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Bioengineering

Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.

Abstract

Molte malattie neuromuscolari, come la miastenia grave (MG), sono associate a disfunzione della giunzione neuromuscolare (NMJ), che è difficile da caratterizzare nei modelli animali a causa delle differenze fisiologiche tra animali e umani. L'ingegneria tissutale offre l'opportunità di fornire modelli in vitro di NMJ umani funzionali che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Incorporando proteine optogenetiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), abbiamo generato neuroni che possono essere stimolati con specifiche lunghezze d'onda della luce. Se l'NMJ è sano e funzionale, un segnale neurochimico dal motoneurone provoca la contrazione muscolare. Attraverso l'integrazione dell'optogenetica e della microfabbricazione con l'ingegneria tissutale, abbiamo stabilito una metodologia imparziale e automatizzata per caratterizzare la funzione NMJ utilizzando l'analisi video. È stato sviluppato un protocollo standardizzato per la formazione di NMJ, la stimolazione ottica con registrazione video simultanea e l'analisi video della contrattilità tissutale. La stimolazione dei motoneuroni optogenetici da parte della luce per indurre contrazioni muscolari scheletriche ricapitola la fisiologia NMJ umana e consente ripetute misurazioni funzionali di NMJ nel tempo e in risposta a vari input. Dimostriamo la capacità di questa piattaforma di mostrare miglioramenti funzionali nella connettività neuromuscolare nel tempo e caratterizzare gli effetti dannosi degli anticorpi MG del paziente o delle neurotossine sulla funzione NMJ.

Introduction

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi chimica tra motoneuroni (MN) e cellule muscolari scheletriche (SkM) che consente la contrazione muscolare. Le tossine, come la neurotossina α-bungarotossina (BTX), o le malattie neuromuscolari (NMD) come la miastenia grave (MG) possono portare alla degenerazione del NMJ e alla riduzione del controllo muscolare1. I modelli di tessuto umano bioingegnerizzati ricapitolano meglio i meccanismi funzionali e fisiologici degli NMJ umani e offrono un maggiore potenziale traslazionale rispetto ai modelli animali.

Mentre i modelli animali hanno avanzato la comprensione della formazione e della funzione del NMJ, ci sono differenze significative tra sinapsi umane e animali che limitano la traduzione dei risultati all'uomo e rendono la caratterizzazione in vivo del NMJ impegnativo 2,3,4. Gli studi hanno mostrato differenze fisiologiche distinte tra NMJ di topo e umani. I topi hanno NMJ più grandi e densità di zone attive più piccole rispetto agli NMJ umani4. Inoltre, gli studi farmacologici condotti su modelli animali non sempre riflettono gli effetti riscontrati negli studi clinici sull'uomo. I modelli di tessuto umano ingegnerizzati offrono l'opportunità di studiare lo sviluppo sano del NMJ e la patologia delle malattie neuromuscolari e consentono screening farmacologici. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs)5 possono essere differenziate in una varietà di tipi di cellule, comprese le cellule muscolari scheletriche 6,7 e i motoneuroni 8,9. Le hiPSC possono essere generate facilmente dalle cellule del paziente, consentendo una migliore modellazione della malattia10 e lo screening farmacologico 11,12 attraverso modelli tissutali specifici per il paziente.

Le co-colture monostrato bidimensionali (2D) di SkM e MN mancano della morfologia, del fenotipo, dell'organizzazione e del comportamento funzionale degli NMJ fisiologici. Gli NMJ si formano casualmente in coltura 2D, il che inibisce l'isolamento delle unità motorie per l'analisi, limita le misurazioni funzionali accurate e ne impedisce l'uso per esperimenti ripetuti e sistematici13 . I modelli tissutali tridimensionali (3D) di NMJ superano molte di queste limitazioni, ricapitolando le caratteristiche morfologiche e funzionali delle NMJ fisiologiche 7,14,15,16,17. Utilizzando questo modello, i due tipi di tessuto vengono sviluppati separatamente e quindi integrati dirigendo la crescita assonale, consentendo lo sviluppo di NMJ più organizzati rispetto ai sistemi di coltura 2D.

Il nostro studio precedente ha dimostrato che la combinazione di optogenetica con l'ingegneria tissutale può consentire un'accurata stimolazione non invasiva e la valutazione della funzione NMJ18,19. Attraverso l'ingegneria genetica, le proteine sensibili alla luce possono essere integrate nel genoma delle hiPSC. L'integrazione di channelrhodopsin-2 (ChR2), un canale ionico che si apre in risposta alla luce blu, nella membrana di cellule eccitabili come i neuroni consente il controllo spaziotemporale senza contatto sull'attivazione cellulare 20,21,22. Le hiPSC che trasportano ChR2 possono essere differenziate in motoneuroni optogenetici sensibili alla luce blu, eliminando la necessità di elettrodi invasivi tipici che stimolano i neuroni ed evitando la stimolazione indesiderata delle cellule muscolari da parte degli elettrodi23. Questo sistema utilizza motoneuroni optogenetici per stimolare le contrazioni nelle cellule muscolari scheletriche non optogenetiche. La combinazione di acquisizione video e illuminazione controllata della luce blu consente di stimolare e registrare simultaneamente i tessuti co-coltivati per la funzione NMJ.

MG è causato da autoanticorpi che prendono di mira i recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR), che si traduce in diminuzione della funzione NMJ e debolezza muscolare24. Viene diagnosticata in base ai sintomi presentati, all'elettrodiagnosi e al rilevamento di autoanticorpi tramite esami del sangue sierologici. Tuttavia, non tutti gli autoanticorpi coinvolti nella MG sono stati identificati e ad alcuni pazienti sieronegativi viene diagnosticata la MG ma senza anticorpi riconosciuti25,26. Il nostro sistema consente una valutazione funzionale ripetuta dell'NMJ prima e dopo l'aggiunta di siero da pazienti con MG, fornendo preziose informazioni sui cambiamenti funzionali e biochimici causati dagli anticorpi MG18. Il nostro protocollo illustra come produrre modelli 3D in vitro di NMJ umano funzionale che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Dimostriamo la versatilità del sistema in due piattaforme, un dispositivo microfluidico e una più grande piattaforma di bioreattore a pozzo aperto.

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Protocol

Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA.

1. Preparazione del bioreattore

  1. Realizzare stampi per bioreattori
    1. Scaricare un file CAD del bioreattore dal file CAD supplementare o creare un progetto personalizzato.
    2. Generare un percorso utensile CNC dal modello 3D utilizzando il software CAM.
    3. Macchina stampi acetali utilizzando una fresatrice CNC.
  2. Fabbricazione di bioreattori
    1. Mescolare una base 10:1 alla miscela di agenti polimerizzanti di polidimetilsilossano (PDMS, 77 g di miscela per 4 piattaforme/stampi).
    2. Posizionare la miscela in una camera a vuoto, chiudere tutte le valvole, accendere il vuoto e degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare la miscela in stampi e degassare gli stampi nella camera a vuoto per 1 ora.
    3. Chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nell'orientamento corretto. Posizionare un'asta esagonale in acciaio sopra il centro e bloccare su entrambi i lati.
    4. Riempi la parte superiore con PDMS.
    5. Polimerizzare gli stampi in forno a 65 °C per almeno 4 ore.
    6. Rimuovere le piattaforme dagli stampi dopo il raffreddamento a temperatura ambiente.
    7. Pulire i dispositivi in un bagno ad ultrasuoni utilizzando cicli di 1 ora di sapone per i piatti, 400 ml di isopropanolo al 100% e acqua distillata.
    8. Asciugare durante la notte a 65 °C.
    9. Immergere le coperture in vetro in poliolo tensioattivo non ionico all'1% per 30 minuti e assicurarsi che le coperture non si impilano in modo che siano tutte adeguatamente rivestite.
    10. Risciacquare bene con acqua distillata e asciugare per una notte a 65 °C.
    11. Utilizzare un detergente al plasma in alto con 6 L / min di ossigeno per 1-2 minuti per trattare i coperchi di vetro e la piattaforma PDMS. Una volta trattati, legare i due insieme premendo il PDMS verso il basso sulla coverslip per almeno 30 s.
    12. Autoclave dei dispositivi incollati prima di aggiungere celle.

2. Costruire una configurazione di stimolazione ottica

  1. Utilizzando un sistema a cubo a gabbia da 30 mm, collegare uno specchio dicroico da 573 nm al centro. Accoppia un LED rosso da 627 nm con un filtro di eccitazione a lungo passaggio da 594 nm e collegalo al lato superiore del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio. Quindi collegare un LED blu da 488 nm con un filtro di eccitazione a passaggio corto da 546 nm sul lato adiacente del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio come mostrato nello schema nella Figura 3A.
  2. Attaccare un diaframma dell'iride azionato ad anello sul fondo del cubo della gabbia per controllare le dimensioni dell'area illuminata.
  3. Alimenta ogni LED da un driver LED T-Cube e controllalo tramite una scheda Arduino Uno Rev3. Collegare l'ingresso laterale del driver LED a una spina della fonte di alimentazione, collegare l'uscita centrale ad Arduino e collegare l'uscita laterale direttamente ai LED.
  4. Collegare Arduino Uno ad un PC tramite un cavo USB.
  5. Scaricare file dal collegamento GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Apri il file "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dalla cartella GitHub.
  7. Impostare i parametri di partenza: Passi = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. Assicurarsi che l'uscita pin 4 sia assegnata al driver LED blu e che l'uscita pin 2 sia assegnata al driver LED rosso. Verificare che i fili centrali del driver LED siano collegati a terra e alla rispettiva uscita pin.
  9. Compila e carica il programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" su Arduino.
  10. Collegare ogni driver LED al canale corrispondente.

3. Configurazione della coltura cellulare (giorno -21-0)

  1. Cellule muscolari scheletriche primarie
    1. Scongelare ed espandere i mioblasti scheletrici primari (ottenuti da Cook Myosite) per un massimo di sei passaggi utilizzando il mezzo di crescita miotonico (+ supplemento). Mantenere le celle in un incubatore impostato a 37 °C e 5% CO2.
    2. Cambia i media ogni 2 giorni.
    3. Una volta che le cellule sono confluenti per circa il 60%, passarle usando lo 0,05% di tripsina-EDTA (1x, per 5 minuti a 37 °C). Raccogliere le cellule dissociate e aggiungere nuovi mezzi per neutralizzare la tripsina.
    4. Abbassare le cellule a 300 x g e aspirare il surnatante sopra il pellet cellulare.
    5. Risospese le cellule con MGM e seme 1:3 con 60 ml per pallone a triplo strato.
  2. ChR2-hiPSC
    NOTA: Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA. In questo protocollo, le hiPSC che esprimono ChR2 sono state generate tramite l'editing del genoma CRISPR-Cas9 utilizzando i metodi precedentemente descritti18, ma qualsiasi linea cellulare optogenetica stabile (lentivirale, piggyBac, ecc.) può essere utilizzata allo stesso modo. Sono stati scelti promotori costitutivi espressi sia in iPSC che in motoneuroni (CAG). Le cellule sono risultate avere cariotipo sano, come notato in precedenti pubblicazioni 18,19.
    1. Rivestire piastre a 6 pozzetti con 1 mL/pozzetto di matrice di membrana basale solubilizzata diluita in DMEM/F12 (1:80) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Semina iPSC su piastre rivestite a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di coltura cellulare privo di alimentatore (iPSC media), scambiando 2 mL di media a giorni alterni e passando ogni 5-7 giorni. Mantenere le cellule in un incubatore impostato a 37 ° C e 5% CO2.
    3. Passaggio
      1. Dissociare le cellule staminali incubando con 1 mL di reagente rilasciando cellule staminali prive di enzimi per 4 minuti e tagliando meccanicamente con una pipetta P1000 a punta larga.
      2. Cellule di semi in un rapporto di 1:24 o 1:48 in mezzi iPSC con 2 μM di dicloridrato Y-27632 in 2 ml/pozzetto su piastre rivestite a 6 pozzetti.

4. Semina del tessuto muscolare scheletrico (giorno -3)

  1. Isolare e contare 30 x 106 mioblasti utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
  2. Sospendere i mioblasti in una miscela 4:1 di 3 mg/mL di collagene I e matrice solubilizzata della membrana basale (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di matrice di membrana basale per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume di 800 μL.
  3. Aggiungere 15 μL di sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta (Figura 2).
  4. Lasciare polimerizzare la miscela cellula-gel a 37 °C per 30 minuti e quindi riempire bene ogni bioreattore con 450 μL di terreno di crescita miotonico.
  5. Dopo 3 giorni (una volta che il gel si è compattato), iniziare la differenziazione del miotubo.

5. Differenziazione miotubica (giorni 0-14)

  1. Iniziare l'infusione di miotubi commutando i tessuti a 450 μL di mezzi che inducono la fusione (FS, Tabella 1) per 7 giorni, cambiando i mezzi a giorni alterni.
    NOTA: Provare a iniziare la differenziazione dei miotubi lo stesso giorno della differenziazione dei motoneuroni dalle hiPSC al fine di seminare i motoneuroni alla fine dei programmi di differenziazione di entrambi i tipi di cellule.
  2. Il giorno 7 cambiare il mezzo a 450 μL di terreno di maturazione Ia (MMIa, Tabella 1).
  3. Il giorno 9, passare a 450 μL di terreno di maturazione Ib (MMIb, Tabella 1).
  4. Il giorno 11, cambiare il supporto a 450 μL di NbActiv4. Continuare a cambiare il supporto ogni 2 giorni fino a quando i motoneuroni non sono seminati (Passaggio 7).

6. Differenziazione del motoneurone (giorni 0-14)

NOTA: Il nostro protocollo di differenziazione dei motoneuroni è stato adattato da Maury et al8.

  1. Il giorno 0, trasferire 4 x 106 ChR2- hiPSC su una capsula di Petri ad attacco ultra-basso con 15 mL di terreno di coltura di sospensione del motoneurone (MSCM, Tabella 1). Integrare MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 5 μM Y-27632 dicloridrato.
  2. Il giorno 2, isolare le neurosfere (NS) con un filtro reversibile da 37 μM e riplazionare in 15 mL di MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 0,1 μM di acido retinoico. NS dovrebbe essere visibile nella capsula di Petri senza usare un microscopio dopo il giorno 2.
  3. Il giorno 4, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 ml e consentire alle neurosfere di depositarsi sul fondo (5 minuti). Aspirare il surnatante e risospesare le cellule in 15 ml di MSCM integrati con 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e 0,1 μM di acido retinoico.
  4. Il giorno 7, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 0,5 μM SAG e 0,1μM di acido retinoico.
  5. Il giorno 9, ripetere il passaggio 6.3. ma le cellule risospese in 15 mL di MSCM integrate con 10 μM DAPT.
  6. Il giorno 11, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrate con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
  7. Il giorno 14, semina i motoneuroni nella piattaforma.

7. Semina di aggregati di motoneuroni in bioreattore (giorno 14)

  1. Preparare una miscela di gel 4:1 di 2 mg/mL di collagene I e Matrigel (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di Matrigel per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume finale di 800 μL.
  2. Utilizzare un filtro cellulare da 400 nm per selezionare grandi neurosfere e risospescerle nella miscela di gel.
  3. Aspirare i mezzi dal serbatoio e con attenzione dal pozzo della neurosfera (Figura 2).
  4. Aggiungere 15 μL di miscela di gel nel canale della neurosfera.
  5. Caricare una pipetta da 10 μL con 10 μL di gel e quindi scegliere una neurosfera.
  6. Depositare la NS nel canale della neurosfera e assicurarsi che la NS sia nella camera. Sollevare lentamente la pipetta rilasciando il gel rimanente una volta depositato l'NS. Se non sei sicuro che l'NS sia stato depositato correttamente, controlla la sua posizione usando un microscopio.
  7. Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 °C.
  8. Aggiungere 450 μL di NbActiv4 integrati con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF ai serbatoi.
  9. Cambia i media a giorni alterni per consentire la crescita assonale dalla NS al tessuto muscolare.

8. Stimolazione ottica simultanea e registrazione video della funzione NMJ (giorno 24+)

  1. Per l'imaging, utilizzare un microscopio fluorescente invertito con una fotocamera scientifica complementare metallo-ossido-semiconduttore (sCMOS).
  2. Impostare il binning del software della fotocamera su 2x2, esposizione a 20 ms, rolling shutter ON, velocità di lettura a 540 MHz, gamma dinamica: 12 bit e guadagno 1 e modalità sensore: sovrapposizione.
  3. Usa l'obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtissu.
  4. Collegare una camera a cellule vive (37 °C, 5% CO2) allo stadio del microscopio.
  5. Selezionare la regione di interesse (ROI) che contiene il tessuto dei tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione.
  6. Posizionare un filtro di emissione passa-lungo da 594 nm tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.
  7. Posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente 4 bioreattori (24 tessuti) nella camera delle cellule vive.
  8. Fare clic su Live View. Centra e focalizza l'immagine con il ROI desiderato.
  9. Carica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) per controllare la posizione dello stage, la scheda Arduino e l'acquisizione video.
  10. Impostare il filmato di output come segue: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Esegui il codice macro con le coordinate X,Y desiderate impostate sullo stage e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi/s.
  12. Sostituire il supporto dopo l'imaging e restituire i campioni all'incubatore. Consentire almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti.

9. Elaborazione e analisi dei lotti (giorno 24+)

  1. Elaborazione filmati
    1. Utilizza il codice MATLAB personalizzato per elaborare i video in analisi batch. I file possono essere scaricati dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Le funzioni sono elencate e spiegate nella Tabella 2.
      NOTA: il codice è compatibile con i formati .nd2 e .czi. Richiede l'elaborazione parallela per essere attivato in MATLAB e ha bisogno del pacchetto bioformati.
    2. Eseguire lo script recursiveOSAnalysis per analizzare i filmati tramite elaborazione parallela. Avere tutti i video acquisiti nella stessa cartella e selezionare quella cartella durante l'esecuzione del codice.
    3. Regolate i parametri post-analisi in base alle esigenze.
      1. Modificare baselineTime (opzione 1) se la contrazione spontanea viene rilevata all'inizio della registrazione. Questo mostrerà una lettura iniziale superiore a 0 e avrà bisogno che il fotogramma venga spostato per compensare.
      2. Modificare peakThreshold (opzione 2) se le contrazioni non vengono registrate. Il codice rileverà le contrazioni superiori al 25% del picco più alto per impostazione predefinita in modo che questo valore possa essere modificato.
      3. Modificare minMinProminence e minMinWidth per regolare la sensibilità quando si rileva l'inizio di ogni picco.
    4. Genera output video e grafico.
      1. Eseguire recursiveOSMovie per generare un file video per ogni tessuto con la rispettiva traccia di contrattilità.

10. Perturbazione della funzione NMJ (giorno 24+)

  1. Preparare i mezzi di trattamento aggiungendo un effettore esterno al mezzo basale NbActiv4 integrato con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.
    1. Per l'esperimento MG sera, utilizzare il 20% di sieri del paziente MG in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Per l'esperimento BTX, utilizzare 5 μg/mL BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimolare/visualizzare utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la linea di base.
  3. Sostituire il mezzo nei tessuti con mezzi di trattamento (450 μL/tessuto).
  4. Incubare per il tempo desiderato (48 ore per i sieri del paziente, 20 minuti per BTX).
  5. Stimolare/visualizzare di nuovo utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la funzione dopo il trattamento.
  6. Rimuovere il mezzo di trattamento e lasciare riposare i tessuti per il tempo desiderato (48 ore dopo la rimozione dei sieri)
    NOTA: consentire almeno 24 ore tra la stimolazione e l'imaging per evitare l'affaticamento dei tessuti

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Representative Results

Le giunzioni neuromuscolari sono state generate dalla co-coltura di motoneuroni optogenetici derivati da hiPSC con tessuto muscolare scheletrico non optogenetico. I mioblasti scheletrici primari umani (SkM) sono stati seminati nelle piattaforme e differenziati in miotubi multinucleati utilizzando il protocollo di 2 settimane. I motoneuroni optogenetici sono stati differenziati separatamente, ma in parallelo con la differenziazione del miotubo, e quindi seminati nella piattaforma (Figura 1). I tessuti hanno iniziato a contrarsi in risposta alla stimolazione della luce blu 7-12 giorni dopo la semina MN, indicando il successo dello sviluppo e della maturazione degli NMJ. Gli NMJ possono essere coltivati, stimolati e ripresi fino a 40 giorni dopo la semina del motoneurone, ma il punto temporale ottimale si verifica il giorno 1619. La validazione morfologica e biochimica delle differenziazioni e della presenza delle proteine optogenetiche sono mostrate nella Figura Supplementare 1 e sono state validate in precedenti studi18,19.

Per dimostrare che il protocollo può essere facilmente adattato a diversi sistemi di coltura, la strategia è stata testata utilizzando due diversi reattori compartimentati: un dispositivo microfluidico e un bioreattore a pozzo aperto. Entrambi i sistemi hanno un design simile, con una camera dotata di pilastri per la generazione di tessuti muscolari scheletrici e una seconda camera per la coltura di aggregati di motoneuroni 3D che possono estendere gli assoni per innervare i tessuti scheletrici (Figura 2A,B). Tuttavia, i due sistemi hanno scale diverse, con il dispositivo microfluidico che produce tessuti muscolari scheletrici lunghi 1 mm che comprendono circa 20.000 mioblasti (Figura 2C) e il sistema di bioreattori a pozzo aperto che si traduce in tessuti muscolari lunghi 4 mm che comprendono circa 450.000 mioblasti (Figura 2D).

Per consentire la stimolazione controllata degli NMJ optogenetici, è stata costruita una configurazione ottica, comprendente un LED rosso da 637 nm per l'illuminazione a campo luminoso, un LED blu da 488 nm per l'attivazione di ChR2-MN e un filtro di luce blu tra il campione di tessuto e l'obiettivo per impedire alla luce blu di interferire con l'analisi dell'immagine (Figura 3A). I LED erano alimentati da driver LED e controllati con precisione tramite un microprocessore Arduino. La funzione NMJ è stata valutata acquisendo contemporaneamente video time-lapse mentre stimolava i MN con luce blu utilizzando un macro-script del microscopio personalizzato abbinato al codice Arduino (Figura 3B). Il protocollo ha aumentato la frequenza di stimolazione da 0,2 Hz a 2 Hz in 30 passi. Una volta acquisiti i filmati, la funzione tissutale è stata analizzata utilizzando un pacchetto MATLAB personalizzato (Figura 3C). L'analisi ha misurato lo spostamento dei tessuti, generato una traccia di contrattilità e sincronizzata con il protocollo di stimolazione della luce. Ha quindi determinato la frazione di impulsi efficaci (F) e una frazione attesa di impulsi efficaci (E) per tenere conto delle potenziali contrazioni non stimolate. La frazione attesa (E) è stata calcolata come la frazione di impulsi che sarebbe stata etichettata come efficace se le contrazioni fossero state distribuite casualmente all'interno dei 30 s. Il punteggio del tessuto è stato quindi calcolato come (F-E)/(1-E), con un valore compreso tra 0 e 1 (Figura 3C). Il codice determina se viene attivata una contrazione in base al tempo che intercorre tra un impulso luminoso e l'inizio del picco di contrattilità, come illustrato nella Figura 3D. Questo metodo automatizzato e imparziale consente la caratterizzazione ripetuta della funzione NMJ in campioni di grandi dimensioni e nel tempo. Il codice include parametri sintonizzabili che possono essere regolati dopo l'elaborazione per garantire un punteggio corretto (Figura supplementare 2).

La capacità del sistema di caratterizzare quantitativamente la funzione NMJ nel tempo è stata dimostrata dall'imaging di un gruppo di tessuti per 11 giorni (dal giorno 9 al giorno 20 dopo la semina del motoneurone). Il sistema ha catturato il miglioramento della funzione NMJ nei tessuti, mostrando un aumento delle risposte innescate 1 settimana dopo la fabbricazione dei tessuti (Figura 4A), seguito da una funzione stabile per un'ulteriore settimana (Figura 4B). Per verificare che la stimolazione muscolare avvenisse attraverso gli NMJ, un altro gruppo di tessuti è stato analizzato prima e dopo 20 minuti di incubazione con 5 μg / mL della neurotossina α-bungarotossina (BTX), che si lega specificamente e irreversibilmente ai recettori dell'acetilcolina. BTX ha fermato tutte le contrazioni innescate e spontanee, ha provocato una completa interruzione della funzione NMJ e ha dimostrato che la stimolazione luminosa dei tessuti richiede un NMJ funzionale (Figura 4C, D). Le diluizioni seriali di BTX sono state inizialmente testate per identificare la concentrazione ottimale di BTX (risultati non mostrati).

Per valutare la capacità traslazionale del sistema, la funzione NMJ è stata valutata prima e dopo l'aggiunta di siero da cinque pazienti affetti da miastenia grave. L'analisi dei tessuti trattati con siero MG al 20% per 48 ore ha mostrato una diminuzione della funzione rispetto ai tessuti di controllo trattati con siero di donatori sani (Figura 4E,F). Gli NMJ ingegnerizzati sono stati anche valutati di nuovo 48 ore dopo la rimozione e il washout del siero e hanno mostrato un recupero della funzione (Figura 4F). Inoltre, sono state testate concentrazioni crescenti di siero del paziente e il normale controllo del siero umano (5%, 20%, 40%) per identificare la concentrazione ottimale che ha influenzato la funzione tissutale. I risultati hanno mostrato la capacità del sistema di caratterizzare e quantificare la funzione NMJ e di modellare la miastenia grave in vitro.

Figure 1
Figura 1. Progettazione sperimentale e timeline. Timeline (giorni) di differenziazione e semina in piattaforme. SkM = muscolo scheletrico, ChR2 = motoneuroni optogenetici, NMJ = giunzione neuromuscolare. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Vila et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Sistemi di co-coltura per la generazione di NMJ 3D. (A) Schema della piattaforma microfluidica. (B) Schema del bioreattore PDMS a pozzo aperto. (C) Tessuto muscolare scheletrico innervato nella piattaforma microfluidica. (D) Tessuto innervato nel bioreattore a pozzo aperto. Barra scala 0,5 mm. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Vila et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Stimolazione, registrazione e analisi della funzione NMJ. (A) Schema di configurazione del LED e percorso della luce. (B) Configurazione ottica con microscopio invertito, camera a cellule vive, stadio automatizzato e telecamera sCMOS. (C) Algoritmo per l'elaborazione in batch di video di stimolazione ottica di colture NMJ. (D) Fotogramma rappresentativo del video generato dal codice MATLAB e dal corrispondente grafico di traccia di contrattilità. La casella blu lampeggiante nel video e le linee verticali nel grafico indicano quando si verifica la stimolazione della luce blu. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Vila et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Funzione NMJ. (A) Traccia di contrattilità per NMJ umani ingegnerizzati in 3D. (B) Punteggio di NMJ in risposta alla luce, che mostra un miglioramento della funzione in 11 giorni (n = 47, ANOVA unidirezionale p = 1 x 10-8). (C) Traccia di contrattilità dopo 20 minuti di trattamento con 5 mg/mL di neurotossina α-bungarotossina (BTX). (D) Quantificazione della funzione NMJ (punteggio) prima e dopo il trattamento con BTX (n = 6; ANOVA F unidirezionale = 9 x 10-8). (E) Traccia di contrattilità di tessuti con sieri MG al 20% dopo 48 ore di trattamento. (F) Valutazione della funzione NMJ per i gruppi trattati e di controllo prima e dopo il trattamento e dopo il recupero (n = 12; dopo il trattamento post-hoc ANOVA F = 0,0002; *indica p = 0,0015 **indica p = 3,5 x10−6) (MG = Miastenia grave; NHS=siero umano normale). n indica il numero di repliche biologiche. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Vila et al.18,19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Formulazioni miogeniche e di media neurali. Elenco organizzato di fattori di crescita e supplementi per i media. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2. Elenco delle funzioni MATLAB. Brevi spiegazioni delle funzioni MATLAB utilizzate per l'analisi delle immagini. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Vila et al.18. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File supplementari

Figura supplementare 1. Differenziazioni di miotubi e motoneuroni. (A) Protocollo di differenziazione dei miotubi (MM = mezzi di maturazione). (B) Immagini di immunofluorescenza (IF) che mostrano l'espressione dei marcatori muscolari scheletrici della catena pesante della miosina (MHC), α-actinina e desmina in miotubi differenziati. (C) Protocollo di differenziazione dei motoneuroni. (D) Localizzazione di channelrhodopsin-2 con YFP (ChR2-YFP) a membrana in iPSC optogenetiche e (E) MN che confermano il successo dell'infezione. (F) Co-espressione di colina acetiltransferasi (ChAT, rosso) e ChR2 (verde) in MN optogenetici. Barre di scala 100 μm. Riprodotto con il permesso di Vila et al.18. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2. Elaborazione errata che richiede la regolazione dei parametri. (A) Un tempo di riferimento errato si traduce in picchi della forma sbagliata. (B) Una soglia di picco troppo elevata fa sì che i picchi non vengano rilevati. (C) Condizioni troppo indulgenti per il rilevamento di minimi (cioè valori troppo bassi scelti per minMinProminence e/o minMinWidth) fanno sì che i minimi siano etichettati nel mezzo o addirittura in cima ai picchi, quindi conteggiati come "non triggerizzati" perché iniziano troppo lontano dall'impulso luminoso precedente. (D) Condizioni troppo rigorose per il rilevamento dei minimi fanno sì che l'inizio del picco venga etichettato prima dell'impulso luminoso o addirittura mancante, come in questo esempio. Riprodotto con il permesso di Vila et al.18. File che mostra il modello 3D della piattaforma del bioreattore che può essere modificato ed esportato per realizzare stampi per la produzione di bioreattori utilizzando PDMS. Fare clic qui per scaricare questo file.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

File CAD supplementare. File che mostra il modello 3D della piattaforma del bioreattore che può essere modificato ed esportato per realizzare stampi per la produzione di bioreattori utilizzando PDMS. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo sistema è un modello di tessuto umano 3D ingegnerizzato che combina optogenetica ed elaborazione video per consentire una valutazione automatizzata e imparziale della funzione NMJ. Utilizzando un protocollo standardizzato, abbiamo dimostrato la capacità di misurare i cambiamenti nella funzione NMJ durante lo sviluppo fisiologico e caratterizzare gli effetti dannosi di patologie come l'esposizione alle neurotossine e la miastenia gravis dei sieri dei pazienti.

Studi precedenti hanno riportato la capacità di modellare MG con motoneuroni optogenetici derivati da hPSC in co-coltura con miotubi scheletrici utilizzando sieri22 di pazienti MG. Tuttavia, il sistema era in 2D e registrava contrazioni in posizioni casuali, limitando così la riproducibilità e diminuendo la capacità quantitativa del modello. Uno dei maggiori vantaggi del nostro sistema, rispetto a un sistema 2D, è che ci consente di emulare l'ambiente 3D, che facilita in modo più accurato lo sviluppo cellulare e morfologico tra MN e SkM. Ci sono grandi prove che supportano che i segnali biomeccanici necessari affinché un tessuto si comporti come la sua fisiologia nativa sono imitati in modo superiore in un sistema 3D 13,14,15,16. Inoltre, vari aspetti del sistema 3D consentono un ambiente più controllato: formazione diretta di sinapsi, minore eterogeneità tra i campioni, maggiore controllo spazio-temporale della stimolazione tramite optogenetica e un sistema automatizzato ad alto rendimento che diminuisce la soggettività dell'analisi di ciascun campione.

Il sistema sviluppato può essere utilizzato per modellare altre malattie neuromuscolari (NMD), come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e altri. Sebbene la fisiopatologia della SLA coinvolga la disfunzione del motoneurone stesso piuttosto che la giunzione neuromuscolare17,27, il nostro sistema ha la capacità di ricapitolare lo stato di malattia della SLA mostrando una diminuzione della contrazione muscolare dopo la degenerazione o il danno dei neuroni. La DMD è una malattia degenerativa muscolare causata da una mancanza di proteina distrofina, che porta alla debolezza muscolare e all'eventuale degenerazione28. Il sistema potrebbe modellare la DMD incorporando muscoli scheletrici geneticamente modificati che trasportano un inibitore della distrofina o cellule muscolari malate che mancano di distrofina. Nel complesso, il sistema ha la flessibilità e la potenza per ricapitolare vari NMD in una piattaforma 3D in vitro.

Per un protocollo che richiede varie fonti di cellule, ognuna con particolari livelli di confluenza, uno degli aspetti più critici è la tempistica. Durante l'espansione delle cellule muscolari scheletriche primarie, è importante non permettere loro di diventare troppo confluenti (65%-70%) a causa della fusione. A volte, anche quando si utilizza la tripsina per rompere i ciuffi, è stato osservato che ciò si traduce in una semina meno efficace nei bioreattori. Un altro aspetto critico è la produzione della piattaforma di bioreattore a pozzo aperto. Al fine di aumentare l'omogeneità tra le piattaforme PDMS, la quantità di tempo che trascorrono nel forno dovrebbe essere mantenuta uniforme su tutte le piattaforme per evitare fluttuazioni delle proprietà meccaniche dei pilastri della piattaforma. Inoltre, durante la semina delle cellule muscolari nei reattori, al fine di mantenere la coerenza della densità di semina, è sensato ruotare delicatamente il tubo (1-1,5 s) tra ogni due o tre compartimenti all'interno dei bioreattori. Infine, il tasso di successo per lo sviluppo di NMJ è stato visto dipendere in gran parte dal successo della semina di motoneuroni poiché l'aggiunta di neurosfere è così delicata e varia da persona a persona. Con la pratica della semina, il tasso di successo aumenta, consentendo a circa il 90% delle colture iniziate di essere stimolate e fotografate.

Attualmente, alcune limitazioni che potrebbero essere affrontate nel prossimo futuro sono l'incorporazione e la convalida di proteine optogenetiche diverse dal ChR2 discusso. Il controllo specifico su entrambi i tipi di cellule e sensori optogenetici per l'imaging di tensione / calcio o il metabolismo muscolare potrebbe essere aggiunto al sistema per aumentare le letture e l'analisi. Poiché la luce blu induce fototossicità a dosi elevate, il regime di stimolazione era limitato a 30 s. Questo effetto potrebbe essere migliorato incorporando una channelrhodopsin spostata in rosso per studi di stimolazione di lunga durata. Inoltre, un'altra limitazione che potrebbe essere migliorata nelle future iterazioni del modello è la mancanza di cellule di supporto neuronale come le cellule di Schwann. La versatilità di questa piattaforma e del codice di analisi, tuttavia, consente di incorporare una varietà di costrutti optogenetici e tipi di cellule. Mentre la nostra linea ChR2-hiPSC è stata creata utilizzando CRISPR, altri metodi potrebbero essere utilizzati per implementare una risposta optogenetica in hiPSC. Inoltre, con l'adattabilità delle hiPSC, il modello NMJ può essere sviluppato da una singola fonte cellulare, consentendo di utilizzare modelli specifici per il paziente per studiare ulteriormente le malattie neuromuscolari18.

Questa piattaforma fornisce un'analisi ripetuta, automatizzata e imparziale della funzione NMJ umana nel tempo e può rilevare cambiamenti quantificabili nella funzione dovuti a effettori esterni, come neurotossine o siero per pazienti MG. Nel complesso, il nostro sistema 3D consente di studiare la funzione NMJ umana nelle prime fasi della patologia della malattia, offre l'opportunità di screening farmacologico e pone le basi per un sistema robusto per far progredire la medicina di precisione.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte del NIH [numeri di sovvenzione EB025765 e EB027062], DOD [numero di premio W81XWH-18-1-0095] e UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Riconosciamo con gratitudine il nucleo di cellule staminali della Columbia University per il loro aiuto e guida con la riprogrammazione cellulare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

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References

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Bioingegneria Numero 182
Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana
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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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