Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.

Abstract

מחלות נוירומוסקולריות רבות, כגון myasthenia gravis (MG), קשורות לתפקוד לקוי של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ), שקשה לאפיין אותו במודלים של בעלי חיים בשל הבדלים פיזיולוגיים בין בעלי חיים לבני אדם. הנדסת רקמות מציעה הזדמנויות לספק מודלים במבחנה של NMJs אנושיים פונקציונליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. על-ידי שילוב חלבונים אופטוגנטיים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יצרנו נוירונים שיכולים להיות מגורה עם אורכי גל ספציפיים של אור. אם ה- NMJ בריא ומתפקד, אות נוירוכימי מהמוטונורון גורם להתכווצות שרירים. באמצעות שילוב של אופטוגנטיקה ומיקרו-פבריקציה עם הנדסת רקמות, הקמנו מתודולוגיה בלתי משוחדת ואוטומטית לאפיון תפקודי NMJ באמצעות ניתוח וידאו. פותח פרוטוקול סטנדרטי להיווצרות NMJ, גירוי אופטי עם הקלטת וידאו סימולטנית, וניתוח וידאו של התכווצות רקמות. גירוי של מוטונים אופטוגנטיים על ידי אור כדי לגרום להתכווצויות שרירי השלד משחזר את הפיזיולוגיה האנושית של NMJ ומאפשר מדידות תפקודיות חוזרות ונשנות של NMJ לאורך זמן ובתגובה לקלטים שונים. אנו מדגימים את יכולתה של פלטפורמה זו להראות שיפורים תפקודיים בקישוריות הנוירומוסקולרית לאורך זמן ולאפיין את ההשפעות המזיקות של נוגדני MG או טטוקסינים עצביים בחולים על תפקוד NMJ.

Introduction

הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא הסינפסה הכימית בין מוטונרונים (MNs) לתאי שריר השלד (SkM) המאפשרת התכווצות שרירים. רעלנים, כגון נוירוטוקסין α-בונגארוטוקסין (BTX), או מחלות נוירומוסקולריות (NMD) כמו מיאסתניה גרביס (MG) יכולים להוביל לניוון של NMJ ולהפחתה בשליטה בשרירים1. מודלים של רקמות אנושיות מהונדסות ביולוגית משחזרים טוב יותר את המנגנונים התפקודיים והפיזיולוגיים של NMJs אנושיים ומציעים פוטנציאל תרגומי גדול יותר מאשר מודלים של בעלי חיים.

בעוד שמודלים של בעלי חיים קידמו את ההבנה של היווצרות ותפקוד ה- NMJ, ישנם הבדלים משמעותיים בין סינפסות של בני אדם ובעלי חיים המגבילים את תרגום התוצאות לבני אדם והופכים את אפיון in vivo של NMJ למאתגר 2,3,4. מחקרים הראו הבדלים פיזיולוגיים מובהקים בין NMJs של עכברים לבני אדם. לעכברים יש NMJs גדולים יותר וצפיפות אזורים פעילים קטנה יותר בהשוואה ל-NMJs4 אנושיים. בנוסף, מחקרים תרופתיים שנערכו במודלים של בעלי חיים לא תמיד משקפים את ההשפעות שנמצאו בניסויים קליניים בבני אדם. מודלים מהונדסים של רקמות אנושיות מספקים את ההזדמנות לחקור את ההתפתחות הבריאה של NMJ ואת הפתולוגיה של מחלות נוירומוסקולריות ולאפשר הקרנות תרופות. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs)5 יכולים להתמיין למגוון סוגי תאים, כולל תאי שריר השלד 6,7 ומוטונורונים 8,9. hiPSCs יכולים להיווצר בקלות מתאי המטופל, מה שמאפשר מודלים טובים יותר של מחלות10 ובדיקת תרופות11,12 באמצעות מודלים של רקמות ספציפיות לחולה.

תרבויות חד-שכבתיות דו-ממדיות (2D) של SkMs ו-MNs חסרות את המורפולוגיה, הפנוטיפ, הארגון וההתנהגות התפקודית של NMJs פיזיולוגיים. NMJs נוצרים באופן אקראי בתרבית דו-ממדית, מה שמעכב את הבידוד של יחידות מוטוריות לניתוח, מגביל מדידות תפקודיות מדויקות ומונע את השימוש בהן לניסויים חוזרים ושיטתיים13 . מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמות NMJs מתגברים על רבות מהמגבלות הללו, ומשחזרים את המאפיינים המורפולוגיים והתפקודיים של NMJs פיזיולוגיים 7,14,15,16,17. באמצעות מודל זה, שני סוגי הרקמות מפותחים בנפרד ולאחר מכן משולבים על ידי הכוונת הצמיחה האקסונלית, מה שמאפשר לפתח NMJs מאורגנים יותר בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות.

המחקר הקודם שלנו הראה כי שילוב של אופטוגנטיקה עם הנדסת רקמות יכול לאפשר גירוי לא פולשני מדויק והערכה של תפקוד NMJ18,19. באמצעות הנדסה גנטית, חלבונים רגישים לאור יכולים להיות משולבים בגנום של hiPSCs. שילוב channelrhodopsin-2 (ChR2), תעלת יונים הנפתחת בתגובה לאור כחול, לתוך הממברנה של תאים נרגשים כגון נוירונים מאפשרת שליטה מרחבית-טמפורלית ללא מגע על הפעלת התא 20,21,22. hiPSCs הנושאים ChR2 ניתנים להבחנה למוטונורונים אופטוגנטיים הרגישים לאור כחול, ובכך מבטלים את הצורך באלקטרודות פולשניות טיפוסיות הממריצות נוירונים ונמנעים מגירוי לא רצוי של תאי השריר על ידי אלקטרודות23. מערכת זו משתמשת במוטונורונים אופטוגנטיים כדי לעורר התכווצויות בתאי שרירי שלד שאינם אופטוגנטיים. שילוב של רכישת וידאו ותאורת אור כחול מבוקרת מאפשר לעורר ולהקליט בו-זמנית את הרקמות שעברו תרבית משותפת לתפקוד NMJ.

MG נגרמת על ידי נוגדנים עצמיים המכוונים נגד קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChR), מה שמביא לירידה בתפקוד NMJ ולחולשת שרירים24. הוא מאובחן על סמך הסימפטומים המוצגים, אלקטרודיאגנוזה וזיהוי נוגדנים עצמיים באמצעות בדיקות דם סרולוגיות. עם זאת, לא כל נוגדנים עצמיים המעורבים ב- MG זוהו, וחלק מהחולים הסרונגטיביים מאובחנים עם MG אך ללא נוגדנים מוכרים 25,26. המערכת שלנו מאפשרת הערכה תפקודית חוזרת ונשנית של ה- NMJ לפני ואחרי הוספת הסרום ממטופלי MG, ומספקת תובנה שלא תסולא בפז לגבי השינויים התפקודיים והביוכימיים הנגרמים על ידי נוגדני MG18. הפרוטוקול שלנו ממחיש כיצד לייצר מודלים תלת-ממדיים במבחנה של NMJ אנושי תפקודי שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות של NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. אנו מדגימים את הרבגוניות של המערכת בשתי פלטפורמות, התקן מיקרופלואידי ופלטפורמת ביו-ריאקטורים גדולה יותר עם באר פתוחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל קווי התאים לעבודה זו נוצרו ונעשה בהם שימוש בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ארה"ב.

1. הכנת ביוריאקטורים

  1. הכינו תבניות ביוריאקטורים
    1. הורד קובץ CAD של bioreactor מקובץ ה- CAD המשלים או צור עיצוב מותאם אישית.
    2. צור נתיב כלים CNC מהמודל התלת-ממדי באמצעות תוכנת CAM.
    3. תבניות אצטליות מכונה באמצעות מכונת כרסום CNC.
  2. ייצור ביוריאקטורים
    1. מערבבים תערובת של 10:1 לתערובת חומרי ריפוי של פולידימתילסילוקסן (PDMS, 77 גרם של תערובת לכל 4 פלטפורמות/תבניות).
    2. מכניסים את התערובת לתא ואקום, סוגרים את כל השסתומים, מפעילים את הוואקום ומבטלים את הגז של התערובת למשך 30 דקות לפחות עד שלא יישארו בועות אוויר. יוצקים את התערובת לתבניות ומוציאים גז מהתבניות בתא הוואקום למשך שעה אחת.
    3. סגור את התבניות עם החצי העליון של התבנית בכיוון הנכון. מניחים מוט משושה מפלדה מעל המרכז ומהדקים משני הצדדים.
    4. מלאו מחדש את החלק העליון ב-PDMS.
    5. יש לרפא את התבניות בתנור של 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
    6. הסר את הפלטפורמות מהתבניות לאחר הקירור לטמפרטורת החדר.
    7. נקו את המכשירים באמבטיה קולית באמצעות מחזור של שעה אחת של סבון כלים, 400 מ"ל של 100% איזופרופנול ומים מזוקקים.
    8. יבש לילה ב 65 °C (86 °F).
    9. השרו את כיסויי הזכוכית בפוליאול פעילי שטח לא-יוניים במשך 30 דקות, והקפידו שהכיסויים לא ייערמו כך שכולם יהיו מצופים כראוי.
    10. יש לשטוף היטב במים מזוקקים ולייבש למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    11. השתמשו בחומר ניקוי פלזמה גבוה עם 6 ליטר/דקה של חמצן למשך דקה-2 דקות לכיסויי הזכוכית ולפלטפורמת PDMS לטיפול. לאחר הטיפול, קשרו את השניים זה לזה על ידי לחיצה על ה-PDMS כלפי מטה על הכיסוי למשך 30 שניות לפחות.
    12. יש להשתמש באופן אוטומטי במכשירים המחוברים לפני הוספת תאים.

2. בניית מערך גירוי אופטי

  1. באמצעות מערכת קוביות כלוב 30 מ"מ, חברו למרכז מראה דיכרואית של 573 ננומטר. הצמידו נורית LED אדומה של 627 ננומטר עם מסנן עירור ארוך של 594 ננומטר והצמידו אותו לצד העליון של הקובייה, כאשר ה-LED פונה למראה. לאחר מכן חברו נורית LED כחולה של 488 ננומטר עם מסנן עירור קצר-מעבר של 546 ננומטר לצד הסמוך של הקובייה, כאשר ה-LED פונה אל המראה כפי שמוצג בשרטוט באיור 3A.
  2. חברו דיאפרגמה של קשתית המופעלת בטבעת לתחתית קוביית הכלוב כדי לשלוט בגודל האזור המואר.
  3. הפעל כל נורית LED על ידי דרייבר T-Cube LED ובקרה באמצעות לוח Arduino Uno Rev3. חבר את הקלט הצדדי של מנהל ההתקן LED לתקע מקור חשמל, חבר את הפלט האמצעי ל- Arduino וחבר את יציאת הצד ישירות לנורות ה- LED.
  4. חבר את Arduino Uno למחשב על ידי כבל USB.
  5. הורד קבצים מקישור GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. פתח את הקובץ "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" מתיקיית GitHub.
  7. הגדרת פרמטרים התחלתיים: שלבים = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. ודא שפלט פין 4 מוקצה למנהל ההתקן Blue LED ופלט פין 2 מוקצה למנהל ההתקן Red LED. בדוק שהחוטים האמצעיים של מנהל ההתקן LED מחוברים לקרקע וליציאת הפין המתאימה.
  9. הידור וטען את התוכנית "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" לארדוינו.
  10. חבר כל מנהל התקן LED לערוץ המתאים לו.

3. הגדרת תרבית תאים (יום -21-0)

  1. תאי שריר השלד הראשוניים
    1. להפשיר ולהרחיב את המיובלסטים העיקריים של השלד (המתקבלים מ-Cook Myosite) במשך שישה מעברים לכל היותר באמצעות מדיום גדילה מיוטוני (+ תוספת). יש לשמור על תאים באינקובטור המוגדרים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    2. שנה את המדיה כל יומיים.
    3. ברגע שהתאים נפגשים בכ-60%, העבירו אותם באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA (1x, למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס). אספו את התאים המנותקים והוסיפו מדיה טרייה כדי לנטרל את הטריפסין.
    4. סובבו את התאים ב-300x g ושאפו לסופרנטנט שמעל לכדור התא.
    5. החייאת התאים עם MGM וזרע 1:3 עם 60 מ"ל לכל בקבוקון תלת שכבתי.
  2. ChR2-hiPSC
    הערה: כל קווי התאים של עבודה זו נוצרו ונעשה בהם שימוש בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ארה"ב. בפרוטוקול זה, hiPSCs המבטאים ChR2 נוצרו באמצעות עריכת גנום CRISPR-Cas9 באמצעות שיטותשתוארו קודם לכן 18, אך ניתן להשתמש בכל קווי התאים האופטוגנטיים היציבים (lentiviral, piggyBac וכו ') באותו אופן. נבחרו מקדמים מכוננים המתבטאים הן ב-iPSCs והן ב-motoneurons (CAG). התאים נמצאו כבעלי קריוטיפ בריא, כפי שצוין בפרסומים קודמים18,19.
    1. מצפים לוחות 6-באר עם 1 מ"ל / באר של מטריצת קרום מרתף solubilized מדולל DMEM / F12 (1:80) ודגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
    2. iPSCs של זרעים על צלחות מצופים של 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא הזנה (iPSC media), מחליפים 2 מ"ל של מדיה כל יומיים וחולפים כל 5-7 ימים. שמור על תאים באינקובטור המוגדרים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    3. עובר אורח
      1. נתקו את תאי הגזע על ידי דגירה עם 1 מ"ל של תאי גזע נטולי אנזימים המשחררים ריאגנטים למשך 4 דקות וגזירה מכנית עם קצה רחב P1000 פיפטה.
      2. תאי זרע ביחס של 1:24 או 1:48 במדיית iPSC עם 2 μM של Y-27632 דיהידרוכלוריד ב-2 מ"ל/באר על צלחות מצופות של 6 בארות.

4. זריעת רקמת שריר השלד (יום -3)

  1. בודד וספור 30 x 106 מיובלסטים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
  2. בצעו החייאה של המיובלסטים בתערובת של 4:1 של קולגן I במינון 3 מ"ג/מ"ל ומטריצת קרום מרתף מבודדת (800 μL של תערובת קולגן + 200 μL של מטריצת קרום מרתף כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור רכיב הקולגן, מוסיפים את החומר המנטרל הנלווה (תערובת 9:1 של קולגן לחומר מנטרל) ומדללים את התערובת עם 1x PBS כדי להשיג נפח של 800 μL.
  3. הוסיפו 15 μL של תרחיף קולגן-תאי לכל תא שריר של הביו-ריאקטור, והקפידו לפזר את המתלים על פני שני העמודים באמצעות קצה הפיפטה (איור 2).
  4. תנו לתערובת התאים-ג'ל להתפלמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן מלאו כל ביו-ריאקטור היטב ב-450 μL של מדיית גדילה מיוטונית.
  5. לאחר 3 ימים (לאחר שהג'ל נדחס), התחילו בהבחנה במיוטוב.

5. בידול מיוטוב (ימים 0-14)

  1. התחל עירוי myotube על ידי החלפת רקמות ל 450 μL של מדיה גרימת היתוך (FS, טבלה 1) במשך 7 ימים, שינוי המדיה כל יומיים.
    הערה: נסו להתחיל בהבחנה של מיוטובייט באותו יום כמו התמיינות מוטונרון מ-hiPSCs על מנת לזרוע מוטונורונים בסוף לוחות הזמנים של התמיינות שני סוגי התאים.
  2. ביום 7 שנה את המדיה ל-450 μL של מדיית התבגרות Ia (MMIa, טבלה 1).
  3. ביום התשיעי, החליפו ל-450 μL של מדיית התבגרות Ib (MMIb, טבלה 1).
  4. ביום ה-11, שנו את המדיה ל-450 μL של NbActiv4. המשיכו לשנות את המדיה כל יומיים עד שהמוטונורונים יזרעו (שלב 7).

6. בידול מוטונרון (ימים 0-14)

הערה: פרוטוקול ההבחנה של motoneuron שלנו הותאם מ- Maury et al8.

  1. ביום 0, העבירו 4 x 106 ChR2- hiPSCs לצלחת פטרי עם חיבור נמוך במיוחד עם 15 מ"ל של מדיום תרבית המתלים motoneuron (MSCM, טבלה 1). תוסף MSCM עם 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 הידרט ו-5 μM Y-27632 דיהידרוכלוריד.
  2. ביום השני, לבודד את הנוירוספרות (NS) עם מסננת הפיכה של 37 μM ולחזור בתשובה ב-15 מ"ל של MSCM עם 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate ו-0.1 μM חומצה רטינואית. NS צריך להיות גלוי בצלחת פטרי ללא שימוש במיקרוסקופ לאחר היום השני.
  3. ביום הרביעי, מעבירים את התאים והמדיה לצינור של 50 מ"ל ומאפשרים לנוירוספרות להתיישב לקרקעית (5 דקות). לשאוף את הסופרנטנט ולהחיות את התאים ב-15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 וחומצה רטינואית של 0.1 μM.
  4. ביום 7, חזור על שלב 6.3. אבל resuspened את התאים ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 0.5 μM SAG ו 0.1μM חומצה רטינואית.
  5. ביום התשיעי, חזור על שלב 6.3. אבל תאים resuspend ב 15 מ"ל של MSCM בתוספת 10 μM DAPT.
  6. ביום ה-11, חזור על שלב 6.3. אבל החייאת התאים ב-15 מ"ל של MSCM בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
  7. ביום ה-14, זרעו את המוטונאורונים לתוך הרציף.

7. זריעת אגרגטים של מוטונורונים בביוריאקטור (יום 14)

  1. מכינים תערובת ג'ל 4:1 של 2 מ"ג/מ"ל קולגן I ומטריגל (800 μL של תערובת קולגן + 200 μL של Matrigel כדי להגיע לנפח סופי של 1 מ"ל). עבור רכיב הקולגן, הוסיפו את החומר המנטרל הנלווה (תערובת של 9:1 של קולגן לחומר מנטרל) ודללו את התערובת עם 1x PBS כדי להשיג נפח סופי של 800 μL.
  2. השתמשו במסננת תאים של 400 ננומטר כדי לבחור נוירוספרות גדולות ולהחיות אותן בתערובת הג'ל.
  3. לשאוף מדיה מהמאגר ובזהירות מהנוירוספרה היטב (איור 2).
  4. מוסיפים 15 μL של תערובת ג'ל לתעלה הנוירוספרית.
  5. טען פיפטה של 10 μL עם 10 μL של ג'ל ולאחר מכן בחר נוירוספרה אחת.
  6. להפקיד את ה- NS בערוץ הנוירוספרה ולוודא שה- NS נמצא בתא. לאט לאט להרים את הפיפטה תוך שחרור הג'ל הנותר לאחר הפקדת ה- NS. אם אינך בטוח שה- NS הופקד כראוי, בדוק את מיקומו באמצעות מיקרוסקופ.
  7. אפשרו לג'ל להתפלמר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. הוסיפו למאגרים 450 μL של NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
  9. שנה את המדיה כל יומיים כדי לאפשר צמיחה אקסונאלית מ- NS לרקמת שריר.

8. גירוי אופטי סימולטני והקלטת וידאו של פונקציית NMJ (יום 24+)

  1. להדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת מתכת-תחמוצת-מוליך למחצה משלימה מדעית משלימה (sCMOS).
  2. הגדר את התאמת תוכנת המצלמה ל- 2x2, חשיפה ל- 20 אלפיות השנייה, הפעלת תריס מתגלגל, קצב קריאה ל- 540 MHz, טווח דינמי: 12 סיביות ורווח 1, ומצב חיישן: חפיפה.
  3. השתמש במטרת 2x על המיקרוסקופ כדי לדמות את המיקרוטיסים.
  4. חברו תא תא חי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לשלב המיקרוסקופ.
  5. בחר את אזור העניין (ROI) המכיל את רקמת רקמות השלד המופנמות כדי למזער את גודל הקובץ ואת זמן העיבוד.
  6. מקם מסנן פליטה ארוך של 594 ננומטר בין הדגימה לבין מטרת ההדמיה כדי לסנן את פעימות האור הכחול מהמצלמה.
  7. מניחים לוח מלבני בעל 4 בארות המכיל 4 ביוריאקטורים (24 רקמות) לתוך תא התא החי.
  8. לחץ על תצוגה חיה. מרכז וממקד את התמונה בהחזר ההשקעה הרצוי.
  9. העלה את קוד המאקרו המותאם אישית מתיקיית GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) כדי לשלוט במיקום הבמה, בלוח Arduino וברכישת הווידאו.
  10. הגדר סרט פלט כ: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. הפעל את קוד המאקרו עם קואורדינטות X,Y הרצויות על הבמה וקבל הפסקה מהירה בזמן עם 1700 פריימים ב- 50 פריימים לשנייה.
  12. החלף את המדיה לאחר ההדמיה והחזיר את הדגימות לחממה. אפשרו לפחות 24 שעות בין מפגשי רכישת תמונה כדי למנוע עייפות רקמות.

9. עיבוד וניתוח אצווה (יום 24+)

  1. עיבוד סרטים
    1. השתמש בקוד MATLAB המותאם אישית כדי לעבד את הסרטונים בניתוח אצווה. ניתן להוריד את הקבצים מהתיקיה GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). הפונקציות מפורטות ומוסברות בטבלה 2.
      הערה: הקוד תואם לתבניות .nd2 ו- .czi. זה דורש עיבוד מקבילי כדי להיות מופעל ב MATLAB וצריך את חבילת bioformats.
    2. הפעל את הסקריפט הרקורסיביOSAnalysis כדי לנתח את הסרטים באמצעות עיבוד מקבילי. בקש את כל סרטוני הווידאו שנרכשו באותה תיקיה ובחר תיקיה זו בעת הפעלת הקוד.
    3. התאם את הפרמטרים שלאחר הניתוח לפי הצורך.
      1. שנה את baselineTime (אפשרות 1) אם הכיווץ הספונטני נקלט בתחילת ההקלטה. פעולה זו תציג קריאה ראשונית הרבה מעל 0 ותצטרך להזיז את המסגרת כדי לפצות על כך.
      2. שנה את peakThreshold (אפשרות 2) אם הצירים אינם רשומים. הקוד יזהה התכווצויות שהן מעל 25% מהשיא הגבוה ביותר כברירת מחדל, כך שניתן יהיה לשנות ערך זה.
      3. שנה את minMinProminence ואת minMinWidth כדי להתאים את הרגישות בעת זיהוי ההתחלה של כל שיא.
    4. צור פלט וידאו וגרף.
      1. הפעל את RECURSIVEOSMovie כדי ליצור קובץ וידאו עבור כל רקמה עם עקבות התכווצות המתאימים שלה.

10. הפרעה לפונקציית NMJ (יום 24+)

  1. הכן את מדיית הטיפול על ידי הוספת אפקטור חיצוני למדיה הבסיסית NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF.
    1. לניסוי MG sera, השתמש ב-20% MG sera של מטופלים ב-NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. לניסוי BTX, השתמש ב-5 מיקרוגרם/מ"ל BTX ב-NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. מגרה/תמונה באמצעות שלב 3.2. כדי להקליט את קו הבסיס.
  3. החליפו את המדיה ברקמות במדיית טיפול (450 μL/רקמה).
  4. דגירה לזמן הרצוי (48 שעות עבור סרה החולה, 20 דקות עבור BTX).
  5. הגרה/תמונה שוב באמצעות שלב 3.2. כדי לתעד את התפקוד לאחר הטיפול.
  6. הסר את אמצעי הטיפול ואפשר לרקמות לנוח לזמן הרצוי (48 שעות לאחר הסרת סרה)
    הערה: אפשר לפחות 24 שעות בין גירוי להדמיה כדי למנוע עייפות רקמות

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צמתים נוירומוסקולריים נוצרו על ידי גידול משותף של מוטונורונים שמקורם ב-hiPSC אופטוגנטיים עם רקמת שרירי שלד לא אופטוגנטית. מיובלסטים של שלדיים ראשוניים אנושיים (SkM) נזרעו לפלטפורמות והובחנו למיו-טיובים מרובי גרעינים באמצעות פרוטוקול של שבועיים. המוטונורונים האופטוגנטיים נבדלו בנפרד, אך במקביל להבחנה המיו-טובית, ואז נזרעו לתוך הפלטפורמה (איור 1). הרקמות החלו להתכווץ בתגובה לגירוי אור כחול 7-12 ימים לאחר זריעת MN, מה שמצביע על התפתחות מוצלחת והבשלה של NMJs. ניתן לתרבת את ה- NMJs, לגרות אותם ולדמות אותם במשך עד 40 יום לאחר זריעת המוטונרון, אך נקודת הזמן האופטימלית מתרחשת ביום 1619. האימות המורפולוגי והביוכימי של ההבחנות והנוכחות של החלבונים האופטוגנטיים מוצגים באיור משלים 1 ואומתו במחקרים קודמים18,19.

כדי להדגים כי ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות למערכות תרביות שונות, האסטרטגיה נבחנה באמצעות שני כורים ממודרים שונים: התקן מיקרופלואידי וביוריאקטור פתוח היטב. לשתי המערכות יש עיצוב דומה, כאשר תא אחד מסופק עם עמודים ליצירת רקמות שרירי השלד ותא שני לתרבית של אגרגטים תלת-ממדיים של מוטונרון שיכולים להרחיב אקסונים כדי להעצים את רקמות השלד (איור 2A,B). עם זאת, לשתי המערכות יש קני מידה שונים, כאשר המכשיר המיקרופלואידי מניב רקמות שריר שלד באורך 1 מ"מ הכוללות כ-20,000 מיובלסטים (איור 2C) ומערכת הביו-ריאקטור הפתוחה יוצרת רקמות שריר באורך 4 מ"מ הכוללות כ-450,000 מיובלסטים (איור 2D).

כדי לאפשר גירוי מבוקר של ה-NMJs האופטוגנטיים, נבנתה מערך אופטי, המורכב מ-LED אדום של 637 ננומטר להארת שדה בהיר, נורית LED כחולה של 488 ננומטר להפעלה של ChR2-MNs, ומסנן אור כחול בין דגימת הרקמה ומטרתו למנוע מאור כחול להפריע לניתוח התמונה (איור 3A). נוריות ה-LED הופעלו על ידי נהגי LED ונשלטו במדויק באמצעות מיקרו-מעבד Arduino. פונקציית NMJ הוערכה על ידי רכישה בו-זמנית של סרטוני קיטועי זמן תוך גירוי MNs עם אור כחול באמצעות מיקרוסקופ מותאם אישית של סקריפט מאקרו בשילוב עם קוד Arduino (איור 3B). הפרוטוקול הגדיל את תדירות הגירוי מ-0.2 הרץ ל-2 הרץ ב-30 צעדים. לאחר רכישת הסרטים, פונקציית הרקמה נותחה באמצעות חבילת MATLAB מותאמת אישית (איור 3C). הניתוח מדד את תזוזת הרקמה, יצר עקבות התכווצות וסנכרן אותה עם פרוטוקול גירוי האור. לאחר מכן הוא קבע את החלק של הפולסים האפקטיביים (F) ואת השבר הצפוי של פולסים יעילים (E) כדי להסביר התכווצויות פוטנציאליות לא מגורות. השבר הצפוי (E) חושב כשבר של פולסים שיסומנו כיעילים אם הצירים יתפלגו באופן אקראי בתוך 30 השניות. לאחר מכן חושב ציון הרקמה כ-(F-E)/(1-E), עם ערך בין 0 ל-1 (איור 3C). הקוד קובע אם כיווץ מופעל על סמך הזמן שבין פולס האור לתחילת שיא ההתכווצות, כפי שמוצג באיור 3D. שיטה אוטומטית ובלתי משוחדת זו מאפשרת אפיון חוזר ונשנה של פונקציית NMJ בגדלים גדולים של מדגם ולאורך זמן. הקוד כולל פרמטרים הניתנים לכוונון שניתן להתאים לאחר העיבוד כדי להבטיח ניקוד נכון (איור משלים 2).

יכולתה של המערכת לאפיין באופן כמותי את תפקוד NMJ לאורך זמן הודגמה על ידי הדמיה של קבוצת רקמות במשך 11 יום (יום 9 עד יום 20 לאחר זריעת מוטונרון). המערכת תפסה שיפור בתפקוד NMJ ברקמות, והראתה עלייה בתגובות המופעלות שבוע לאחר ייצור הרקמות (איור 4A), ולאחר מכן פונקציה יציבה במשך שבוע נוסף (איור 4B). כדי לוודא כי גירוי שרירים התרחש באמצעות NMJs, קבוצה נוספת של רקמות נותחה לפני ואחרי 20 דקות של דגירה עם 5 מיקרוגרם / מ"ל של נוירוטוקסין α-bungarotoxin (BTX), אשר נקשר באופן ספציפי ובלתי הפיך לקולטני אצטילכולין. BTX עצר את כל ההתכווצויות המופעלות והספונטניות, גרם להפרעה מוחלטת בתפקוד NMJ, והראה כי גירוי קל של הרקמות דורש NMJ תפקודי (איור 4C,D). דילולים סדרתיים של BTX נבדקו בתחילה כדי לזהות את ריכוז ה-BTX האופטימלי (התוצאות לא הוצגו).

כדי להעריך את יכולת התרגום של המערכת, הוערך תפקוד NMJ לפני ואחרי הוספת סרום מחמישה מטופלי מיאסטניה גרביס. ניתוח הרקמות שטופלו בסרום של 20% MG במשך 48 שעות הראה ירידה בתפקוד בהשוואה לרקמות בקרה שטופלו בסרום מתורמים בריאים (איור 4E,F). ה-NMJs המהונדסים הוערכו שוב 48 שעות לאחר ההסרה והשטיפה של הסרום והראו התאוששות של תפקוד (איור 4F). בנוסף, נבדקו ריכוזים הולכים וגדלים של סרום מטופל ושליטה תקינה בסרום אנושי (5%, 20%, 40%) כדי לזהות את הריכוז האופטימלי שהשפיע על תפקוד הרקמה. התוצאות הראו את יכולתה של המערכת לאפיין ולכמת את תפקודי NMJ ולדגום את מיאסתניה גרביס במבחנה.

Figure 1
איור 1. תכנון ניסיוני וציר זמן. ציר זמן (ימים) של בידול וזריעה לפלטפורמות. SkM = שרירי השלד, ChR2 = מוטונורונה אופטוגנטית, NMJ = צומת נוירומוסקולרי. נתון זה שונה באישור Vila et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. מערכות תרבות משותפות ליצירת NMJs תלת-ממדיים. (A) סכמטי של הפלטפורמה המיקרופלואידית. (B) סכמטית של הביוריאקטור PDMS הפתוח. (C) רקמת שריר שלד פנימית במשטח המיקרופלואידי. (D) רקמה פנימית בביוריאקטור הפתוח. סרגל קנה מידה 0.5 מ"מ. נתון זה שונה באישור Vila et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. גירוי, הקלטה וניתוח של תפקוד NMJ. (A) שרטוט של הגדרת נורית LED ונתיב אור. (B) מערך אופטי עם מיקרוסקופ הפוך, תא תא חי, במה אוטומטית ומצלמת sCMOS. (C) אלגוריתם לעיבוד אצווה של סרטוני גירוי אופטי של תרביות NMJ. (D) מסגרת מייצגת של הסרטון שנוצרה על-ידי קוד MATLAB וגרף המעקב המתאים להתכווצות. התיבה הכחולה המהבהבת בסרטון והקווים האנכיים בגרף מציינים מתי מתרחש גירוי האור הכחול. נתון זה שונה באישור Vila et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. פונקציית NMJ. (A) עקבות התכווצות עבור NMJs אנושיים מהונדסים בתלת-ממד. (B) ציון NMJs בתגובה לאור, מה שמראה שיפור בתפקוד במשך 11 ימים (n = 47, ANOVA p חד-כיווני = 1 x 10-8). מוטות שגיאה = SEM. (C) מעקב אחר התכווצות לאחר טיפול של 20 דקות עם 5 מ"ג / מ"ל של נוירוטוקסין α-bungarotoxin (BTX). (D) כימות פונקציית NMJ (ציון) לפני ואחרי הטיפול ב- BTX (n = 6; ANOVA F חד-כיווני = 9 x 10-8). (E) עקבות התכווצות של רקמות עם 20% MG סרה לאחר 48 שעות של טיפול. (F) הערכת תפקודי NMJ עבור קבוצות מטופלות וביקורת לפני ואחרי הטיפול ואחרי ההחלמה (n = 12; לאחר הטיפול לאחר הטיפול לאחר הוק ANOVA F = 0.0002; *מציין p = 0.0015 **מציין p = 3.5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS=סרום אנושי רגיל). n מציין את מספר השכפולים הביולוגיים. נתון זה שונה באישור Vila et al.18,19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. ניסוחים של מדיה מיוגנית ועצובית. רשימה מסודרת של גורמי גדילה ותוספי תזונה למדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. רשימה של פונקציות MATLAB. הסברים קצרים על פונקציות MATLAB המשמשות לניתוח תמונות. טבלה זו שונתה באישור Vila et al.18. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קבצים משלימים

איור משלים 1. בידולי מיוטו-טיוב ומוטונרון. (A) פרוטוקול הבחנה של Myotube (MM = מדיית התבגרות). (B) תמונות אימונופלואורסצנציה (IF) המציגות ביטוי של סמני שרירי שלד, שרשרת כבדה של מיוזין (MHC), α-אקטינין ודסמין במיוטובים מובחנים. (C) פרוטוקול הבחנה של Motoneuron. (D) לוקליזציה של תקשוררדופסין-2 עם YFP (ChR2-YFP) לממברנה ב- iPSCs אופטוגנטיים ו- (E) MNs המאשרים זיהום מוצלח. (F) ביטוי משותף של כולין אצטילטרנספראז (ChAT, אדום) ו-ChR2 (ירוק) ב-MNs אופטוגנטיים. הועתק באישור וילה ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2. עיבוד שגוי הדורש התאמת פרמטרים. (A) זמן בסיס שגוי גורם לשיאים של הצורה הלא נכונה. (B) סף שיא גבוה מדי גורם לכך שפסגות לא זוהו. (C) תנאים מקלים מדי לזיהוי מינימה (כלומר, ערכים נמוכים מדי שנבחרו עבור minMinProminence ו/או minMinWidth) גורמים לכך שמינימה מסומנת באמצע או אפילו בראש הפסגות, ולכן נספרת כ"לא מנוצלת" מכיוון שהם מתחילים רחוק מדי מפעימת האור הקודמת. (D) תנאים מחמירים מדי לזיהוי מינימה גורמים לכך שתחילת השיא מסומנת לפני פולס האור או אפילו חסרה, כמו בדוגמה זו. הועתק באישור וילה ואח '18. קובץ המציג מודל תלת מימדי של פלטפורמת ביוריאקטור שניתן לערוך ולייצא כדי ליצור תבניות לייצור ביוריאקטורים באמצעות PDMS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

קובץ CAD משלים. קובץ המציג מודל תלת מימדי של פלטפורמת ביוריאקטור שניתן לערוך ולייצא כדי ליצור תבניות לייצור ביוריאקטורים באמצעות PDMS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת זו היא מודל רקמות אנושיות תלת-ממדי מהונדס המשלב אופטוגנטיקה ועיבוד וידאו כדי לאפשר הערכה אוטומטית ובלתי משוחדת של תפקוד NMJ. באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, הדגמנו את היכולת למדוד שינויים בתפקוד NMJ במהלך ההתפתחות הפיזיולוגית ולאפיין את ההשפעות המזיקות של פתולוגיות כגון חשיפה לנוירוטוקסין ומיאסתניה גראוויס חולה סרה.

מחקרים קודמים דיווחו על היכולת לדגום MG עם מוטונורונים אופטוגנטיים שמקורם ב-hPSC בתרבית משותפת עם מיו-צינוריות שלד באמצעות MG patient sera22. עם זאת, המערכת הייתה בדו-ממד ותיעדה התכווצויות במיקומים אקראיים, ובכך הגבילה את יכולת השכפול והפחיתה את היכולת הכמותית של המודל. אחד היתרונות הגדולים ביותר של המערכת שלנו, בהשוואה למערכת דו-ממדית, הוא שהיא מאפשרת לנו לחקות את הסביבה התלת-ממדית, מה שמאפשר בצורה מדויקת יותר את ההתפתחות התאית והמורפולוגית בין MNs ל-SkMs. ישנן עדויות רבות התומכות בכך שהרמזים הביומכניים הנדרשים לרקמה כדי להתנהג כמו הפיזיולוגיה הטבעית שלה מחקים בצורה מעולה במערכת תלת-ממדית 13,14,15,16. בנוסף, היבטים שונים של המערכת התלת-ממדית מאפשרים סביבה מבוקרת יותר: היווצרות מכוונת של סינפסות, פחות הטרוגניות בין דגימות, שליטה מרחבית-טמפורלית מוגברת בגירוי באמצעות אופטוגנטיקה, ומערכת אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה המפחיתה את הסובייקטיביות של הניתוח של כל דגימה.

המערכת שפותחה יכולה לשמש למודל מחלות נוירומוסקולריות אחרות (NMDs), כגון טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), ניוון שרירים דושן (DMD) ואחרים. למרות שפתופיזיולוגיה של ALS מערבת את תפקוד לקוי של הנוירון המוטורי עצמו ולא את הצומת הנוירומוסקולרי17,27, למערכת שלנו יש את היכולת לשחזר את מצב המחלה של ALS על ידי הצגת התכווצות שרירים מופחתת לאחר ניוון או נזק לנוירון. מחלת דושן היא מחלה ניוונית שרירים הנגרמת על ידי מחסור בחלבון דיסטרופין, מה שמוביל לחולשת שרירים ובסופו של דבר לניוון28. המערכת יכלה לדגום דושן על ידי שילוב שרירי שלד מהונדסים גנטית הנושאים מעכב דיסטרופין או תאי שריר חולים חסרי דיסטרופין. בסך הכל, למערכת יש את הגמישות והעוצמה לשחזר NMDs שונים בפלטפורמה תלת-ממדית במבחנה.

עבור פרוטוקול הדורש מקורות שונים של תאים, שלכל אחד מהם רמות מסוימות של מפגש, אחד ההיבטים הקריטיים ביותר הוא התזמון. במהלך התפשטות תאי שריר השלד הראשוניים, חשוב לא לאפשר להם להפוך למפגשיים מדי (65%-70%) עקב היתוך. לעיתים, גם כאשר משתמשים בטריפסין כדי לפרק את הגושים, נצפה כי הדבר מתורגם לזריעה יעילה יותר לתוך הביוריאקטורים. היבט קריטי נוסף הוא ייצור פלטפורמת הביו-ריאקטור הפתוחה. על מנת להגביר את ההומוגניות בקרב פלטפורמות PDMS, יש לשמור על כמות הזמן שהן מבליות בתנור אחידה בכל הפלטפורמות כדי למנוע תנודות בתכונות המכניות של עמודי הפלטפורמה. בנוסף, במהלך זריעת תאי השריר לתוך הכורים, על מנת לשמור על עקביות של צפיפות הזריעה, הגיוני לסובב את הצינור בעדינות (1-1.1.5 שניות) בין כל שניים עד שלושה תאים בתוך הביוריאקטורים. לבסוף, נראה כי אחוזי ההצלחה של פיתוח NMJ תלויים במידה רבה בהצלחת זריעת המוטונרון מכיוון שהתוספת של נוירוספרות היא כה עדינה ומשתנה מאדם לאדם. עם תרגול הזריעה, אחוזי ההצלחה עולים, ומאפשרים לכ-90% מהתרביות היזומות להיות מגורות ומדומות.

נכון לעכשיו, כמה מגבלות שניתן לטפל בהן בעתיד הקרוב הן שילוב ואימות של חלבונים אופטוגנטיים שאינם ChR2 הנדון. ניתן להוסיף למערכת שליטה ספציפית על שני סוגי התאים ועל חיישנים אופטוגנטיים להדמיית מתח/סידן או חילוף חומרים בשרירים לצורך קריאות וניתוח מוגברים. מכיוון שאור כחול גורם לפוטוטוקסיות במינונים גבוהים, משטר הגירוי הוגבל ל-30 שניות. ניתן למתן את האפקט הזה על ידי שילוב של תעלת תעלהודופסין עם תזוזה אדומה למחקרי גירוי למשך זמן ארוך יותר. בנוסף, מגבלה נוספת שניתן לשפר באיטרציות עתידיות של המודל היא היעדר תאים תומכים עצביים כמו תאי שוואן. עם זאת, הרבגוניות של פלטפורמה זו וקוד הניתוח מאפשרים לשלב מגוון מבנים אופטוגנטיים וסוגי תאים. בעוד שקו ChR2-hiPSC שלנו נוצר באמצעות CRISPR, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי ליישם תגובה אופטוגנטית ב- hiPSCs. יתר על כן, עם יכולת ההסתגלות של hiPSCs, ניתן לפתח את מודל NMJ ממקור תא יחיד, המאפשר להשתמש במודלים ספציפיים לחולה כדי להמשיך ולחקור מחלות נוירומוסקולריות18.

פלטפורמה זו מספקת ניתוח חוזר, אוטומטי ובלתי מוטה של תפקוד NMJ אנושי לאורך זמן ויכולה לזהות שינויים הניתנים לכימות בתפקוד עקב אפקטים חיצוניים, כמו נוירוטוקסינים או סרום מטופל MG. באופן כללי, מערכת התלת-ממד שלנו מאפשרת חקירה של תפקוד NMJ אנושי בשלב מוקדם בפתולוגיה של מחלות, מספקת את ההזדמנות לבדיקת תרופות ומניחה את היסודות למערכת חזקה לקידום הרפואה המדויקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על תמיכת המימון על ידי ה- NIH [מספרי המענק EB025765 ו- EB027062], DOD [מספר הפרס W81XWH-18-18-1-0095], והחדשנות בבריאות של UCSF באמצעות הנדסה (מלגת HIVE). אנו מודים תודה לליבת תאי הגזע של אוניברסיטת קולומביה על עזרתם והדרכתם בתכנות מחדש של תאים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 182
הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter