Summary
För observation av murina neonatala gallgångsstörningar krävs en intakt gallgång och effektiv förberedelse. Därför utvecklades ett nytt tillvägagångssätt för att isolera hela det extrahepatiska gallkanalsystemet i murina nyfödda framgångsrikt samtidigt som gallgångens integritet bibehölls.
Abstract
Dissektion av murina neonatala gallgångar har beskrivits som svår. Huvudsyftet med det beskrivna standardoperationsförfarandet är isoleringen av den extrahepatiska gallgången (EBD) hos musnyfödda utan att skada gallgången under beredningen. På grund av dess exceptionellt nära förberedelse jämfört med kolangiocyternas cellinje och skörd av hela det extrahepatiska gallgångssystemet (EBDS) är det beskrivna tillvägagångssättet extremt användbart vid forskning av djurmodeller av nyfödda gallgångsstörningar, såsom gallatresi. Efter eutanasi nåddes bukhålan och gallgångssystemet, tolvfingertarmen och levern extraherades med den unika En-bloc-Resection (EbR). Det extraherade provet placeras på en skummatta och EBD dissekeras från förorenande celler atraumatiskt utan nödvändig beröring. Dissektion av hela EBDS är en betydande fördel med denna metod. Försiktighet måste vidtas på grund av den lilla storleken och mängden gallgångsvävnad. Med hjälp av den beskrivna tekniken finns det ingen skada på kolangiocyterna. Vidare är teknikens renhet reproducerbar (n = 10). Därför kan optimalt jämförbara prover skördas. Dessutom skadas ingen gallgångsvävnad, eftersom all kontakt med gallgångssystemet kan undvikas under beredningen och lämnar gallvätskan inuti gallblåsan. Viktigast av allt, medan man utförde den slutliga gallblåsan och gallgångsdissektionen, användes atraumatiska mikroinstrument endast något i sidled av gallgången utan att klämma på den. Detta är nyckeln till ett rent och intakt prov och viktigt för ytterligare histologisk undersökning eller isolering av kolangiocyter. Sammanfattningsvis gör den beskrivna innovativa dissektionstekniken det möjligt för särskilt oerfarna operatörer med nödvändig utrustning att isolera EBDS så rent som möjligt.
Introduction
Uppkomsten och utvecklingen av kolangiopatier såsom gallatresi, primär skleroserande kolangit (PSC) och primär gallkolangit (PBC) är antingen okända eller ofullständiga 1,2. Den begränsade förståelsen av ursprunget och utvecklingen av dessa sjukdomar leder till brist på behandlingsalternativ3. Det svåraste hindret för att studera neonatala gallgångsstörningar är att få en molekylär förståelse för patofysiologin. En av de viktigaste nycklarna till en bättre förståelse av molekylär patologi är bästa möjliga observation av drabbad vävnad. För att undvika minskad jämförbarhet och skillnader mellan forskning, såsom att observera potentiell viral etiologi av gallatresi4, uppstår behovet av bästa möjliga beredning och delning av de utförda dissektionsteknikerna. En ren beredning av målvävnaden är nödvändig för senare mikroskopiska undersökningar eller avel av cell- och 3D-organoidkulturer. Men vid murina neonatala störningar är vävnadsprover sällsynta och förekommer endast i en liten mängd på grund av den mycket lilla storleken. När det gäller gallgångsstörningar har svårigheter med en ren beredning av gallgångar hos murina nyfödda beskrivits5. På grund av det neonatala utvecklingsstadiet är vävnadsdifferentiering inte alltför avancerad, vilket komplicerar beredningen och ökar svårigheten jämfört med beredningen av vuxna prover. Därför undersökte den operativa arbetsgruppen en ny strategi för att förbereda EBDS i en neonatal musmodell. I den aktuella studien möjliggör tekniken en effektiv dissektion av varje prov.
Gallkanalsystemet är intraperitonealt placerat i höger övre buk, som härrör från levern. Gallblåsan ligger under den viscerala ytan av leverns högra lob. Gallgången, tillsammans med portalvenen och leverartären, är inbäddad i hepatoduodenalt ligament. Det förenar levern och tolvfingertarmen direkt och dränerar gallvätska i tolvfingertarmen6. Anatomiskt är gallgången uppdelad i höger och vänster leverkanal, den gemensamma leverkanalen, den cystiska kanalen och Ductus choledochus, som bildas av sammanflödet av den cystiska kanalen och den gemensamma leverkanalen7. Den här tömmer så småningom gallvätska och saliv från bukspottkörtelkanalen in i tolvfingertarmen via Ampulla of Vater.
Kolangiocyter kantar gallgången intra- och extrahepatiskt och bor i en komplicerad anatomisk nisch där de hjälper till med gallproduktion och homeostas8. Gallvätska passerar dessa specialiserade epitelceller i höga koncentrationer dagligen. I synnerhet är HCO3-paraplyunderhållet mycket viktigt för att skydda mot gallsyratoxicitet9. Kolangiocyter är den första försvarslinjen i hepatobiliärsystemet mot exempelvis luminala mikroorganismer10. Kolangiocyternas försvarseffekt mot giftiga angrepp kan försvagas av genetisk predisposition. En giftig överbelastning orsakar skador och förstörelse och kan därför leda till kolangiopatier. Dessutom är den utvecklande gallgången inte helt kapabel till alla självskyddande mekanismer, vilket leder till en högre känslighet för miljögifter i neonatala gallgångar11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Efter etiskt godkännande (N045/2021) observerades nyfödda nyfödda möss av hankön och hona C57BL/6 tills de var 9 dagar gamla. Djuren föddes och tillhandahölls för experimentella ändamål av djuranläggningen vid University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland. Nyföddabarnen inhystes i en bur tillsammans med sina föräldradjur. Miljöförhållandena kontrollerades i temperatur (20-24 ° C), 12:12 h ljus-mörk cykel och relativ luftfuktighet på 40% -70%.
1. Experimentell förberedelse
- Förbered den utrustning som krävs för kirurgisk operation, inklusive sax, pincett etc. (se materialförteckning).
- Placera desinficerade och autoklaverade instrument på en steril yta bredvid operationsbordet.
- Avliva en P9-åldrad neonatalmus snabbt genom halshuggning med en operationssax. Placera kroppen på den avlivade neonatalmusen på ett sterilt operationsfält. Dissekera EBDS i 9 dagar gamla musnyfödda (steg 5).
OBS: Det beskrivna dissektionsförfarandet ger alla forskare rätt verktyg för att ta bort EBDS från neonatala och äldre möss. Ju äldre musen är, desto lättare är förberedelsen.
2. Tillgång till bukhålan
- Ta tag i huden ovanför urinblåsans placering med pincett. Skär ett hål med en diameter på 2 mm i huden med sax, utan att skada bukhinnan och underliggande strukturer. Expandera snittet till platsen för halshuggningen, följ den vänstra främre axillarlinjen. Ta bort huden från vänster till höger sida med de atraumatiska pincettarna.
- Ta tag i bukhinnan som omger mjälten. Lyft försiktigt upp den tills bukhinnan liknar en tältliknande struktur och skär ett hål med en diameter på 1 mm i mitten. Vänta tills "peritonealtältet" fylls med luft. Använd en 10x mikroskopisk förstoring för detta och följande steg.
- Skär av bukhinnan i ett fönster inramat av de nedre revbenen, båda laterala bukregionerna och nedre blåsområdet för att säkerställa full tillgång till levern, gallgångssystemet, magen, tunntarmen och tjocktarmen.
OBS: För att förbättra tillgången till levern kan ett ytterligare snitt utföras, ta bort de tre lägsta revbenen samtidigt som xiphoidprocessen, falciforma ligament-, lever- och gallgångsstrukturerna lämnas intakta. Utsikten över levern är lätt att få.
3. Undersökning av gallblåsan och gallgångarna
OBS: Se till att hålla provet vått regelbundet under alla följande steg.
- Dra försiktigt xiphoidprocessen i kranioventral position för att undersöka gallblåsan.
OBS: Spänningen på det falciforma ligamentet ökar med denna rörelse och den bifogade gallblåsan blir synlig.- Utför endast ett litet drag för att undvika okontrollerbar rivning av det falciforma ligamentet, vilket kan leda till att gallblåsan rivs från gallgångssystemet. Släpp dragningen av xiphoid-processen före nästa steg.
- Dra försiktigt ner tolvfingertarmen för att frigöra gallgångssystemet.
OBS: När spänningen på hepatoduodenalt ligament ökar blir gallgångsvävnaden synlig.
4. En-bloc-resektion
- Utför den lägre en-bloc-mobiliseringen enligt stegen nedan.
- Identifiera duodenal papilla, som förbinder gallkanalsystemet med tolvfingertarmen.
- Skär genom tolvfingertarmen ca 2 cm från till papillens högra sida.
- Skär genom det pyloriska området. Se till att maginnehållet finns i det pyloriska området mellan skärplatsen och duodenalpapillen.
OBS: Detta är ett viktigt steg för senare orienteringssäkerhet för korrekt placering av orala och aborala duodenala delar.
- Utför den övre en-bloc-mobiliseringen.
- Dra försiktigt i xiphoidprocessen och få tillgång till det falciforma ligamentet.
- Utför ett 1 cm långt snitt genom det falciforma ligamentet, så nära xiphoidprocessen som möjligt, mellan gallblåsan och xiphoidprocessen. Se till att inte skada gallblåsan.
- Skär genom följande anslutningsstrukturer mellan levern och bröstkorgen: matstrupe, underlägsen vena cava, bröstkorgsaorta, alla ligament som omger leverns nakna område och alla dorsalt återstående vävnadsanslutningar.
OBS: En-bloc-provet är helt dissekerat. Den innehåller levern, gallkanalsystemet och duodenal corpus, som är kopplad till den pyloriska regionen i magen.
5. Slutlig gallblåsa och gallgångsdissektion
- Utför bruttoberedningen enligt stegen nedan.
- Placera en-bloc-provet på en skumkudde som vanligtvis används för uttorkning. Använd en 20x mikroskopisk förstoring och två mikrokirurgiska atraumatiska pincett med en maximal spetsstorlek på 6 mm för detta och följande steg.
- Montera provet på skumdynan. Omorganisera provet i rätt anatomisk position. Platta den orala och aborala delen av tolvfingertarmen, utför en mild rörelse.
- Starta rörelsen vid duodenal papilla och fortsätt till skärkanterna med atraumatiska pincett. Släta ut det vita massainnehållet i magen, som endast kommer att uppstå i den orala delen av tolvfingertarmen. Se till att identifiera den orala och den aborala delen av tolvfingertarmen för att utesluta sannolik gallgångsrotation.
- Skär bort stora rester av levervävnad för att börja dissektion av gallgången.
- Utför den slutliga isoleringen.
- Tryck försiktigt in den återstående levervävnaden i skummattans porer. Se till att skraprörelserna börjar från gallgångssystemet och leder till levergränserna.
- Överför provet till ett renare läge på skummattan efter några skraprörelser i olika riktningar. Använd fördelen med mindre pressad levervävnad i bakgrunden för att optimera vyn för bästa möjliga differentiering mellan EBDS och oönskade celler. Skrapa levervävnaden från gallgången tills ingenting, eller så lite som möjligt, av levervävnaden kvarstår.
- Bearbeta hepatoduodenalt ligament tills den isolerade EBDS kvarstår. Ta bort intraligamentösa blodkärl som leverartären, portalvenen och små rester. Ta bort detta känsliga filament, med ett försiktigt drag och hög omsorg, till vänster i sidled. Detta dissektionssteg kan redan ha börjat oavsiktligt eller delvis slutfört under det tidigare avlägsnandet av levervävnad, vilket i slutändan leder till samma resultat.
OBS: Blodkärlen växer fram som en vit och mycket känslig glödtråd cirka 3-5 mm oralt av duodenalpapillen och förenar hepatoduodenalbandet från vänster sidosida och ackumuleras med gallgången till den glissoniska triaden. Med slutförandet av detta steg isoleras det slutliga provet helt. Om det finns behov av en post kan bilder tas efter att ha organiserat gallgångsstrukturerna i sin anatomiska position (figur 1). Att göra de sista förberedelsestegen på en skummatta rekommenderas eftersom provet inte kommer att fastna lika mycket på operationsfältets yta. Om porerna är våta, svävar gallgången eller flyter. När du flyttar provet kommer det inte att fastna lika fast som det skulle göra med förberedelse på operationsduken, vilket resulterar i ingen rivning när provet flyttas.
6. Förberedelse för histologisk analys
- Lägg det isolerade provet i en buffrad lösning, ett specialmedium eller formalinhaltiga fixeringsmedel (se materialförteckningen) så snart som möjligt efter dissektionen.
- Välj en lämplig lagringslösning beroende på ytterligare planerade bearbetningssteg.
VARNING: Använd formalinhaltiga fixeringsmedel endast under en luftventil på grund av akut toxicitet, frätande egenskaper och olika hälsorisker.
OBS: I den presenterade studien har EBDS-proverna satts in i paraformaldehyd, dehydrerats och bäddats in i paraffin. De har förvarats i rumstemperatur och kylts ner före sektionering. I ett uppvärmningsskåp förvarades 2 μm skivor över natten och färgades med konventionellt hematoxylin och eosin4 (se materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar EBDS för en murin nyfödd, som dissekerades med den beskrivna tekniken. Mikroskopiskt är ingen ytterligare levervävnad synlig. Levervävnaden har avlägsnats under protokollets sista isoleringssteg och kan lätt särskiljas från gallgångsvävnad avseende färg och konsistens. Figur 1B visar det isolerade provet jämfört med en millimeterskala. EBD: s längd (mätt från gallblåsan till duodenal papilla) är mindre än 10 mm. Diametern på den mycket känsliga Ductus choledochus varierade från 0,05-0,2 mm. Figur 2 visar hematoxylin-eosinfärgning av en längsgående sektion av EBDS med en öppen lumen. Kolangiocyterna kan identifieras kring lumen som ett monolager och färgas mörkare. Mikroskopi utfördes med 20x förstoring. Siffrorna visar att användningen av det beskrivna dissektionsprotokollet gör det möjligt för operatören att mikroskopiskt dissekera EBDS nära kanalens marginaler, även hos neonatala möss. Proverna togs från 9 dagar gamla murina nyfödda.
Figur 1: EBDS-dissektion. (A) Slutligt EBDS-prov av ett murint nyfött. (1) Gallblåsan, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Tolvfingertarmen. Skalstreck = 500 μm. (B) Storleksdimensionen för den dissekerade EBDS jämfört med en millimeterskala. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Längsgående sektion av EBDS. Hematoxylin-eosinfärgning visar EBDS som innehåller en öppen lumen. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Viktutveckling för C57BL/6-nyfödda fram till deras nionde levnadsdag. Nyfödda vägdes upp till två gånger om dagen. Tillhandahållna data visar kontrolldjurens vikt (n = 5). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel rapporterade och diskuterade skapandet och valideringen av ett nytt kirurgiskt tillvägagångssätt för att ta bort EBDS av avlivade neonatala möss. Mikroskopiska och histologiska fynd avslöjar att tillvägagångssättet snabbt upptäcker EBD och dissekerar dem nära kanalens marginaler, även hos neonatala möss. Endast kirurgiska instrument och ett mikroskop med 20x förstoring krävs för det beskrivna protokollet. Dessutom möjliggör tillvägagångssättet isolering av hela EBDS. Tekniken är mycket effektiv, enkel och enkel att replikera.
För studier av gallgångssjukdomar som gallgångsatresi, PSC och PBC krävs ofta mekanisk extraktion av hela gallgångssystemet. På grund av den lilla storleken, särskilt hos nyfödda, är det svårt att dissekera, bearbeta och analysera. Isoleringen av extrahepatiska duktala celler från 1 dag gamla nyfödda mus EBD har redan fastställts, men metoden har beskrivits som svår. I allmänhet kämpar individer som är nya i denna procedur på grund av tekniska utmaningar med dissektionsteknikerna samt rengöring av de små gallgångarna5. Därför undersökte den operativa arbetsgruppen en ny strategi för att förbereda EBDS i en neonatal musmodell. I den aktuella studien möjliggör tekniken en effektiv dissektion av varje prov. Nyfödda offrades vid 9 dagars ålder och gallgångar skördades enligt beskrivningen i protokollet. Dessutom var tekniken också tillämplig på yngre nyfödda. Vissa individer dog eller var tvungna att offras innan de nådde dag nio, inklusive nyfödda som väger mindre än 2 g (kompletterande figur 1). Operatörer bör överväga en längre driftstid på grund av det neonatala utvecklingsstadiet. Vävnadsdifferentieringen är inte alltför avancerad, vilket komplicerar beredningen och ökar svårigheten jämfört med beredningen av vuxna prover.
En ytterligare bieffekt när det gäller preparatets svårighet är den stora möjligheten till oönskade celler i provet, vilket kan leda till kontaminering i cellkulturer. Däremot gör den nya dissektionstekniken det möjligt för oerfarna operatörer med nödvändig utrustning att ta bort EBDS så rent som möjligt. Som ett resultat är det ännu viktigare att använda det bästa möjliga tillvägagångssättet för EBD-dissektion hos neonatala grisar. Om den används enligt protokollet kommer den atraumatiska utrustningen, åtföljd av en skummatta, inte, eller bara mycket lite, att skada gallgången. Skumdynan kommer mjukt att motverka operatörens rörelser medan den dissekerar den oönskade vävnaden, innehållande celler som hepatocyter och fibroblaster i EBD utan att skada den. Faktum är att även gallan kan bevaras. Dessutom beskriver protokollet säker åtkomst till gallgångssystemet på grund av försiktigt framsteg lager för lager. Som ett resultat kommer medfödda abnormiteter och peritoneala vidhäftningar att vara synliga innan någon vävnad skadas.
En viktig kirurgisk princip under operation i syfte att avlägsna (t.ex. tumörresektion eller cholecystektomi hos levande individer) är att skona så mycket frisk vävnad som möjligt. Tillämpligheten av denna princip måste begäras för utförandet av kirurgisk beredning i avlivade möss. För EBD-dissektion beslutades att inte skona levervävnaden utan snarare utföra en EbR av EBDS, lever och duodenal corpus, vilket visade sig vara en stor teknisk fördel och vara mindre svårt än att uteslutande ta bort EBD från bukhålan. Efter EbR överfördes en-bloc-provet till en skummatta för rörelse av levervävnad och förorenande rester.
Användningen av alternativa kirurgiska tekniker för att avlägsna det fullständiga extrahepatiska gallgångssystemet kan inte övervägas för musberedning efter eutanasi. Anledningen till detta är sekvensen av operationsrörelser; top-down förberedelse, som namnet antyder, börjar på toppen (i detta fall gallblåsan) och fortskrider till korsningen av tolvfingertarmen och Ductus choledochus. För att börja, ta bort gallblåsan från levervävnaden, sedan den cystiska kanalen och slutligen den vanliga lever- och ductus choledochus till korsningen av tolvfingertarmen och ductus choledochus. Denna isoleringsteknik som användes intraoperativt i buken hos neonatala möss resulterade i gallgångsskada eller lindning av den isolerade gallgången. Spolningen orsakades av att greppet var för löst. Det är extremt svårt att lokalisera gallgången efter lindning. För att försöka undvika lindning i ytterligare dissektioner drogs gallgången eller det länkade falciforma ligamentet åt fastare, vilket stoppar oönskad spolning men kan leda till cellskador med dåliga resultat vid den efterföljande histologiska undersökningen. För dissektion av enstaka gallblåsan rekommenderas dissektion uppifrån och ner.
I en alternativ teknik görs bottom-up-preparatet i motsatt ordning. Preparatet börjar vid korsningen av tolvfingertarmen och Ductus choledochus. För det andra måste tolvfingertarmen dras ner kaudalt med hjälp av atraumatiska tångar med höger hand, vilket orsakar en sträcka av hepatoduodenalbandet och därmed avslöjar gallgången. Under tiden, använd de atraumatiska tångarna i vänster hand för att komma åt omental bursa och upprätthålla spänningen på hepatoduodenal ligament. Från och med tolvfingertarmen kan en noggrann beredning upp till sammanflödet av den cystiska och den gemensamma leverkanalen uppnås. Men medan ytterligare dissekering av leverns cystiska kanal och gallblåsan kan spänningar byggas upp vid en punkt, vilket resulterar i att gallgången rivs och lindas. Experimenten visade att bottom-up-preparat endast rekommenderas för dissektion av Ductus choledochus hos nyfödda möss.
Sammanfattningsvis visade top-down och bottom-up-preparat signifikanta nackdelar med att förbereda nyfödda möss. Som ett resultat utvecklades den nya modellen för att uppnå dissektion av hela EBDS lättare, vilket gör det möjligt att identifiera och överföra gallgångsplatser till senare undersökta histologiska sammanhang på ett tillförlitligt och effektivt sätt.
Förutom mekaniska och kirurgiska tillvägagångssätt har enzymatisk matsmältning blivit mer relevant vid vävnadsbehandling under de senaste decennierna 5,12. Högrenade enzymer ger ett exakt alternativ till målspecifika strukturer utan att skada de celler som valts ut för ytterligare experiment.
Isoleringen av extra- och intrahepatiska kolangiocyter har framgångsrikt etablerats hos möss och råttor 5,13,14,15,16. Båda teknikerna möjliggör dock isolering av enstaka celler när en intakt gallgång är avgörande för vissa tekniker - särskilt histologiska tillvägagångssätt. Dessutom, även för cellodlingsmetoder, kräver alla publicerade studier ett mekaniskt dissektionssteg före enzymatisk matsmältning utan att tillhandahålla ett detaljerat steg-för-steg-protokoll. Föregående dissektion resulterar i en minskning av cellodlingskontaminering, vilket bevisar att dissektionstekniken kommer att vara fördelaktig för histologiska och olika experimentella tillvägagångssätt.
I början kan tekniken kräva lite tid för träning. Övning kommer att öka hastigheten och resultatet. Operatörer kan vara säkra på att helt enkelt att följa steg-för-steg-metoden kommer att leda till enkel reproducerbarhet och korrekt isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna erkänner Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl och Magdalena Trochimiuk för deras bidrag. Hans Christian Schmidt fick ekonomiskt stöd av Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME-stipendiet (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
