Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.

Abstract

Viele neuromuskuläre Erkrankungen, wie Myasthenia gravis (MG), sind mit einer Dysfunktion der neuromuskulären Verbindung (NMJ) verbunden, die in Tiermodellen aufgrund physiologischer Unterschiede zwischen Tieren und Menschen schwer zu charakterisieren ist. Tissue Engineering bietet Möglichkeiten, In-vitro-Modelle funktioneller menschlicher NMJs bereitzustellen, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Durch den Einbau optogenetischer Proteine in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugten wir Neuronen, die mit bestimmten Wellenlängen des Lichts stimuliert werden können. Wenn das NMJ gesund und funktionell ist, führt ein neurochemisches Signal des Motoneurons zu einer Muskelkontraktion. Durch die Integration von Optogenetik und Mikrofabrikation mit Tissue Engineering haben wir eine unvoreingenommene und automatisierte Methodik zur Charakterisierung der NMJ-Funktion mittels Videoanalyse etabliert. Es wurde ein standardisiertes Protokoll für die NMJ-Bildung, die optische Stimulation mit gleichzeitiger Videoaufzeichnung und die Videoanalyse der Gewebekontraktilität entwickelt. Die Stimulation optogenetischer Motoneuronen durch Licht zur Induktion von Kontraktionen der Skelettmuskulatur rekapituliert die menschliche NMJ-Physiologie und ermöglicht wiederholte funktionelle Messungen von NMJ im Laufe der Zeit und als Reaktion auf verschiedene Eingaben. Wir demonstrieren die Fähigkeit dieser Plattform, funktionelle Verbesserungen der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit zu zeigen und die schädlichen Auswirkungen von MG-Antikörpern oder Neurotoxinen von Patienten auf die NMJ-Funktion zu charakterisieren.

Introduction

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die chemische Synapse zwischen Motoneuronen (MNs) und Skelettmuskelzellen (SkM), die eine Muskelkontraktion ermöglicht. Toxine wie Neurotoxin α-Bungarotoxin (BTX) oder neuromuskuläre Erkrankungen (NMD) wie Myasthenia gravis (MG) können zu einer Degeneration des NMJ und einer Verringerung der Muskelkontrolleführen 1. Biotechnologisch hergestellte menschliche Gewebemodelle rekapitulieren die funktionellen und physiologischen Mechanismen menschlicher NMJs besser und bieten ein größeres translationales Potenzial als Tiermodelle.

Während Tiermodelle das Verständnis der Bildung und Funktion des NMJ vorangebracht haben, gibt es signifikante Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Synapsen, die die Übersetzung der Ergebnisse auf den Menschen beschränken und die In-vivo-Charakterisierung des NMJ zu einer Herausforderung machen 2,3,4. Studien haben deutliche physiologische Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen NMJs gezeigt. Mäuse haben im Vergleich zu menschlichen NMJs größere NMJs und kleinere aktive Zonendichten4. Darüber hinaus spiegeln Arzneimittelstudien, die in Tiermodellen durchgeführt werden, nicht immer die Wirkungen wider, die in klinischen Studien am Menschen gefunden wurden. Technisch hergestellte menschliche Gewebemodelle bieten die Möglichkeit, die gesunde Entwicklung des NMJ und die Pathologie neuromuskulärer Erkrankungen zu untersuchen und medikamentöse Screenings zu ermöglichen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs)5 können in eine Vielzahl von Zelltypen differenziert werden, einschließlich Skelettmuskelzellen6,7 und Motoneuronen 8,9. hiPS-Zellen können leicht aus Patientenzellen generiert werden, was eine bessere Krankheitsmodellierung 10 und ein Arzneimittelscreening11,12 durch patientenspezifische Gewebemodelle ermöglicht.

Zweidimensionalen (2D) Monolayer-Co-Kulturen von SkMs und MNs fehlen die Morphologie, der Phänotyp, die Organisation und das funktionelle Verhalten physiologischer NMJs. NMJs bilden sich zufällig in einer 2D-Kultur, die die Isolierung motorischer Einheiten für die Analyse hemmt, genaue funktionelle Messungen einschränkt und ihre Verwendung für wiederholte, systematische Experimente verhindert13 . Dreidimensionale (3D) Gewebemodelle von NMJs überwinden viele dieser Einschränkungen und rekapitulieren die morphologischen und funktionellen Eigenschaften physiologischer NMJs 7,14,15,16,17. Unter Verwendung dieses Modells werden die beiden Gewebetypen separat entwickelt und dann integriert, indem das axonale Wachstum gesteuert wird, so dass sich im Vergleich zu 2D-Kultursystemen besser organisierte NMJs entwickeln können.

Unsere frühere Studie zeigte, dass die Kombination von Optogenetik mit Tissue Engineering eine genaue nicht-invasive Stimulation und Bewertung der NMJ-Funktionermöglichen kann 18,19. Durch die Gentechnik können lichtempfindliche Proteine in das Genom von hiPSCs integriert werden. Die Integration von Kanalrhodopsin-2 (ChR2), einem Ionenkanal, der sich als Reaktion auf blaues Licht öffnet, in die Membran erregbarer Zellen wie Neuronen ermöglicht eine berührungslose raumzeitliche Kontrolle über die Zellaktivierung20,21,22. hiPSCs, die ChR2 tragen, können in optogenetische Motoneuronen unterschieden werden, die für blaues Licht empfindlich sind, wodurch die Notwendigkeit typischer invasiver Elektroden, die Neuronen stimulieren, entfällt und eine unerwünschte Stimulation der Muskelzellen durch Elektrodenvermieden wird 23. Dieses System verwendet optogenetische Motoneuronen, um Kontraktionen in nicht-optogenetischen Skelettmuskelzellen zu stimulieren. Durch die Kombination von Videoerfassung und kontrollierter Blaulichtbeleuchtung können die gemeinsam kultivierten Gewebe gleichzeitig stimuliert und für die NMJ-Funktion aufgezeichnet werden.

MG wird durch Autoantikörper verursacht, die auf nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChR) abzielen, was zu einer verminderten NMJ-Funktion und Muskelschwäche führt24. Es wird auf der Grundlage der vorgestellten Symptome, der Elektrodiagnose und des Nachweises von Autoantikörpern durch serologische Bluttests diagnostiziert. Es wurden jedoch nicht alle an MG beteiligten Autoantikörper identifiziert, und bei einigen seronegativen Patienten wird MG diagnostiziert, aber ohne anerkannte Antikörper25,26. Unser System ermöglicht eine wiederholte funktionelle Beurteilung des NMJ vor und nach der Zugabe von Serum von MG-Patienten und liefert unschätzbare Einblicke in die funktionellen und biochemischen Veränderungen, die durch die MG-Antikörper verursachtwerden 18. Unser Protokoll veranschaulicht, wie 3D-In-vitro-Modelle von funktionellem menschlichem NMJ erstellt werden können, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Wir demonstrieren die Vielseitigkeit des Systems in zwei Plattformen, einem mikrofluidischen Gerät und einer größeren Open-Well-Bioreaktorplattform.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet.

1. Vorbereitung des Bioreaktors

  1. Bioreaktorformen herstellen
    1. Laden Sie eine Bioreaktor-CAD-Datei aus der ergänzenden CAD-Datei herunter oder erstellen Sie ein benutzerdefiniertes eigenes Design.
    2. Generieren Sie mit der CAM-Software einen CNC-Werkzeugweg aus dem 3D-Modell.
    3. Bearbeiten Sie Acetalformen mit einer CNC-Fräsmaschine.
  2. Herstellung von Bioreaktoren
    1. Mischen Sie eine 10:1-Base zu einem Härtergemisch aus Polydimethylsiloxan (PDMS, 77 g Mischung pro 4 Plattformen/Formen).
    2. Legen Sie das Gemisch in eine Vakuumkammer, schließen Sie alle Ventile, schalten Sie das Vakuum ein und entgasen Sie das Gemisch für mindestens 30 Minuten, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Gießen Sie das Gemisch in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 h.
    3. Schließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie eine sechseckige Stahlstange über die Mitte und klemmen Sie sie auf beiden Seiten.
    4. Füllen Sie die Oberseite mit PDMS auf.
    5. Die Schimmelpilze in einem 65 °C Ofen für mindestens 4 h aushärten.
    6. Entfernen Sie die Plattformen aus den Formen, nachdem Sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind.
    7. Reinigen Sie die Geräte in einem Ultraschallbad mit 1-stündigen Zyklen Spülmittel, 400 ml 100% Isopropanol und destilliertem Wasser.
    8. Über Nacht bei 65 °C trocknen.
    9. Glasabdeckungen 30 min in 1% nichtionischem Tensidpolyol einweichen und sicherstellen, dass sich die Deckgläser nicht stapeln, damit sie alle ordnungsgemäß beschichtet sind.
    10. Mit destilliertem Wasser gut abspülen und über Nacht bei 65 °C trocknen.
    11. Verwenden Sie einen Plasmareiniger auf hoher Höhe mit 6 l / min Sauerstoff für 1-2 Minuten, um Glasabdeckungen und PDMS-Plattform zu behandeln. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 Sekunden lang auf das Deckglas drücken.
    12. Autoklavieren Sie die gebundenen Geräte, bevor Sie Zellen hinzufügen.

2. Aufbau eines optischen Stimulations-Setups

  1. Befestigen Sie mit einem 30-mm-Käfigwürfelsystem einen dichroitischen 573-nm-Spiegel in der Mitte. Kombinieren Sie eine rote 627-nm-LED mit einem 594-nm-Longpass-Erregungsfilter und befestigen Sie sie an der Oberseite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist. Befestigen Sie dann eine blaue 488-nm-LED mit einem 546-nm-Kurzpass-Erregungsfilter an der angrenzenden Seite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist, wie im Schaltplan in Abbildung 3A dargestellt.
  2. Befestigen Sie eine ringbetätigte Irismembran an der Unterseite des Käfigwürfels, um die Größe der beleuchteten Fläche zu steuern.
  3. Versorgen Sie jede LED über einen T-Cube-LED-Treiber mit Strom und steuern Sie sie über ein Arduino Uno Rev3-Board. Schließen Sie den seitlichen Eingang des LED-Treibers an einen Stromquellenstecker an, schließen Sie den mittleren Ausgang an den Arduino an und schließen Sie den seitlichen Ausgang direkt an die LEDs an.
  4. Verbinden Sie den Arduino Uno über ein USB-Kabel mit einem PC.
  5. Laden Sie Dateien vom GitHub-Link (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) herunter.
  6. Öffnen Sie die Datei "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" aus dem Ordner GitHub.
  7. Startparameter festlegen: Schritte = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. Stellen Sie sicher, dass der Pinausgang 4 dem blauen LED-Treiber und der Pinausgang 2 dem roten LED-Treiber zugewiesen ist. Überprüfen Sie, ob die mittleren Drähte des LED-Treibers mit der Masse und dem jeweiligen Pin-Ausgang verbunden sind.
  9. Kompilieren und laden Sie das Programm "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" nach Arduino.
  10. Schließen Sie jeden LED-Treiber an den entsprechenden Kanal an.

3. Aufbau der Zellkultur (Tag -21-0)

  1. Primäre Skelettmuskelzellen
    1. Auftauen und erweitern Sie primäre Skelettmyoblasten (erhalten aus Cook Myosite) für maximal sechs Passagen mit myotonem Wachstumsmedium (+ Ergänzung). Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.
    2. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.
    3. Sobald die Zellen zu etwa 60% konfluent sind, passieren Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA (1x, für 5 min bei 37 °C). Sammeln Sie die dissoziierten Zellen und fügen Sie frische Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
    4. Drehen Sie die Zellen mit 300 x g nach unten und saugen Sie den Überstand über dem Zellpellet ab.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen mit MGM und Samen 1:3 mit 60 ml pro Dreischichtkolben.
  2. ChR2-hiPSC
    HINWEIS: Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet. In diesem Protokoll wurden ChR2-exprimierende HiPS-Zellen durch CRISPR-Cas9-Genom-Editierung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden18 erzeugt, aber alle stabilen optogenetischen Zelllinien (lentiviral, piggyBac usw.) können auf die gleiche Weise verwendet werden. Konstitutive Promotoren, die sowohl in iPSCs als auch in Motoneuronen exprimiert werden, wurden ausgewählt (CAG). Es wurde festgestellt, dass die Zellen einen gesunden Karyotyp aufweisen, wie in früheren Veröffentlichungen18,19 erwähnt.
    1. Beschichten Sie 6-Well-Platten mit 1 ml/Well solubilisierter Basalmembranmatrix, verdünnt in DMEM/F12 (1:80) und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 1 h.
    2. Saatierung von iPSCs auf beschichteten 6-Well-Platten mit 2 ml feederfreiem Zellkulturmedium (iPSC-Medien), Austausch von 2 ml Medien jeden zweiten Tag und Durchgang alle 5-7 Tage. Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.
    3. Weitergabe
      1. Dissoziieren Sie die Stammzellen, indem Sie mit 1 ml enzymfreiem Stammzellfreisetzungsreagenz für 4 min inkubieren und mechanisch mit einer breiten P1000-Pipette scheren.
      2. Samenzellen im Verhältnis 1:24 oder 1:48 in iPSC-Medien mit 2 μM Y-27632-Dihydrochlorid in 2 ml/Well auf beschichteten 6-Well-Platten.

4. Skelettmuskelgewebe-Seeding (Tag -3)

  1. Isolieren und zählen Sie 30 x 106 Myoblasten mit einem automatisierten Zellzähler.
  2. Resuspendieren Sie die Myoblasten in einer 4: 1-Mischung aus 3 mg / ml Kollagen I und gelöster Basalmembranmatrix (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen). Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie die Mischung mit 1x PBS, um ein Volumen von 800 μL zu erreichen.
  3. Fügen Sie 15 μL Zell-Kollagen-Suspension zu jeder Muskelkammer des Bioreaktors hinzu und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen (Abbildung 2).
  4. Lassen Sie das Zell-Gel-Gemisch bei 37 °C für 30 min polymerisieren und füllen Sie dann jeden Bioreaktor gut mit 450 μL myotonen Wachstumsmedien.
  5. Nach 3 Tagen (sobald sich das Gel verdichtet hat) beginnt die Myotube-Differenzierung.

5. Myotube-Differenzierung (Tage 0-14)

  1. Beginnen Sie mit der Myotube-Infusion, indem Sie das Gewebe für 7 Tage auf 450 μL fusionsinduzierende Medien (FS, Tabelle 1) umstellen und das Medium jeden zweiten Tag wechseln.
    HINWEIS: Versuchen Sie, die Myotube-Differenzierung am selben Tag wie die Motoneuron-Differenzierung von hiPSCs zu beginnen, um Motoneuronen am Ende der Differenzierungspläne beider Zelltypen zu säen.
  2. Am Tag 7 wechseln Sie das Medium auf 450 μL Reifungsmedium Ia (MMIa, Tabelle 1).
  3. Wechseln Sie am 9. Tag auf 450 μL Reifungsmedium Ib (MMIb, Tabelle 1).
  4. Wechseln Sie am 11. Tag auf 450 μL NbActiv4. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Motoneuronen ausgesät sind (Schritt 7).

6. Motoneuron-Differenzierung (Tage 0-14)

HINWEIS: Unser Motoneuron-Differenzierungsprotokoll wurde von Maury et al8 übernommen.

  1. Übertragen Sie am 0. Tag 4 x 106 ChR2-hiPSCs in eine Petrischale mit extrem niedriger Befestigung und 15 ml Motoneuron-Suspensionskulturmedium (MSCM, Tabelle 1). Ergänzen Sie MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 5 μM Y-27632 Dihydrochlorid.
  2. Isolieren Sie an Tag 2 die Neurosphären (NS) mit einem 37 μM reversiblen Sieb und einer Neuplatte in 15 ml MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 0,1 μM Retinsäure. NS sollte nach Tag 2 ohne Verwendung eines Mikroskops in der Petrischale sichtbar sein.
  3. Übertragen Sie die Zellen und Medien an Tag 4 in eine 50-ml-Röhre und lassen Sie die Neurosphären auf dem Boden absetzen (5 min). Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 und 0,1 μM Retinsäure.
  4. Wiederholen Sie an Tag 7 Schritt 6.3. aber die Zellen in 15 ml MSCM resuspendieren, ergänzt mit 0,5 μM SAG und 0,1 μM Retinsäure.
  5. Wiederholen Sie an Tag 9 Schritt 6.3. aber resuspendierte Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 10 μM DAPT.
  6. Wiederholen Sie an Tag 11 Schritt 6.3. aber resuspendieren die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 20 ng / ml BDNF und 10 ng / ml GDNF.
  7. Samen Sie am 14. Tag die Motoneuronen in die Plattform.

7. Aussaat von Motoneuronenaggregaten im Bioreaktor (Tag 14)

  1. Bereiten Sie eine 4:1-Gelmischung aus 2 mg/ml Kollagen I und Matrigel (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Matrigel zu einem Endvolumen von 1 ml) vor. Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie das Gemisch mit 1x PBS, um ein Endvolumen von 800 μL zu erreichen.
  2. Verwenden Sie ein 400-nm-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und in der Gelmischung zu resuspendieren.
  3. Aspirieren Sie Medien aus dem Reservoir und vorsichtig aus der Neurosphärenvertiefung (Abbildung 2).
  4. Fügen Sie 15 μL Gelmischung in den Neurosphärenkanal hinzu.
  5. Laden Sie eine 10 μL Pipette mit 10 μL Gel und wählen Sie dann eine Neurosphäre.
  6. Deponieren Sie die NS in den Neurosphärenkanal und stellen Sie sicher, dass sich die NS in der Kammer befindet. Heben Sie die Pipette langsam an, während Sie das verbleibende Gel freisetzen, sobald das NS abgeschieden ist. Wenn Sie nicht sicher sind, ob der NS korrekt hinterlegt wurde, überprüfen Sie seinen Standort mit einem Mikroskop.
  7. Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C polymerisieren.
  8. 450 μL NbActiv4 ergänzt mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/mL GDNF in die Reservoirs geben.
  9. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, um ein axonales Wachstum von NS zu Muskelgewebe zu ermöglichen.

8. Gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung der NMJ-Funktion (Tag 24+)

  1. Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter-Kamera (sCMOS).
  2. Stellen Sie das Binning der Kamerasoftware auf 2x2, die Belichtung auf 20 ms, den Rolling-Shutter-EIN, die Ausleserate auf 540 MHz, den Dynamikbereich: 12-Bit & Gain 1 und den Sensormodus: Überlappung.
  3. Verwenden Sie ein 2-faches Objektiv auf dem Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden.
  4. Befestigen Sie eine Lebendzellkammer (37 °C, 5% CO2) an der Mikroskopstufe.
  5. Wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren.
  6. Platzieren Sie einen 594-nm-Langpass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem abbildenden Objektiv, um blaue Lichtimpulse aus der Kamera herauszufiltern.
  7. Legen Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit 4 Bioreaktoren (24 Gewebe) in die Lebendzellkammer.
  8. Klicken Sie auf Live-Ansicht. Zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI.
  9. Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) hoch, um die Bühnenposition, das Arduino-Board und die Videoaufnahme zu steuern.
  10. Legen Sie den Ausgabefilm wie folgt fest: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X,Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern/s.
  12. Ersetzen Sie das Medium nach der Bildgebung und bringen Sie die Proben zurück in den Inkubator. Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden.

9. Stapelverarbeitung und Analyse (Tag 24+)

  1. Filmverarbeitung
    1. Verwenden Sie den benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die Videos in der Batch-Analyse zu verarbeiten. Die Dateien können aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) heruntergeladen werden. Die Funktionen sind in Tabelle 2 aufgelistet und erläutert.
      HINWEIS: Der Code ist mit den Formaten .nd2 und .czi kompatibel. Es erfordert die parallele Verarbeitung, die in MATLAB aktiviert werden muss, und benötigt das Bioformatpaket.
    2. Führen Sie das Skript recursiveOSAnalysis aus, um die Filme durch parallele Verarbeitung zu analysieren. Halten Sie alle erworbenen Videos im selben Ordner und wählen Sie diesen Ordner aus, wenn Sie den Code ausführen.
    3. Passen Sie die Parameter nach der Analyse nach Bedarf an.
      1. Ändern Sie baselineTime (Option 1), wenn zu Beginn der Aufzeichnung eine spontane Kontraktion aufgenommen wird. Dies zeigt einen anfänglichen Messwert weit über 0 an und erfordert, dass der Frame verschoben wird, um dies zu kompensieren.
      2. Ändern Sie peakThreshold (Option 2), wenn die Kontraktionen nicht registriert werden. Der Code erkennt standardmäßig Kontraktionen, die über 25 % des höchsten Peaks liegen, sodass dieser Wert geändert werden kann.
      3. Ändern Sie minMinProminence und minMinWidth , um die Empfindlichkeit anzupassen, wenn der Beginn jedes Peaks erkannt wird.
    4. Generieren Sie Video- und Diagrammausgaben.
      1. Führen Sie recursiveOSMovie aus, um für jedes Gewebe eine Videodatei mit seiner jeweiligen Kontraktilitätsspur zu generieren.

10. Störung der NMJ-Funktion (Tag 24+)

  1. Bereiten Sie die Behandlungsmedien vor, indem Sie den Basalmedien von NbActiv4 einen externen Effektor hinzufügen, der mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF ergänzt wird.
    1. Verwenden Sie für das MG-Sera-Experiment 20% MG-Patientenseren in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Verwenden Sie für das BTX-Experiment 5 μg / ml BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimulieren/Bild mit Schritt 3.2. , um die Baseline aufzuzeichnen.
  3. Ersetzen Sie die Medien im Gewebe durch Behandlungsmedien (450 μL/Gewebe).
  4. Inkubieren für die gewünschte Zeit (48 h für Patientenseren, 20 min für BTX).
  5. Stimulieren/Bild erneut mit Schritt 3.2. um die Funktion nach der Behandlung aufzuzeichnen.
  6. Entfernen Sie die Behandlungsmedien und lassen Sie das Gewebe für die gewünschte Zeit ruhen (48 h nach Serenentfernung)
    HINWEIS: Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen Stimulation und Bildgebung, um Gewebeermüdung zu vermeiden

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neuromuskuläre Verbindungen wurden durch Kokultivierung optogenetischer HiPSC-abgeleiteter Motoneuronen mit nicht-optogenetischem Skelettmuskelgewebe erzeugt. Menschliche primäre Skelettmyoblasten (SkM) wurden in die Plattformen eingesät und unter Verwendung des 2-Wochen-Protokolls in mehrkernige Myotubes differenziert. Die optogenetischen Motoneuronen wurden separat, aber parallel zur Myotube-Differenzierung, differenziert und dann in die Plattform eingesät (Abbildung 1). Die Gewebe begannen sich als Reaktion auf die Blaulichtstimulation 7-12 Tage nach der MN-Aussaat zusammenzuziehen, was auf eine erfolgreiche Entwicklung und Reifung der NMJs hinweist. Die NMJs können bis zu 40 Tage nach der Motoneuronenaussaat kultiviert, stimuliert und abgebildet werden, aber der optimale Zeitpunkt tritt am Tag 16und 19 auf. Die morphologische und biochemische Validierung der Differenzierungen und des Vorhandenseins der optogenetischen Proteine ist in Ergänzende Abbildung 1 dargestellt und wurde in früheren Studien18,19 validiert.

Um zu zeigen, dass das Protokoll leicht an verschiedene Kultursysteme angepasst werden kann, wurde die Strategie mit zwei verschiedenen unterteilten Reaktoren getestet: einem mikrofluidischen Gerät und einem Open-Well-Bioreaktor. Beide Systeme haben ein ähnliches Design, wobei eine Kammer mit Säulen für die Erzeugung von Skelettmuskelgewebe und eine zweite Kammer für die Kultur von 3D-Motoneuronaggregaten ausgestattet ist, die Axone verlängern können, um das Skelettgewebe zu innervieren (Abbildung 2A, B). Die beiden Systeme haben jedoch unterschiedliche Skalen, wobei die mikrofluidische Vorrichtung 1 mm langes Skelettmuskelgewebe mit etwa 20.000 Myoblasten (Abbildung 2C) und das Open-Well-Bioreaktorsystem zu 4 mm langem Muskelgewebe mit etwa 450.000 Myoblasten führt (Abbildung 2D).

Um eine kontrollierte Stimulation der optogenetischen NMJs zu ermöglichen, wurde ein optischer Aufbau aufgebaut, der aus einer roten 637-nm-LED für die Hellfeldbeleuchtung, einer blauen 488-nm-LED zur Aktivierung von ChR2-MNs und einem Blaulichtfilter zwischen der Gewebeprobe und dem Objektiv besteht, um zu verhindern, dass blaues Licht die Bildanalyse stört (Abbildung 3A). Die LEDs wurden von LED-Treibern gespeist und präzise über einen Arduino-Mikroprozessor gesteuert. Die NMJ-Funktion wurde durch gleichzeitige Aufnahme von Zeitraffervideos bei gleichzeitiger Stimulation von MNs mit blauem Licht unter Verwendung eines benutzerdefinierten Mikroskop-Makroskripts in Verbindung mit dem Arduino-Code ausgewertet (Abbildung 3B). Das Protokoll erhöhte die Häufigkeit der Stimulation von 0,2 Hz auf 2 Hz in 30 Schritten. Nachdem die Filme erfasst waren, wurde die Gewebefunktion mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Paket analysiert (Abbildung 3C). Die Analyse maß die Gewebeverschiebung, erzeugte eine Kontraktilitätsspur und synchronisierte sie mit dem Lichtstimulationsprotokoll. Anschließend wurde der Anteil der effektiven Impulse (F) und ein erwarteter Anteil der effektiven Impulse (E) bestimmt, um mögliche nicht stimulierte Kontraktionen zu berücksichtigen. Der erwartete Anteil (E) wurde als der Anteil der Impulse berechnet, der als effektiv bezeichnet würde, wenn die Kontraktionen innerhalb der 30 s zufällig verteilt wären. Der Gewebe-Score wurde dann als (F-E)/(1-E) mit einem Wert zwischen 0 und 1 berechnet (Abbildung 3C). Der Code bestimmt, ob eine Kontraktion ausgelöst wird, basierend auf der Zeit zwischen einem Lichtimpuls und dem Beginn der Kontraktilitätsspitze, wie in Abbildung 3D dargestellt. Diese automatisierte, unvoreingenommene Methode ermöglicht eine wiederholte Charakterisierung der NMJ-Funktion in großen Stichprobengrößen und im Laufe der Zeit. Der Code enthält abstimmbare Parameter, die nach der Verarbeitung angepasst werden können, um eine korrekte Bewertung sicherzustellen (Ergänzende Abbildung 2).

Die Fähigkeit des Systems, die NMJ-Funktion im Laufe der Zeit quantitativ zu charakterisieren, wurde durch die Abbildung einer Gruppe von Geweben für 11 Tage (Tag 9 bis Tag 20 nach der Motoneuronenaussaat) demonstriert. Das System erfasste eine Verbesserung der NMJ-Funktion in Geweben und zeigte eine Zunahme der ausgelösten Reaktionen 1 Woche nach der Gewebeherstellung (Abbildung 4A), gefolgt von einer stabilen Funktion für eine weitere Woche (Abbildung 4B). Um zu überprüfen, ob die Muskelstimulation durch die NMJs erfolgte, wurde eine weitere Gruppe von Geweben vor und nach 20 min Inkubation mit 5 μg/ml des Neurotoxins α-Bungarotoxin (BTX) analysiert, das spezifisch und irreversibel an Acetylcholinrezeptoren bindet. BTX stoppte alle ausgelösten und spontanen Kontraktionen, führte zu einer vollständigen Störung der NMJ-Funktion und zeigte, dass die Lichtstimulation der Gewebe eine funktionelle NMJ erfordert (Abbildung 4C, D). Serielle Verdünnungen von BTX wurden zunächst getestet, um die optimale BTX-Konzentration zu identifizieren (Ergebnisse nicht gezeigt).

Um die translationale Fähigkeit des Systems zu bewerten, wurde die NMJ-Funktion vor und nach der Zugabe von Serum von fünf Myasthenia gravis-Patienten untersucht. Die Analyse der mit 20% MG-Serum für 48 h behandelten Gewebe zeigte eine verminderte Funktion im Vergleich zu Kontrollgeweben, die mit Serum von gesunden Spendern behandelt wurden (Abbildung 4E, F). Die technischen NMJs wurden ebenfalls 48 h nach Entfernung und Auswaschung des Serums erneut evaluiert und zeigten eine Wiederherstellung der Funktion (Abbildung 4F). Darüber hinaus wurden steigende Konzentrationen von Patientenserum und eine normale menschliche Serumkontrolle (5%, 20%, 40%) getestet, um die optimale Konzentration zu identifizieren, die die Gewebefunktion beeinflusst. Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit des Systems, die NMJ-Funktion zu charakterisieren und zu quantifizieren und Myasthenia gravis in vitro zu modellieren.

Figure 1
Abbildung 1. Experimentelles Design und Zeitplan. Zeitleiste (Tage) der Differenzierung und Aussaat in Plattformen. SkM = Skelettmuskulatur, ChR2 = optogenetische Motoneuronen, NMJ = neuromuskuläre Verbindung. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Vila et al.18 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2. Kokultursysteme zur Erzeugung von 3D-NMJs. (A) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Plattform. (B) Schematische Darstellung des PDMS-Bioreaktors mit offenem Bohrloch. (C) Innerviertes Skelettmuskelgewebe in der mikrofluidischen Plattform. (D) Innerviertes Gewebe im Bioreaktor mit offenem Brunnen. Maßstabsleiste 0,5 mm. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Vila et al.18 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Stimulation, Aufzeichnung und Analyse der NMJ-Funktion. (A) Schematische Darstellung des LED-Aufbaus und des Lichtwegs. (B) Optischer Aufbau mit einem inversen Mikroskop, einer lebenden Zellkammer, einem automatisierten Tisch und einer sCMOS-Kamera. (C) Algorithmus zur Stapelverarbeitung von optischen Stimulationsvideos von NMJ-Kulturen. (D) Repräsentativer Frame des durch den MATLAB-Code generierten Videos und den entsprechenden Kontraktilitäts-Trace-Graphen. Das blinkende blaue Feld im Video und die vertikalen Linien im Diagramm zeigen an, wann die Blaulichtstimulation auftritt. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Vila et al.18 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. NMJ-Funktion. (A) Kontraktilitätsspur für 3D-konstruierte menschliche NMJs. (B) Punktzahl der NMJs als Reaktion auf Licht, die eine Verbesserung der Funktion über 11 Tage zeigt (n = 47, unidirektionale ANOVA p = 1 x 10-8). Fehlerbalken = SEM. (C) Kontraktilitätsspur nach 20-minütiger Behandlung mit 5 mg/ml des Neurotoxins α-Bungarotoxin (BTX). (D) Quantifizierung der NMJ-Funktion (Score) vor und nach der Behandlung mit BTX (n = 6; Einweg-ANOVA F = 9 x 10-8). (E) Kontraktilitätsspur von Geweben mit 20% MG-Seren nach 48 h Behandlung. (F) NMJ-Funktionsbeurteilung für behandelte und Kontrollgruppen vor und nach der Behandlung und nach der Genesung (n = 12; nach der Behandlung post-hoc ANOVA F = 0,0002; *zeigt p = 0,0015 **zeigt p = 3,5 x10−6) an (MG = Myasthenia Gravis; NHS = normales menschliches Serum). n gibt die Anzahl der biologischen Replikate an. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Vila et al.18,19 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1. Myogene und neuronale Medienformulierungen. Organisierte Liste von Wachstumsfaktoren und Ergänzungen für Medien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. Liste der MATLAB-Funktionen. Kurze Erläuterungen der MATLAB-Funktionen für die Bildanalyse. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Vila et al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Dateien

Ergänzende Abbildung 1. Myotube- und Motoneuron-Differenzierungen. (A) Myotube-Differenzierungsprotokoll (MM = Reifungsmedien). (B) Immunfluoreszenzbilder (IF), die die Expression von Skelettmuskelmarkern Myosin Heavy Chain (MHC), α-Actinin und Desmin in differenzierten Myotubes zeigen. (C) Motoneuron-Differenzierungsprotokoll. (D) Lokalisation von Kanalrhodopsin-2 mit YFP (ChR2-YFP) zur Membran in optogenetischen iPSCs und (E) MNs, die eine erfolgreiche Infektion bestätigen. (F) Ko-Expression von Cholin-Acetyltransferase (ChAT, rot) und ChR2 (grün) in optogenetischen MNs. Skalenbalken 100 μm. Reproduziert mit Genehmigung von Vila et al.18. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Falsche Verarbeitung, die eine Anpassung der Parameter erfordert. (A) Eine falsche Baseline-Zeit führt zu Spitzen der falschen Form. (B) Eine zu hohe Spitzenschwelle führt dazu, dass Spitzen nicht erkannt werden. (C) Zu milde Bedingungen für die Detektion von Minima (d. h. zu niedrige Werte, die für minMinProminence und/oder minMinWidth gewählt wurden) führen dazu, dass Minima in der Mitte oder sogar oben auf den Peaks markiert werden und daher als "untriggered" gezählt werden, weil sie zu weit vom vorhergehenden Lichtpuls entfernt beginnen. (D) Zu strenge Bedingungen für den Nachweis von Minima führen dazu, dass der Beginn des Peaks vor dem Lichtimpuls markiert wird oder sogar, wie in diesem Beispiel, fehlt. Reproduziert mit Genehmigung von Vila et al.18. Datei mit 3D-Modell der Bioreaktorplattform, die bearbeitet und exportiert werden kann, um Formen für die Bioreaktorherstellung mit PDMS herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Ergänzende CAD-Datei. Datei mit 3D-Modell der Bioreaktorplattform, die bearbeitet und exportiert werden kann, um Formen für die Bioreaktorherstellung mit PDMS herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses System ist ein entwickeltes 3D-Modell für menschliches Gewebe, das Optogenetik und Videoverarbeitung kombiniert, um eine automatisierte und unvoreingenommene Bewertung der NMJ-Funktion zu ermöglichen. Mit einem standardisierten Protokoll haben wir die Fähigkeit nachgewiesen, Veränderungen der NMJ-Funktion während der physiologischen Entwicklung zu messen und die schädlichen Auswirkungen von Pathologien wie Neurotoxinexposition und Myasthenia gravis Patientenseren zu charakterisieren.

Frühere Studien haben über die Fähigkeit berichtet, MG mit optogenetischen hPSC-abgeleiteten Motoneuronen in Kokultur mit Skelettmyotubes unter Verwendung von MG-Patientenseren22 zu modellieren. Das System befand sich jedoch in 2D und zeichnete Kontraktionen an zufälligen Orten auf, wodurch die Reproduzierbarkeit eingeschränkt und die quantitative Fähigkeit des Modells verringert wurde. Einer der größten Vorteile unseres Systems im Vergleich zu einem 2D-System besteht darin, dass es uns ermöglicht, die 3D-Umgebung nachzuahmen, was die zelluläre und morphologische Entwicklung zwischen MNs und SkMs genauer erleichtert. Es gibt großartige Beweise dafür, dass die biomechanischen Hinweise, die ein Gewebe benötigt, um sich wie seine native Physiologie zu verhalten, in einem 3D-System13,14,15,16 überlegen nachgeahmt werden. Darüber hinaus ermöglichen verschiedene Aspekte des 3D-Systems eine kontrolliertere Umgebung: gerichtete Bildung von Synapsen, weniger Heterogenität zwischen den Proben, erhöhte räumlich-zeitliche Kontrolle der Stimulation durch Optogenetik und ein automatisiertes Hochdurchsatzsystem, das die Subjektivität der Analyse jeder Probe verringert.

Das entwickelte System kann verwendet werden, um andere neuromuskuläre Erkrankungen (NMDs) wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und andere zu modellieren. Obwohl die ALS-Pathophysiologie die Dysfunktion des Motoneurons selbst und nicht der neuromuskulären Verbindung17,27 beinhaltet, hat unser System die Fähigkeit, den Krankheitszustand von ALS zu rekapitulieren, indem es eine verminderte Muskelkontraktion nach Neuronendegeneration oder -schädigung zeigt. DMD ist eine muskuläre degenerative Erkrankung, die durch einen Mangel an Dystrophinprotein verursacht wird, was zu Muskelschwäche und eventueller Degeneration führt28. Das System könnte DMD modellieren, indem es gentechnisch veränderte Skelettmuskeln einbezieht, die einen Dystrophin-Inhibitor tragen, oder erkrankte Muskelzellen, denen Dystrophin fehlt. Insgesamt verfügt das System über die Flexibilität und die Leistungsfähigkeit, verschiedene NMDs in einer In-vitro-3D-Plattform zu rekapitulieren.

Für ein Protokoll, das verschiedene Zellquellen mit jeweils bestimmten Konfluenzniveaus erfordert, ist einer der kritischsten Aspekte das Timing. Während der Expansion der primären Skelettmuskelzellen ist es wichtig, dass sie aufgrund der Fusion nicht zu konfluent werden (65% -70%). Manchmal, selbst wenn Trypsin verwendet wird, um die Klumpen aufzubrechen, wurde beobachtet, dass dies zu einer geringeren wirksamen Aussaat in den Bioreaktoren führt. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Produktion von Open-Well-Bioreaktorplattformen. Um die Homogenität zwischen den PDMS-Plattformen zu erhöhen, sollte die Zeit, die sie im Ofen verbringen, über alle Plattformen hinweg einheitlich gehalten werden, um Schwankungen der mechanischen Eigenschaften der Plattformsäulen zu vermeiden. Darüber hinaus ist es während der Aussaat der Muskelzellen in die Reaktoren sinnvoll, um die Konsistenz der Aussaatdichte aufrechtzuerhalten, das Rohr vorsichtig (1-1,5 s) zwischen zwei bis drei Kompartimenten innerhalb der Bioreaktoren zu wirbeln. Schließlich wurde die Erfolgsrate für die NMJ-Entwicklung weitgehend vom Erfolg der Motoneuronenaussaat abhängig gemacht, da die Zugabe von Neurosphären so empfindlich ist und von Person zu Person variiert. Mit der Seeding-Praxis steigt die Erfolgsrate, so dass etwa 90% der initiierten Kulturen stimuliert und abgebildet werden können.

Derzeit sind einige Einschränkungen, die in naher Zukunft angegangen werden könnten, die Einbeziehung und Validierung anderer optogenetischer Proteine als die diskutierten ChR2. Eine spezifische Kontrolle über beide Zelltypen und optogenetische Sensoren für die Spannungs- / Kalziumbildgebung oder den Muskelstoffwechsel könnte dem System hinzugefügt werden, um die Auslesungen und Analysen zu erhöhen. Da blaues Licht bei hohen Dosen Phototoxizität induziert, war das Stimulationsschema auf 30 s begrenzt. Dieser Effekt könnte durch die Einbeziehung eines rotverschobenen Kanalrhodopsins für längerfristige Stimulationsstudien verbessert werden. Darüber hinaus ist eine weitere Einschränkung, die in zukünftigen Iterationen des Modells verbessert werden könnte, der Mangel an neuronalen unterstützenden Zellen wie Schwann-Zellen. Die Vielseitigkeit dieser Plattform und des Analysecodes ermöglicht es jedoch, eine Vielzahl von optogenetischen Konstrukten und Zelltypen einzubeziehen. Während unsere ChR2-hiPSC-Linie mit CRISPR entwickelt wurde, könnten andere Methoden verwendet werden, um eine optogenetische Antwort in hiPSCs zu implementieren. Darüber hinaus kann das NMJ-Modell mit der Anpassungsfähigkeit von hiPSCs aus einer einzigen Zellquelle entwickelt werden, so dass patientenspezifische Modelle zur weiteren Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungenverwendet werden können 18.

Diese Plattform bietet eine wiederholte, automatisierte und unvoreingenommene Analyse der menschlichen NMJ-Funktion im Laufe der Zeit und kann quantifizierbare Funktionsänderungen aufgrund externer Effektoren wie Neurotoxine oder MG-Patientenserum erkennen. Insgesamt ermöglicht unser 3D-System die Untersuchung der menschlichen NMJ-Funktion in einem frühen Stadium der Krankheitspathologie, bietet die Möglichkeit zum Screening von Medikamenten und legt den Grundstein für ein robustes System zur Weiterentwicklung der Präzisionsmedizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken der Finanzierung durch das NIH [Fördernummern EB025765 und EB027062], das DOD [Vergabenummer W81XWH-18-1-0095] und die UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Wir danken dem Stammzellkern der Columbia University für seine Hilfe und Anleitung bei der Zellumprogrammierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Bioengineering Ausgabe 182
Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter