Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dissekering af celle-autonom funktion af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i et auditivt kredsløb ved In Ovo-elektroporation

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Ved hjælp af ovo elektroporation udtænkte vi en metode til selektivt at transficere det auditive indre øre og cochlearkernen i kyllingembryoner for at opnå en cellegruppespecifik knockdown af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i diskrete perioder med kredsløbssamling.

Abstract

Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein, der regulerer lokal proteintranslation. FMRP-tab eller dysfunktion fører til afvigende neuronale og synaptiske aktiviteter i skrøbeligt X syndrom (FXS), som er karakteriseret ved intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og sociale kommunikationsproblemer. Undersøgelser af FMRP-funktion og FXS-patogenese er primært blevet udført med Fmr1 (genet, der koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode til bestemmelse af FMRP's celleautonome funktion i perioden med kredsløbssamling og synaptisk dannelse ved hjælp af kyllingembryoner. Denne metode anvender fase-, sted- og retningsspecifik elektroporation af et lægemiddelinducerbart vektorsystem indeholdende Fmr1 lille hårnål RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metode opnåede vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et af dens hjernestammemål, kernen magnocellularis (NM), hvilket gav en komponentspecifik manipulation inden for AG-NM-kredsløbet. Derudover tillader transfektens mosaikmønster kontrol inden for dyr og nærliggende neuron / fibersammenligninger for forbedret pålidelighed og følsomhed i dataanalyse. Det inducerbare vektorsystem giver tidsmæssig kontrol af genredigeringsstart for at minimere akkumulerende udviklingseffekter. Kombinationen af disse strategier giver et innovativt værktøj til at dissekere FMRP's celleautonome funktion i synaptisk og kredsløbsudvikling.

Introduction

Fragilt X syndrom (FXS) er en neurodevelopmental lidelse præget af intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og autistisk adfærd. I de fleste tilfælde er FXS forårsaget af et globalt tab af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein (FMRP; kodet af Fmr1-genet), der starter ved tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein, der normalt udtrykkes i de fleste neuroner og gliaceller i hjernen såvel som i sensoriske organer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sandsynligvis forbundet med hundredvis af mRNA'er, der koder for proteiner, der er vigtige for forskellige neurale aktiviteter5. Undersøgelser af konventionelle Fmr1 knockout-dyr viste, at FMRP-ekspression er særlig vigtig for samlingen og plasticiteten af synaptisk neurotransmission6. Flere betingede og mosaik knockout-modeller har yderligere vist, at FMRP-handlinger og signaler varierer på tværs af hjerneområder, celletyper og synaptiske steder under flere udviklingshændelser, herunder axonal projektion, dendritisk mønster og synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion af FMRP til regulering af synaptisk transmission blev undersøgt ved intracellulær levering af hæmmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede neuroner15,16,17,18. Disse metoder giver imidlertid ikke mulighed for at spore FMRP-fejludtryksinducerede konsekvenser under udviklingen. Der er således et stort behov for at udvikle in vivo-metoder til at undersøge FMRP's celleautonome funktioner og forventes at hjælpe med at afgøre, om de rapporterede anomalier hos FXS-patienter er direkte konsekvenser af FMRP-tab i de tilknyttede neuroner og kredsløb eller sekundære konsekvenser afledt af netværksdækkende ændringer under udvikling19.

Den auditive hjernestamme af kyllingembryoner tilbyder en unik fordelagtig model til dybdegående funktionelle analyser af FMRP-regulering i kredsløbs- og synapseudvikling. Den lette adgang til embryonale kyllingehjerner og den veletablerede teknik til genmanipulation har i høj grad bidraget til vores forståelse af hjernens udvikling i de tidlige fosterstadier. I en nyligt offentliggjort undersøgelse blev denne teknik kombineret med avancerede molekylære værktøjer, der tillader tidsmæssig kontrol af FMRP-fejludtryk20,21. Her er metoden avanceret til at inducere selektive manipulationer af presynaptiske og postsynaptiske neuroner separat. Denne metode blev udviklet i det auditive hjernestammekredsløb. Akustisk signal detekteres af hårceller i det auditive indre øre og overføres derefter til den auditive ganglion (AG; også kaldet spiralganglion hos pattedyr). Bipolære neuroner i AG innerverer hårceller med deres perifere processer og sender igen en central projektion (hørenerven) til hjernestammen, hvor de ender i to primære cochlearkerner, kernen magnocellularis (NM) og kernen angularis (NA). Neuroner i NM er strukturelt og funktionelt sammenlignelige med de sfæriske buskede celler i pattedyrets anteroventrale cochlear kerne. Inden for NM synapser auditive nervefibre (ANF'er) på somata af NM-neuroner via den store endepære af Held-terminaler22. Under udviklingen opstår NM-neuroner fra rhombomerer 5 og 6 (r5/6) i baghjernen23, mens AG-neuroner er afledt af neuroblaster, der er bosiddende i otocyst24. Her beskriver vi proceduren for selektivt at slå FMRP-ekspression i de presynaptiske AG-neuroner og i de postsynaptiske NM-neuroner separat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Æg og kyllingembryoner blev håndteret med omhu og respekt i overensstemmelse med de dyreprotokoller, der blev godkendt af Jinan University Animal Care and Use Committee.

