Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruktion och karakterisering av en optogenetisk modell av den mänskliga neuromuskulära korsningen

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Vi beskriver ett reproducerbart, automatiserat och opartiskt bildsystem för att karakterisera neuromuskulär korsningsfunktion med hjälp av mänskligt konstruerad skelettmuskelvävnad och optogenetiska motoneuroner. Detta system möjliggör funktionell kvantifiering av neuromuskulär anslutning över tid och detekterar minskad neuromuskulär funktion orsakad av neurotoxiner och myasthenia gravis patient serum.

Abstract

Många neuromuskulära sjukdomar, såsom myasthenia gravis (MG), är förknippade med dysfunktion i den neuromuskulära korsningen (NMJ), vilket är svårt att karakterisera i djurmodeller på grund av fysiologiska skillnader mellan djur och människor. Vävnadsteknik erbjuder möjligheter att tillhandahålla in vitro-modeller av funktionella mänskliga NMJ som kan användas för att diagnostisera och undersöka NMJ-patologier och testa potentiella terapier. Genom att införliva optogenetiska proteiner i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genererade vi nervceller som kan stimuleras med specifika våglängder av ljus. Om NMJ är frisk och funktionell resulterar en neurokemisk signal från motoneuron i muskelkontraktion. Genom integrationen av optogenetik och mikrofabrikation med vävnadsteknik etablerade vi en opartisk och automatiserad metod för att karakterisera NMJ-funktionen med hjälp av videoanalys. Ett standardiserat protokoll utvecklades för NMJ-bildning, optisk stimulering med samtidig videoinspelning och videoanalys av vävnadskontraktilitet. Stimulering av optogenetiska motoneuroner med ljus för att inducera skelettmuskelkontraktioner rekapitulerar mänsklig NMJ-fysiologi och möjliggör upprepade funktionella mätningar av NMJ över tid och som svar på olika ingångar. Vi demonstrerar denna plattforms förmåga att visa funktionella förbättringar i neuromuskulär anslutning över tid och karakterisera de skadliga effekterna av patientens MG-antikroppar eller neurotoxiner på NMJ-funktionen.

Introduction

Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är den kemiska synapsen mellan motoneuroner (MNs) och skelettmuskelceller (SkM) som möjliggör muskelkontraktion. Toxiner, såsom neurotoxin α-bungarotoxin (BTX), eller neuromuskulära sjukdomar (NMD) som myastenia gravis (MG) kan leda till degeneration av NMJ och minskningar av muskelkontroll1. Biotekniska modeller av mänsklig vävnad rekapitulerar bättre de funktionella och fysiologiska mekanismerna hos mänskliga NMJ och erbjuder större translationell potential än djurmodeller.

Medan djurmodeller har avancerat förståelsen för NMJ: s bildning och funktion, finns det signifikanta skillnader mellan mänskliga och djursynapser som begränsar översättningen av resultat till människor och gör in vivo-karakterisering av NMJ utmanande 2,3,4. Studier har visat tydliga fysiologiska skillnader mellan mus och mänskliga NMJs. Möss har större NMJs och mindre aktiva zondensiteter jämfört med mänskliga NMJs4. Dessutom återspeglar läkemedelsstudier som utförs i djurmodeller inte alltid de effekter som finns i kliniska prövningar på människa. Konstruerade mänskliga vävnadsmodeller ger möjlighet att studera den hälsosamma utvecklingen av NMJ och patologin för neuromuskulära sjukdomar och möjliggöra läkemedelsscreening. Humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs)5 kan differentieras till en mängd olika celltyper, inklusive skelettmuskelceller 6,7 och motoneuroner 8,9. hiPSCs kan enkelt genereras från patientceller, vilket möjliggör bättre sjukdomsmodellering10 och läkemedelsscreening 11,12 genom patientspecifika vävnadsmodeller.

Tvådimensionella (2D) monolager-samkulturer av SkMs och MNs saknar morfologi, fenotyp, organisation och funktionellt beteende hos fysiologiska NMJs. NMJs bildas slumpmässigt i 2D-kultur, vilket hämmar isoleringen av motorenheter för analys, begränsar exakta funktionella mätningar och förhindrar deras användning för upprepade, systematiska experiment13 . Tredimensionella (3D) vävnadsmodeller av NMJs övervinner många av dessa begränsningar och rekapitulerar de morfologiska och funktionella egenskaperna hos fysiologiska NMJs 7,14,15,16,17. Med hjälp av denna modell utvecklas de två vävnadstyperna separat och integreras sedan genom att styra axonal tillväxt, vilket möjliggör mer organiserade NMJ att utvecklas jämfört med 2D-odlingssystem.

Vår tidigare studie visade att kombinationen av optogenetik med vävnadsteknik kan möjliggöra exakt icke-invasiv stimulering och utvärdering av NMJ-funktion18,19. Genom genteknik kan ljuskänsliga proteiner integreras i arvsmassan hos hiPSCs. Integrering av channelrhodopsin-2 (ChR2), en jonkanal som öppnas som svar på blått ljus, i membranet hos exciterbara celler såsom neuroner möjliggör beröringsfri spatiotemporal kontroll över cellaktivering 20,21,22. hiPSCs som bär ChR2 kan differentieras till optogenetiska motoneuroner som är känsliga för blått ljus, vilket tar bort behovet av typiska invasiva elektroder som stimulerar neuroner och undviker oönskad stimulering av muskelcellerna med elektroder23. Detta system använder optogenetiska motoneuroner för att stimulera sammandragningar i icke-optogenetiska skelettmuskelceller. Genom att kombinera videoförvärv och kontrollerad belysning av blått ljus kan de samodlade vävnaderna samtidigt stimuleras och spelas in för NMJ-funktion.

MG orsakas av autoantikroppar riktade nikotinacetylkolinreceptorer (AChR), vilket resulterar i minskad NMJ-funktion och muskelsvaghet24. Det diagnostiseras baserat på presenterade symtom, elektrodiagnos och detektion av autoantikroppar via serologiska blodprover. Emellertid, inte alla autoantikroppar som är involverade i MG har identifierats, och vissa seronegativa patienter diagnostiseras med MG men utan erkända antikroppar25,26. Vårt system möjliggör upprepad funktionell bedömning av NMJ före och efter tillsats av serum från MG-patienter, vilket ger ovärderlig insikt i de funktionella och biokemiska förändringar som orsakas av MG-antikropparna18. Vårt protokoll illustrerar hur man producerar 3D-in vitro-modeller av funktionell mänsklig NMJ som kan användas för att diagnostisera och undersöka NMJ-patologier och testa potentiella terapier. Vi demonstrerar systemets mångsidighet i två plattformar, en mikrofluidisk enhet och en större bioreaktorplattform med öppen brunn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla cellinjer för detta arbete skapades och användes i enlighet med de institutionella riktlinjerna från Columbia University, NY, USA.

1. Beredning av bioreaktor

  1. Gör bioreaktorformar
    1. Ladda ner en bioreaktor CAD-fil från den kompletterande CAD-filen eller skapa en anpassad egen design.
    2. Generera en CNC-verktygsväg från 3D-modellen med CAM-programvara.
    3. Maskin acetalformar med en CNC-fräsmaskin.
  2. Tillverkning av bioreaktorer
    1. Blanda en 10:1-bas till härdningsmedelsblandning av polydimetylsiloxan (PDMS, 77 g blandning per 4 plattformar/formar).
    2. Placera blandningen i en vakuumkammare, stäng alla ventiler, sätt på vakuumet och avgas blandningen i minst 30 minuter tills inga luftbubblor finns kvar. Häll blandningen i formar och avgasa formarna i vakuumkammaren i 1 h.
    3. Stäng formarna med den övre halvan av formen i rätt riktning. Placera en sexkantig stålstång över mitten och kläm fast på båda sidor.
    4. Fyll på toppen med PDMS.
    5. Härda formarna i en ugn på 65 °C i minst 4 timmar.
    6. Ta bort plattformarna från formarna efter kylning till rumstemperatur.
    7. Rengör enheterna i ett ultraljudsbad med 1 h cykler av diskmedel, 400 ml 100% isopropanol och destillerat vatten.
    8. Torka över natten vid 65 °C.
    9. Blötlägg glasöverdrag i 1% nonjoniskt ytaktivt medel polyol i 30 minuter och se till att täckglasen inte staplas så att de alla är ordentligt belagda.
    10. Skölj väl med destillerat vatten och torka över natten vid 65 °C.
    11. Använd en plasmarengörare i höjden med 6 l/min syre i 1-2 minuter till behandlingsglasöverdragen och PDMS-plattformen. När de har behandlats, bind ihop de två genom att trycka PDMS ner på täckglaset i minst 30 s.
    12. Autoklavera de bundna enheterna innan du lägger till celler.

2. Bygga en optisk stimuleringsinställning

  1. Använd ett 30 mm burkubsystem och fäst en 573 nm dikroisk spegel i mitten. Koppla ihop en röd 627 nm LED med ett 594 nm långpass excitationsfilter och fäst det på kubens ovansida, med lysdioden vänd mot spegeln. Fäst sedan en blå 488 nm lysdiod med ett 546 nm kortpass excitationsfilter på den intilliggande sidan av kuben, med lysdioden vänd mot spegeln som visas i schemat i figur 3A.
  2. Fäst ett ringaktiverat irismembran på botten av burkuben för att kontrollera storleken på det upplysta området.
  3. Strömförsörj varje lysdiod med en T-Cube LED-drivrutin och styr via ett Arduino Uno Rev3-kort. Anslut SIDOINGÅNGEN på LED-drivrutinen till en strömkällkontakt, anslut mittutgången till Arduino och anslut sidoutgången direkt till lysdioderna.
  4. Anslut Arduino Uno till en dator med en USB-kabel.
  5. Ladda ned filer från GitHub-länken (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Öppna filen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" från GitHub-mappen.
  7. Ställ in startparametrar: Steg = 30; startFrekvens = 0,5; endFrequency = 3; pulsLängd = 100.
  8. Se till att stiftutgång 4 är tilldelad den blå LED-drivrutinen och stiftutgång 2 tilldelas den röda LED-drivrutinen. Kontrollera att LED-drivrutinens mittledningar är anslutna till marken och till respektive stiftutgång.
  9. Kompilera och ladda programmet "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" till Arduino.
  10. Anslut varje LED-drivrutin till motsvarande kanal.

3. Inställning av cellodling (dag -21-0)

  1. Primära skelettmuskelceller
    1. Tina och expandera primära skelettmyoblaster (erhållna från Cook Myosite) i högst sex passager med myotoniskt tillväxtmedium (+ tillägg). Behåll cellerna i en inkubator inställd på 37 °C och 5 %CO2.
    2. Byt media var 2: e dag.
    3. När cellerna är cirka 60% sammanflytande, passera dem med 0,05% Trypsin-EDTA (1x, i 5 min vid 37 ° C). Samla de dissocierade cellerna och tillsätt färskt media för att neutralisera trypsinet.
    4. Snurra ner cellerna vid 300 x g och aspirera supernatanten ovanför cellpelleten.
    5. Återsuspendera cellerna med MGM och frö 1:3 med 60 ml per trippelskiktskolv.
  2. ChR2-hiPSC
    OBS: Alla cellinjer för detta arbete skapades och användes i enlighet med de institutionella riktlinjerna från Columbia University, NY, USA. I detta protokoll genererades ChR2-uttryckande hiPSCs via CRISPR-Cas9-genomredigering med tidigare beskrivna metoder18, men alla stabila optogenetiska cellinjer (lentiviral, piggyBac, etc.) kan användas på samma sätt. Konstitutiva promotorer uttryckta i både iPSCs och motoneuroner valdes (CAG). Cellerna visade sig ha frisk karyotyp, vilket noterats i tidigare publikationer18,19.
    1. Täck 6-brunnsplattor med 1 ml/brunn solubiliserad källarmembranmatris utspädd i DMEM/F12 (1:80) och inkubera plattorna vid rumstemperatur i 1 timme.
    2. Frö iPSC på belagda 6-brunnsplattor med 2 ml matarfritt cellodlingsmedium (iPSC-media), utbyte av 2 ml media varannan dag och passaging var 5-7: e dag. Behåll cellerna i en inkubator inställd på 37 °C och 5 % CO2.
    3. Passaging
      1. Dissociera stamcellerna genom att inkubera med 1 ml enzymfritt stamcellsfrisättande reagens i 4 min och mekaniskt skjuva med en bredspets P1000-pipett.
      2. Fröceller i förhållandet 1:24 eller 1:48 i iPSC-media med 2 μM Y-27632 dihydroklorid i 2 ml / väl på belagda 6-brunnarsplattor.

4. Skelettmuskelvävnad sådd (dag -3)

  1. Isolera och räkna 30 x 106 myoblaster med hjälp av en automatiserad cellräknare.
  2. Resuspendera myoblasterna i en 4: 1 blandning av 3 mg / ml kollagen I och löslig källarmembranmatris (800 μL kollagenblandning + 200 μL källarmembranmatris för att nå en slutlig volym på 1 ml). För kollagenkomponenten, tillsätt det medföljande neutraliserande medlet (9: 1 blandning av kollagen till neutraliserande medel) och späd blandningen med 1x PBS för att uppnå en volym av 800 μL.
  3. Tillsätt 15 μL cellkollagensuspension till varje muskelkammare i bioreaktorn, var noga med att sprida suspensionen över båda pelarna med pipettspetsen (figur 2).
  4. Låt cell-gelblandningen polymerisera vid 37 °C i 30 min och fyll sedan varje bioreaktor väl med 450 μL myotoniska tillväxtmedier.
  5. Efter 3 dagar (när gelén har komprimerats), börja myotube-differentiering.

5. Myotube-differentiering (dag 0-14)

  1. Börja myotubeinfusionen genom att byta vävnader till 450 μL fusionsinducerande media (FS, tabell 1) i 7 dagar och byt media varannan dag.
    OBS: Försök att börja myotubedifferentiering samma dag som motoneurondifferentiering från hiPSCs för att fröa motoneuroner i slutet av båda celltypernas differentieringsscheman.
  2. På dag 7 ändra media till 450 μL mognadsmedia Ia (MMIa, tabell 1).
  3. På dag 9, byt till 450 μL mognadsmedia Ib (MMIb, tabell 1).
  4. På dag 11, ändra media till 450 μL NbActiv4. Fortsätt byta media var 2: e dag tills motoneuronerna är sådda (steg 7).

6. Motoneuron differentiering (dag 0-14)

OBS: Vårt motoneurondifferentieringsprotokoll anpassades från Maury et al8.

  1. På dag 0, överför 4 x 106 ChR2- hiPSCs till en petriskål med ultralåg fastsättning med 15 ml motoneuronsuspensionsodlingsmedium (MSCM, tabell 1). Komplettera MSCM med 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat och 5 μM Y-27632 dihydroklorid.
  2. På dag 2, isolera neurosfärerna (NS) med en 37 μM reversibel sil och relatera i 15 ml MSCM med 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrat och 0,1 μM retinsyra. NS ska vara synligt i petriskålen utan att använda ett mikroskop efter dag 2.
  3. På dag 4, överför cellerna och media till ett 50 ml rör och låt neurosfärerna sätta sig till botten (5 min). Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 15 ml MSCM kompletterat med 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 och 0,1 μM retinsyra.
  4. På dag 7, upprepa steg 6.3. men återsuspendera cellerna i 15 ml MSCM kompletterat med 0,5 μM SAG och 0,1 μM retinsyra.
  5. På dag 9, upprepa steg 6.3. men återsuspendera celler i 15 ml MSCM kompletterat med 10 μM DAPT.
  6. På dag 11, upprepa steg 6.3. men återsuspendera cellerna i 15 ml MSCM kompletterat med 20 ng / ml BDNF och 10 ng / ml GDNF.
  7. På dag 14, frö motoneuronerna i plattformen.

7. Sådd av motoneuroneraggregat i bioreaktor (dag 14)

  1. Bered en 4:1 gelblandning av 2 mg/ml kollagen I och Matrigel (800 μl kollagenblandning + 200 μl Matrigel för att nå en slutlig volym på 1 ml). För kollagenkomponenten, tillsätt det medföljande neutraliserande medlet (9: 1 blandning av kollagen till neutraliserande medel) och späd blandningen med 1x PBS för att uppnå en slutlig volym på 800 μL.
  2. Använd en 400 nm cellsil för att välja stora neurosfärer och återsuspendera dem i gelblandningen.
  3. Aspirera media från behållaren och försiktigt från neurosfärbrunnen (Figur 2).
  4. Tillsätt 15 μL gelblandning i neurosfärkanalen.
  5. Ladda en 10 μL pipett med 10 μL gel och välj sedan en neurosfär.
  6. Sätt in NS i neurosfärkanalen och se till att NS är i kammaren. Höj pipetten långsamt medan du släpper ut den återstående gelén när NS har deponerats. Om du är osäker på att NS deponerades korrekt, kontrollera dess plats med ett mikroskop.
  7. Låt gelén polymerisera i 30 min vid 37 °C.
  8. Tillsätt 450 μL NbActiv4 kompletterat med 20 ng/ml BDNF och 10 ng/ml GDNF till behållarna.
  9. Byt media varannan dag för att möjliggöra axonal tillväxt från NS till muskelvävnad.

8. Samtidig optisk stimulering och videoinspelning av NMJ-funktion (dag 24+)

  1. För avbildning, använd ett inverterat fluorescerande mikroskop med en vetenskaplig komplementär metalloxid-halvledarkamera (sCMOS).
  2. Ställ in kamerans programvara på 2x2, exponering för 20 ms, rullande slutare PÅ, avläsningshastighet till 540 MHz, dynamiskt omfång: 12-bitars &gain 1 och sensorläge: överlappning.
  3. Använd 2x mål på mikroskopet för att avbilda mikrotissemerna.
  4. Fäst en levande cellkammare (37 °C, 5 %CO2) i mikroskopstadiet.
  5. Välj den intressanta regionen (ROI) som innehåller den innerverade skelettvävnadsvävnaden för att minimera filstorleken och bearbetningstiden.
  6. Placera ett 594 nm långpass-emissionsfilter mellan provet och bildmålet för att filtrera bort blåljuspulser från kameran.
  7. Placera en rektangulär 4-brunnsplatta som innehåller 4 bioreaktorer (24 vävnader) i den levande cellkammaren.
  8. Klicka på Live View. Centrera och fokusera bilden med önskad ROI.
  9. Ladda upp den anpassade makrokoden från GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) för att styra scenpositionen, Arduino-kortet och videoförvärvet.
  10. Ställ in utdatafilm som: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Kör makrokoden med önskade X,Y-koordinater inställda på scenen och få en snabb tidsfördröjning med 1700 bilder vid 50 bilder /s.
  12. Byt ut media efter avbildning och återför proverna till inkubatorn. Tillåt minst 24 timmar mellan bildinsamlingssessionerna för att undvika vävnadströtthet.

9. Bearbetning och analys av tillverkningssatser (dag 24+)

  1. Film bearbetning
    1. Använd den anpassade MATLAB-koden för att bearbeta videorna i batchanalys. Filerna kan laddas ned från GitHub-mappen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Funktionerna listas och förklaras i tabell 2.
      KODEN är kompatibel med .nd2- och .czi-format. Det kräver parallell bearbetning för att aktiveras i MATLAB och behöver bioformatpaketet.
    2. Kör skriptet recursiveOSAnalysis för att analysera filmerna genom parallell bearbetning. Ha alla förvärvade videor i samma mapp och välj den mappen när du kör koden.
    3. Justera parametrarna efter analys efter behov.
      1. Ändra baselineTime (alternativ 1) om spontan sammandragning tas upp i början av inspelningen. Detta visar en första avläsning långt över 0 och behöver ramen flyttas för att kompensera.
      2. Ändra peakThreshold (alternativ 2) om kontraktionerna inte registreras. Koden kommer att upptäcka sammandragningar som är över 25% av den högsta toppen som standard så att detta värde kan ändras.
      3. Ändra minMinProminence och minMinWidth för att justera känsligheten när du upptäcker början på varje topp.
    4. Generera video- och grafutdata.
      1. Kör rekursivOSMovie för att generera en videofil för varje vävnad med respektive kontraktilitetsspårning.

10. Störning av NMJ-funktionen (dag 24+)

  1. Förbered behandlingsmedier genom att tillsätta extern effektor till NbActiv4 basala medier kompletterat med 20 ng / ml BDNF och 10 ng / ml GDNF.
    1. För MG-serumxperimentet, använd 20% MG patientserum i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. För BTX-experimentet, använd 5 μg / ml BTX i NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimulera/avbilda med steg 3.2. för att registrera baslinjen.
  3. Byt ut mediet i vävnader mot behandlingsmedier (450 μl/vävnad).
  4. Inkubera under önskad tid (48 timmar för patientserum, 20 min för BTX).
  5. Stimulera/avbilda igen med steg 3.2. för att registrera funktion efter behandling.
  6. Ta bort behandlingsmediet och låt vävnaderna vila under önskad tid (48 timmar efter avlägsnande av serum)
    OBS: Tillåt minst 24 timmar mellan stimulering och avbildning för att undvika vävnadsutmattning

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neuromuskulära korsningar genererades genom samodling av optogenetiska hiPSC-härledda motoneuroner med icke-optogenetisk skelettmuskelvävnad. Mänskliga primära skelettmyoblaster (SkM) såddes in i plattformarna och differentierades till flerkärniga myotubes med hjälp av 2-veckorsprotokollet. De optogenetiska motoneuronerna differentierades separat, men parallellt med myotubedifferentieringen, och såddes sedan in i plattformen (Figur 1). Vävnaderna började dra ihop sig som svar på stimulering av blått ljus 7-12 dagar efter MN-sådd, vilket indikerar framgångsrik utveckling och mognad av NMJ: erna. NMJs kan odlas, stimuleras och avbildas i upp till 40 dagar efter motoneuron sådd, men den optimala tidpunkten inträffar på dag 1619. Den morfologiska och biokemiska valideringen av differentieringarna och närvaron av de optogenetiska proteinerna visas i kompletterande figur 1 och har validerats i tidigare studier18,19.

För att visa att protokollet enkelt kan anpassas till olika odlingssystem testades strategin med hjälp av två olika uppdelade reaktorer: en mikrofluidisk anordning och en bioreaktor med öppen brunn. Båda systemen har en liknande design, med en kammare försedd med pelare för generering av skelettmuskelvävnader och en andra kammare för odling av 3D-motoneuronaggregat som kan förlänga axoner för att innervera skelettvävnaderna (Figur 2A, B). De två systemen har emellertid olika skalor, där den mikrofluidiska anordningen ger 1 mm långa skelettmuskelvävnader som omfattar cirka 20 000 myoblaster (figur 2C) och bioreaktorsystemet med öppen brunn vilket resulterar i 4 mm långa muskelvävnader som omfattar cirka 450 000 myoblaster (figur 2D).

För att möjliggöra kontrollerad stimulering av de optogenetiska NMJ: erna byggdes en optisk installation, bestående av en röd 637 nm LED för ljusfältbelysning, en blå 488 nm LED för aktivering av ChR2-MNs och ett blått ljusfilter mellan vävnadsprovet och målet för att förhindra att blått ljus stör bildanalysen (figur 3A). Lysdioderna drevs av LED-drivrutiner och styrdes exakt via en Arduino-mikroprocessor. NMJ-funktionen utvärderades genom att samtidigt förvärva time-lapse-videor samtidigt som MNs stimulerades med blått ljus med hjälp av ett anpassat mikroskopmakroskript parat med Arduino-koden (figur 3B). Protokollet ökade stimuleringsfrekvensen från 0, 2 Hz till 2 Hz i 30 steg. När filmerna hade förvärvats analyserades vävnadsfunktionen med hjälp av ett anpassat MATLAB-paket (figur 3C). Analysen mätte vävnadsförskjutning, genererade ett kontraktilitetsspår och synkroniserade det med ljusstimuleringsprotokollet. Den bestämde sedan fraktionen av effektiva pulser (F) och en förväntad fraktion av effektiva pulser (E) för att ta hänsyn till potentiella ostimulerade sammandragningar. Den förväntade fraktionen (E) beräknades som den fraktion av pulser som skulle märkas som effektiv om sammandragningarna slumpmässigt fördelades inom 30 s. Vävnadspoängen beräknades sedan som (F-E)/(1-E), med ett värde mellan 0 och 1 (figur 3C). Koden avgör om en sammandragning utlöses baserat på tiden mellan en ljuspuls och början av kontraktilitetstoppen, som visas i figur 3D. Denna automatiserade, opartiska metod möjliggör upprepad karakterisering av NMJ-funktionen i stora provstorlekar och över tid. Koden innehåller avstämbara parametrar som kan justeras efter bearbetning för att säkerställa korrekt poängsättning (kompletterande figur 2).

Systemets förmåga att kvantitativt karakterisera NMJ-funktionen över tid demonstrerades genom att avbilda en grupp vävnader i 11 dagar (dag 9 till dag 20 efter motoneuronsådd). Systemet fångade förbättring av NMJ-funktionen i vävnader, vilket visade en ökning av utlösta svar 1 vecka efter vävnadstillverkning (figur 4A), följt av en stabil funktion i ytterligare en vecka (figur 4B). För att verifiera att muskelstimulering inträffade genom NMJ: erna analyserades en annan grupp vävnader före och efter 20 minuters inkubation med 5 μg / ml av neurotoxinet α-bungarotoxin (BTX), som binder specifikt och irreversibelt till acetylkolinreceptorer. BTX stoppade alla utlösta och spontana sammandragningar, resulterade i en fullständig störning av NMJ-funktionen och visade att ljusstimulering av vävnaderna kräver en funktionell NMJ (figur 4C, D). Seriella utspädningar av BTX testades initialt för att identifiera den optimala BTX-koncentrationen (resultat visas inte).

För att utvärdera systemets translationella förmåga utvärderades NMJ-funktionen före och efter tillsatsen av serum från fem myasthenia gravis-patienter. Analys av vävnaderna behandlade med 20% MG serum i 48 timmar visade minskad funktion jämfört med kontrollvävnader behandlade med serum från friska givare (figur 4E,F). De konstruerade NMJ:erna utvärderades också igen 48 timmar efter avlägsnande och tvättning av serumet och visade återhämtning av funktionen (figur 4F). Dessutom testades ökande koncentrationer av patientserum och normal human serumkontroll (5%, 20%, 40%) för att identifiera den optimala koncentrationen som påverkade vävnadsfunktionen. Resultaten visade systemets förmåga att karakterisera och kvantifiera NMJ-funktion och att modellera myasthenia gravis in vitro.

Figure 1
Figur 1. Experimentell design och tidslinje. Tidslinje (dagar) för differentiering och sådd i plattformar. SkM = skelettmuskel, ChR2 = optogenetiska motoneuroner, NMJ = neuromuskulär korsning. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Vila et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Samkultursystem för generering av 3D NMJ. (A) Schematisk för den mikrofluidiska plattformen. (B) Schematisk bild av PDMS-bioreaktorn med öppen brunn. (C) Innerverad skelettmuskelvävnad i den mikrofluidiska plattformen. (D) Innerverad vävnad i bioreaktorn med öppen brunn. Skalstång 0,5 mm. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Vila et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Stimulering, inspelning och analys av NMJ-funktionen. (A) Schematisk över LED-inställning och ljusväg. (B) Optisk inställning med ett inverterat mikroskop, levande cellkammare, automatiserat stadium och sCMOS-kamera. (C) Algoritm för batchbehandling av optiska stimuleringsvideor av NMJ-kulturer. (D) Representativ bildruta för videon som genereras av MATLAB-koden och motsvarande kontraktilitetsspårningsdiagram. Den blinkande blå rutan i videon och de vertikala linjerna i diagrammet indikerar när stimuleringen av blått ljus inträffar. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Vila et al.18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. NMJ-funktion. (A) Kontraktilitetsspår för 3D-konstruerade mänskliga NMJs. (B) Poäng för NMJ som svar på ljus, som visar förbättring av funktionen under 11 dagar (n = 47, enkelriktad ANOVA p = 1 x 10-8). (C) Kontraktilitetsspår efter 20 minuters behandling med 5 mg/ml av neurotoxinet α-bungarotoxin (BTX). (D) Kvantifiering av NMJ-funktion (poäng) före och efter behandling med BTX (n = 6; enkelriktad ANOVA F = 9 x 10-8). (E) Kontraktilitetsspår av vävnader med 20% MG-serum efter 48 timmars behandling. (F) NMJ-funktionsbedömning för behandlade grupper och kontrollgrupper före och efter behandling och efter återhämtning (n = 12; efter behandling post hoc ANOVA F = 0,0002; *indikerar p = 0,0015 **indikerar p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS=normalt humant serum). n anger antalet biologiska replikat. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Vila et al.18,19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Myogena och neurala medieformuleringar. Organiserad lista över tillväxtfaktorer och kosttillskott för media. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2. Lista över MATLAB-funktioner. Korta förklaringar av MATLAB-funktioner som används för bildanalys. Denna tabell har ändrats med tillstånd från Vila et al.18. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande filer

Kompletterande figur 1. Myotube och motoneuron differentieringar. (A) Myotube-differentieringsprotokoll (MM = mognadsmedia). (B) Immunofluorescens (IF) bilder som visar uttryck av skelettmuskelmarkörer myosin tung kedja (MHC), α-aktinin och desmin i differentierade myotubes. (C) Motoneuron differentiering protokoll. (D) Lokalisering av channelrhodopsin-2 med YFP (ChR2-YFP) till membran i optogenetiska iPSCs och (E) MNs som bekräftar framgångsrik infektion. (F) Samuttryck av kolinacetyltransferas (ChAT, röd) och ChR2 (grön) i optogenetiska MNs. Skalstänger 100 μm. Reproducerad med tillstånd från Vila et al.18. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2. Felaktig bearbetning som kräver justering av parametrar. (A) Felaktig baslinjetid resulterar i toppar med fel form. (B) En för hög topptröskel leder till att toppar inte upptäcks. (C) För milda förhållanden för detektion av minima (dvs. för låga värden valda för minMinProminminence och / eller minMinWidth) resulterar i att minima märks i mitten eller till och med toppen av topparna och därför räknas som "origgade" eftersom de börjar för långt från föregående ljuspuls. (D) För stränga villkor för detektering av minima resulterar i att början av toppen märks före ljuspulsen eller till och med saknas, som i detta exempel. Reproducerad med tillstånd från Vila et al.18. Fil som visar 3D-modell av bioreaktorplattform som kan redigeras och exporteras för att göra formar för bioreaktortillverkning med PDMS. Klicka här för att ladda ner den här filen.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Kompletterande CAD-fil. Fil som visar 3D-modell av bioreaktorplattform som kan redigeras och exporteras för att göra formar för bioreaktortillverkning med PDMS. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta system är en konstruerad 3D-modell för mänsklig vävnad som kombinerar optogenetik och videobearbetning för att möjliggöra automatiserad och opartisk utvärdering av NMJ-funktionen. Med hjälp av ett standardiserat protokoll har vi visat förmågan att mäta förändringar i NMJ-funktionen under fysiologisk utveckling och karakterisera de skadliga effekterna av patologier som neurotoxinexponering och myastenia gravis patient sera.

Tidigare studier har rapporterat förmågan att modellera MG med optogenetiska hPSC-härledda motoneuroner i samodling med skelettmyotubes med MG-patientserum22. Systemet var dock i 2D och registrerade sammandragningar på slumpmässiga platser, vilket begränsade reproducerbarheten och minskade modellens kvantitativa förmåga. En av de största fördelarna med vårt system, jämfört med ett 2D-system, är att det gör att vi kan emulera 3D-miljön, vilket mer exakt underlättar cellulär och morfologisk utveckling mellan MNs och SkMs. Det finns stora bevis som stöder att de biomekaniska ledtrådar som krävs för att en vävnad ska bete sig som sin ursprungliga fysiologi efterliknas överlägset i ett 3D-system 13,14,15,16. Dessutom möjliggör olika aspekter av 3D-systemet en mer kontrollerad miljö: riktad bildning av synapser, mindre heterogenitet mellan prover, ökad rumslig-temporal kontroll av stimulering via optogenetik och ett automatiserat system med hög genomströmning som minskar subjektiviteten i varje provs analys.

Det utvecklade systemet kan användas för att modellera andra neuromuskulära sjukdomar (NMD), såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS), Duchennes muskeldystrofi (DMD) och andra. Även om ALS-patofysiologi involverar dysfunktionen hos själva motorneuronen snarare än den neuromuskulära korsningen17,27, har vårt system förmågan att rekapitulera sjukdomstillståndet för ALS genom att visa minskad muskelkontraktion efter neurondegeneration eller skada. DMD är en muskulär degenerativ sjukdom orsakad av brist på dystrofinprotein, vilket leder till muskelsvaghet och eventuell degeneration28. Systemet kan modellera DMD genom att införliva genetiskt konstruerad skelettmuskulatur som bär en dystrofinhämmare eller sjuka muskelceller som saknar dystrofin. Sammantaget har systemet flexibiliteten och kraften att rekapitulera olika NMD i en in vitro 3D-plattform.

För ett protokoll som kräver olika cellkällor, var och en med särskilda nivåer av sammanflöde, är en av de mest kritiska aspekterna timing. Under expansionen av primära skelettmuskelceller är det viktigt att inte låta dem bli för sammanflytande (65%-70%) på grund av fusion. Ibland, även när man använder trypsin för att bryta upp klumparna, har det observerats att detta översätts till lägre effektiv sådd i bioreaktorerna. En annan kritisk aspekt är produktionen av bioreaktorplattformar med öppen brunn. För att öka homogeniteten bland PDMS-plattformarna bör den tid de tillbringar i ugnen hållas enhetlig över alla plattformar för att undvika fluktuationer i plattformspelarnas mekaniska egenskaper. Dessutom, under sådden av muskelcellerna i reaktorerna, för att upprätthålla konsistensen av sådddensiteten, är det förnuftigt att virvla röret försiktigt (1-1,5 s) mellan vartannat till tre fack inom bioreaktorerna. Slutligen sågs framgångsgraden för NMJ-utveckling vara till stor del beroende av framgången med motoneuron sådd eftersom tillsatsen av neurosfärer är så känslig och varierar från person till person. Med såddpraxis ökar framgångsgraden, vilket gör att cirka 90% av de initierade kulturerna kan stimuleras och avbildas.

För närvarande är några begränsningar som kan åtgärdas inom en snar framtid införlivandet och valideringen av andra optogenetiska proteiner än chR2 som diskuteras. Specifik kontroll över båda celltyperna och optogenetiska sensorer för spännings-/kalciumavbildning eller muskelmetabolism kan läggas till systemet för ökad avläsning och analys. Eftersom blått ljus inducerar fototoxicitet vid höga doser var stimuleringsregimen begränsad till 30 s. Denna effekt kan förbättras genom att införliva ett rödförskjutet kanalrhodopsin för stimuleringsstudier med längre varaktighet. Dessutom är en annan begränsning som kan förbättras i framtida iterationer av modellen bristen på neuronala stödjande celler som Schwann-celler. Mångsidigheten hos denna plattform och analyskod gör det dock möjligt att införliva en mängd olika optogenetiska konstruktioner och celltyper. Medan vår ChR2-hiPSC-linje skapades med CRISPR, kunde andra metoder användas för att implementera ett optogenetiskt svar i hiPSCs. Dessutom, med anpassningsförmågan hos hiPSCs, kan NMJ-modellen utvecklas från en enda cellkälla, vilket gör det möjligt att använda patientspecifika modeller för att ytterligare studera neuromuskulära sjukdomar18.

Denna plattform ger upprepad, automatiserad och opartisk analys av human NMJ-funktion över tid och kan upptäcka kvantifierbara funktionsförändringar på grund av externa effektorer, som neurotoxiner eller MG-patientserum. Sammantaget möjliggör vårt 3D-system undersökning av mänsklig NMJ-funktion tidigt i sjukdomspatologi, ger möjlighet till läkemedelsscreening och lägger grunden för ett robust system för att främja precisionsmedicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt finansieringsstöd från NIH [bidragsnummer EB025765 och EB027062], DOD [tilldelningsnummer W81XWH-18-1-0095] och UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Vi erkänner tacksamt Columbia University Stem Cell Core för deras hjälp och vägledning med cellomprogrammering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Bioteknik utgåva 182
Konstruktion och karakterisering av en optogenetisk modell av den mänskliga neuromuskulära korsningen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter