Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.

Abstract

Veel neuromusculaire ziekten, zoals myasthenia gravis (MG), zijn geassocieerd met disfunctie van de neuromusculaire overgang (NMJ), die moeilijk te karakteriseren is in diermodellen vanwege fysiologische verschillen tussen dieren en mensen. Tissue engineering biedt mogelijkheden om in vitro modellen van functionele menselijke NMJ's te bieden die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. Door optogenetische eiwitten op te nemen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), genereerden we neuronen die kunnen worden gestimuleerd met specifieke golflengten van licht. Als de NMJ gezond en functioneel is, resulteert een neurochemisch signaal van het motoneuron in spiercontractie. Door de integratie van optogenetica en microfabricage met tissue engineering, hebben we een onbevooroordeelde en geautomatiseerde methodologie vastgesteld voor het karakteriseren van NMJ-functie met behulp van video-analyse. Een gestandaardiseerd protocol werd ontwikkeld voor NMJ-vorming, optische stimulatie met gelijktijdige video-opname en video-analyse van weefselcontractiliteit. Stimulatie van optogenetische motoneuronen door licht om skeletspiercontracties te induceren, recapituuleert de menselijke NMJ-fysiologie en maakt herhaalde functionele metingen van NMJ in de loop van de tijd en in reactie op verschillende inputs mogelijk. We demonstreren het vermogen van dit platform om functionele verbeteringen in neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd te laten zien en de schadelijke effecten van MG-antilichamen of neurotoxinen van patiënten op de NMJ-functie te karakteriseren.

Introduction

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de chemische synaps tussen motoneuronen (MN's) en skeletspiercellen (SkM) die spiercontractie mogelijk maakt. Toxines, zoals neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), of neuromusculaire ziekten (NMD) zoals myasthenia gravis (MG) kunnen leiden tot degeneratie van de NMJ en vermindering van spiercontrole1. Bio-technische menselijke weefselmodellen kunnen de functionele en fysiologische mechanismen van menselijke NMJ's beter samenvatten en een groter translationeel potentieel bieden dan diermodellen.

Hoewel diermodellen het begrip van de vorming en functie van de NMJ hebben verbeterd, zijn er significante verschillen tussen menselijke en dierlijke synapsen die de vertaling van resultaten naar mensen beperken en in vivo karakterisering van de NMJ uitdagend maken 2,3,4. Studies hebben duidelijke fysiologische verschillen aangetoond tussen muis en menselijke NMJ's. Muizen hebben grotere NMJ's en kleinere actieve zonedichtheden in vergelijking met menselijke NMJ's4. Bovendien weerspiegelen geneesmiddelenstudies die in diermodellen worden uitgevoerd niet altijd de effecten die zijn gevonden in klinische onderzoeken bij mensen. Gemanipuleerde menselijke weefselmodellen bieden de mogelijkheid om de gezonde ontwikkeling van de NMJ en de pathologie van neuromusculaire ziekten te bestuderen en geneesmiddelenscreenings mogelijk te maken. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)5 kunnen worden gedifferentieerd in een verscheidenheid aan celtypen, waaronder skeletspiercellen 6,7 en motoneuronen 8,9. hiPSC's kunnen eenvoudig worden gegenereerd uit patiëntcellen, waardoor een betere ziektemodellering10 en medicijnscreening 11,12 mogelijk is via patiëntspecifieke weefselmodellen.

Tweedimensionale (2D) monolaag co-culturen van SkMs en MN's missen de morfologie, fenotype, organisatie en functioneel gedrag van fysiologische NMJ's. NMJ's vormen zich willekeurig in 2D-cultuur, wat de isolatie van motoreenheden voor analyse remt, nauwkeurige functionele metingen beperkt en voorkomt dat ze worden gebruikt voor herhaalde, systematische experimenten13 . Driedimensionale (3D) weefselmodellen van NMJ's overwinnen veel van deze beperkingen en herformuleren de morfologische en functionele kenmerken van fysiologische NMJ's 7,14,15,16,17. Met behulp van dit model worden de twee weefseltypen afzonderlijk ontwikkeld en vervolgens geïntegreerd door axonale groei te sturen, waardoor meer georganiseerde NMJ's zich kunnen ontwikkelen in vergelijking met 2D-kweeksystemen.

Onze eerdere studie toonde aan dat het combineren van optogenetica met tissue engineering kan zorgen voor nauwkeurige niet-invasieve stimulatie en evaluatie van NMJ-functie18,19. Door middel van genetische manipulatie kunnen lichtgevoelige eiwitten worden geïntegreerd in het genoom van hiPSC's. Het integreren van channelrhodopsine-2 (ChR2), een ionkanaal dat zich opent als reactie op blauw licht, in het membraan van prikkelbare cellen zoals neuronen zorgt voor contactloze spatiotemporale controle over celactivering 20,21,22. hiPSC's die ChR2 dragen, kunnen worden gedifferentieerd in optogenetische motoneuronen die gevoelig zijn voor blauw licht, waardoor de noodzaak voor typische invasieve elektroden die neuronen stimuleren wordt weggenomen en ongewenste stimulatie van de spiercellen door elektroden wordt vermeden23. Dit systeem maakt gebruik van optogenetische motoneuronen om contracties in niet-optogenetische skeletspiercellen te stimuleren. Door video-acquisitie en gecontroleerde blauwlichtverlichting te combineren, kunnen de co-gekweekte weefsels tegelijkertijd worden gestimuleerd en opgenomen voor nmj-functie.

MG wordt veroorzaakt door auto-antilichamen gericht op nicotine-acetylcholinereceptoren (AChR), wat resulteert in een verminderde NMJ-functie en spierzwakte24. Het wordt gediagnosticeerd op basis van gepresenteerde symptomen, elektrodiagnose en detectie van auto-antilichamen via serologische bloedtesten. Echter, niet alle auto-antilichamen betrokken bij MG zijn geïdentificeerd, en sommige seronegatieve patiënten worden gediagnosticeerd met MG, maar met geen erkende antilichamen25,26. Ons systeem maakt herhaalde functionele beoordeling van de NMJ mogelijk voor en na de toevoeging van serum van MG-patiënten, waardoor waardevol inzicht wordt verkregen in de functionele en biochemische veranderingen veroorzaakt door de MG-antilichamen18. Ons protocol illustreert hoe 3D in vitro modellen van functionele menselijke NMJ kunnen worden geproduceerd die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. We demonstreren de veelzijdigheid van het systeem in twee platforms, een microfluïdisch apparaat en een groter open-well bioreactorplatform.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle cellijnen voor dit werk zijn gemaakt en gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Columbia University, NY, VS.

1. Bioreactorvoorbereiding

  1. Bioreactormallen maken
    1. Download een BIOREACTOR CAD-bestand uit het aanvullende CAD-bestand of maak een aangepast eigen ontwerp.
    2. Genereer een CNC-gereedschapspad vanuit het 3D-model met behulp van CAM-software.
    3. Machine acetaal mallen met behulp van een CNC-freesmachine.
  2. Fabricage van bioreactoren
    1. Meng een 10:1 basis tot uithardingsmiddelmengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS, 77 g mengsel per 4 platforms/mallen).
    2. Plaats het mengsel in een vacuümkamer, sluit alle kleppen, zet het vacuüm aan en ontgas het mengsel gedurende ten minste 30 minuten totdat er geen luchtbellen achterblijven. Giet het mengsel in mallen en ontgas de mallen in de vacuümkamer gedurende 1 uur.
    3. Sluit de mallen met de bovenste helft van de mal in de juiste richting. Plaats een stalen zeshoekige staaf over het midden en klem aan beide zijden.
    4. Vul de bovenkant opnieuw met PDMS.
    5. Hard de mallen minstens 4 uur uit in een oven van 65 °C.
    6. Verwijder de platforms van de mallen na afkoeling tot kamertemperatuur.
    7. Reinig de apparaten in een ultrasoon bad met behulp van 1 uur cycli afwasmiddel, 400 ml 100% isopropanol en gedestilleerd water.
    8. Laat een nacht drogen bij 65 °C.
    9. Week glazen coverslips gedurende 30 minuten in 1% niet-ionogene oppervlakteactieve polyol en zorg ervoor dat de coverslips niet stapelen zodat ze allemaal goed gecoat zijn.
    10. Spoel goed af met gedestilleerd water en droog een nacht bij 65 °C.
    11. Gebruik een plasmareiniger op hoog met 6 L/min zuurstof gedurende 1-2 minuten om de glazen afdekplaten en het PDMS-platform te behandelen. Na de behandeling verlijmt u de twee met elkaar door het PDMS minstens 30 s op de coverslip te drukken.
    12. Autoclaaf de gebonden apparaten voordat u cellen toevoegt.

2. Het bouwen van een optische stimulatie setup

  1. Bevestig met behulp van een 30 mm kooikubussysteem een 573 nm dichroïsche spiegel in het midden. Koppel een rode 627 nm LED aan een 594 nm long-pass excitatiefilter en bevestig deze aan de bovenzijde van de kubus, met de LED naar de spiegel gericht. Bevestig vervolgens een blauwe 488 nm LED met een 546 nm short-pass excitatiefilter aan de aangrenzende kant van de kubus, met de LED naar de spiegel gericht zoals weergegeven in het schema in figuur 3A.
  2. Bevestig een ringbediend irismembraan aan de onderkant van de kooikubus om de grootte van het verlichte gebied te regelen.
  3. Voed elke LED door een T-Cube LED-driver en bestuur via een Arduino Uno Rev3-bord. Sluit de zijingang van de LED-driver aan op een stekker van de voedingsbron, sluit de middelste uitgang aan op de Arduino en sluit de zijuitgang rechtstreeks aan op de LED's.
  4. Sluit de Arduino Uno aan op een pc via een USB-kabel.
  5. Download bestanden van github link (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Open het bestand "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" vanuit de map GitHub.
  7. Startparameters instellen: Stappen = 30; startFrequentie = 0,5; endFrequency = 3; pulseLengte = 100.
  8. Zorg ervoor dat pinuitgang 4 is toegewezen aan het blauwe LED-stuurprogramma en pinuitgang 2 is toegewezen aan het rode LED-stuurprogramma. Controleer of de middelste draden van de LED-driver zijn aangesloten op de massa en op de respectieve pinuitgang.
  9. Compileer en laad het programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" naar Arduino.
  10. Sluit elke LED-driver aan op het bijbehorende kanaal.

3. Celkweekopstelling (dag -21-0)

  1. Primaire skeletspiercellen
    1. Ontdooi en breid primaire skeletmyoblasten (verkregen uit Cook Myosiet) uit voor maximaal zes passages met behulp van Myotone groeimedium (+ supplement). Houd cellen in een incubator op 37 °C en 5% CO2.
    2. Verander de media elke 2 dagen.
    3. Zodra cellen ongeveer 60% confluent zijn, passeer ze dan met 0,05% Trypsine-EDTA (1x, gedurende 5 minuten bij 37 °C). Verzamel de gedissocieerde cellen en voeg verse media toe om het trypsine te neutraliseren.
    4. Draai de cellen op 300 x g en aspirateer het supernatant boven de celpellet.
    5. Resuspendeer de cellen met MGM en zaai 1:3 met 60 ml per drielaagse kolf.
  2. ChR2-hiPSC
    OPMERKING: Alle cellijnen voor dit werk zijn gemaakt en gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Columbia University, NY, VS. In dit protocol werden ChR2-expresserende hiPSC's gegenereerd via CRISPR-Cas9-genoombewerking met behulp van eerder beschreven methoden18, maar stabiele optogenetische cellijnen (lentiviral, piggyBac, enz.) kunnen op dezelfde manier worden gebruikt. Constitutieve promotors uitgedrukt in zowel iPSC's als motoneurons werden gekozen (CAG). De cellen bleken een gezond karyotype te hebben, zoals opgemerkt in eerdere publicaties 18,19.
    1. Bekleed 6-well platen met 1 ml / put opgeloste keldermembraanmatrix verdund in DMEM / F12 (1: 80) en incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Zaai iPSC's op gecoate 6-wells platen met 2 ml feedervrij celkweekmedium (iPSC-media), wissel om de dag 2 ml media uit en passag om de 5-7 dagen. Houd cellen in een incubator op 37°C en 5% CO2.
    3. Passaging
      1. Dissociëren van de stamcellen door te incuberen met 1 ml enzymvrije stamcel die reagens vrijgeeft gedurende 4 minuten en mechanisch af te scheren met een P1000-pipet met brede punt.
      2. Zaadcellen in een verhouding van 1:24 of 1:48 in iPSC-media met 2 μM Y-27632 dihydrochloride in 2 ml/put op gecoate 6-well platen.

4. Skeletspierweefsel zaaien (dag -3)

  1. Isoleer en tel 30 x 106 myoblasten met behulp van een geautomatiseerde celteller.
  2. Resuspendeer de myoblasten in een 4:1 mix van 3 mg/ml collageen I en opgeloste keldermembraanmatrix (800 μL collageenmengsel + 200 μL keldermembraanmatrix om een eindvolume van 1 ml te bereiken). Voeg voor de collageencomponent het bijbehorende neutraliserende middel toe (9:1 mengsel van collageen tot neutralisatiemiddel) en verdun het mengsel met 1x PBS om een volume van 800 μL te bereiken.
  3. Voeg 15 μL celcollageensuspensie toe aan elke spierkamer van de bioreactor en zorg ervoor dat de suspensie over beide pijlers wordt verspreid met behulp van de pipetpunt (figuur 2).
  4. Laat het cel-gelmengsel gedurende 30 minuten polymeriseren bij 37 °C en vul vervolgens elke bioreactor goed met 450 μL myotone groeimedia.
  5. Na 3 dagen (zodra de gel is samengeperst), begint u met myotube-differentiatie.

5. Myotube differentiatie (dag 0-14)

  1. Begin met myotube-infusie door weefsels gedurende 7 dagen over te schakelen op 450 μL fusie-inducerende media (FS, tabel 1), waarbij de media om de andere dag worden vervangen.
    OPMERKING: Probeer myotube-differentiatie te beginnen op dezelfde dag als motoneurondifferentiatie van hiPSC's om motoneuronen te zaaien aan het einde van de differentiatieschema's van beide celtypen.
  2. Verander op dag 7 de media in 450 μL rijpingsmedia Ia (MMIa, tabel 1).
  3. Op dag 9, verandering naar 450 μL rijpingsmedium Ib (MMIb, tabel 1).
  4. Verander op dag 11 de media in 450 μL NbActiv4. Blijf de media om de 2 dagen veranderen totdat de motoneurons zijn gezaaid (stap 7).

6. Motoneuron differentiatie (dag 0-14)

OPMERKING: Ons motoneuron differentiatieprotocol is aangepast van Maury et al8.

  1. Breng op dag 0 4 x 106 ChR2- hiPSC's over naar een petrischaal met ultralage bevestiging met 15 ml motoneuron-ophangingscultuurmedium (MSCM, tabel 1). Vul MSCM aan met 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542hydraat en 5 μM Y-27632 dihydrochloride.
  2. Isoleer op dag 2 de neurosferen (NS) met een omkeerbare zeef van 37 μM en replate in 15 ml MSCM met 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542-hydraat en 0,1 μM retinoïnezuur. NS moet na dag 2 zonder gebruik van een microscoop zichtbaar zijn in de petrischaal.
  3. Breng op dag 4 de cellen en media over naar een buis van 50 ml en laat de neurosferen naar de bodem zakken (5 min). Adem het supernatant op en resuspensieer de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 en 0,1 μM retinoïnezuur.
  4. Herhaal op dag 7 stap 6.3. maar resuspensie van de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 0,5 μM SAG en 0,1μM retinoïnezuur.
  5. Herhaal op dag 9 stap 6.3. maar resuspend cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 10 μM DAPT.
  6. Herhaal op dag 11 stap 6.3. maar resuspend de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 20 ng / ml BDNF en 10 ng / ml GDNF.
  7. Op dag 14 zaai je de motoneuronen in het platform.

7. Zaaien van motoneuronen aggregaten in bioreactor (dag 14)

  1. Bereid een 4:1 gelmengsel van 2 mg/ml collageen I en Matrigel (800 μL collageenmengsel + 200 μL Matrigel om een eindvolume van 1 ml te bereiken). Voeg voor de collageencomponent het bijbehorende neutraliserende middel toe (9:1 mengsel van collageen tot neutraliserend middel) en verdun het mengsel met 1x PBS om een eindvolume van 800 μL te bereiken.
  2. Gebruik een celzeef van 400 nm om grote neurosferen te selecteren en deze in het gelmengsel te resuspeneren.
  3. Aspirate media uit het reservoir en voorzichtig uit de neurosfeerput (figuur 2).
  4. Voeg 15 μL gelmengsel toe aan het neurosfeerkanaal.
  5. Laad een pipet van 10 μL met 10 μL gel en kies vervolgens één neurosfeer.
  6. Deponeer de NS in het neurosfeerkanaal en zorg ervoor dat de NS in de kamer zit. Til de pipet langzaam op terwijl u de resterende gel loslaat zodra de NS is afgezet. Als u niet zeker weet of de NS correct is gedeponeerd, controleert u de locatie met behulp van een microscoop.
  7. Laat de gel 30 min polymeriseren bij 37 °C.
  8. Voeg 450 μL NbActiv4 aangevuld met 20 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF toe aan de reservoirs.
  9. Verander de media om de dag om axonale groei van NS naar spierweefsel mogelijk te maken.

8. Gelijktijdige optische stimulatie en video-opname van nmj-functie (dag 24+)

  1. Gebruik voor beeldvorming een omgekeerde fluorescerende microscoop met een wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera (sCMOS).
  2. Stel de camerasoftware binning in op 2x2, belichting op 20 ms, rolling shutter AAN, uitleessnelheid op 540 MHz, dynamisch bereik: 12-bit &gain 1 en sensormodus: overlap.
  3. Gebruik 2x objectief op de microscoop om de microtissues in beeld te brengen.
  4. Bevestig een levende celkamer (37 °C, 5% CO2) aan het microscoopstadium.
  5. Selecteer het interessante gebied (ROI) dat het generveerde weefsel van skeletweefsels bevat om de bestandsgrootte en verwerkingstijd te minimaliseren.
  6. Plaats een 594 nm langdoorlaatemissiefilter tussen het monster en het beeldobjectief om blauwe lichtpulsen uit de camera te filteren.
  7. Plaats een rechthoekige 4-wells plaat met 4 bioreactoren (24 weefsels) in de levende celkamer.
  8. Klik op Liveweergave. Centreer en focus de afbeelding met de gewenste ROI.
  9. Upload de aangepaste macrocode vanuit de GitHub-map (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) om de podiumpositie, het Arduino-bord en video-acquisitie te regelen.
  10. Stel uitvoerfilm in als: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Voer de macrocode uit met de gewenste X,Y-coördinaten die in het werkgebied zijn ingesteld en verkrijg een snelle time-lapse met 1700 frames bij 50 frames/s.
  12. Vervang de media na beeldvorming en breng de monsters terug naar de incubator. Laat ten minste 24 uur tussen beeldacquisitiesessies om weefselvermoeidheid te voorkomen.

9. Batchverwerking en -analyse (dag 24+)

  1. Filmverwerking
    1. Gebruik de aangepaste MATLAB-code om de video's in batchanalyse te verwerken. De bestanden kunnen worden gedownload van de GitHub-map (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). De functies worden opgesomd en uitgelegd in tabel 2.
      OPMERKING: De code is compatibel met .nd2- en .czi-indelingen. Het vereist parallelle verwerking om te worden geactiveerd in MATLAB en heeft het bioformats-pakket nodig.
    2. Voer het recursiveOSAnalysis-script uit om de films te analyseren via parallelle verwerking. Plaats alle verkregen video's in dezelfde map en selecteer die map wanneer u de code uitvoert.
    3. Pas de parameters na de analyse indien nodig aan.
      1. Baseline wijzigenTijd (optie 1) als spontane contractie wordt opgepikt aan het begin van de opname. Dit toont een eerste meting ver boven 0 en vereist dat het frame wordt verschoven om te compenseren.
      2. Wijzig piekDonderhold (optie 2) als de weeën niet worden geregistreerd. De code detecteert standaard contracties die hoger zijn dan 25% van de hoogste piek, zodat deze waarde kan worden gewijzigd.
      3. Wijzig minMinProminence en minMinWidth om de gevoeligheid aan te passen bij het detecteren van het begin van elke piek.
    4. Genereer video- en grafiekuitvoer.
      1. Voer recursiveOSMovie uit om een videobestand te genereren voor elk weefsel met de respectieve contractiliteitstracering.

10. Verstoring van nmj-functie (dag 24+)

  1. Bereid behandelingsmedia voor door externe effector toe te voegen aan NbActiv4 basale media aangevuld met 20 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF.
    1. Gebruik voor het MG sera experiment 20% MG patiënt sera in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Gebruik voor het BTX-experiment 5 μg/ml BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimuleer/afbeelding met stap 3.2. om de basislijn vast te leggen.
  3. Vervang de media in weefsels door behandelingsmedia (450 μL/weefsel).
  4. Incubeer gedurende de gewenste tijd (48 uur voor sera van de patiënt, 20 minuten voor BTX).
  5. Stimuleer/afbeelding opnieuw met stap 3.2. om de functie na de behandeling vast te leggen.
  6. Verwijder de behandelingsmedia en laat de weefsels de gewenste tijd rusten (48 uur na verwijdering van sera)
    OPMERKING: Laat ten minste 24 uur tussen stimulatie en beeldvorming om weefselvermoeidheid te voorkomen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neuromusculaire juncties werden gegenereerd door het co-kweken van optogenetische hiPSC-afgeleide motoneuronen met niet-optogenetisch skeletspierweefsel. Menselijke primaire skeletmyoblasten (SkM) werden in de platforms gezaaid en gedifferentieerd in multinucleaire myotubes met behulp van het 2-wekenprotocol. De optogenetische motoneuronen werden afzonderlijk gedifferentieerd, maar parallel aan de myotube-differentiatie, en vervolgens in het platform gezaaid (figuur 1). De weefsels begonnen samen te trekken als reactie op stimulatie van blauw licht 7-12 dagen na het zaaien van MN, wat wijst op een succesvolle ontwikkeling en rijping van de NMJ's. De NMJ's kunnen tot 40 dagen na het zaaien van motoneuron worden gekweekt, gestimuleerd en in beeld gebracht, maar het optimale tijdstip vindt plaats op dag 1619. De morfologische en biochemische validatie van de differentiaties en aanwezigheid van de optogenetische eiwitten zijn weergegeven in aanvullende figuur 1 en zijn gevalideerd in eerdere studies18,19.

Om aan te tonen dat het protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan verschillende kweeksystemen, werd de strategie getest met behulp van twee verschillende gecompartimenteerde reactoren: een microfluïdisch apparaat en een open-well bioreactor. Beide systemen hebben een vergelijkbaar ontwerp, met één kamer voorzien van pilaren voor het genereren van skeletspierweefsels en een tweede kamer voor de kweek van 3D-motoneuronaggregaten die axonen kunnen uitbreiden om de skeletweefsels te innerveren (figuur 2A, B). De twee systemen hebben echter verschillende schalen, waarbij het microfluïdische apparaat 1 mm lange skeletspierweefsels oplevert die ongeveer 20.000 myoblasten bevatten (figuur 2C) en het open-well bioreactorsysteem dat resulteert in 4 mm lange spierweefsels bestaande uit ongeveer 450.000 myoblasten (figuur 2D).

Om gecontroleerde stimulatie van de optogenetische NMJ's mogelijk te maken, werd een optische opstelling gebouwd, bestaande uit een rode 637 nm LED voor brightfield-verlichting, een blauwe 488 nm LED voor activering van ChR2-MN's en een blauwlichtfilter tussen het weefselmonster en het doel om te voorkomen dat blauw licht de beeldanalyse verstoort (figuur 3A). De LED's werden gevoed door LED-drivers en nauwkeurig bestuurd via een Arduino-microprocessor. Nmj-functie werd geëvalueerd door tegelijkertijd time-lapse-video's te verwerven en MN's met blauw licht te stimuleren met behulp van een aangepast microscoop-macroscript in combinatie met de Arduino-code (figuur 3B). Het protocol verhoogde de frequentie van stimulatie van 0,2 Hz naar 2 Hz in 30 stappen. Nadat de films waren verkregen, werd de weefselfunctie geanalyseerd met behulp van een aangepast MATLAB-pakket (figuur 3C). De analyse mat weefselverplaatsing, genereerde een contractiliteitsspoor en synchroniseerde het met het lichtstimulatieprotocol. Vervolgens bepaalde het de fractie van effectieve pulsen (F) en een verwachte fractie van effectieve pulsen (E) om rekening te houden met potentiële niet-gestimuleerde contracties. De verwachte fractie (E) werd berekend als de fractie van pulsen die als effectief zou worden bestempeld als de contracties willekeurig binnen de 30 s zouden worden verdeeld. De weefselscore werd vervolgens berekend als (F-E)/(1-E), met een waarde tussen 0 en 1 (figuur 3C). De code bepaalt of een contractie wordt geactiveerd op basis van de tijd tussen een lichtpuls en het begin van de contractiliteitspiek, zoals weergegeven in figuur 3D. Deze geautomatiseerde, onbevooroordeelde methode maakt herhaalde karakterisering van NMJ-functie mogelijk in grote steekproefgroottes en in de loop van de tijd. De code bevat instelbare parameters die na verwerking kunnen worden aangepast om een correcte score te garanderen (aanvullende figuur 2).

Het vermogen van het systeem om de NMJ-functie in de loop van de tijd kwantitatief te karakteriseren, werd aangetoond door een groep weefsels gedurende 11 dagen in beeld te brengen (dag 9 tot dag 20 na motoneuronzaaien). Het systeem registreerde verbetering van de NMJ-functie in weefsels, met een toename van getriggerde reacties 1 week na weefselfabricage (figuur 4A), gevolgd door een stabiele functie gedurende een extra week (figuur 4B). Om te verifiëren dat spierstimulatie plaatsvond via de NMJ's, werd een andere groep weefsels geanalyseerd voor en na 20 minuten incubatie met 5 μg / ml van het neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), dat specifiek en onomkeerbaar bindt aan acetylcholinereceptoren. BTX stopte alle getriggerde en spontane contracties, resulteerde in een volledige verstoring van de NMJ-functie en toonde aan dat lichtstimulatie van de weefsels een functionele NMJ vereist (figuur 4C,D). Seriële verdunningen van BTX werden in eerste instantie getest om de optimale BTX-concentratie te identificeren (resultaten niet getoond).

Om het translationele vermogen van het systeem te evalueren, werd de NMJ-functie beoordeeld voor en na de toevoeging van serum van vijf myasthenia gravis-patiënten. Analyse van de weefsels behandeld met 20% MG serum gedurende 48 uur toonde een verminderde functie in vergelijking met controleweefsels behandeld met serum van gezonde donoren (figuur 4E, F). De gemanipuleerde NMJ's werden ook 48 uur na verwijdering en uitwassing van het serum opnieuw geëvalueerd en vertoonden herstel van de functie (figuur 4F). Bovendien werden toenemende concentraties van patiëntenserum en normale menselijke serumcontrole (5%, 20%, 40%) getest om de optimale concentratie te identificeren die de weefselfunctie beïnvloedde. De resultaten toonden het vermogen van het systeem om de NMJ-functie te karakteriseren en te kwantificeren en om myasthenia gravis in vitro te modelleren.

Figure 1
Figuur 1. Experimenteel ontwerp en tijdlijn. Tijdlijn (dagen) van differentiatie en zaaien in platforms. SkM = skeletspieren, ChR2 = optogenetische motoneuronen, NMJ = neuromusculaire overgang. Dit cijfer is met toestemming van Vila et al.18 aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Co-culture systemen voor de generatie van 3D NMJ's. (A) Schema van het microfluïdische platform. (B) Schema van de open-well PDMS bioreactor. (C) Geïnnerveerd skeletspierweefsel in het microfluïdische platform. (D) Geïnnerveerd weefsel in de open-well bioreactor. Schaalbalk 0,5 mm. Dit cijfer is met toestemming van Vila et al.18 aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Stimulatie, opname en analyse van de NMJ-functie. (A) Schema van LED-opstelling en lichtpad. (B) Optische opstelling met een omgekeerde microscoop, levende celkamer, geautomatiseerd podium en sCMOS-camera. (C) Algoritme voor de batchverwerking van optische stimulatievideo's van NMJ-culturen. (D) Representatief frame van de video gegenereerd door de MATLAB-code en de bijbehorende contractiliteitsspoorgrafiek. Het knipperende blauwe vak in de video en de verticale lijnen in de grafiek geven aan wanneer de blauwe lichtstimulatie optreedt. Dit cijfer is met toestemming van Vila et al.18 aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. NMJ-functie. (A) Contractiliteitsspoor voor 3D-ontworpen menselijke NMJ's. (B) Score van NMJ's in reactie op licht, die verbetering van de functie gedurende 11 dagen laat zien (n = 47, eenrichtings-ANOVA p = 1 x 10-8). Foutstaven = SEM. (C) Contractiliteitsspoor na 20 minuten behandeling met 5 mg/ml van het neurotoxine α-bungarotoxine (BTX). (D) Kwantificering van nmj-functie (score) voor en na behandeling met BTX (n = 6; eenrichtings-ANOVA F = 9 x 10-8). (E) Contractiliteitsspoor van weefsels met 20% MG sera na 48 uur behandeling. (F) NMJ-functiebeoordeling voor behandelde en controlegroepen voor en na de behandeling en na herstel (n = 12; na behandeling post-hoc ANOVA F = 0,0002; *geeft p = 0,0015 ** geeft p = 3,5 x10−6 aan) (MG = Myasthenia Gravis; NHS=normaal humaan serum). n geeft het aantal biologische replicaties aan. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Vila et al.18,19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Myogene en neurale media formuleringen. Georganiseerde lijst van groeifactoren en supplementen voor media. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. Lijst met MATLAB-functies. Korte uitleg van MATLAB-functies die worden gebruikt voor beeldanalyse. Deze tabel is aangepast met toestemming van Vila et al.18. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende bestanden

Aanvullende figuur 1. Myotube en motoneuron differentiaties. (A) Myotube differentiatieprotocol (MM = rijpingsmedium). (B) Immunofluorescentie (IF) beelden die expressie van skeletspiermarkers tonen myosine zware keten (MHC), α-actinine en desmine in gedifferentieerde myotubes. (C) Motoneuron differentiatieprotocol. (D) Lokalisatie van channelrhodopsine-2 met YFP (ChR2-YFP) naar membraan in optogenetische iPSC's en (E) MN's die een succesvolle infectie bevestigen. (F) Co-expressie van choline-acetyltransferase (ChAT, rood) en ChR2 (groen) in optogenetische MN's. Schaalstaven 100 μm. Gereproduceerd met toestemming van Vila et al.18. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Onjuiste verwerking die aanpassing van parameters vereist. (A) Onjuiste basislijntijd resulteert in pieken van de verkeerde vorm. (B) Een te hoge piekdrempel leidt ertoe dat pieken onopgemerkt blijven. (C) Te soepele omstandigheden voor de detectie van minima (d.w.z. te lage waarden gekozen voor minMinProminence en/of minMinWidth) resulteren in minima die in het midden of zelfs de bovenkant van de pieken wordt gelabeld, waardoor ze worden geteld als "untriggered" omdat ze te ver van de voorgaande lichtpuls beginnen. (D) Te strenge voorwaarden voor de detectie van minima leiden ertoe dat het begin van de piek vóór de lichtpuls wordt gelabeld of zelfs ontbreekt, zoals in dit voorbeeld. Gereproduceerd met toestemming van Vila et al.18. Bestand met 3D-model van bioreactorplatform dat kan worden bewerkt en geëxporteerd om mallen te maken voor bioreactorproductie met behulp van PDMS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Aanvullend CAD-bestand. Bestand met 3D-model van bioreactorplatform dat kan worden bewerkt en geëxporteerd om mallen te maken voor bioreactorproductie met behulp van PDMS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit systeem is een gemanipuleerd 3D-menselijk weefselmodel dat optogenetica en videoverwerking combineert om geautomatiseerde en onbevooroordeelde evaluatie van nmj-functie mogelijk te maken. Met behulp van een gestandaardiseerd protocol hebben we het vermogen aangetoond om veranderingen in de NMJ-functie tijdens fysiologische ontwikkeling te meten en de schadelijke effecten van pathologieën zoals blootstelling aan neurotoxine en sera van myasthenia gravis-patiënten te karakteriseren.

Eerdere studies hebben melding gemaakt van het vermogen om MG te modelleren met optogenetische hPSC-afgeleide motoneuronen in co-cultuur met skeletmyotubes met mg-patiënt sera22. Het systeem was echter in 2D en registreerde contracties op willekeurige locaties, waardoor de reproduceerbaarheid werd beperkt en het kwantitatieve vermogen van het model afnam. Een van de grootste voordelen van ons systeem, in vergelijking met een 2D-systeem, is dat het ons in staat stelt om de 3D-omgeving te emuleren, wat de cellulaire en morfologische ontwikkeling tussen MN's en Sku's nauwkeuriger vergemakkelijkt. Er is veel bewijs dat ondersteunt dat de biomechanische signalen die nodig zijn om een weefsel te laten gedragen als zijn oorspronkelijke fysiologie, superieur worden nagebootst in een 3D-systeem 13,14,15,16. Bovendien zorgen verschillende aspecten van het 3D-systeem voor een meer gecontroleerde omgeving: gerichte vorming van synapsen, minder heterogeniteit tussen monsters, verhoogde ruimtelijk-temporele controle van stimulatie via optogenetica en een geautomatiseerd high-throughput systeem dat de subjectiviteit van de analyse van elk monster vermindert.

Het ontwikkelde systeem kan worden gebruikt om andere neuromusculaire ziekten (NMD's) te modelleren, zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), Duchenne spierdystrofie (DMD) en anderen. Hoewel ALS pathofysiologie de disfunctie van het motorneuron zelf omvat in plaats van de neuromusculaire junctie17,27, heeft ons systeem het vermogen om de ziektetoestand van ALS te recapituleren door verminderde spiercontractie te vertonen na neurondegeneratie of schade. DMD is een spierdegeneratieve ziekte veroorzaakt door een gebrek aan dystrofine-eiwit, wat leidt tot spierzwakte en uiteindelijk degeneratie28. Het systeem zou DMD kunnen modelleren door genetisch gemanipuleerde skeletspieren op te nemen die een dystrofineremmer of zieke spiercellen dragen die dystrofine missen. Over het algemeen heeft het systeem de flexibiliteit en kracht om verschillende NMD's samen te vatten in een in vitro 3D-platform.

Voor een protocol dat verschillende bronnen van cellen vereist, elk met bepaalde niveaus van confluentie, is een van de meest kritieke aspecten timing. Tijdens de uitbreiding van primaire skeletspiercellen is het belangrijk om ze niet te confluent (65%-70%) te laten worden als gevolg van fusie. Soms, zelfs bij het gebruik van trypsine om de klonten te breken, is waargenomen dat dit zich vertaalt in een lagere effectieve zaaiing in de bioreactoren. Een ander cruciaal aspect is de productie van het open-well bioreactorplatform. Om de homogeniteit tussen de PDMS-platforms te vergroten, moet de hoeveelheid tijd die ze in de oven doorbrengen uniform worden gehouden op alle platforms om schommelingen in de mechanische eigenschappen van de platformpijlers te voorkomen. Bovendien is het tijdens het zaaien van de spiercellen in de reactoren, om de consistentie van de zaaidichtheid te behouden, verstandig om de buis voorzichtig (1-1,5 s) tussen elke twee tot drie compartimenten in de bioreactoren te vortexen. Ten slotte werd het succespercentage voor NMJ-ontwikkeling grotendeels afhankelijk geacht van het succes van motoneuronzaaien, omdat de toevoeging van neurosferen zo delicaat is en van persoon tot persoon varieert. Met zaaipraktijken neemt het slagingspercentage toe, waardoor ongeveer 90% van de geïnitieerde culturen kan worden gestimuleerd en in beeld gebracht.

Momenteel zijn enkele beperkingen die in de nabije toekomst kunnen worden aangepakt, de opname en validatie van andere optogenetische eiwitten dan de besproken ChR2. Specifieke controle over zowel celtypen als optogenetische sensoren voor spanning / calcium beeldvorming of spiermetabolisme kan aan het systeem worden toegevoegd voor verhoogde uitlezingen en analyse. Omdat blauw licht fototoxiciteit induceert bij hoge doses, was het stimulatieregime beperkt tot 30 s. Dit effect kan worden verbeterd door een rood verschoven kanaalrhodopsine op te nemen voor stimulatiestudies van langere duur. Bovendien is een andere beperking die in toekomstige iteraties van het model kan worden verbeterd, het gebrek aan neuronale ondersteunende cellen zoals Schwann-cellen. De veelzijdigheid van dit platform en de analysecode maakt het echter mogelijk om een verscheidenheid aan optogenetische constructies en celtypen op te nemen. Terwijl onze ChR2-hiPSC-lijn is gemaakt met CRISPR, kunnen andere methoden worden gebruikt om een optogenetische respons in hiPSC's te implementeren. Bovendien kan het NMJ-model met het aanpassingsvermogen van hiPSC's worden ontwikkeld vanuit een enkele celbron, waardoor patiëntspecifieke modellen kunnen worden gebruikt om neuromusculaire ziekten verder te bestuderen18.

Dit platform biedt herhaalde, geautomatiseerde en onbevooroordeelde analyse van de menselijke NMJ-functie in de loop van de tijd en kan kwantificeerbare veranderingen in functie detecteren als gevolg van externe effectoren, zoals neurotoxinen of MG-patiëntenserum. Over het algemeen maakt ons 3D-systeem het mogelijk om de menselijke NMJ-functie vroeg in de ziektepathologie te onderzoeken, biedt het de mogelijkheid voor medicijnscreening en legt het de basis voor een robuust systeem om precisiegeneeskunde te bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We erkennen dankbaar de financiële steun van de NIH [subsidienummers EB025765 en EB027062], DOD [awardnummer W81XWH-18-1-0095] en de UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). We bedanken de Columbia University Stem Cell Core voor hun hulp en begeleiding bij het herprogrammeren van cellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Bio-engineering Nummer 182
Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter