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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Published: April 14, 2022 doi: 10.3791/63759
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Summary

Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Abstract

Muchas enfermedades neuromusculares, como la miastenia gravis (MG), están asociadas con la disfunción de la unión neuromuscular (NMJ), que es difícil de caracterizar en modelos animales debido a las diferencias fisiológicas entre animales y humanos. La ingeniería de tejidos ofrece oportunidades para proporcionar modelos in vitro de NMJ humanos funcionales que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Al incorporar proteínas optogenéticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), generamos neuronas que pueden ser estimuladas con longitudes de onda específicas de luz. Si el NMJ es saludable y funcional, una señal neuroquímica de la motoneurona resulta en la contracción muscular. A través de la integración de la optogenética y la microfabricación con la ingeniería de tejidos, establecimos una metodología imparcial y automatizada para caracterizar la función NMJ utilizando el análisis de video. Se desarrolló un protocolo estandarizado para la formación de NMJ, la estimulación óptica con grabación de video simultánea y el análisis de video de la contractilidad del tejido. La estimulación de motoneuronas optogenéticas por la luz para inducir contracciones del músculo esquelético recapitula la fisiología humana de NMJ y permite mediciones funcionales repetidas de NMJ a lo largo del tiempo y en respuesta a diversas entradas. Demostramos la capacidad de esta plataforma para mostrar mejoras funcionales en la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y caracterizar los efectos dañinos de los anticuerpos MG o neurotoxinas del paciente en la función NMJ.

Introduction

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis química entre las motoneuronas (MN) y las células del músculo esquelético (SkM) que permite la contracción muscular. Las toxinas, como la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), o las enfermedades neuromusculares (NMD) como la miastenia gravis (MG) pueden conducir a la degeneración de la NMJ y reducciones en el control muscular1. Los modelos de tejidos humanos de bioingeniería recapitulan mejor los mecanismos funcionales y fisiológicos de los NMJ humanos y ofrecen un mayor potencial de traducción que los modelos animales.

Si bien los modelos animales han avanzado en la comprensión de la formación y función del NMJ, existen diferencias significativas entre las sinapsis humanas y animales que limitan la traducción de los resultados a los humanos y hacen que la caracterización in vivo del NMJ sea un desafío 2,3,4. Los estudios han demostrado diferencias fisiológicas distintas entre los NMJ de ratón y humanos. Los ratones tienen NMJ más grandes y densidades de zona activa más pequeñas en comparación con los NMJ humanos4. Además, los estudios de medicamentos realizados en modelos animales no siempre reflejan los efectos encontrados en los ensayos clínicos en humanos. Los modelos de tejido humano diseñados brindan la oportunidad de estudiar el desarrollo saludable de la NMJ y la patología de las enfermedades neuromusculares y permiten la detección de drogas. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs)5 se pueden diferenciar en una variedad de tipos de células, incluidas las células del músculo esquelético 6,7 y las motoneuronas 8,9. Las hiPSC se pueden generar fácilmente a partir de células de pacientes, lo que permite un mejor modelado de la enfermedad10 y la detección de fármacos11,12 a través de modelos de tejido específicos del paciente.

Los cocultivos monocapa bidimensionales (2D) de SkMs y MNs carecen de la morfología, fenotipo, organización y comportamiento funcional de los NMJ fisiológicos. Los NMJ se forman aleatoriamente en cultivo 2D, lo que inhibe el aislamiento de unidades motoras para su análisis, limita las mediciones funcionales precisas e impide su uso para experimentos repetidos y sistemáticos13 . Los modelos tisulares tridimensionales (3D) de NMJ superan muchas de estas limitaciones, recapitulando las características morfológicas y funcionales de los NMJ fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, los dos tipos de tejido se desarrollan por separado y luego se integran dirigiendo el crecimiento axonal, lo que permite que se desarrollen NMJ más organizados en comparación con los sistemas de cultivo 2D.

Nuestro estudio anterior demostró que la combinación de optogenética con ingeniería de tejidos puede permitir una estimulación no invasiva precisa y una evaluación de la función NMJ18,19. A través de la ingeniería genética, las proteínas sensibles a la luz se pueden integrar en el genoma de las hiPSC. La integración de la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal iónico que se abre en respuesta a la luz azul, en la membrana de células excitables como las neuronas permite el control espaciotemporal sin contacto sobre la activación celular 20,21,22. Las hiPSC que transportan ChR2 se pueden diferenciar en motoneuronas optogenéticas sensibles a la luz azul, eliminando la necesidad de electrodos invasivos típicos que estimulan las neuronas y evitando la estimulación no deseada de las células musculares por electrodos23. Este sistema utiliza motoneuronas optogenéticas para estimular las contracciones en las células del músculo esquelético no optogenético. La combinación de la adquisición de video y la iluminación controlada de luz azul permite que los tejidos cocultivados se estimulen y graben simultáneamente para la función NMJ.

La MG es causada por autoanticuerpos dirigidos a los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR), lo que resulta en una disminución de la función NMJ y debilidad muscular24. Se diagnostica en función de los síntomas presentados, el electrodiagnóstico y la detección de autoanticuerpos a través de análisis de sangre serológicos. Sin embargo, no se han identificado todos los autoanticuerpos implicados en la MG, y algunos pacientes seronegativos son diagnosticados con MG pero sin anticuerpos reconocidos25,26. Nuestro sistema permite la evaluación funcional repetida de la NMJ antes y después de la adición de suero de pacientes con MG, proporcionando información invaluable sobre los cambios funcionales y bioquímicos causados por los anticuerpos MG18. Nuestro protocolo ilustra cómo producir modelos 3D in vitro de NMJ humana funcional que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Demostramos la versatilidad del sistema en dos plataformas, un dispositivo microfluídico y una plataforma de biorreactor de pozo abierto más grande.

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Protocol

Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU.

1. Preparación del biorreactor

  1. Hacer moldes de biorreactores
    1. Descargue un archivo CAD de biorreactor desde el archivo CAD complementario o cree un diseño propio personalizado.
    2. Genere una trayectoria de herramienta CNC a partir del modelo 3D utilizando el software CAM.
    3. Máquina de moldes de acetal utilizando una fresadora CNC.
  2. Fabricación de biorreactores
    1. Mezclar una base 10:1 con la mezcla de agentes de curado de polidimetilsiloxano (PDMS, 77 g de mezcla por 4 plataformas/moldes).
    2. Coloque la mezcla en una cámara de vacío, cierre todas las válvulas, encienda el vacío y desgasifique la mezcla durante al menos 30 minutos hasta que no queden burbujas de aire. Vierta la mezcla en moldes y desgasifique los moldes en la cámara de vacío durante 1 h.
    3. Cierre los moldes con la mitad superior del molde en la orientación correcta. Coloque una varilla hexagonal de acero sobre el centro y una abrazadera en ambos lados.
    4. Rellena la parte superior con PDMS.
    5. Curar los moldes en un horno de 65 °C durante al menos 4 h.
    6. Retire las plataformas de los moldes después de enfriar a temperatura ambiente.
    7. Limpie los dispositivos en un baño ultrasónico utilizando ciclos de 1 h de jabón para platos, 400 ml de isopropanol 100% y agua destilada.
    8. Secar durante la noche a 65 °C.
    9. Remoje las hojas de cubierta de vidrio en poliol surfactante no iónico al 1% durante 30 minutos y asegúrese de que las hojas de cubierta no se apilan para que todas estén debidamente recubiertas.
    10. Enjuague bien con agua destilada y seque durante la noche a 65 °C.
    11. Use un limpiador de plasma en alto con 6 L / min de oxígeno durante 1-2 min para tratar las cubiertas de vidrio y la plataforma PDMS. Una vez tratados, unan los dos presionando el PDMS hacia abajo en el cubrehojas durante al menos 30 s.
    12. Autoclave los dispositivos enlazados antes de agregar celdas.

2. Construcción de una configuración de estimulación óptica

  1. Usando un sistema de cubo de jaula de 30 mm, coloque un espejo dicroico de 573 nm en el centro. Acople un LED rojo de 627 nm con un filtro de excitación de paso largo de 594 nm y conéctelo a la parte superior del cubo, con el LED mirando hacia el espejo. A continuación, conecte un LED azul de 488 nm con un filtro de excitación de paso corto de 546 nm al lado adyacente del cubo, con el LED mirando hacia el espejo como se muestra en el esquema de la Figura 3A.
  2. Conecte un diafragma de iris accionado por anillo a la parte inferior del cubo de la jaula para controlar el tamaño del área iluminada.
  3. Encienda cada LED mediante un controlador LED T-Cube y controle a través de una placa Arduino Uno Rev3. Conecte la entrada lateral del controlador LED a un enchufe de fuente de alimentación, conecte la salida central al Arduino y conecte la salida lateral directamente a los LED.
  4. Conecte el Arduino Uno a un PC mediante un cable USB.
  5. Descargar archivos desde el enlace de GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Abra el archivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" de la carpeta GitHub.
  7. Establecer parámetros de inicio: Pasos = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLongitud = 100.
  8. Asegúrese de que la salida del pin 4 esté asignada al controlador led azul y la salida del pin 2 se asigne al controlador LED rojo. Compruebe que los cables centrales del controlador LED estén conectados a tierra y a la salida del pin respectivo.
  9. Compile y cargue el programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" en Arduino.
  10. Conecte cada controlador LED a su canal correspondiente.

3. Configuración del cultivo celular (día -21-0)

  1. Células primarias del músculo esquelético
    1. Descongelar y expandir los mioblastos esqueléticos primarios (obtenidos de Cook Myosite) para un máximo de seis pasajes utilizando el medio de crecimiento miotónico (+ suplemento). Mantenga las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Cambie los medios cada 2 días.
    3. Una vez que las células son aproximadamente 60% confluentes, páselas usando 0.05% de tripsina-EDTA (1x, durante 5 min a 37 °C). Recoge las células disociadas y añade medios frescos para neutralizar la tripsina.
    4. Gire hacia abajo las células a 300 x g y aspire el sobrenadante por encima de la bolita celular.
    5. Resuspendir las células con MGM y sembrar 1:3 con 60 mL por matraz de triple capa.
  2. ChR2-hiPSC
    NOTA: Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU. En este protocolo, las hiPSC que expresan ChR2 se generaron a través de la edición del genoma CRISPR-Cas9 utilizando métodospreviamente descritos 18, pero cualquier línea celular optogenética estable (lentiviral, piggyBac, etc.) se puede usar de la misma manera. Se eligieron promotores constitutivos expresados tanto en iPSCs como en motoneuronas (CAG). Se encontró que las células tenían cariotipo sano, como se señaló en publicaciones anteriores18,19.
    1. Cubra las placas de 6 pocillos con 1 ml/pocillo de matriz de membrana basal solubilizada diluida en DMEM/F12 (1:80) e incube las placas a temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Semillas iPSC en placas recubiertas de 6 pocillos con 2 ml de medio de cultivo celular sin alimentador (medios iPSC), intercambiando 2 ml de medios cada dos días y pasando cada 5-7 días. Mantenga las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
    3. Pasaje
      1. Disociar las células madre incubando con 1 ml de reactivo liberador de células madre libres de enzimas durante 4 min y esquilando mecánicamente con una pipeta P1000 de punta ancha.
      2. Células de semilla en una proporción de 1:24 o 1:48 en medios iPSC con 2 μM de diclorhidrato de Y-27632 en 2 ml/pozo sobre placas recubiertas de 6 pocillos.

4. Siembra de tejido muscular esquelético (día -3)

  1. Aísle y cuente 30 x 106 mioblastos utilizando un contador celular automatizado.
  2. Resuspendir los mioblastos en una mezcla 4:1 de colágeno I de 3 mg/mL y matriz de membrana basal solubilizada (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de matriz de membrana basal para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante acompañante (mezcla 9: 1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen de 800 μL.
  3. Agregue 15 μL de suspensión de colágeno celular a cada cámara muscular del biorreactor, asegurándose de extender la suspensión a través de ambos pilares usando la punta de la pipeta (Figura 2).
  4. Deje polimerizar la mezcla de gel celular a 37 °C durante 30 min y luego llene bien cada biorreactor con 450 μL de medios de crecimiento miotónico.
  5. Después de 3 días (una vez que el gel se haya compactado), comience la diferenciación de miotubos.

5. Diferenciación de myotube (días 0-14)

  1. Comience la infusión de miotubos cambiando los tejidos a 450 μL de medios inductores de fusión (FS, Tabla 1) durante 7 días, cambiando el medio cada dos días.
    NOTA: Trate de comenzar la diferenciación de miotubos el mismo día que la diferenciación de motoneuronas de hiPSC para sembrar motoneuronas al final de los programas de diferenciación de ambos tipos de células.
  2. El día 7 cambiar el medio a 450 μL de medio de maduración Ia (MMIa, Tabla 1).
  3. En el día 9, cambio a 450 μL de medios de maduración Ib (MMIb, Tabla 1).
  4. El día 11, cambie el medio a 450 μL de NbActiv4. Siga cambiando los medios cada 2 días hasta que las motoneuronas se sembran (Paso 7).

6. Diferenciación de motoneuronas (días 0-14)

NOTA: Nuestro protocolo de diferenciación de motoneuronas fue adaptado de Maury et al8.

  1. El día 0, transfiera 4 x 106 ChR2- hiPSCs a una placa de Petri de fijación ultra baja con 15 ml de medio de cultivo en suspensión de motoneuronas (MSCM, Tabla 1). Suplemento MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato y 5 μM Y-27632 diclorhidrato.
  2. El día 2, aislar las neuroesferas (NS) con un colador reversible de 37 μM y replatar en 15 ml de MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato y 0,1 μM de ácido retinoico. El NS debe ser visible en la placa de Petri sin usar un microscopio después del día 2.
  3. En el día 4, transfiera las células y los medios a un tubo de 50 ml y permita que las neuroesferas se asienten en el fondo (5 min). Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 15 mL de MSCM suplementado con 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 y ácido retinoico 0,1 μM.
  4. El día 7, repita el paso 6.3. pero resuspend las células en 15 ml de MSCM suplementado con 0,5 μM de SAG y 0,1 μM de ácido retinoico.
  5. El día 9, repita el paso 6.3. pero células resuspend en 15 ml de MSCM suplementadas con 10 μM DAPT.
  6. El día 11, repita el paso 6.3. pero resuspend las células en 15 mL de MSCM suplementado con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF.
  7. El día 14, siembra las motoneuronas en la plataforma.

7. Siembra de agregados de motoneuronas en biorreactor (día 14)

  1. Preparar una mezcla en gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I y Matrigel (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de Matrigel para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante acompañante (mezcla 9: 1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen final de 800 μL.
  2. Utilice un colador celular de 400 nm para seleccionar neuroesferas grandes y resuspendírlas en la mezcla de gel.
  3. Aspirar medios desde el reservorio y cuidadosamente desde el pozo de la neuroesfera (Figura 2).
  4. Agregue 15 μL de mezcla de gel en el canal de la neuroesfera.
  5. Cargue una pipeta de 10 μL con 10 μL de gel y luego elija una neuroesfera.
  6. Deposite el NS en el canal de la neuroesfera y asegúrese de que el NS esté en la cámara. Levante lentamente la pipeta mientras libera el gel restante una vez que se deposita el NS. Si no está seguro de que el NS se haya depositado correctamente, verifique su ubicación con un microscopio.
  7. Deje que el gel polimerice durante 30 min a 37 °C.
  8. Añadir 450 μL de NbActiv4 suplementado con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF a los reservorios.
  9. Cambie los medios cada dos días para permitir el crecimiento axonal de NS a tejido muscular.

8. Estimulación óptica simultánea y grabación de video de la función NMJ (día 24+)

  1. Para obtener imágenes, utilice un microscopio fluorescente invertido con una cámara científica complementaria de metal-óxido-semiconductor (sCMOS).
  2. Ajuste el binning del software de la cámara a 2x2, exposición a 20 ms, obturador rodante ON, velocidad de lectura a 540 MHz, rango dinámico: 12 bits y ganancia 1, y modo de sensor: superposición.
  3. Utilice el objetivo 2x en el microscopio para obtener imágenes de los microtejidos.
  4. Conecte una cámara de células vivas (37 °C, 5% de CO2) a la etapa del microscopio.
  5. Seleccione la región de interés (ROI) que contiene el tejido de los tejidos esqueléticos inervados para minimizar el tamaño del archivo y el tiempo de procesamiento.
  6. Coloque un filtro de emisión de paso largo de 594 nm entre la muestra y el objetivo de imagen para filtrar los pulsos de luz azul de la cámara.
  7. Coloque una placa rectangular de 4 pocillos que contenga 4 biorreactores (24 tejidos) en la cámara de células vivas.
  8. Haz clic en Live View. Centra y enfoca la imagen con el ROI deseado.
  9. Cargue el código de macro personalizado desde la carpeta github (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar la posición del escenario, la placa Arduino y la adquisición de video.
  10. Establezca la película de salida como: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Ejecute el código de macro con las coordenadas X, Y deseadas establecidas en el escenario y adquiera un lapso de tiempo rápido con 1700 cuadros a 50 cuadros / s.
  12. Reemplace el medio después de la toma de imágenes y devuelva las muestras a la incubadora. Permita al menos 24 horas entre las sesiones de adquisición de imágenes para evitar la fatiga tisular.

9. Procesamiento y análisis por lotes (día 24+)

  1. Procesamiento de películas
    1. Utilice el código personalizado de MATLAB para procesar los vídeos en el análisis por lotes. Los archivos se pueden descargar desde la carpeta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Las funciones se enumeran y explican en la Tabla 2.
      NOTA: El código es compatible con los formatos .nd2 y .czi. Requiere que el procesamiento paralelo se active en MATLAB y necesita el paquete de bioformatos.
    2. Ejecute el script recursiveOSAnalysis para analizar las películas a través del procesamiento paralelo. Tenga todos los videos adquiridos en la misma carpeta y seleccione esa carpeta cuando ejecute el código.
    3. Ajuste los parámetros posteriores al análisis según sea necesario.
      1. Cambie la línea de baseTiempo (opción 1) si se detecta una contracción espontánea al comienzo de la grabación. Esto mostrará una lectura inicial muy por encima de 0 y necesitará que el marco se desplace para compensar.
      2. Cambie peakThreshold (opción 2) si las contracciones no se están registrando. El código detectará contracciones que están por encima del 25% del pico más alto de forma predeterminada para que este valor se pueda cambiar.
      3. Cambie minMinProminence y minMinWidth para ajustar la sensibilidad al detectar el inicio de cada pico.
    4. Genere salida de video y gráficos.
      1. Ejecute recursiveOSMovie para generar un archivo de video para cada tejido con su respectivo rastro de contractilidad.

10. Perturbación de la función NMJ (día 24+)

  1. Preparar los medios de tratamiento añadiendo un efector externo a los medios basales NbActiv4 suplementados con 20 ng/mL BDNF y 10 ng/mL GDNF.
    1. Para el experimento de sueros de MG, use sueros de pacientes con MG al 20% en NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Para el experimento BTX, utilice 5 μg/mL BTX en NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Estimular/visualizar usando el Paso 3.2. para registrar la línea base.
  3. Reemplace los medios en los tejidos con medios de tratamiento (450 μL/tejido).
  4. Incubar durante el tiempo deseado (48 h para sueros de paciente, 20 min para BTX).
  5. Estimular/visualizar de nuevo usando el Paso 3.2. para registrar la función después del tratamiento.
  6. Retire los medios de tratamiento y deje que los tejidos descansen durante el tiempo deseado (48 h después de la extracción de sueros)
    NOTA: Permita al menos 24 horas entre la estimulación y la obtención de imágenes para evitar la fatiga tisular

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Representative Results

Las uniones neuromusculares se generaron mediante el co-cultivo de motoneuronas derivadas de hiPSC optogenéticas con tejido muscular esquelético no optogenético. Los mioblastos esqueléticos primarios humanos (SkM) se sembraron en las plataformas y se diferenciaron en miotubos multinucleados utilizando el protocolo de 2 semanas. Las motoneuronas optogenéticas se diferenciaron por separado, pero en paralelo con la diferenciación de miotubos, y luego se sembraron en la plataforma (Figura 1). Los tejidos comenzaron a contraerse en respuesta a la estimulación de la luz azul 7-12 días después de la siembra de MN, lo que indica un desarrollo y maduración exitosos de los NMJ. Los NMJ se pueden cultivar, estimular y tomar imágenes hasta 40 días después de la siembra de motoneuronas, pero el punto de tiempo óptimo ocurre en el día 1619. La validación morfológica y bioquímica de las diferenciaciones y presencia de las proteínas optogenéticas se muestran en la Figura Suplementaria 1 y han sido validadas en estudios previos18,19.

Para demostrar que el protocolo se puede adaptar fácilmente a diferentes sistemas de cultivo, la estrategia se probó utilizando dos reactores compartimentados diferentes: un dispositivo microfluídico y un biorreactor de pozo abierto. Ambos sistemas tienen un diseño similar, con una cámara provista de pilares para la generación de tejidos musculares esqueléticos y una segunda cámara para el cultivo de agregados de motoneuronas 3D que pueden extender los axones para inervar los tejidos esqueléticos (Figura 2A, B). Sin embargo, los dos sistemas tienen diferentes escalas, con el dispositivo microfluídico produciendo tejidos musculares esqueléticos de 1 mm de largo que comprenden aproximadamente 20,000 mioblastos (Figura 2C) y el sistema de biorreactor de pozo abierto que resulta en tejidos musculares de 4 mm de largo que comprenden aproximadamente 450,000 mioblastos (Figura 2D).

Para permitir la estimulación controlada de los NMJ optogenéticos, se construyó una configuración óptica, que comprende un LED rojo de 637 nm para la iluminación de campo brillante, un LED azul de 488 nm para la activación de ChR2-MNs y un filtro de luz azul entre la muestra de tejido y el objetivo para evitar que la luz azul interfiera con el análisis de la imagen (Figura 3A). Los LED fueron alimentados por controladores LED y controlados con precisión a través de un microprocesador Arduino. La función NMJ se evaluó mediante la adquisición simultánea de videos de lapso de tiempo mientras se estimulaban las NM con luz azul utilizando un macro-script de microscopio personalizado emparejado con el código Arduino (Figura 3B). El protocolo aumentó la frecuencia de estimulación de 0,2 Hz a 2 Hz en 30 pasos. Una vez adquiridas las películas, se analizó la función tisular utilizando un paquete MATLAB personalizado (Figura 3C). El análisis midió el desplazamiento tisular, generó un rastro de contractilidad y lo sincronizó con el protocolo de estimulación lumínica. Luego determinó la fracción de pulsos efectivos (F) y una fracción esperada de pulsos efectivos (E) para dar cuenta de posibles contracciones no estimuladas. La fracción esperada (E) se calculó como la fracción de pulsos que se etiquetaría como efectiva si las contracciones se distribuyeran aleatoriamente dentro de los 30 s. La puntuación tisular se calculó entonces como (F-E)/(1-E), con un valor entre 0 y 1 (Figura 3C). El código determina si se desencadena una contracción en función del tiempo transcurrido entre un pulso de luz y el inicio del pico de contractilidad, como se muestra en la Figura 3D. Este método automatizado e imparcial permite la caracterización repetida de la función NMJ en tamaños de muestra grandes y a lo largo del tiempo. El código incluye parámetros ajustables que se pueden ajustar después del procesamiento para garantizar una puntuación correcta (Figura suplementaria 2).

La capacidad del sistema para caracterizar cuantitativamente la función de NMJ a lo largo del tiempo se demostró mediante la obtención de imágenes de un grupo de tejidos durante 11 días (día 9 a día 20 después de la siembra de motoneuronas). El sistema capturó una mejora de la función NMJ en los tejidos, mostrando un aumento en las respuestas desencadenadas 1 semana después de la fabricación del tejido (Figura 4A), seguida de una función estable durante una semana adicional (Figura 4B). Para verificar que la estimulación muscular se produjo a través de los NMJ, se analizó otro grupo de tejidos antes y después de 20 min de incubación con 5 μg/mL de la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), que se une específica e irreversiblemente a los receptores de acetilcolina. BTX detuvo todas las contracciones desencadenadas y espontáneas, resultó en una interrupción completa de la función nmj y demostró que la estimulación lumínica de los tejidos requiere una NMJ funcional (Figura 4C, D). Las diluciones seriadas de BTX se probaron inicialmente para identificar la concentración óptima de BTX (resultados no mostrados).

Para evaluar la capacidad traslacional del sistema, se evaluó la función NMJ antes y después de la adición de suero de cinco pacientes con miastenia gravis. El análisis de los tejidos tratados con suero de MG al 20% durante 48 h mostró una disminución de la función en comparación con los tejidos de control tratados con suero de donantes sanos (Figura 4E, F). Los NMJ diseñados también se evaluaron nuevamente 48 h después de la extracción y el lavado del suero y mostraron recuperación de la función (Figura 4F). Además, se probaron las concentraciones crecientes de suero del paciente y el control normal del suero humano (5%, 20%, 40%) para identificar la concentración óptima que afectaba la función tisular. Los resultados mostraron la capacidad del sistema para caracterizar y cuantificar la función NMJ y para modelar la miastenia gravis in vitro.

Figure 1
Figura 1. Diseño experimental y cronograma. Línea de tiempo (días) de diferenciación y siembra en plataformas. SkM = músculo esquelético, ChR2 = motoneuronas optogenéticas, NMJ = unión neuromuscular. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Vila et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Sistemas de cocultivo para la generación de NMJ 3D. (A) Esquema de la plataforma microfluídica. (B) Esquema del biorreactor PDMS de pozo abierto. (C) Tejido muscular esquelético inervado en la plataforma microfluídica. (D) Tejido inervado en el biorreactor de pozo abierto. Barra de escala 0,5 mm. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Vila et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Estimulación, registro y análisis de la función NMJ. (A) Esquema de configuración del LED y trayectoria de la luz. (B) Configuración óptica con un microscopio invertido, cámara de células vivas, escenario automatizado y cámara sCMOS. (C) Algoritmo para el procesamiento por lotes de videos de estimulación óptica de cultivos NMJ. (D) Fotograma representativo del vídeo generado por el código MATLAB y el correspondiente gráfico de trazas de contractilidad. El cuadro azul parpadeante en el video y las líneas verticales en el gráfico indican cuándo se produce la estimulación de la luz azul. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Vila et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Función NMJ. (A) Traza de contractilidad para NMJ humanos diseñados en 3D. (B) Puntuación de NMJ en respuesta a la luz, mostrando una mejora de la función durante 11 días (n = 47, ANOVA p unidireccional = 1 x 10-8). Barras de error = SEM. (C) Traza de contractilidad después de 20 min de tratamiento con 5 mg/ml de la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX). (D) Cuantificación de la función NMJ (puntuación) antes y después del tratamiento con BTX (n = 6; ANOVA F unidireccional = 9 x 10-8). (E) Traza de contractilidad de tejidos con sueros de MG al 20% después de 48 h de tratamiento. (F) Evaluación de la función nmJ para los grupos tratados y de control antes y después del tratamiento y después de la recuperación (n = 12; después del tratamiento ANOVA F post-hoc = 0,0002; *indica p = 0,0015 **indica p = 3,5 x10−6) (MG = Miastenia Gravis; NHS=suero humano normal). n indica el número de réplicas biológicas. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Vila et al.18,19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Formulaciones miogénicas y de medios neuronales. Lista organizada de factores de crecimiento y suplementos para medios de comunicación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Lista de funciones de MATLAB. Breves explicaciones de las funciones de MATLAB utilizadas para el análisis de imágenes. Esta tabla ha sido modificada con permiso de Vila et al.18. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivos complementarios

Figura suplementaria 1. Diferenciaciones de myotube y motoneurona. (A) Protocolo de diferenciación de miotubos (MM = medio de maduración). (B) Imágenes de inmunofluorescencia (IF) que muestran la expresión de marcadores musculares esqueléticos de cadena pesada de miosina (MHC), α-actinina y desmina en miotubos diferenciados. (C) Protocolo de diferenciación de motoneuronas. (D) Localización de la canalrodopsina-2 con YFP (ChR2-YFP) a la membrana en iPSCs optogenéticas y (E) MNs que confirman una infección exitosa. (F) Coexpresión de colina acetiltransferasa (ChAT, rojo) y ChR2 (verde) en MNs optogenéticas. Barras de escala 100 μm. Reproducido con permiso de Vila et al.18. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2. Procesamiento incorrecto que requiere ajuste de parámetros. (A) El tiempo de referencia incorrecto da como resultado picos de la forma incorrecta. (B) Un umbral de pico que es demasiado alto da como resultado que los picos no se detecten. (C) Las condiciones demasiado indulgentes para la detección de mínimos (es decir, valores demasiado bajos elegidos para minMinProminence y / o minMinWidth) dan como resultado que los mínimos se etiqueten en el medio o incluso en la parte superior de los picos, por lo que se cuentan como "no escalonados" porque comienzan demasiado lejos del pulso de luz anterior. (D) Las condiciones demasiado estrictas para la detección de mínimos dan como resultado que el inicio del pico se etiquete antes del pulso de luz o incluso falte, como en este ejemplo. Reproducido con permiso de Vila et al.18. Archivo que muestra el modelo 3D de la plataforma de biorreactores que se puede editar y exportar para hacer moldes para la fabricación de biorreactores utilizando PDMS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis

Archivo CAD complementario. Archivo que muestra el modelo 3D de la plataforma de biorreactores que se puede editar y exportar para hacer moldes para la fabricación de biorreactores utilizando PDMS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este sistema es un modelo de tejido humano 3D diseñado que combina optogenética y procesamiento de video para permitir una evaluación automatizada e imparcial de la función NMJ. Utilizando un protocolo estandarizado, hemos demostrado la capacidad de medir los cambios en la función de NMJ durante el desarrollo fisiológico y caracterizar los efectos dañinos de patologías como la exposición a neurotoxinas y los sueros de pacientes con miastenia gravis.

Estudios previos han reportado la capacidad de modelar MG con motoneuronas optogenéticas derivadas de hPSC en co-cultivo con miotubos esqueléticos utilizando sueros de pacientes con MG22. Sin embargo, el sistema estaba en 2D y registraba contracciones en ubicaciones aleatorias, limitando así la reproducibilidad y disminuyendo la capacidad cuantitativa del modelo. Una de las mayores ventajas de nuestro sistema, frente a un sistema 2D, es que nos permite emular el entorno 3D, lo que facilita con mayor precisión el desarrollo celular y morfológico entre MNs y SkMs. Existe una gran evidencia que apoya que las señales biomecánicas requeridas para que un tejido se comporte como su fisiología nativa se imitan superiormente en un sistema 3D 13,14,15,16. Además, varios aspectos del sistema 3D permiten un entorno más controlado: formación dirigida de sinapsis, menor heterogeneidad entre muestras, mayor control espacio-temporal de la estimulación a través de la optogenética y un sistema automatizado de alto rendimiento que disminuye la subjetividad del análisis de cada muestra.

El sistema desarrollado se puede utilizar para modelar otras enfermedades neuromusculares (NMD), como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y otras. Aunque la fisiopatología de la ELA implica la disfunción de la neurona motora en sí misma en lugar de la unión neuromuscular17,27, nuestro sistema tiene la capacidad de recapitular el estado de enfermedad de la ELA al mostrar una contracción muscular disminuida después de la degeneración o daño neuronal. La DMD es una enfermedad degenerativa muscular causada por la falta de proteína distrofina, que conduce a debilidad muscular y eventual degeneración28. El sistema podría modelar DMD mediante la incorporación de músculo esquelético genéticamente modificado que lleva un inhibidor de la distrofina o células musculares enfermas que carecen de distrofina. En general, el sistema tiene la flexibilidad y el poder de recapitular varios NMD en una plataforma 3D in vitro.

Para un protocolo que requiere varias fuentes de células, cada una con niveles particulares de confluencia, uno de los aspectos más críticos es el tiempo. Durante la expansión de las células primarias del músculo esquelético, es importante no permitir que se vuelvan demasiado confluentes (65% -70%) debido a la fusión. A veces, incluso cuando se usa tripsina para romper los grupos, se ha observado que esto se traduce en una siembra menos eficaz en los biorreactores. Otro aspecto crítico es la producción de plataformas de biorreactores de pozo abierto. Con el fin de aumentar la homogeneidad entre las plataformas PDMS, la cantidad de tiempo que pasan en el horno debe mantenerse uniforme en todas las plataformas para evitar fluctuaciones en las propiedades mecánicas de los pilares de la plataforma. Además, durante la siembra de las células musculares en los reactores, para mantener la consistencia de la densidad de siembra, es sensato vórtice el tubo suavemente (1-1.5 s) entre cada dos o tres compartimentos dentro de los biorreactores. Por último, se observó que la tasa de éxito para el desarrollo de NMJ dependía en gran medida del éxito de la siembra de motoneuronas, ya que la adición de neuroesferas es muy delicada y varía de persona a persona. Con la práctica de siembra, la tasa de éxito aumenta, lo que permite que aproximadamente el 90% de las culturas iniciadas sean estimuladas e imaginadas.

Actualmente, algunas limitaciones que podrían abordarse en un futuro próximo son la incorporación y validación de proteínas optogenéticas distintas a la ChR2 discutida. El control específico sobre ambos tipos de células y los sensores optogenéticos para imágenes de voltaje / calcio o metabolismo muscular podrían agregarse al sistema para aumentar las lecturas y el análisis. Como la luz azul induce fototoxicidad a dosis altas, el régimen de estimulación se limitó a 30 s. Este efecto podría mejorarse mediante la incorporación de una canalrodopsina desplazada al rojo para estudios de estimulación de mayor duración. Además, otra limitación que podría mejorarse en futuras iteraciones del modelo es la falta de células de soporte neuronal como las células de Schwann. La versatilidad de esta plataforma y código de análisis, sin embargo, permite incorporar una variedad de construcciones optogenéticas y tipos de células. Si bien nuestra línea ChR2-hiPSC se creó utilizando CRISPR, se podrían usar otros métodos para implementar una respuesta optogenética en hiPSC. Además, con la adaptabilidad de las hiPSC, el modelo NMJ se puede desarrollar a partir de una sola fuente celular, lo que permite utilizar modelos específicos del paciente para estudiar más a fondo las enfermedades neuromusculares18.

Esta plataforma proporciona un análisis repetido, automatizado e imparcial de la función nmj humana a lo largo del tiempo y puede detectar cambios cuantificables en la función debido a efectores externos, como neurotoxinas o suero de paciente mg. En general, nuestro sistema 3D permite la investigación de la función NMJ humana al principio de la patología de la enfermedad, brinda la oportunidad de detección de medicamentos y sienta las bases para un sistema robusto para avanzar en la medicina de precisión.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos el apoyo financiero de los NIH [números de subvención EB025765 y EB027062], el DOD [número de premio W81XWH-18-1-0095] y la UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos al Núcleo de Células Madre de la Universidad de Columbia por su ayuda y orientación con la reprogramación celular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NbActiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

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References

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Bioingeniería Número 182
Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana
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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T.… More

Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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