Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Разработка и характеристика оптогенетической модели нервно-мышечного соединения человека

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Мы описываем воспроизводимую, автоматизированную и непредвзятую систему визуализации для характеристики функции нервно-мышечного соединения с использованием искусственной скелетной мышечной ткани человека и оптогенетических мотонейронов. Эта система позволяет проводить функциональную количественную оценку нервно-мышечной связности с течением времени и обнаруживает снижение нервно-мышечной функции, вызванное нейротоксинами и миастенией в сыворотке крови пациента.

Abstract

Многие нервно-мышечные заболевания, такие как миастения (МГ), связаны с дисфункцией нервно-мышечного соединения (NMJ), которую трудно охарактеризовать на животных моделях из-за физиологических различий между животными и людьми. Тканевая инженерия предлагает возможности для предоставления in vitro моделей функциональных NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Включив оптогенетические белки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мы создали нейроны, которые можно стимулировать с помощью определенных длин волн света. Если NMJ здоров и функционален, нейрохимический сигнал от мотонейрона приводит к сокращению мышц. Благодаря интеграции оптогенетики и микрофабрикации с тканевой инженерией мы создали объективную и автоматизированную методологию характеристики функции NMJ с использованием видеоанализа. Разработан стандартизированный протокол формирования NMJ, оптической стимуляции с одновременной видеозаписью и видеоанализа сократимости тканей. Стимуляция оптогенетических мотонейронов светом для индуцирования сокращений скелетных мышц повторяет физиологию NMJ человека и позволяет проводить повторные функциональные измерения NMJ с течением времени и в ответ на различные входы. Мы демонстрируем способность этой платформы демонстрировать функциональные улучшения в нервно-мышечной связности с течением времени и характеризовать повреждающее воздействие антител или нейротоксинов пациента на функцию NMJ.

Introduction

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой химический синапс между мотонейронами (MNs) и клетками скелетных мышц (SkM), который позволяет сокращать мышцы. Токсины, такие как нейротоксин α-бунгаротоксин (BTX), или нервно-мышечные заболевания (NMD), такие как миастения (MG), могут привести к дегенерации NMJ и снижению мышечного контроля1. Биоинженерные модели тканей человека лучше отражают функциональные и физиологические механизмы НМЖ человека и предлагают больший трансляционный потенциал, чем животные модели.

В то время как животные модели продвинули понимание формирования и функции NMJ, существуют значительные различия между синапсами человека и животных, которые ограничивают трансляцию результатов людям и делают характеристику NMJ in vivo сложной 2,3,4. Исследования показали отчетливые физиологические различия между NMJ мышей и людей. Мыши имеют большие NMJ и меньшую плотность активных зон по сравнению с NMJ человека4. Кроме того, исследования лекарств, проведенные на животных моделях, не всегда отражают эффекты, обнаруженные в клинических испытаниях на людях. Инженерные модели тканей человека дают возможность изучать здоровое развитие NMJ и патологию нервно-мышечных заболеваний и позволяют проводить скрининг лекарств. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs)5 могут быть дифференцированы на различные типы клеток, включая клетки скелетных мышц 6,7 и мотонейроны 8,9. hiPSCs могут быть легко получены из клеток пациента, что позволяет лучше моделировать заболевание10 и скрининг лекарств11,12 с помощью моделей тканей, специфичных для пациента.

Двумерным (2D) монослойным кокультурам SkMs и MNs не хватает морфологии, фенотипа, организации и функционального поведения физиологических NMJ. NMJ случайным образом формируются в 2D-культуре, что ингибирует выделение двигательных единиц для анализа, ограничивает точные функциональные измерения и препятствует их использованию для повторных, систематических экспериментов13 . Трехмерные (3D) тканевые модели NMJ преодолевают многие из этих ограничений, повторяя морфологические и функциональные характеристики физиологических NMJ 7,14,15,16,17. Используя эту модель, два типа тканей разрабатываются отдельно, а затем интегрируются путем направления роста аксонов, что позволяет развиваться более организованным NMJ по сравнению с системами 2D-культур.

Наше предыдущее исследование показало, что сочетание оптогенетики с тканевой инженерией может обеспечить точную неинвазивную стимуляцию и оценку функции NMJ18,19. С помощью генной инженерии светочувствительные белки могут быть интегрированы в геном hiPSCs. Интеграция канала родопсина-2 (ChR2), ионного канала, который открывается в ответ на синий свет, в мембрану возбудимых клеток, таких как нейроны, позволяет осуществлять бесконтактный пространственно-временный контроль над активацией клеток 20,21,22. hiPSCs, несущие ChR2, могут быть дифференцированы в оптогенетические мотонейроны, чувствительные к синему свету, устраняя необходимость в типичных инвазивных электродах, которые стимулируют нейроны, и избегая нежелательной стимуляции мышечных клеток электродами23. Эта система использует оптогенетические мотонейроны для стимуляции сокращений в неоптогенетических клетках скелетных мышц. Сочетание сбора видео и контролируемого освещения синим светом позволяет одновременно стимулировать и записывать совместно культивируемые ткани для функции NMJ.

MG вызывается аутоантителами, нацеленными на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AChR), что приводит к снижению функции NMJ и мышечной слабости24. Он диагностируется на основе представленных симптомов, электродиагностики и обнаружения аутоантител с помощью серологических анализов крови. Тем не менее, не все аутоантитела, участвующие в МГ, были идентифицированы, и у некоторых серонегативных пациентов диагностируется МГ, но без признанных антител25,26. Наша система позволяет проводить повторную функциональную оценку NMJ до и после добавления сыворотки от пациентов с МГ, обеспечивая бесценную информацию о функциональных и биохимических изменениях, вызванных антителами MG18. Наш протокол иллюстрирует, как создавать 3D-модели in vitro функционального NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Мы демонстрируем универсальность системы на двух платформах: микрофлюидном устройстве и более крупной платформе биореактора с открытой скважиной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными руководящими принципами Колумбийского университета, Нью-Йорк, США.

1. Подготовка биореактора

  1. Изготовление форм для биореакторов
    1. Загрузите файл САПР биореактора из дополнительного файла САПР или создайте собственный дизайн.
    2. Сгенерируйте траекторию инструмента с ЧПУ из 3D-модели с помощью программного обеспечения CAM.
    3. Станок ацетальных форм с использованием фрезерного станка с ЧПУ.
  2. Изготовление биореакторов
    1. Смешайте основание 10:1 со смесью отверждающего агента полидиметилсилоксана (PDMS, 77 г смеси на 4 платформы/формы).
    2. Поместите смесь в вакуумную камеру, закройте все клапаны, включите вакуум и дегазируйте смесь не менее чем на 30 минут, пока не останутся пузырьки воздуха. Вылейте смесь в формы и дегазируйте формы в вакуумной камере в течение 1 ч.
    3. Закройте формы верхней половиной формы в правильной ориентации. Поместите стальной шестиугольный стержень по центру и зажмите с обеих сторон.
    4. Наполните верхнюю часть PDMS.
    5. Отверждайте формы в духовке с температурой 65 °C в течение не менее 4 ч.
    6. Снимите платформы с форм после охлаждения до комнатной температуры.
    7. Очистите устройства в ультразвуковой ванне, используя 1-часовой цикл мыла для посуды, 400 мл 100% изопропанола и дистиллированной воды.
    8. Сушить ночью при 65 °C.
    9. Замачивайте стеклянные крышки в 1% неионного поверхностно-активного полиола в течение 30 минут и убедитесь, что крышки не укладываются так, чтобы все они были должным образом покрыты.
    10. Хорошо промыть дистиллированной водой и высушить на ночь при температуре 65 °C.
    11. Используйте плазменный очиститель на высоком уровне с 6 л/мин кислорода в течение 1-2 мин для обработки стеклянных крышек и платформы PDMS. После обработки свяжите их вместе, прижав PDMS к крышке в течение не менее 30 с.
    12. Автоклавируйте связанные устройства перед добавлением ячеек.

2. Построение установки оптической стимуляции

  1. Используя 30-миллиметровую систему кубического сепаратора, прикрепите 573-нм дихроичное зеркало в центре. Соедините красный светодиод 627 нм с 594-нм фильтром возбуждения с длинными проходами и прикрепите его к верхней стороне куба, причем светодиод будет обращен к зеркалу. Затем прикрепите синий светодиод 488 нм с фильтром возбуждения коротких частот 546 нм к соседней стороне куба, причем светодиод будет обращен к зеркалу, как показано на схеме на рисунке 3A.
  2. Прикрепите диафрагму радужной оболочки с кольцевым приводом к нижней части куба клетки, чтобы контролировать размер освещенной области.
  3. Питание каждого светодиода с помощью светодиодного драйвера T-Cube и управление с помощью платы Arduino Uno Rev3. Подключите боковой вход светодиодного драйвера к разъему источника питания, подключите средний выход к Arduino и подключите боковой выход непосредственно к светодиодам.
  4. Подключите Arduino Uno к ПК с помощью USB-кабеля.
  5. Загрузка файлов по ссылке GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Откройте файл "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" из папки GitHub.
  7. Установка начальных параметров: Шагов = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseДлинь = 100.
  8. Убедитесь, что контактный выход 4 назначен драйверу синего светодиода, а контактный выход 2 назначен драйверу красного светодиода. Убедитесь, что средние провода светодиодного драйвера подключены к земле и к соответствующему выводу.
  9. Скомпилируйте и загрузите программу "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" в Arduino.
  10. Подключите каждый светодиодный драйвер к соответствующему каналу.

3. Настройка клеточной культуры (день -21-0)

  1. Первичные клетки скелетных мышц
    1. Разморозить и расширить первичные скелетные миобласты (полученные из миозита Кука) максимум на шесть проходов с использованием миотонической питательной среды (+ добавка). Поддерживайте ячейки в инкубаторе, установленные на 37 °C и 5% CO2.
    2. Меняйте носитель каждые 2 дня.
    3. Как только клетки станут около 60% сливающимися, пройдите их с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА (1x, в течение 5 мин при 37 °C). Соберите диссоциированные клетки и добавьте свежие среды, чтобы нейтрализовать трипсин.
    4. Раскрутите клетки при 300 x g и аспирируйте супернатант над клеточной гранулой.
    5. Повторно суспендировать клетки с MGM и семенами 1:3 с 60 мл на трехслойную колбу.
  2. ChR2-hiPSC
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными руководящими принципами Колумбийского университета, Нью-Йорк, США. В этом протоколе ChR2-экспрессирующие hiPSCs генерировались с помощью редактирования генома CRISPR-Cas9 с использованием ранее описанных методов18, но любые стабильные оптогенетические клеточные линии (лентивирусные, piggyBac и т. д.) могут быть использованы таким же образом. Были выбраны конститутивные промоторы, выраженные как в иПСК, так и в мотонейронах (CAG). Было обнаружено, что клетки имеют здоровый кариотип, как отмечалось в предыдущих публикациях18,19.
    1. Покрыть 6-луночные пластины 1 мл/лунку солюбилизированной базальной мембранной матрицей, разведенной в DMEM/F12 (1:80), и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 1 ч.
    2. Посевные иПСК на покрытых 6-луночными пластинами с 2 мл питательной клеточной культуральной среды (iPSC среды), обменивая 2 мл среды через день и проходя каждые 5-7 дней. Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO2.
    3. Пассаж
      1. Диссоциируют стволовые клетки путем инкубации с 1 мл безферментного реагента, высвобождающего реагент в течение 4 мин и механической резки с широким наконечником пипетки P1000.
      2. Семенные клетки в соотношении 1:24 или 1:48 в среде iPSC с 2 мкМ дигидрохлорида Y-27632 в 2 мл/лунку на покрытых 6-луночными пластинами.

4. Посев скелетно-мышечной ткани (день -3)

  1. Изолируйте и подсчитайте 30 х 106 миобластов с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  2. Повторно суспендировать миобласты в смеси 4:1 3 мг/мл коллагена I и солюбилизированной базальной мембранной матрицы (800 мкл коллагеновой смеси + 200 мкл матрицы базальной мембраны для достижения конечного объема 1 мл). Для коллагенового компонента добавляют сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена 9:1 с нейтрализующим агентом) и разбавляют смесь 1x PBS для достижения объема 800 мкл.
  3. Добавьте 15 мкл клеточно-коллагеновой суспензии в каждую мышечную камеру биореактора, обязательно распределив суспензию по обеим стойкам с помощью кончика пипетки (рисунок 2).
  4. Дайте клеточно-гелевой смеси полимеризоваться при 37 °C в течение 30 мин, а затем наполните каждый биореактор 450 мкл миотонической питательной среды.
  5. Через 3 дня (как только гель уплотнится) начинают дифференцировку миотубей.

5. Дифференциация миотубей (дни 0-14)

  1. Начинают инфузию миотубов с переключения тканей на 450 мкл индуцирующих слияние сред (ФС, табл. 1) в течение 7 дней, меняя носители через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте начать дифференцировку миотубов в тот же день, что и дифференцировку мотонейрона от hiPSCs, чтобы посеять мотонейроны в конце графиков дифференцировки обоих типов клеток.
  2. На 7 день изменяют носитель до 450 мкл среды созревания Ia (MMIa, табл. 1).
  3. На 9 день изменяют на 450 мкл среды созревания Ib (MMIb, табл. 1).
  4. На 11 день измените носитель на 450 мкл NbActiv4. Продолжайте менять носитель каждые 2 дня, пока мотонейроны не будут посеяны (шаг 7).

6. Дифференциация мотонейрона (дни 0-14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Наш протокол дифференциации мотонейронов был адаптирован из Maury et al8.

  1. На 0 день перенесите 4 x 106 ChR2-hiPSCs в чашку Петри со сверхнизким насадкой с 15 мл питательной среды суспензии мотонейрона (MSCM, таблица 1). Добавка MSCM содержит 3 мкМ ГИДРАТА CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 5 мкМ Y-27632 дигидрохлорида.
  2. На 2-й день выделяют невросферы (НС) с помощью обратимого сетчатого фильтра 37 мкМ и перекладывают в 15 мл MSCM с 3 мкМ CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты. NS должен быть виден в чашке Петри без использования микроскопа после 2-го дня.
  3. На 4 день перенесите клетки и среды в трубку объемом 50 мл и дайте невросферам осесть на дно (5 мин). Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 15 мл MSCM, дополненных 0,5 мкМ SAG, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431541 и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
  4. На 7-й день повторите Шаг 6.3. но повторно суспендируют клетки в 15 мл MSCM, дополненных 0,5 мкМ SAG и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
  5. На 9-й день повторите Шаг 6.3. но повторное суспендирование клеток в 15 мл MSCM, дополненных 10 мкМ DAPT.
  6. На 11-й день повторите Шаг 6.3. но повторно суспендировать клетки в 15 мл MSCM, дополненных 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
  7. На 14-й день посейте мотонейроны в платформу.

7. Посев агрегатов мотонейронов в биореакторе (день 14)

  1. Приготовьте гелевую смесь 4:1 из 2 мг/мл коллагена I и матригеля (800 мкл коллагеновой смеси + 200 мкл матригеля для достижения конечного объема 1 мл). Для коллагенового компонента добавьте сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена 9:1 с нейтрализующим агентом) и разбавьте смесь 1x PBS для достижения конечного объема 800 мкл.
  2. Используйте клеточный ситечко 400 нм для выбора больших невросфер и повторного суспендирования их в гелевой смеси.
  3. Аспирировать среды из резервуара и осторожно из невросферного колодца (рисунок 2).
  4. Добавьте 15 мкл гелевой смеси в канал невросферы.
  5. Загрузите пипетку объемом 10 мкл с 10 мкл геля, а затем выберите одну невросферу.
  6. Поместите NS в канал нейросферы и убедитесь, что NS находится в камере. Медленно поднимите пипетку, высвобождая оставшийся гель после осаждения NS. Если вы не уверены, что НС был правильно депонирован, проверьте его местоположение с помощью микроскопа.
  7. Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин при 37 °C.
  8. Добавьте в резервуары 450 мкл NbActiv4 с добавлением 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
  9. Меняйте среду через день, чтобы обеспечить рост аксонов от NS до мышечной ткани.

8. Одновременная оптическая стимуляция и видеозапись функции NMJ (день 24+)

  1. Для визуализации используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп с научной комплементарной камерой металл-оксид-полупроводник (sCMOS).
  2. Установите программное обеспечение камеры на 2x2, экспозицию до 20 мс, скользящий затвор вкл., частоту считывания до 540 МГц, динамический диапазон: 12-битный и коэффициент усиления 1 и режим датчика: перекрытие.
  3. Используйте 2x объектив на микроскопе, чтобы получить изображение микроткани.
  4. Прикрепите камеру живых клеток (37 °C, 5% CO2) к ступени микроскопа.
  5. Выберите интересующую область (ROI), содержащую иннервированную ткань скелетных тканей, чтобы свести к минимуму размер файла и время обработки.
  6. Поместите длинночастотный эмиссионный фильтр 594 нм между образцом и объективом изображения, чтобы отфильтровать импульсы синего света от камеры.
  7. Поместите прямоугольную 4-луночную пластину, содержащую 4 биореактора (24 ткани), в камеру живых клеток.
  8. Щелкните Интерактивный просмотр. Центрируйте и фокусируйте изображение с желаемой рентабельностью инвестиций.
  9. Загрузите пользовательский код макроса из папки GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis), чтобы управлять положением сцены, платой Arduino и сбором видео.
  10. Установите выходной фильм как: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Запустите макрокод с заданными на сцене координатами X,Y и получите быстрый таймлапс с 1700 кадрами со скоростью 50 кадров/с.
  12. Замените носитель после визуализации и верните образцы в инкубатор. Подождите не менее 24 часов между сеансами получения изображения, чтобы избежать усталости тканей.

9. Пакетная обработка и анализ (день 24+)

  1. Обработка фильмов
    1. Используйте пользовательский код MATLAB для обработки видео в пакетном анализе. Файлы можно загрузить из папки GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Функции перечислены и объяснены в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Код совместим с форматами .nd2 и .czi. Он требует параллельной обработки для активации в MATLAB и нуждается в пакете биоформатов.
    2. Запустите скрипт рекурсивного анализаOSAnalysis для анализа фильмов с помощью параллельной обработки. Поместите все полученные видео в одну папку и выберите эту папку при выполнении кода.
    3. При необходимости настройте параметры постанализа.
      1. Изменить baselineTime (вариант 1), если спонтанное сокращение улавливается в начале записи. Это покажет начальное считывание выше 0 и потребует смещения кадра для компенсации.
      2. Измените peakThreshold (вариант 2), если сокращения не регистрируются. Код обнаружит сокращения, которые по умолчанию превышают 25% от самого высокого пика, так что это значение можно изменить.
      3. Измените minMinProminence и minMinWidth , чтобы настроить чувствительность при обнаружении начала каждого пика.
    4. Создавайте видео- и графовые выходные данные.
      1. Запустите рекурсивныйOSMovie, чтобы создать видеофайл для каждой ткани с соответствующей трассировкой сократимости.

10. Возмущение функции NMJ (день 24+)

  1. Подготовьте лечебные среды, добавив внешний эффектор к базальным средам NbActiv4, дополненным 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
    1. Для эксперимента с сыворотками МГ используйте 20% МГ сывороток пациента в NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Для эксперимента BTX используйте 5 мкг/мл BTX в NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Стимуляция/изображение с помощью Шага 3.2. , чтобы записать базовый уровень.
  3. Заменить среду в тканях лечебной средой (450 мкл/ткань).
  4. Инкубировать в течение нужного времени (48 ч для сыворотки пациента, 20 мин для BTX).
  5. Снова стимулируйте/создавайте изображение с помощью Шага 3.2. записывать функцию после лечения.
  6. Удалите лечебные среды и дайте тканям отдохнуть в течение нужного времени (48 ч после удаления сывороток)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите не менее 24 часов между стимуляцией и визуализацией, чтобы избежать усталости тканей

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Нервно-мышечные соединения были получены путем совместного культивирования оптогенетических мотонейронов, полученных из hiPSC, с неоптогенетической скелетной мышечной тканью. Первичные скелетные миобласты человека (SkM) были засеяны в платформы и дифференцированы в многоядерные миотрубы с использованием 2-недельного протокола. Оптогенетические мотонейроны дифференцировали отдельно, но параллельно с дифференциацией миотруб, а затем засеивали в платформу (рисунок 1). Ткани начали сокращаться в ответ на стимуляцию синим светом через 7-12 дней после посева MN, что указывает на успешное развитие и созревание NMJ. NMJ можно культивировать, стимулировать и визуализировать в течение 40 дней после посева мотонейрона, но оптимальный момент времени наступает на16-19-й день. Морфологическая и биохимическая валидация дифференцировок и присутствия оптогенетических белков показана на дополнительном рисунке 1 и подтверждена в предыдущих исследованиях18,19.

Чтобы продемонстрировать, что протокол может быть легко адаптирован к различным системам культивирования, стратегия была опробована с использованием двух различных компартментированных реакторов: микрофлюидного устройства и биореактора с открытой скважиной. Обе системы имеют схожую конструкцию, с одной камерой, снабженной столбами для генерации скелетных мышечных тканей, и второй камерой для культуры 3D-мотонейронных агрегатов, которые могут расширять аксоны для иннервации скелетных тканей (рисунок 2A, B). Тем не менее, эти две системы имеют разные масштабы, причем микрофлюидное устройство дает скелетные мышечные ткани длиной 1 мм, включающие примерно 20 000 миобластов (рисунок 2C), и систему биореактора с открытым отверстием, в результате чего мышечные ткани длиной 4 мм, содержащие примерно 450 000 миобластов (рисунок 2D).

Чтобы обеспечить контролируемую стимуляцию оптогенетических NMJ, была построена оптическая установка, состоящая из красного светодиода 637 нм для яркого освещения поля, синего светодиода 488 нм для активации ChR2-MNs и фильтра синего света между образцом ткани и объективом, чтобы предотвратить вмешательство синего света в анализ изображения (рисунок 3A). Светодиоды питались от светодиодных драйверов и управлялись точно через микропроцессор Arduino. Функция NMJ оценивалась путем одновременного получения покадровых видео при стимуляции МН синим светом с помощью пользовательского макроскрипта микроскопа в паре с кодом Arduino (рисунок 3B). Протокол увеличил частоту стимуляции с 0,2 Гц до 2 Гц за 30 шагов. После того, как пленки были получены, функция ткани была проанализирована с использованием пользовательского пакета MATLAB (рисунок 3C). Анализ измерял смещение тканей, генерировал след сократимости и синхронизировал его с протоколом световой стимуляции. Затем он определил долю эффективных импульсов (F) и ожидаемую долю эффективных импульсов (E) для учета потенциальных нестимулированных сокращений. Ожидаемая фракция (E) была рассчитана как доля импульсов, которые были бы помечены как эффективные, если бы сокращения были случайным образом распределены в пределах 30 с. Затем оценка ткани была рассчитана как (F-E)/(1-E), со значением от 0 до 1 (рисунок 3C). Код определяет, инициируется ли сокращение, основываясь на времени между световым импульсом и началом пика сократимости, как показано на рисунке 3D. Этот автоматизированный, непредвзятый метод позволяет повторно характеризовать функцию NMJ в больших размерах выборки и с течением времени. Код включает настраиваемые параметры, которые могут быть скорректированы после обработки для обеспечения правильной оценки (дополнительный рисунок 2).

Способность системы количественно характеризовать функцию NMJ с течением времени была продемонстрирована путем визуализации группы тканей в течение 11 дней (с 9-го по 20-й день после посева мотонейрона). Система зафиксировала улучшение функции NMJ в тканях, показав увеличение триггерных реакций через 1 неделю после изготовления тканей (рисунок 4A), за которым следовала стабильная функция в течение дополнительной недели (рисунок 4B). Чтобы убедиться, что стимуляция мышц происходила через NMJ, другая группа тканей была проанализирована до и после 20 мин инкубации с 5 мкг / мл нейротоксина α-бунгаротоксина (BTX), который специфически и необратимо связывается с рецепторами ацетилхолина. BTX остановил все спровоцированные и спонтанные сокращения, привел к полному нарушению функции NMJ и продемонстрировал, что световая стимуляция тканей требует функционального NMJ (рисунок 4C, D). Серийные разбавления BTX были первоначально протестированы для определения оптимальной концентрации BTX (результаты не показаны).

Чтобы оценить трансляционную способность системы, функцию NMJ оценивали до и после добавления сыворотки у пяти пациентов с миастенией. Анализ тканей, получавших 20% МГ сыворотки в течение 48 ч, показал снижение функции по сравнению с контрольными тканями, обработанными сывороткой от здоровых доноров (Рисунок 4E,F). Инженерные NMJ также были снова оценены через 48 ч после удаления и вымывания сыворотки и показали восстановление функции (рисунок 4F). Кроме того, были протестированы увеличивающиеся концентрации сыворотки пациента и нормальный контроль сыворотки крови человека (5%, 20%, 40%) для выявления оптимальной концентрации, которая влияет на функцию тканей. Результаты показали способность системы характеризовать и количественно оценивать функцию NMJ и моделировать миастению in vitro.

Figure 1
Рисунок 1. Экспериментальный дизайн и временная шкала. Сроки (дни) дифференциации и посева в платформы. SkM = скелетные мышцы, ChR2 = оптогенетические мотонейроны, NMJ = нервно-мышечное соединение. Эта цифра была изменена с разрешения Vila et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Кокультурные системы для генерации 3D NMJ. (A) Схема микрофлюидной платформы. (B) Схема открытого биореактора PDMS. (C) Иннервированная скелетная мышечная ткань в микрофлюидной платформе. (D) Иннервируемая ткань в открытом биореакторе. Шкала стержня 0,5 мм. Эта цифра была изменена с разрешения Vila et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Стимуляция, запись и анализ функции NMJ. (A) Схема установки светодиода и светового контура. (B) Оптическая установка с инвертированным микроскопом, камерой живых клеток, автоматизированной сценой и камерой sCMOS. (C) Алгоритм пакетной обработки видео оптической стимуляции культур NMJ. (D) Репрезентативный кадр видео, сгенерированного кодом MATLAB, и соответствующий график трассировки сократимости. Мигающее синее поле на видео и вертикальные линии на графике указывают, когда происходит стимуляция синим светом. Эта цифра была изменена с разрешения Vila et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Функция NMJ. (A) След сократимости для 3D-инженерных NMJ человека. (B) Оценка NMJ в ответ на свет, показывающая улучшение функции в течение 11 дней (n = 47, односторонняя ANOVA p = 1 x 10-8). Погрешности = SEM. (C) След сократимости после 20 мин лечения 5 мг/мл нейротоксина α-бунгаротоксина (BTX). (D) Количественная оценка функции NMJ (оценка) до и после лечения BTX (n = 6; односторонняя ANOVA F = 9 x 10-8). (Е) Сократимость следов тканей с 20% МГ сывороток после 48 ч лечения. (F) Оценка функции NMJ для обработанных и контрольных групп до и после лечения и после выздоровления (n = 12; после лечения пост-hoc ANOVA F = 0,0002; *указывает p = 0,0015 ** указывает на p = 3,5 x10−6) (MG = Myasthenia Gravis; NHS = нормальная сыворотка человека). n указывает на количество биологических реплик. Эта цифра была изменена с разрешения Vila et al.18,19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Миогенные и нейронные среды. Организован список факторов роста и добавок для СМИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2. Список функций MATLAB. Краткие пояснения к функциям MATLAB, используемым для анализа изображений. Эта таблица была изменена с разрешения Vila et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительные файлы

Дополнительный рисунок 1. Дифференциация миотубе и мотонейрона. (A) Протокол дифференциации миотубов (MM = среда созревания). (B) Иммунофлуоресцентные (IF) изображения, показывающие экспрессию маркеров скелетных мышц миозина тяжелой цепи (MHC), α-актинина и десмина в дифференцированных миотубах. (C) Протокол дифференциации мотонейрона. (D) Локализация каналродопсина-2 с YFP (ChR2-YFP) на мембрану в оптогенетических ИПСК и (E) МН, подтверждающих успешную инфекцию. (F) Коэкспрессия холинацетилтрансферазы (ChAT, красный) и ChR2 (зеленый) в оптогенетических МН. Шкала баров 100 мкм. Воспроизводится с разрешения Vila et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Неправильная обработка, требующая корректировки параметров. (A) Неправильное базовое время приводит к пикам неправильной формы. (B) Слишком высокий пиковый порог приводит к тому, что пики остаются незамеченными. (C) Слишком мягкие условия для обнаружения минимумов (т.е. слишком низкие значения, выбранные для minMinProminence и/или minMinWidth) приводят к тому, что минимумы маркируются в середине или даже в верхней части пиков, поэтому считаются "нетронутыми", поскольку они начинаются слишком далеко от предыдущего светового импульса. (D) Слишком строгие условия для обнаружения минимумов приводят к тому, что начало пика маркируется до светового импульса или даже отсутствует, как в этом примере. Воспроизводится с разрешения Vila et al.18. Файл, показывающий 3D-модель платформы биореактора, которая может быть отредактирована и экспортирована для изготовления пресс-форм для производства биореакторов с использованием PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Дополнительный файл САПР. Файл, показывающий 3D-модель платформы биореактора, которая может быть отредактирована и экспортирована для изготовления пресс-форм для производства биореакторов с использованием PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта система представляет собой инженерную 3D-модель тканей человека, которая сочетает в себе оптогенетику и обработку видео, чтобы обеспечить автоматизированную и непредвзятую оценку функции NMJ. Используя стандартизированный протокол, мы продемонстрировали способность измерять изменения функции NMJ во время физиологического развития и характеризовать повреждающие эффекты таких патологий, как воздействие нейротоксинов и миастения сывороток пациента.

В предыдущих исследованиях сообщалось о способности моделировать MG с оптогенетическими мотонейронами, полученными из hPSC, в совместной культуре со скелетными миотрубами с использованием сывороток пациента с MGsera 22. Однако система находилась в 2D и регистрировала сокращения в случайных местах, тем самым ограничивая воспроизводимость и уменьшая количественную способность модели. Одним из самых больших преимуществ нашей системы по сравнению с 2D-системой является то, что она позволяет нам эмулировать 3D-среду, что более точно облегчает клеточное и морфологическое развитие между МН и SkMs. Существует множество доказательств того, что биомеханические сигналы, необходимые для того, чтобы ткань вела себя как ее родная физиология, превосходно имитируются в 3D-системе 13,14,15,16. Кроме того, различные аспекты 3D-системы обеспечивают более контролируемую среду: направленное формирование синапсов, меньшую гетерогенность между образцами, повышенный пространственно-временной контроль стимуляции с помощью оптогенетики и автоматизированную высокопроизводительную систему, которая снижает субъективность анализа каждого образца.

Разработанная система может быть использована для моделирования других нервно-мышечных заболеваний (НМД), таких как боковой амиотрофический склероз (БАС), мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) и другие. Хотя патофизиология БАС включает в себя дисфункцию самого двигательного нейрона, а не нервно-мышечного соединения 17,27, наша система обладает способностью повторять болезненное состояние БАС, показывая уменьшенное сокращение мышц после дегенерации или повреждения нейронов. МДД является мышечным дегенеративным заболеванием, вызванным недостатком белка дистрофина, что приводит к мышечной слабости и возможной дегенерации28. Система может моделировать МДД, включая генетически модифицированные скелетные мышцы, которые несут ингибитор дистрофина или больные мышечные клетки, в которых отсутствует дистрофин. В целом, система обладает гибкостью и мощностью для рекапитуляции различных NMD в 3D-платформе in vitro.

Для протокола, который требует различных источников клеток, каждый из которых имеет определенные уровни слияния, одним из наиболее важных аспектов является время. Во время расширения первичных клеток скелетных мышц важно не допустить, чтобы они стали слишком сливающимися (65%-70%) из-за слияния. Иногда, даже при использовании трипсина для разрушения сгустков, было замечено, что это приводит к снижению эффективности посева в биореакторы. Другим важным аспектом является производство платформы биореактора с открытыми скважинами. Чтобы повысить однородность среди платформ PDMS, количество времени, которое они проводят в печи, должно быть одинаковым на всех платформах, чтобы избежать каких-либо колебаний механических свойств стоек платформы. Кроме того, во время посева мышечных клеток в реакторы, чтобы сохранить постоянство плотности посева, разумно осторожно вращать трубку (1-1,5 с) между каждыми двумя-тремя отсеками внутри биореакторов. Наконец, было замечено, что успешность развития NMJ в значительной степени зависит от успеха посева мотонейронов, поскольку добавление невросфер настолько деликатно и варьируется от человека к человеку. С практикой посева показатель успеха увеличивается, что позволяет стимулировать и ображать около 90% инициированных культур.

В настоящее время некоторые ограничения, которые могут быть устранены в ближайшем будущем, - это включение и валидация оптогенетических белков, отличных от обсуждаемого ChR2. Специфический контроль над типами клеток и оптогенетическими датчиками для визуализации напряжения / кальция или мышечного метаболизма может быть добавлен в систему для увеличения показаний и анализа. Поскольку синий свет индуцирует фототоксичность в высоких дозах, режим стимуляции был ограничен 30 с. Этот эффект может быть смягчен путем включения красного смещенного каналоподопсина для более длительных исследований стимуляции. Кроме того, еще одним ограничением, которое может быть улучшено в будущих итерациях модели, является отсутствие нейронных поддерживающих клеток, таких как клетки Шванна. Универсальность этой платформы и кода анализа, однако, позволяет включать различные оптогенетические конструкции и типы клеток. В то время как наша линия ChR2-hiPSC была создана с использованием CRISPR, другие методы могут быть использованы для реализации оптогенетического ответа в hiPSCs. Кроме того, благодаря адаптивности hiPSCs модель NMJ может быть разработана из одного клеточного источника, что позволяет использовать специфические для пациента модели для дальнейшего изучения нервно-мышечных заболеваний18.

Эта платформа обеспечивает повторный, автоматизированный и непредвзятый анализ функции NMJ человека с течением времени и может обнаруживать количественные изменения в функции из-за внешних эффекторов, таких как нейротоксины или сыворотка пациента MG. В целом, наша 3D-система позволяет исследовать функцию NMJ человека на ранних стадиях патологии заболевания, предоставляет возможность для скрининга лекарств и закладывает основу для надежной системы для продвижения точной медицины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку со стороны NIH [номера грантов EB025765 и EB027062], DOD [номер награды W81XWH-18-1-0095] и UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Мы с благодарностью благодарим Columbia University Stem Cell Core за их помощь и руководство по перепрограммированию клеток.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Tags

Биоинженерия выпуск 182
Разработка и характеристика оптогенетической модели нервно-мышечного соединения человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter