기계적 특성의 변동을 피하기 위해 오븐에서 소비하는 시간을 모든 플랫폼에서 균일하게 유지해야합니다. 추가적으로, 근육 세포를 반응기 내로 시딩하는 동안, 시딩 밀도의 일관성을 유지하기 위해, 생물반응기 내의 매 두 개 내지 세 개의 구획 사이에서 튜브를 부드럽게 와류(1-1.5 s)하는 것이 합리적이다. 마지막으로, NMJ 개발의 성공률은 신경 구체의 첨가가 매우 섬세하고 사람마다 다르기 때문에 모토네론 시딩의 성공에 크게 의존하는 것으로 나타났습니다. 시드 연습을 통해 성공률이 증가하여 시작된 문화의 약 90 %가 자극되고 이미징 될 수 있습니다.
현재, 가까운 장래에 해결될 수 있는 몇 가지 한계는 논의된 ChR2 이외의 광유전학 단백질의 혼입 및 검증이다. 전압/칼슘 이미징 또는 근육 대사를 위한 세포 유형 및 광유전학 센서에 대한 특정 제어가 시스템에 추가되어 판독 및 분석을 증가시킬 수 있습니다. 청색광이 고용량에서 광독성을 유도함에 따라, 자극 요법은 30초로 제한되었다. 이 효과는 더 긴 기간의 자극 연구를 위해 적색 이동 채널로돕신을 통합함으로써 개선될 수 있다. 추가적으로, 모델의 향후 반복에서 개선될 수 있는 또 다른 한계는 슈완 세포와 같은 뉴런 지지 세포의 부족이다. 그러나이 플랫폼 및 분석 코드의 다양성은 다양한 광유전학 적 구조 및 세포 유형을 통합 할 수있게합니다. 우리의 ChR2-hiPSC 라인은 CRISPR을 사용하여 만들어졌지만 hiPSC에 광유전 반응을 구현하는 데 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 또한, hiPSCs의 적응성으로, NMJ 모델은 단일 세포 공급원으로부터 개발될 수 있고, 환자 특이적 모델이 신경근 질환(18)을 더 연구하는데 사용될 수 있게 한다.
이 플랫폼은 시간이 지남에 따라 인간 NMJ 기능에 대한 반복적이고 자동화되고 편향되지 않은 분석을 제공하며 신경 독소 또는 MG 환자 혈청과 같은 외부 이펙터로 인한 기능의 정량화 가능한 변화를 감지 할 수 있습니다. 전반적으로, 우리의 3D 시스템은 질병 병리학 초기에 인간의 NMJ 기능을 조사 할 수있게하고, 약물 검사의 기회를 제공하며, 정밀 의학을 발전시키기위한 견고한 시스템의 토대를 마련합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 NIH [보조금 번호 EB025765 및 EB027062], DOD [수상 번호 W81XWH-18-1-0095] 및 엔지니어링을 통한 UCSF 건강 혁신 (HIVE 펠로우십)의 자금 지원을 감사하게 생각합니다. 우리는 컬럼비아 대학 줄기 세포 코어가 세포 재 프로그래밍에 대한 도움과지도에 대해 감사하게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NbActiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25x36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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