1. Forberedelse af æg og plasmid

  1. Æg forberedelse
    1. Få friske befrugtede kyllingæg (Gallus gallus) fra South China Agricultural University og opbevar ved 16 ° C før inkubation. For optimal levedygtighed skal du indstille alle æg til inkubation inden for en uge efter ankomsten.
    2. Æggene anbringes vandret, og der inkuberes ved 38 °C i 46-48 timer, indtil Hamburger og Hamilton (HH) trin 1225 til neuralrørstransfektion eller i 54-56 timer indtil HH13 til otocysttransfektion. Fordi æggets dyrepol er lettere end grøntsagspolen, placerer vandret placering embryoet på toppen af ægget for nem manipulation. Vær forsigtig med at holde ægget vandret i dette og alle følgende trin.
    3. Embryoets placering fremstår som et mørkt område på æggeskallen, når der kastes lys fra bunden af ægget ved hjælp af en lommelygte. På de ønskede HH-stadier skal du bruge denne lommelygtemetode til at markere embryonets placering på æggeskallen med blyant.
    4. Tør æggene af med gasbind indeholdende 75% ethanol. Bor et hul i den spidse ende af æggene ved hjælp af spidsen af saksen og fjern 2 ml albumin med en 18 G nålesprøjte. Sørg for, at hullet kun er stort nok til at tillade nåleindsættelse. Tør ethvert lækkende albumin væk med gasbind og forsegl hullet med klar tape.
    5. For at minimere revner og for at forhindre faldende skalrester under vinduesåbninger skal du dække toppen af æg med klart tape, centreret på det blyantmærkede mørke område.
  2. Plasmid DNA-ekstraktion
    1. Klon kylling Fmr1 shRNA ved hjælp af et transposonbaseret Tet-on-system som beskrevet tidligere20. Dette system indeholder tre plasmider: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 og pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, hvilket giver et lægemiddelinducerbart vektorsystem, hvorved ekspressionen af Fmr1 shRNA og EGFP dæmpes efter transfektion og kan tændes ved doxycyclin (Dox) induktion.
      BEMÆRK: Disse plasmider er i øjeblikket ikke tilgængelige i et lager. Forfatterne er enige om at levere plasmider efter rimelig anmodning.
    2. Ekstrahers plasmid-DNA'er ved hjælp af et endotoksinfrit præparatsæt i henhold til producentens instruktion og bundfald ved at tilsætte 1/15 volumen 7,5 M natriumacetat og 1 volumen 100% isopropanol.
    3. Udfælde plasmider ved -20 °C natten over og centrifuge ved 13.000 x g i 10 min. Pelleten opløses med Tris-EDTA-bufferen, der er tilvejebragt i sættet, til en slutkoncentration på 4-5 μg/μL. Plasmider kan opbevares ved -20 °C i 12 måneder uden reduceret transfektionseffektivitet.
    4. På dagen for elektroporation blandes grundigt 2 μL af hvert plasmid i et sterilt centrifugerør ved hjælp af en pipettespids. Det resulterende 6 μL volumen af plasmidblandingen er nok til at elektroporere tre dusin æg. For at hjælpe med at visualisere plasmidet under elektroporation tilsættes 1 μL 0,1% hurtig grøn (fremstillet i steril ddH2O) for hver 6 μL DNA-blanding26, som gør plasmidblandingen blå.

2. I ovo elektroporation

  1. Identifikation af ægvinduer og embryoner
    1. På dagen for elektroporation skal du fjerne æggene fra inkubatoren, et dusin æg ad gangen. At holde æg ude af deres inkubator i mere end 1 time introducerer udviklingsvariationer og reducerer levedygtigheden.
    2. Tør alle kirurgiske værktøjer med gasbind, der indeholder 75% ethanol.
    3. Placer hvert æg i en specialfremstillet skumholder. Tør det tapedækkede område af med 75% ethanol og skær et vindue (1-2 cm2) rundt om blyantmærkets omkreds ved hjælp af en lille saks (figur 1A). Når du klipper, skal du holde saksen fladt for at undgå at beskadige embryoet nedenunder.
    4. Placer vinduesægget under et stereomikroskop med et 10x okular og 2x zoom og identificer embryoet. Juster lyskildens vinkel og lysstyrke for bedre visualisering.
      BEMÆRK: Det kræver øvelse og erfaring at visualisere embryoet og identificere neuralrøret på dette stadium.
      1. For begyndere skal du bruge følgende valgfri blækinjektion for at lette embryoidentifikation. Forbered 10% indisk blækopløsning i 0,01 M fosfatbufferet saltvand (PBS) og autoklave på forhånd. Fyld en 1 ml sprøjte med blækopløsningen, og monter derefter en 27G-nål. Bøj nålen til en vinkel på 45° med tang.
      2. Under mikroskopet skal du forsigtigt stikke fra kanten af området opaca og indsætte nålen under embryoet. Injicer ~ 50 μL blæk, som vil diffundere under området pellucida til embryovisualisering. Blækket danner en mørk baggrund for en klar visualisering af embryoet.
        BEMÆRK: Udvis luften fra sprøjten før isætning og injektion. Når du er dygtig til at visualisere, skal du undgå blækinjektionstrinningen, da det reducerer overlevelsesraten.
  2. Neuralrørsinjektion og elektroporation
    BEMÆRK: Denne procedure udføres ved HH12 til transficering af NM-neuroner i hjernestammen.
    1. Træk glaskapillærer (~ 1 mm i diameter og 100 mm lange) i pipetter ved hjælp af en pipettetrækker. Under et dissekeringsmikroskop skal du forsigtigt åbne spidsen af kapillærnålen til 10-20 μm i diameter med tang. Opbevar pipetterne (normalt 5-10 ad gangen) i en opbevaringsboks indtil brug.
    2. Fyld en kapillærpipette med 0,5-1 μL af plasmidblandingen ved at påføre undertryk gennem et gummirør i enden af pipetten. Dette kan opnås med en sprøjte eller luftpumpe.
    3. Placer ægget under mikroskopet, så embryoet er lodret orienteret med halen tæt på dig (eller vandret til injektion af kapillærpipetter ved hjælp af en treakset manipulator). Hold kapillærpipetten med den ene hånd eller med den treaksede manipulator, og kør pipettens spids til r5/6 i en hale-til-hoved retning.
      BEMÆRK: Det mest forreste baghjerneområde er r1, og hver efterfølgende bule langs neuralrøret er en individuel rombomere. R5/6 er på samme anteroposterior niveau som otocysten, som er en let genkendelig koplignende struktur (figur 1B-C).
    4. Stik forsigtigt spidsen gennem vitellinmembranen og ind i dorsalneuralrøret, og træk derefter pipetten lidt ud, så spidsen er i neuralrørets lumen. Plasmidblandingen injiceres ved at påføre lufttryk, indtil det tonede plasmid diffunderer helt ind i r5/6 og strækker sig ind i r3 og r4.
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at lave en åbning på vitellinmembranen til injektion.
    5. Kontroller for en vellykket injektion, som opnås, når den blå plasmidopløsning hurtigt diffunderer ned i neuralrøret uden at lække (figur 1B-C). Når der opstår lækage, falder det blå hurtigt.
    6. Umiddelbart efter injektionen anbringes en platinbipolar elektrode på hver side af neuralrøret (figur 1D). Lever to impulser af 12 V og 50 ms varighed med en elektroporator. Overhold luftbobler i enderne af den bipolære elektrode, med mere på den negative side.
    7. Kontroller for vellykket elektroporation, hvilket opnås, når den tonede plasmidblanding kommer ind i neuralrørsvævet nær den positive side af elektroden. Efter elektroporation skal du forsigtigt fjerne den bipolære elektrode.
    8. Dæk vinduet på æggeskallen med et stykke gennemsigtig film, der er forskåret i 2 i firkanter og sprøjtet med 75% ethanol. Placer ægget tilbage i sin inkubator.
    9. Rengør den bipolære elektrode ved at levere 10-20 impulser af 12 V og 50 ms varighed i saltvand, inden du fortsætter til det næste æg.
  3. Otocystinjektion og elektroporation
    BEMÆRK: Denne procedure udføres ved HH13 til transficering af hårceller og AG-neuroner i det indre øre.
    1. Ved HH13 (som er ~embryonal dag 2,5) er embryoet drejet, så højre side af hovedet vender opad. Under mikroskopet skal du placere ægget, så embryoet er lodret, med halen tæt på dig. Hold kapillærpipetten og stik forsigtigt den højre otocyst i dorsolateral retning (figur 2A).
      BEMÆRK: På dette stadium fremstår otocysten som en lille cirkulær struktur på toppen af kroppen på samme anteroposterior niveau som r5/6.
    2. Plasmidblandingen injiceres med lufttryk, indtil otocysten er fyldt med blå opløsning27. Kontroller for en vellykket injektion, som opnås, når den blå plasmidblanding er begrænset i otocysten og ikke lækker.
    3. Umiddelbart efter injektionen anbringes den bipolære elektrode på otocysten som vist i figur 2B. Placer henholdsvis de positive og negative sider anterior og posterior til otocysten. Lever to impulser af 12 V og 50 ms varighed med elektroporatoren.
    4. Kontroller for vellykket elektroporation, som opnås, når den blå plasmidblanding kommer ind i otocystens væv nær den positive side af elektroden. Efter elektroporation skal du forsigtigt fjerne den bipolære elektrode. Dæk vinduet på æggeskallen med en gennemsigtig film og returner ægget til inkubatoren.

3. Administration af Dox for at initiere og vedligeholde plasmidtranskription

  1. Fremstilling af Dox-opløsningen
    1. Mål 100 mg Dox-pulver under en kemisk hætte, og opløs det i 100 ml sterilt PBS for at fremstille en 1 mg/ml arbejdsløsning. Opløsningen filtreres med et 0,22 μm filter, og der opbevares 1 ml alikvoter ved -20 °C. Beskyt mod lys20,28.
  2. Administration af Dox
    1. Til genredigering med fuld styrke, ved 24 timer før den ønskede alder, optøes en Dox aliquot på is. Slip 50 μL Dox direkte på æggets chorioallantoiske membran ved hjælp af en sprøjte, der trænger ind i den gennemsigtige film. Forsegl nålehullet med gennemsigtig film eller tape efter injektion.
    2. For at opretholde knockdown-effekten skal du administrere Dox hver anden dag, indtil vævshøsten er på det ønskede udviklingsstadium.

4. Vævsdissektion og sektionering

  1. Hjernestammen
    1. For embryoner i embryonal fase 3 (E3) og E6 skal du åbne æggeskallen og skære den tilhørende membran med en saks. Ske embryoet ud og nedsænk det i 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer.
    2. For E9-embryoner skal du åbne æggeskallen, halshugge embryoet med en saks og overføre hovedet til en siliciumbundet plade fyldt med PBS. Fastgør hovedet ned gennem banerne og skær toppen af kraniet fra hinanden. Placer forsigtigt tangen under hjernen fra begge sider og løft hele hjernen fra kraniet med tangens skuldre. Fordyb hjernen i 4% PFA.
    3. For E15- og E19-embryoner skal du åbne æggeskallen, halshugge embryoet med en saks og placere hovedet på en siliciumbundet plade fyldt med PBS. Skær huden op oven på hovedet for at udsætte kraniet.
    4. Skær gennem kraniet lodret med en barbermaskine for at adskille forhjernen og den kaudale hjerne. Nedsænk den kaudale blok i PBS, fjern toppen af kraniet, og tag derefter hjernen af kraniet.
    5. Stik hjernen ned gennem den optiske lap og adskil lillehjernen og hjernestammen. Pas på ikke at beskadige den auditive hjernestamme, som er placeret lige under cerebellum. Fjern så meget dura som muligt fra hjernestammen og nedsænk det derefter i 4% PFA.
    6. Embryoner og hjernevæv opbevares i 4 % PFA ved 4 °C natten over undtagen E19-hjernestammer, som skal holdes under samme tilstand i 24 timer.
    7. Efter fiksering dehydreres vævet i PBS indeholdende 30% saccharose, indtil det sætter sig, hvilket normalt tager 1-3 dage afhængigt af alderen.
    8. Sektion hjernestammen (E15 og E19) ved 30 μm ved koronalplanet ved hjælp af et glidende mikrotom. Opsamling af sektioner i PBS og opbevar ved 4 °C inden immunfarvning.
    9. For E3- og E6-embryoner og E9-hjernestammer, sektion ved 50 μm på tværs. Saml sektioner i PBS og opbevar ved 4 °C. Monter sektionerne på gelatinebelagte mikroskopglider før immunfarvning. Indsamling af tykkere sektioner til disse aldre letter vævshåndtering.
  2. Auditiv kanal
    1. Efter fjernelse af hjernestammerne fra E9-, E15- og E19-embryoner er den auditive kanal, der er indlejret i den tidsmæssige knogle, let identificerbar liggende under kraniet, og den temporale knogle kan let adskilles fra det omgivende kranium. For E9-embryoner fastgøres hele den temporale knogle i 4% PFA. For ældre embryoner skal du fjerne den benede struktur af den tidlige knogle for at isolere den auditive kanal og fastgøre den auditive kanal i 4% PFA.
    2. Opbevar alle temporale knogler og auditive kanaler i 4% PFA ved 4 °C natten over før vævsindlejring.
    3. Udfør vævsindlejring som beskrevet. Forbered indlejringsopløsningen som følger: Sug 10% gelatine (fra kvæghud) i koldt vand, indtil gelatinegranulatet svulmer op og sætter sig (ca. 30 min). Blandingen opvarmes til ~50 °C for at opløse gelatinen, og der tilsættes 20 % saccharose i gelatineopløsningen, og der omrøres for at opløses. Gelatine-saccharoseopløsningen opbevares ved 4 °C i op til en måned.
    4. Til brug opvarmes gelatine-saccharoseopløsningen ved 37 °C. Læg de temporale knogler/auditive kanaler i blød i den varme gelatine-saccharoseopløsning på en 96-brøndsplade ved 37 °C, indtil de sætter sig, normalt 30-60 min.
    5. Beklæd bunden af brøndene på en 12-brøndplade med en strimmel gennemsigtig film. Tilsæt et lag varm gelatine-saccharoseopløsning og vent, indtil den størkner. Overfør en tidsmæssig knogle / auditiv kanal til hver brønd.
    6. Implanter vævet med et andet lag varm gelatine-saccharoseopløsning. Juster vævets position, så det er i midten af gelen, og den auditive kanal er orienteret vandret. Flyt forsigtigt pladen ind i et 4 °C køleskab, og vent, indtil gelen er fast.
    7. Træk den gennemsigtige filmstrimmel for at flytte gelvævsblokken ud af brønden. Trim ekstra gel i en firkantet blok og skær et hjørne af blokken for at identificere orienteringen. Pak gelatineblokken ind med et stykke folie, frys på tøris, og opbevar derefter ved -80 °C indtil sektionering.
    8. Sektion blokken ved 20 μm langs længdegraden af den auditive kanal med en kryostat. Monter sektionerne direkte på gelatinebelagte mikroskopglas. Lysbillederne opbevares ved -80 °C inden immunfarvning.
    9. Før immunfarvning nedsænkes diasene i forvarmet PBS (45 °C) i 5 minutter for at opløse gelatinen, og derefter vaskes diasene 3x med stuetemperatur PBS for at fjerne resterende gelatine.

5. Immunostaining og mikroskopbilleddannelse

BEMÆRK: Der udføres to typer immunfarvning afhængigt af, om sektionerne er monteret på dias eller fritsvævende i PBS.

  1. Immunostaining på dias
    1. Vask diasene 3x i 10 min hver med PBS. Cirkel det område, der indeholder sektionerne, med en oliepen for at forhindre, at væske lækker under farvning. Sektionerne dækkes med en blokerende opløsning indeholdende 5% normalt gedeserum i PBS og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
    2. De primære antistoffer fortyndes (for den endelige koncentration, der anvendes, henvises til materialetabellen) i PBS indeholdende 0,3% TritonX-100 og 5% normalt gedeserum. Fjern blokeringsopløsningen, og dæk derefter sektionerne med den primære antistofopløsning. Rutsjebanerne udruges ved 4 °C natten over i en kasse, der indeholder et lag destilleret vand i bunden.
    3. Skyl diasene 3x i 10 min med PBS. Påfør fluorescerende sekundære antistoffer fortyndet ved 1:500 i PBS indeholdende 0,3% TritonX-100 på dias. Inkuber diasene ved stuetemperatur i 4 timer, afskærmet fra lys.
    4. Vask diasene 3x med PBS. Slip forsigtigt to dråber monteringsmedium på diasene og dæk sektionerne med dæksler. Pas på ikke at generere luftbobler mellem dækslikket og diaset.
  2. Immunostaining til helmonterede embryoner og fritsvævende sektioner
    1. Embryonerne/sektionerne vaskes med PBS 3x i 10 minutter hver i en brøndplade. De primære antistoffer i PBS indeholdende 0,3 % TritonX-100 og 5 % normalt gedeserum fortyndes i centrifugalrør. Hvert embryo/sektion overføres til et rør med en glaskrog, og der inkuberes på en ryster ved 60 o / min natten over ved 4 ° C.
    2. Embryoner/sektioner 3x med PBS vaskes i 10 minutter hver i en brøndplade. Hvert embryo/sektion overføres til et mørkt centrifugalrør fyldt med fluorescerende sekundær antistofopløsning, og der inkuberes ved stuetemperatur i 4 timer på rysteren.
    3. Embryonerne/sektionerne 3x vaskes med PBS i en brøndplade. Brug en pensel til at montere sektionerne på gelatinebelagte mikroskopglas i et 15 cm fad indeholdende PBS. Når diasene er tørret lidt (~ 5 min), påføres to dråber monteringsmedium og anbringes en dækslip. Pas på ikke at generere luftbobler mellem dækslikket og diaset. Opbevar hele monteringsvævet i PBS til billeddannelse.
  3. Imaging
    1. Forestil dig hele monteringsvævet i PBS i en skål med en siliciumbund, der indeholder kulstofpulver, som giver en sort baggrund. Optag og behandl billeder ved hjælp af en kommerciel billedbehandlings-Olympus-softwarepakke, som beskrevet tidligere29.
    2. Billede sektionerne på diasene med et konfokalt mikroskop som beskrevet tidligere20. Forestil dig sektionerne på et enkelt fokusplan med 10x, 20x og 63x mål. Tag alle billeder fra det samme dyr ved hjælp af de samme parametre. Sørg for at justere indstillingerne for laserniveau og billedoptagelse for at undgå signalmætning.
    3. Udfør billedbehandling ved hjælp af Fiji-softwaren. Til illustration skal du justere billedets lysstyrke, kontrast og gamma ved hjælp af en professionel billedredigeringssoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved at udføre i ovo elektroporation på forskellige steder og på forskellige udviklingsstadier opnåede vi selektiv FMRP-knockdown enten i den auditive periferi eller i den auditive hjernestamme.

FMRP knockdown i NM
Lille hårnål RNA (shRNA) mod kyllingen Fmr1 blev designet og klonet ind i Tet-On vektorsystemet som beskrevet tidligere20. Opsætningen for in ovo-elektroporation er vist i figur 1A. Plasmid-DNA'et tonet med hurtigt grønt blev injiceret i neuralrøret på r5/r6-niveau ved HH12 (figur 1B-C). En platin bipolar elektrode blev anbragt på hver side af neuralrøret på r5/6-niveau (figur 1D). To impulser ved 12 V blev leveret for at drive plasmidet ind i vævet nær den positive side af elektroden. Dox blev påført på chorioallantoic membranen for at udløse ekspressionen af Fmr1 shRNA og EGFP. Efter 24 timers Dox-behandling var EGFP tydelig under et fluorescerende stereomikroskop. Figur 1E-F viser et eksempel ved E3, hvor Dox blev anvendt ved E2. Tværgående sektioner bekræftede placeringen af EGFP-ekspressive (EGFP +) celler på den ene side af baghjernen (figur 1G-H). Derudover blev en gruppe transinficerede celler fundet anterior til otocysten; disse var kraniale neurale kamceller, der migrerede ventrolateralt fra neuralrøret (figur 1F). Elektroporerede embryoner kan også inkuberes længere for at studere kredsløbsdannelse på senere stadier. Ved E15 blev EGFP observeret i hjernestammen, men kun på den transficerede side (figur 1I-J). Tværsnit på niveau med ryghjernestammen viste en håndfuld EGFP + neuroner, der var spredt i NM på siden af elektroporation (figur 1L). EGFP + fibre blev set projicere til målet for NM neuroner: dorsal nucleus laminaris (NL) på den ipsilaterale side (figur 1L) og den ventrale NL på den kontralaterale side (figur 1K). Knockdown-effekten af Fmr1 shRNA blev valideret af markante reduktioner i FMRP-immunreaktivitet i transinficerede NM-neuroner sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner (figur 1M-N). I den auditive ganglion (AG) var neuroner ikke-transficerede (EGFP-), selvom nogle gliaceller omkring AG-neuroner var EGFP + (figur 1O-P), formodentlig afledt af EGFP + kraniale neurale kamceller (se figur 1F). Således tilvejebringer denne elektroporationsstrategi en selektiv transfektion af de postsynaptiske neuroner i AG-NM-kredsløbet.

FMRP knockdown i den auditive kanal
Plamidblandingen blev injiceret i otocysten ved HH13 (figur 2A) efterfulgt af elektroporation ved at placere den positive side af elektroden anterior til otocysten og den negative side bagud til otocysten (figur 2B). Helhovedafsnit ved E6 viste stærk EGFP-fluorescens i højre otocyst, men ikke i hjernestammen (figur 2C). Isolerede auditive kanaler på E9 udviste omfattende EGFP-fluorescens i hele kanalens længde (figur 2D-E). På tværgående sektioner blev EGFP+ celler bekræftet i basilar papilla (BP) langs væggen i cochlearkanalen og i AG (figur 2F-G). Knockdown-effekten af Fmr1 shRNA blev valideret ved markante reduktioner i FMRP-immunreaktivitet i transinficerede hårceller (*, figur 2H-J) sammenlignet med tilstødende ikke-transficerede hårceller (•, figur 2H-J). For understøttende celler var FMRP-immunreaktivitet svag i både transinficerede og ikke-transinficerede celler (figur 2H-J). I lighed med hårceller blev FMRP-immunreaktivitet stort set formindsket i transinficerede AG-neuroner sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner (figur 2K-M).

Vi sporede derefter den centrale projektion af transficerede AG-neuroner til hjernestammen via hørenerven. Mosaikmønsteret af Fmr1 shRNA-transfektion i AG blev yderligere bekræftet ved E6 ved anvendelse af Islet-1 immunreaktivitet (figur 3A), en markør for det udviklende kyllingens indre øre31. Når en del af AG blev ekstraheret med hjernestammen under dissektion, blev isolerede EGFP + AG neuroner og deres fibre i hjernestammen visualiseret in situ i de samme præparater (figur 3B-C). På tværgående strækninger på NM-niveau havde EGFP+ ANF'er nået NM ved E9 (figur 3D) og blev kontinuerligt observeret ved E15 og E19 (figur 3E-F). Billeder med høj forstørrelse afslørede vækstkeglelignende endelser af ANF'er ved E9 (figur 3H), som dannede den store palmelignende endepære ved E15, før de voksede til den karakteriserede endepære af Held-morfologi med komplekse grene ved E19 (figur 3I-J). Ud over NM blev der også set omfattende grene af ANF'er i NA, en anden primær cochlearkerne (figur 3E). Dette var forventet, da de samme ANF'er bifurcate at innervere både NM og NA i kyllinger32. Vi så også EGFP + fibre komme ind i de tilstødende vestibulære cellegrupper, herunder den faldende vestibulære kerne (VeD) som vist i figur 3E. Selvom vi optimerede placeringen af elektroporeringselektroden for fortrinsvis at målrette den forreste del af otocysten, hvor AG dannes, blev nogle vestibulære ganglionneuroner også transficeret. Immunostaining for parvalbumin, en markør for ANF'er hos kyllinger, kan bruges til at differentiere auditive vs. vestibulære fibre i hjernestammen (figur 3F-G).

Sammenfattende giver denne elektroporationsstrategi en selektiv transfektion af de presynaptiske neuroner i AG-NM-kredsløbet og kan bruges til at spore udviklingen af endbulb af Held på individuelle terminalniveauer efter genetiske manipulationer.

Figure 1
Figur 1. FMRP knockdown i kylling NM. (A) Billede af opsætning af elektroporation. (B) Skematisk tegning, der viser mikroinjektionsstedet på rhombomere r5/6-niveauet af et HH12-kyllingembryo. Forkortelser: NT = neuralrør; SO = somite. (C) For at øge synligheden blev indisk blæk (sort) injiceret under embryoet med en sprøjte. Plasmidblanding tonet med hurtigt grønt blev derefter injiceret i neuralrørets lumen. (D) Placering af den bipolære elektrode til elektroporation. + og - angiv henholdsvis de positive og negative sider. Bemærk, at den blå plasmidblanding diffunderes ind i neuralrøret på den positive side efter elektroporation. (E-F) Bright field (BF) billede (E) fusioneret med EGFP kanal (F) af et elektroporeret kyllingembryon på embryonal dag 3 (E3), der viser transfektion i neuralrøret på samme anteroposterior niveau af otocysten. Dox blev påført ved E2, 6 timer efter elektroporationen. Migrerende kraniale neurale kamceller (CNC) er angivet med den gule pil og forstørret i indsatsen i F. Skalabjælke = 500 μm i E, gælder for E og F; 100 μm i indsatsen. (G-H) Transficerede celler med Fmr1 shRNA og EGFP på tværsnittet af et transficeret E3-embryo. EGFP + celler var begrænset på den ene side af neuralrøret. Afsnittet var dobbeltfarvet med FMRP-immunreaktivitet (grå). Skalabjælke = 40 μm i G, gælder for G og H. (I-J) BF-billede (I) fusioneret med EGFP-kanal (J) af en E15-hjernestamme efter Dox-behandling ved E8. Skalastang = 1 mm i I, gælder kun for I og J. (K-L) Tværsnit af en E15 hjernestamme med EGFP + NM neuroner på den transinficerede (trans) side. På den kontralaterale (contra) side (K) sås EGFP+ axoner i den ventrale del af kernen laminaris (NL). (M-N) Billeder med høj forstørrelse af NM ved E19 med dobbelt mærkning af FMRP (rød) og SNAP25 (blå) immunfarvning. SNAP25 er en presynaptisk markør, der mærker slutpæren på Held. Bemærk den markante reduktion af FMRP-immunreaktivitet i de transinficerede (grønne; *) neuroner sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner (•). (O-P) Billeder med høj forstørrelse af den auditive ganglion (AG) ved E19 med FMRP-immunreaktivitet. AG-neuroner (AGN) blev ikke transficeret (EGFP-). Nogle gliaceller afledt af CNC-celler angivet i F blev transficeret. Skalabjælke = 10 μm i M, gælder for M-P. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. FMRP knockdown i kyllingens auditive kanal. (A) Bright field (BF) billede, der viser mikroinjektion af plasmider i otocysten ved HH13. Indisk blæk (sort) blev injiceret under embryoet for øget synlighed. (B) Placering af den bipolære elektrode til elektroporation. Den positive side (mærket med et plussymbol, +) blev placeret anterior til otocysten, og den negative side (mærket med et minussymbol, -) blev placeret bageste til otocysten. (C) Tværsnittet af et kyllingehoved ved E6 var immunfarvet for FMRP (rødt) og neurofilament (NF; blåt). Dox blev påført ved E3 efter elektroporationen. EGFP-fluorescens blev påvist i otocysten, men ikke i hjernestammen. Skalabjælke = 100 μm. (D-E) BF-billede (D) fusioneret med EGFP-kanal (E) af en auditiv kanal ved E9. Skalastang = 500 μm. (F-G) Tværsnit af en E9 auditiv kanal med FMRP (rød) og NF (blå) immunostaining. EGFP + celler blev set i cochlear kanalvæggen, basilar papilla (BP) og auditiv ganglion (AG). Skalabjælke = 50 μm i F, gælder for F og G. (H-J) Billeder med høj forstørrelse af en E9 BP, der viser stort set nedsat FMRP-immunreaktivitet i transinficerede hårceller (HC'er; *) sammenlignet med ikke-transficerede HC'er (•). NF-positive fibre (blå) var periferien innervation fra AG neuroner. (K-M) Billeder med høj forstørrelse af AG-neuroner ved E9 med FMRP-immunfarvning (rød). FMRP-immunreaktivitet var stærk i ikke-transinficerede neuroner (•) og kunne ikke påvises i transinficerede neuroner (EGFP+; *). Skalabjælke = 50 μm i H og gælder for H-M. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Axonal sporing af transficerede AG neuroner i hjernestammen. Embryoner blev elektroporeret ved HH13 til otocysttransfektion af Fmr1 shRNA. Dox-applikationen startede ved E2. (A) Tværgående sektioner af et E6 kyllingehoved med Islet-1 immunostaining og DAPI modfarve. EGFP + celler var tydelige i den auditive ganglion (AG). Stjerner* angiver flere transficerede AG-neuroner i indsatsen. Skalabjælke = 100 μm i A og 10 μm i indsat. (B-C) Bright field (BF) billede (B) fusioneret med EGFP kanal (C) af en E9 hjernestamme. I dette tilfælde blev en del af AG (hvide pile) efterladt forbundet med den auditive hjernestamme. Gul pil angiver transficerede AG-neuroner (AGN) i indsatsen. EGFP + fibre var tydelige på den transinficerede side af hjernestammen. Skalastang = 1 mm i B, gælder for B og C; 100 μm i indsatsen. (D) Tværsnit af E9-hjernestammen på det niveau, der er angivet i C med den stiplede linje. EGFP + auditive nervefibre (ANF; grøn) strakte sig langs hjernestammens dorsale margen og nærmede sig kernen magnocellularis (NM). Skalabar = 100 μm. (E-G) EGFP+ fibre ved E15 (E) og E19 (F-G). Nogle fibre blev også set i kernen angularis (NA) og den faldende vestibulære kerne (VeD). E19 sektioner blev farvet for parvalbumin (PV) immunreaktivitet som en markør for ANF'er. Den stiplede boks i F forstørres i indsatserne og viser en EGFP + ANF, som var PV immunreaktiv. Skala bar = 100 μm i E; 50 μm i F, gælder for F og G; 2 μm i indsatserne. (H-J) Billeder med høj forstørrelse af ANF-terminaler i NM ved E9, E15 og E19, der viser dannelsen og den progressive modning af endepæren i Held. Skalabjælke = 5 μm i H, gælder for H-J. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at bestemme FMRP's celleautonome funktion er det nødvendigt at manipulere dets udtryk i individuelle cellegrupper eller celletyper. Da en af FMRP's hovedfunktioner er at regulere synaptisk dannelse og plasticitet, er selektiv manipulation af hver synaptisk komponent i et bestemt kredsløb forudsætning for en fuld forståelse af FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Ved hjælp af ovo elektroporation af kyllingembryoner demonstrerede vi en metode til at målrette FMRP-ekspression i AG-NM-kredsløbet, enten i presynaptiske AG-neuroner eller postsynaptiske NM-neuroner. For at opnå dette er valg af passende udviklingstrin til elektroporation og nøjagtig placering af elektroporationselektroden på embryoet kritiske trin. NM neuroner stammer fra neurale forfædre i neuralrøret på r5/6 niveau ved HH1223. På samme stadium migrerer kraniale neurale kamceller fra neuralrørets dorsale spids til cochleovestibulær ganglion for at omslutte fremtidige AG-neuroner33. Således er både NM-neuronerne og gliacellerne i AG neuralrør afledt. I modsætning hertil stammer hårceller og AG-neuroner fra ektoderm24. Ektodermen, der støder op til r5/6-niveauet, tykner ved HH10 og invagaderes derefter for at danne den otiske kop ved HH13. Den otiske kop lukker derefter og adskiller sig fra ektodermen for at danne otocysten, hvor den forreste del bliver det auditive sensoriske organ og den bageste del bidrager til det vestibulære system. I både de auditive og vestibulære dele delaminerer neuroblastcellerne, der befinder sig i den ventrale del af den otiske kop, og migrerer for at danne den cochleovestibulære ganglion. Baseret på disse skæbnekortlægningsundersøgelser transficerede vi forfædrene til NM-neuroner ved at elektroporere neuralrøret ved HH12, en strategi, der tidligere er etableret26,28,34. Selvom denne strategi fører til yderligere transfektion af gliaceller i hjernestammen og AG, blev ingen af AG-neuronerne transficeret. Neuronalspecifik transfektion kan opnås ved at anvende en Atoh1 promotordrevet strategi, som vi gjorde tidligere21. Til selektiv transfektion af AG-neuroner elektroporerede vi otocysten ved HH13. Plasmider injiceret i den otiske kop kom overvejende ind i den forreste del af otocysten til hårcelle- og AG-neurontransfektion samtidigt ved placering af elektroder som vist i figur 2B. For fortrinsvis at målrette AG-neuroner over hårceller er det muligt at injicere plasmidopløsningen direkte i regionen ved siden af den forreste otocyst, hvor de delaminerede neuroblaster lokaliserer35. Denne metode har imidlertid en lavere effektivitet af AG neurontransfektion sammenlignet med otocystinjektion, da plasmiderne diffunderer hurtigt efter injektion. Denne metode kan også føre til yderligere transfektion af de omgivende hoved mesenkymale celler. En metode til fortrinsvis at målrette hårceller over AG-neuroner er at forsinke otocystinjektionen og elektroporationen til HH18 (som er ~ embryonal dag 3), da størstedelen af neuroblaster (AG-neuronforstadier) er migreret ud fra otocysten på dette stadium24.

Med modifikationer kan denne metode udvides til at studere det vestibulære system. For vestibulær gangliontransfektion skal elektrodernes retning vist i figur 2B vendes for at transficere den bageste del af otocysten på grund af den tydelige placering af auditive og vestibulære ganglionforstadier.

I ovo elektroporation af kyllingembryoner er en veletableret teknik til undersøgelse af tidlige udviklingsstadier (inden for den første uge af inkubation). For langsigtede undersøgelser er overlevelsesraten et stort problem. Når du starter Dox-behandling ved E8, er overlevelsesraten, der findes her, ~ 60% ved E9, men falder til 30% ved E15 og endnu lavere ved E19. Hatchlings fra elektroporerede æg er mulige, men sjældne og kan kun overleve i flere dage i de fleste tilfælde. For at øge overlevelsesraten bør følgende overvejes: 1) brug en elektroporator, der giver firkantede bølger i stedet for skarpe bølger; 2) påfør en eller to dråber steril PBS på toppen af embryoet, hvis albuminlaget ikke er tykt nok til at fremme elektrisk ledningsevne (dette vil hjælpe med at reducere elektrisk traume); 3) åbning af vitellinmembranen for at udsætte embryoet på injektionsstedet er ikke nødvendig for en vellykket transfektion og kan skade embryoet; 4) For at reducere risikoen for forurening skal du bruge en sprøjte til at stikke parafilmen og administrere Dox i stedet for at genåbne vinduet. Efter injektion skal du tørre den gennemsigtige film med 75% ethanol og dække nåleåbningen med tape; 5) Ved otocysttransfektion injiceres plasmider i otocysten dorsolateralt med en 45° vinklet pipette for at undgå mulig punktering af aorta dorsalis nedenunder. Hvis aorta dorsalis er beskadiget, vil blødning skylle plasmiderne ud og endda forårsage død; 6) hvis det er muligt, undgå at bruge indisk blæk til at visualisere embryoet. Mindre håndtering og færre procedurer vil resultere i en højere overlevelsesrate.

Ud over evnen til selektivt at transficere AG- eller NM-neuroner giver i ovo-elektroporation et unikt system, der tillader nabosammenligninger til dataanalyser. Efter elektroporation transficeres kun en delmængde af celler i enten NM eller AG, hvilket gør det muligt for de omgivende ikke-transficerede celler i samme cellegruppe at tjene som en ideel kontrol20. Hvis potentiel interaktion mellem naboneuroner er en bekymring, kan neuron-modstykker fra den ikke-transficerede side af øret og hjernen tjene som en ekstra kontrol. For histologiske og billeddannende undersøgelser muliggør dette resultat dataanalyser med høj effektivitet på enkeltcelle- eller enkeltfiberniveau. Molekylære analyser er også mulige, hvis de kombineres med fluorescerende baseret cellesortering og protein- og RNA-analyser i stor skala såsom massespektrometri og næste generations sekventering. Imidlertid kan anvendelse af ovo-elektroporation som et middel til genredigering være udfordrende for funktionelle og adfærdsstudier, fordi procentdelen af transinficerede celler i en cellegruppe muligvis ikke er stor nok til at resultere i funktionelle konsekvenser.

Det er vigtigt at udføre to verifikationsanalyser, når man anvender in ovo-elektroporationsmetoden. For det første bør effekten af genredigering på proteinet af interesse bekræftes. I ovo elektroporation transfects kun en delmængde af neuroner i NM eller AG (dvs. et mosaikmønster). Udførelse af western blot på homogeniserede væv, der indeholder en blanding af transinficerede og ikke-transficerede neuroner, er ikke følsom nok til nøjagtigt at afspejle knockdown-effekten. Valideringen skal således udføres på individcelleniveau ved hjælp af metoder som immunocytokemi. Til dette formål har vi tidligere genereret et antistof, der genkender kylling FMRP. Specificiteten af dette antistof blev verificeret af immuncytokemi og western blot i en tidligere undersøgelse30. Knockdown-effekten af Fmr1 shRNA blev valideret kvantitativt ved at observere signifikante reduktioner i intensiteten af FMRP-immunreaktivitet i transinficerede NM-neuroner sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner. For det andet bør kontrolgrupper, der bruger krypterede RNA'er eller andre kontrolkonstruktioner, anvendes til at bekræfte specificiteten af observerede cellulære virkninger af FMRP-fejlekspression20,21. For at nå dette mål designede vi et krypteret shRNA, klonede det i det samme Tet-On-vektorsystem og elektroporerede det til NM-prækursorer, som beskrevet tidligere20. FMRP-ekspression i NM-neuronerne transficeret med det krypterede shRNA blev ikke påvirket, hvilket fremgår af den uændrede intensitet af FMRP-immunreaktivitet sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner. Vi har også identificeret en række effekter af Fmr1 shRNA-transfektion på aksonal vækst, dendritisk beskæring, terminal dannelse og neurotransmission (gennemgået i Curnow og Wang, 2022)36. Vi konkluderede, at disse virkninger blev induceret specifikt af celleautonomt tab af FMRP, fordi det krypterede shRNA ikke inducerede lignende ændringer.

Afslutningsvis muliggør in ovo-elektroporationsteknikken selektiv Fmr1-genredigering med tidsmæssig kontrol og komponentspecificitet i de auditive øre-hjernestamme-kredsløb og kan modificeres til at manipulere det vestibulære system. Udvikling af denne avancerede teknologi i kyllingembryoet, en veletableret model inden for udviklingsbiologi, har og vil fortsat bidrage til vores forståelse af hjernens udvikling under normale og unormale forhold som FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af: et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 32000697); Videnskabs- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de centrale universiteters grundforskningsfonde (11620324) et forskningsstipendium fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Undervisningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); grundforskningsfondene for de centrale universiteter i Kina (21621054) og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medicinske eksperimentelle center på Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for omhyggelig redigering af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Neurovidenskab udgave 185 fragilt X syndrom sensorisk kredsløb indre øre cochlear kerne synapse dannelse hjerneudvikling endepære af Held kyllingembryo
Dissekering af celle-autonom funktion af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i et auditivt kredsløb ved <em>In Ovo-elektroporation</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter