Summary
मुराइन नवजात पित्त नली विकारों के अवलोकन के लिए, एक बरकरार पित्त नली और कुशल तैयारी की आवश्यकता होती है। इसलिए, पित्त नली की अखंडता को बनाए रखते हुए मुराइन नवजात शिशुओं में पूरे एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली प्रणाली को अलग करने के लिए एक नया दृष्टिकोण सफलतापूर्वक विकसित किया गया था।
Abstract
मुराइन नवजात पित्त नलिकाओं के विच्छेदन को कठिन के रूप में वर्णित किया गया है। वर्णित मानक संचालन प्रक्रिया का मुख्य उद्देश्य तैयारी के दौरान पित्त नली को नुकसान पहुंचाए बिना माउस नवजात शिशुओं में एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली (ईबीडी) का अलगाव है। कोलेंजियोसाइट्स सेल लाइन और पूरे एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली प्रणाली (ईबीडीएस) की कटाई की तुलना में इसकी असाधारण रूप से करीबी तैयारी के कारण, वर्णित दृष्टिकोण नवजात पित्त नली विकारों के पशु मॉडल पर शोध करने में बेहद उपयोगी है, जैसे कि पित्त एट्रेसिया। इच्छामृत्यु के बाद, पेरिटोनियल गुहा तक पहुंच बनाई गई थी, और पित्त नली प्रणाली, ग्रहणी और यकृत को अद्वितीय एन-ब्लॉक-रिसेक्शन (ईबीआर) के साथ निकाला गया था। निकाले गए नमूने को फोम मैट पर रखा जाता है, और ईबीडी को आवश्यक स्पर्श के बिना दर्दनाक रूप से दूषित कोशिकाओं से विच्छेदित किया जाता है। पूरे ईबीडीएस का विच्छेदन इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है। पित्त नली ऊतक के छोटे आकार और मात्रा के कारण सावधानी बरतनी चाहिए। वर्णित तकनीक का उपयोग करके, कोलेंजियोसाइट्स को कोई नुकसान नहीं होता है। इसके अलावा, तकनीक की शुद्धता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (एन = 10)। इसलिए, बेहतर रूप से तुलनीय नमूने काटे जा सकते हैं। इसके अलावा, पित्त नली ऊतक को कोई नुकसान नहीं पहुंचाया जाता है, क्योंकि पित्त नली प्रणाली के साथ किसी भी संपर्क को तैयारी के दौरान टाला जा सकता है, पित्ताशय के अंदर पित्त द्रव छोड़ दिया जाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, अंतिम पित्ताशय और पित्त नली विच्छेदन करते समय, इसे निचोड़ने के बिना पित्त नली के केवल थोड़े पार्श्व में दर्दनाक सूक्ष्म उपकरणों का उपयोग किया गया था। यह एक साफ और बरकरार नमूने की कुंजी है, और आगे हिस्टोलॉजिकल जांच या कोलेंजियोसाइट्स के अलगाव के लिए आवश्यक है। संक्षेप में, वर्णित अभिनव विच्छेदन तकनीक विशेष रूप से अनुभवहीन ऑपरेटरों को ईबीडीएस को यथासंभव सफाई से अलग करने के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ सक्षम बनाती है।
Introduction
पित्त एट्रेसिया, प्राथमिक स्क्लेरोसिंग चोलैंगिटिस (पीएससी), और प्राथमिक पित्त चोलैंगिटिस (पीबीसी) जैसे कोलेंजियोपैथियों की उत्पत्ति और प्रगति या तो अज्ञात या अपूर्ण हैं। उन बीमारियों की उत्पत्ति और प्रगति की सीमित समझ चिकित्सा विकल्पों की कमी की ओरले जाती है। नवजात पित्त नली विकारों का अध्ययन करने में सबसे कठिन बाधा पैथोफिज़ियोलॉजी की आणविक समझ प्राप्त कर रही है। आणविक विकृति की बेहतर समझ के लिए आवश्यक कुंजी में से एक प्रभावित ऊतक का सबसे अच्छा संभव अवलोकन है। अनुसंधान के बीच कम तुलनात्मकता और विसंगतियों से बचने के लिए, जैसे कि बाइलरी एट्रेसिया4 के संभावित वायरल एटियलजि का अवलोकन करना, प्रदर्शन विच्छेदन तकनीकों की सर्वोत्तम संभव तैयारी और साझाकरण की आवश्यकता उत्पन्न होती है। लक्ष्य ऊतक की एक शुद्ध तैयारी बाद में सूक्ष्म जांच या प्रजनन सेल- और 3 डी-ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए आवश्यक है। हालांकि, मुराइन नवजात विकारों में, ऊतक के नमूने दुर्लभ होते हैं और बहुत छोटे आकार के कारण केवल थोड़ी मात्रा में होते हैं। पित्त नली विकारों के बारे में, मुराइन नवजात शिशुओं में पित्त नलिकाओं की साफ तैयारी में कठिनाइयोंका वर्णन किया गया है। विकास के नवजात चरण के कारण, ऊतक भेदभाव अत्यधिक उन्नत नहीं होता है, जो तैयारी को जटिल बनाता है और वयस्क नमूनों की तैयारी की तुलना में कठिनाई को बढ़ाता है। इसलिए, ऑपरेटिंग वर्कग्रुप ने नवजात माउस मॉडल में ईबीडीएस तैयार करने के लिए एक नई रणनीति की जांच की। वर्तमान अध्ययन में, तकनीक प्रत्येक नमूने के एक कुशल विच्छेदन की अनुमति देती है।
पित्त नली प्रणाली को यकृत से उत्पन्न होने वाले दाहिने ऊपरी पेट में इंट्रापेरिटोनियल रूप से रखा जाता है। पित्ताशय यकृत के दाहिने लोब की आंत की सतह के नीचे स्थित होता है। पित्त नली, पोर्टल नस और यकृत धमनी के साथ, हेपेटोडोडेनल लिगामेंट में एम्बेडेड है। यह यकृत और ग्रहणी को सीधे जोड़ता है और ग्रहणी 6 में पित्त द्रव को बाहरनिकालता है। शारीरिक रूप से, पित्त नली को दाएं और बाएं यकृत नलिकाओं, सामान्य यकृत नलिका, सिस्टिक वाहिनी और डक्टस कोलेडोचस में विभाजित किया जाता है, जो सिस्टिक वाहिनी और सामान्य यकृत वाहिनी7 के संगम से बनता है। यह अंततः पित्त द्रव और लार को अग्नाशयी नलिका से डुओडेनम में खाली कर देता है।
कोलेंजियोसाइट्स पित्त नली को इंट्रा- और एक्स्ट्राहेपेटिक रूप से पंक्तिबद्ध करते हैं, जो एक जटिल शारीरिक आला में रहते हैं जहां वे पित्त उत्पादन और होमियोस्टेसिस8 में सहायता करते हैं। पित्त द्रव इन विशेष उपकला कोशिकाओं को दैनिक उच्च सांद्रता में पारित करता है। विशेष रूप से, पित्त एसिड विषाक्ततासे बचाने के लिए एचसीओ 3- छाता रखरखाव बहुत महत्वपूर्ण है। कोलेंजियोसाइट्स हेपेटोबिलरी सिस्टम में रक्षा की पहली पंक्ति है, उदाहरण के लिए, ल्यूमिनल सूक्ष्मजीव10। विषाक्त हमलों के खिलाफ कोलेंजियोसाइट्स की रक्षा प्रभावकारिता आनुवंशिक प्रवृत्ति से कमजोर हो सकती है। एक विषाक्त अधिभार क्षति और विनाश का कारण बनता है और इसलिए कोलेंजियोपैथी का कारण बन सकता है। इसके अलावा, विकासशील पित्त नली सभी आत्म-सुरक्षात्मक तंत्रों में पूरी तरह से सक्षम नहीं है, जिससे नवजात पित्तनलिकाओं में पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों के लिए उच्च संवेदनशीलता होती है।
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Protocol
नैतिक अनुमोदन (एन045/2021) के बाद, नर और मादा सी 57बीएल /6 चूहों नवजात शिशुओं को 9 दिन की उम्र तक देखा गया था। जानवरों का जन्म और प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर हैम्बर्ग-एपेंडोर्फ, हैम्बर्ग, जर्मनी की पशु सुविधा द्वारा प्रदान किया गया था। नवजात शिशुओं को उनके मूल जानवरों के साथ एक पिंजरे में रखा गया था। पर्यावरणीय परिस्थितियों को तापमान (20-24 डिग्री सेल्सियस), 12:12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र और 40% -70% की सापेक्ष आर्द्रता में नियंत्रित किया गया था।
1. प्रयोगात्मक तैयारी
- सर्जिकल ऑपरेशन के लिए आवश्यक उपकरण तैयार करें, जिसमें कैंची, फोर्स आदि शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
- ऑपरेशन टेबल के बगल में एक बाँझ सतह पर कीटाणुरहित और आटोक्लेव उपकरण रखें।
- एक पी 9-आयु वर्ग के नवजात माउस को जल्दी से एक ऑपरेटिंग कैंची के साथ डिकैपिटेशन करके इच्छामृत्यु करें। एक बाँझ ऑपरेशन क्षेत्र पर इच्छामृत्यु नवजात माउस के शरीर को रखें। 9 दिन के माउस नवजात शिशुओं में ईबीडीएस का विच्छेदन करें (चरण 5)।
नोट: वर्णित विच्छेदन प्रक्रिया किसी भी वैज्ञानिक को नवजात और पुराने चूहों से ईबीडीएस को हटाने के लिए उचित उपकरण देती है। माउस जितना पुराना होगा, तैयारी उतनी ही आसान होगी।
2. पेरिटोनियल गुहा तक पहुंच
- मूत्राशय के स्थान के ऊपर की त्वचा को बल के साथ समझें। पेरिटोनियम और अंतर्निहित संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना कैंची का उपयोग करके त्वचा में 2 मिमी व्यास के छेद को इंजेक्ट करें। बाएं सामने एक्सिलर लाइन का पालन करते हुए, कट को डिकैपिटेशन के स्थान पर विस्तारित करें। त्वचा को बाईं से दाईं ओर की ओर दर्दनाक बल के साथ हटा दें।
- तिल्ली के आसपास के पेरिटोनियम को पकड़ें। धीरे से इसे तब तक उठाएं जब तक पेरिटोनियम एक तम्बू जैसी संरचना जैसा न हो जाए और केंद्र में 1 मिमी व्यास का छेद काट दें। हवा से भरने के लिए "पेरिटोनियल तम्बू" की प्रतीक्षा करें। इसके लिए 10x माइक्रोस्कोपिक आवर्धन का उपयोग करें और निम्नलिखित चरणों का उपयोग करें।
- यकृत, पित्त नली प्रणाली, पेट, छोटी आंतों और बृहदान्त्र तक पूर्ण पहुंच सुनिश्चित करने के लिए निचली पसलियों, दोनों पार्श्व पेट क्षेत्रों और निचले मूत्राशय क्षेत्र द्वारा तैयार की गई खिड़की में पेरिटोनियम को काट दें।
नोट: जिगर तक पहुंच में सुधार करने के लिए, एक अतिरिक्त चीरा लगाया जा सकता है, जिसमें xiphoid प्रक्रिया, फाल्सीफॉर्म लिगामेंट, यकृत और पित्त नली संरचनाओं को बरकरार रखते हुए तीन सबसे कम पसलियों को हटा दिया जाता है। जिगर का दृश्य प्राप्त करना आसान है।
3. पित्ताशय और पित्त नलिकाओं की परीक्षा
नोट: निम्नलिखित सभी चरणों के दौरान नियमित आधार पर नमूना गीला रखना सुनिश्चित करें।
- पित्ताशय की जांच करने के लिए एक क्रैनियोवेंट्रल स्थिति में xiphoid प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक खींचें।
नोट: इस गति के साथ फाल्सीफॉर्म लिगामेंट पर तनाव बढ़ जाता है, और संलग्न पित्ताशय दिखाई देने लगता है।- फाल्सीफॉर्म लिगामेंट के अनियंत्रित फटने से बचने के लिए केवल थोड़ा सा खिंचाव करें, जिससे पित्त नली प्रणाली से पित्ताशय फट सकता है। अगले चरण से पहले xiphoid प्रक्रिया के खिंचाव को छोड़ दें।
- पित्त नली प्रणाली को मुक्त करने के लिए ग्रहणी को धीरे से नीचे खींचें।
नोट: जैसे-जैसे हेपेटोडोडेनल लिगामेंट पर तनाव बढ़ता है, पित्त नली ऊतक दिखाई देने लगता है।
4. एन-ब्लॉक-रिसेक्शन
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए निचला एन-ब्लॉक-मोबिलाइजेशन करें।
- ग्रहणी पैपिला की पहचान करें, जो पित्त नली प्रणाली को ग्रहणी से जोड़ता है।
- ग्रहणी को पैपिला के दाईं ओर से लगभग 2 सेमी काट लें।
- पाइलोरिक क्षेत्र के माध्यम से काटें। सुनिश्चित करें कि पेट की सामग्री काटने के स्थान और ग्रहणी पैपिला के बीच पाइलोरिक क्षेत्र में मौजूद है।
नोट: यह मौखिक और अबोरल ग्रहणी भागों के सही स्थान के लिए अभिविन्यास की बाद की सुरक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
- ऊपरी एन-ब्लॉक-मोबिलाइजेशन करें।
- धीरे से ज़िफॉइड प्रक्रिया को खींचें और फाल्सीफॉर्म लिगामेंट तक पहुंच प्राप्त करें।
- पित्ताशय और ज़िफॉइड प्रक्रिया के बीच, ज़िफॉइड प्रक्रिया के जितना संभव हो सके, फाल्सीफॉर्म लिगामेंट के माध्यम से 1 सेमी लंबा कट करें। सुनिश्चित करें कि पित्ताशय को नुकसान न पहुंचे।
- जिगर और वक्ष के बीच निम्नलिखित कनेक्टिंग संरचनाओं के माध्यम से काटें: अन्नप्रणाली, अवर वेना कावा, वक्ष महाधमनी, यकृत के नंगे क्षेत्र को घेरने वाले सभी स्नायुबंधन, और सभी पृष्ठीय शेष ऊतक कनेक्शन।
नोट: एन-ब्लॉक नमूना पूरी तरह से विच्छेदित है। इसमें यकृत, पित्त नली प्रणाली और ग्रहणी कॉर्पस होता है, जो पेट के पाइलोरिक क्षेत्र से जुड़ा होता है।
5. अंतिम पित्ताशय और पित्त नली विच्छेदन
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सकल तैयारी करें।
- आमतौर पर निर्जलीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले फोम पैड पर एन-ब्लॉक नमूना रखें। इसके लिए 6 मिमी के अधिकतम टिप आकार के साथ 20x माइक्रोस्कोपिक आवर्धन और दो माइक्रोसर्जिकल एट्रोमेटिक फोर्सेस का उपयोग करें और निम्नलिखित चरणों का उपयोग करें।
- फोम पैड पर नमूना इकट्ठा करें। नमूने को सही शारीरिक स्थिति में पुनर्गठित करें। ग्रहणी के मौखिक और अबोरल हिस्से को समतल करें, एक कोमल आंदोलन का प्रदर्शन करें।
- ग्रहणी पैपिला पर आंदोलन शुरू करें और दर्दनाक बल का उपयोग करके काटने के किनारों तक जारी रखें। पेट की सफेद गूदेदार सामग्री को चिकना करें, जो केवल ग्रहणी के मौखिक भाग में होगा। संभावित पित्त नली रोटेशन का पता लगाने के लिए ग्रहणी के मौखिक और अबोरल हिस्से की पहचान करना सुनिश्चित करें।
- पित्त नली का विच्छेदन शुरू करने के लिए यकृत ऊतक के बड़े अवशेषों को काट लें।
- अंतिम अलगाव करें।
- फोम मैट के छिद्रों में शेष यकृत ऊतक को धीरे से दबाएं। सुनिश्चित करें कि स्क्रैपिंग आंदोलन पित्त नली प्रणाली से शुरू होते हैं और यकृत सीमाओं की ओर ले जाते हैं।
- विभिन्न दिशाओं में कुछ स्क्रैपिंग आंदोलनों के बाद नमूने को फोम मैट पर एक क्लीनर स्थिति में स्थानांतरित करें। ईबीडीएस और अवांछित कोशिकाओं के बीच सर्वोत्तम संभव भेदभाव के लिए दृश्य को अनुकूलित करने के लिए पृष्ठभूमि में कम निचोड़े गए यकृत ऊतक के लाभ का उपयोग करें। पित्त नली से यकृत ऊतक को तब तक खुरचें जब तक कि यकृत ऊतक का कुछ भी नहीं, या जितना संभव हो उतना कम न हो।
- हेपेटोडोडेनल लिगामेंट को तब तक संसाधित करें जब तक कि पृथक ईबीडीएस न रह जाए। यकृत धमनी, पोर्टल नस और छोटे अवशेषों जैसे इंट्रालिगामेंटस रक्त वाहिकाओं को हटा दें। इस नाजुक फिलामेंट को, एक कोमल खिंचाव और उच्च देखभाल के साथ, बाईं पार्श्व तरफ निकालें। यह विच्छेदन चरण पहले से ही अनजाने में या आंशिक रूप से यकृत ऊतक के पूर्व हटाने के दौरान पूरा हो सकता है, जो अंत में एक ही परिणाम की ओर जाता है।
नोट: रक्त वाहिकाएं ग्रहणी पैपिला के लगभग 3-5 मिमी मौखिक रूप से एक सफेद और बहुत नाजुक फिलामेंट के रूप में उभर रही हैं और बाईं पार्श्व तरफ से हेपेटोडोडेनल लिगामेंट में शामिल होती हैं, पित्त नली के साथ ग्लिसोनियन ट्रायड में जमा होती हैं। इस चरण के पूरा होने के साथ, अंतिम नमूना पूरी तरह से अलग है। यदि रिकॉर्ड की आवश्यकता है, तो पित्त नली संरचनाओं को उनकी शारीरिक स्थिति में व्यवस्थित करने के बाद छवियों को कैप्चर किया जा सकता है (चित्रा 1)। फोम मैट पर अंतिम तैयारी चरणों को करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि नमूना ऑपरेशन क्षेत्र की सतह पर उतना नहीं चिपकेगा। यदि छिद्र गीले हैं, तो पित्त नली लेवेट या तैरती है। नमूने को स्थानांतरित करते समय, यह ऑपरेशन कपड़े पर तैयारी के साथ उतनी मजबूती से नहीं चिपकेगा, जिसके परिणामस्वरूप नमूने को स्थानांतरित करते समय कोई रिपिंग नहीं होगी।
6. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की तैयारी
- विच्छेदन के बाद अलग किए गए नमूने को जल्द से जल्द एक बफर समाधान, विशेष माध्यम, या फॉर्मेलिन युक्त फिक्सेटिव ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें।
- आगे योजनाबद्ध प्रसंस्करण चरणों के आधार पर एक उपयुक्त भंडारण समाधान चुनें।
सावधानी: तीव्र विषाक्तता, संक्षारकता और विभिन्न स्वास्थ्य खतरों के कारण केवल एक एयर वेंट के नीचे फॉर्मेलिन युक्त फिक्सेटिव का उपयोग करें।
नोट: प्रस्तुत अध्ययन में, ईबीडीएस नमूने पैराफॉर्मलडिहाइड में डाले गए हैं, निर्जलित हैं, और पैराफिन में एम्बेडेड हैं। उन्हें कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया गया है और सेक्शनिंग से पहले ठंडा किया गया है। वार्मिंग कैबिनेट में, 2 μm स्लाइस रात भर रखे गए थे और पारंपरिक हेमटोक्सिलिन और ईओसिन4 का उपयोग करके दाग दिया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
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Representative Results
चित्रा 1 ए एक मुराइन नवजात शिशु के ईबीडीएस को दर्शाता है, जिसे वर्णित तकनीक के साथ विच्छेदित किया गया था। माइक्रोस्कोपिक रूप से, कोई और यकृत ऊतक दिखाई नहीं देता है। प्रोटोकॉल के अंतिम अलगाव चरणों के दौरान यकृत ऊतक को हटा दिया गया है और आसानी से रंग और स्थिरता के बारे में पित्त नली ऊतक से अलग किया जा सकता है। चित्रा 1 बी मिलीमीटर पैमाने की तुलना में पृथक नमूना प्रदर्शित करता है। ईबीडी की लंबाई (पित्ताशय से ग्रहणी पैपिला तक मापा जाता है) 10 मिमी से कम है। बहुत नाजुक डक्टस कोलेडोकस का व्यास 0.05-0.2 मिमी से भिन्न होता है। चित्र 2 में खुले लुमेन के साथ ईबीडीएस के अनुदैर्ध्य खंड के हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधलापन को दर्शाया गया है। कोलेंजियोसाइट्स को लुमेन के आसपास एक मोनोलेयर और रंगे हुए गहरे रंग के रूप में पहचाना जा सकता है। माइक्रोस्कोपी 20x आवर्धन का उपयोग करके किया गया था। आंकड़े बताते हैं कि वर्णित विच्छेदन प्रोटोकॉल का उपयोग करने से ऑपरेटर को वाहिनी के मार्जिन के पास ईबीडीएस को सूक्ष्म रूप से विच्छेदित करने में सक्षम बनाता है, यहां तक कि नवजात चूहों में भी। नमूने 9 दिन के मुराइन नवजात शिशुओं से लिए गए थे।
चित्र 1: ईबीडीएस विच्छेदन( ए) एक मुराइन नवजात शिशु का अंतिम ईबीडीएस नमूना। (1) पित्ताशय, (2) डक्टस सिस्टिकस, (3) डक्टस हेपेटिकस डेक्सटर, (4) डक्टस हेपेटिकस भयावह, (5) डक्टस हेपेटिकस कम्यूनिस, (6) डक्टस कोलेडोचस, (7) डुओडेनम। स्केल बार = 500 μm. (B) एक मिलीमीटर स्केल की तुलना में विच्छेदित EBDS का आकार आयाम। स्केल पट्टी = 1 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: ईबीडीएस का अनुदैर्ध्य खंड। हेमेटॉक्सिलिन-ईओसिन धुंधला एक खुले लुमेन युक्त ईबीडीएस दिखाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पूरक चित्र 1: सी 57बीएल / 6-नवजात शिशुओं का वजन उनके जीवन के नौवें दिन तक विकास। नवजात शिशुओं को दिन में दो बार वजन किया जाता था। प्रदान किए गए डेटा नियंत्रण जानवरों (एन = 5) के वजन को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस लेख ने इच्छामृत्यु नवजात चूहों के ईबीडीएस को हटाने के लिए एक नए सर्जिकल दृष्टिकोण के निर्माण और सत्यापन की सूचना दी और चर्चा की। माइक्रोस्कोपिक और हिस्टोलॉजिकल निष्कर्षों से पता चलता है कि दृष्टिकोण जल्दी से ईबीडी का पता लगाता है और उन्हें वाहिनी के मार्जिन के पास विच्छेदित करता है, यहां तक कि नवजात चूहों में भी। वर्णित प्रोटोकॉल के लिए केवल सर्जिकल उपकरण और 20x आवर्धन के साथ एक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, दृष्टिकोण पूरे ईबीडीएस के अलगाव की अनुमति देता है। तकनीक अत्यधिक कुशल, सीधी और दोहराने के लिए सरल है।
पित्त नली रोगों जैसे पित्त एट्रेसिया, पीएससी और पीबीसी के अध्ययन के लिए, पूरे पित्त नली प्रणाली के यांत्रिक निष्कर्षण की अक्सर आवश्यकता होती है। छोटे आकार के कारण, विशेष रूप से नवजात शिशुओं में, विच्छेदन, प्रक्रिया और विश्लेषण करना मुश्किल है। 1 दिन के नवजात माउस ईबीडी के एक्स्ट्राहेपेटिक डक्टल कोशिकाओं का अलगाव पहले ही स्थापित किया जा चुका है, हालांकि, विधि को मुश्किल के रूप में वर्णित किया गया है। आम तौर पर, इस प्रक्रिया के लिए नए व्यक्ति विच्छेदन तकनीकों के साथ-साथ छोटे पित्त नलिकाओं की सफाई के साथ तकनीकीचुनौतियों के कारण संघर्ष करते हैं। इसलिए, ऑपरेटिंग वर्कग्रुप ने नवजात माउस मॉडल में ईबीडीएस तैयार करने के लिए एक नई रणनीति की जांच की। वर्तमान अध्ययन में, तकनीक प्रत्येक नमूने के एक कुशल विच्छेदन की अनुमति देती है। नवजात शिशुओं को 9 दिनों की उम्र में बलिदान किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित पित्त नलिकाओं को काटा गया था। इसके अलावा, तकनीक युवा नवजात शिशुओं में भी लागू थी। कुछ व्यक्तियों की मृत्यु हो गई या नौवें दिन तक पहुंचने से पहले बलिदान किया जाना पड़ा, जिसमें 2 ग्राम से कम वजन वाले नवजात शिशु शामिल थे (पूरक चित्र 1)। ऑपरेटरों को विकास के नवजात चरण के कारण लंबे समय तक परिचालन समय पर विचार करना चाहिए। ऊतक भेदभाव अत्यधिक उन्नत नहीं है, जो तैयारी को जटिल बनाता है और वयस्क नमूनों की तैयारी की तुलना में कठिनाई बढ़ाता है।
तैयारी की कठिनाई के बारे में एक और दुष्प्रभाव नमूने में अवांछित कोशिकाओं की उच्च संभावना है, जिससे सेल संस्कृतियों में संदूषण हो सकता है। इसके विपरीत, उपन्यास विच्छेदन तकनीक अनुभवहीन ऑपरेटरों को ईबीडीएस को यथासंभव साफ करने के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ सक्षम बनाती है। नतीजतन, नवजात चूहों में ईबीडी विच्छेदन के लिए सबसे अच्छा तरीका उपयोग करना और भी महत्वपूर्ण है। यदि प्रोटोकॉल में बताए गए अनुसार उपयोग किया जाता है, तो फोम मैट के साथ दर्दनाक उपकरण, पित्त नली को घायल नहीं करेगा, या बस थोड़ा सा। फोम पैड अवांछित ऊतक को विच्छेदित करते समय ऑपरेटर के आंदोलनों का धीरे से मुकाबला करेगा, जिसमें हेपेटोसाइट्स और ईबीडी के फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाएं होती हैं। वास्तव में, यहां तक कि पित्त को संरक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल परत दर परत सावधानीपूर्वक प्रगति के कारण पित्त नली प्रणाली तक सुरक्षित पहुंच का वर्णन करता है। नतीजतन, जन्मजात असामान्यताएं और पेरिटोनियल आसंजन किसी भी ऊतक के क्षतिग्रस्त होने से पहले दिखाई देंगे।
हटाने के उद्देश्य से ऑपरेशन के दौरान एक प्रमुख शल्य चिकित्सा सिद्धांत (उदाहरण के लिए, जीवित व्यक्तियों में ट्यूमर रिसेक्शन या कोलेसिस्टेक्टोमी) जितना संभव हो उतना स्वस्थ ऊतक को छोड़ना है। इच्छामृत्यु वाले चूहों में शल्य चिकित्सा की तैयारी के निष्पादन के लिए इस सिद्धांत की प्रयोज्यता का अनुरोध किया जाना चाहिए। ईबीडी विच्छेदन के लिए, यकृत ऊतक को नहीं छोड़ने का निर्णय लिया गया था, बल्कि ईबीडीएस, यकृत और ग्रहणी कॉर्पस का ईबीआर किया गया था, जो एक महान तकनीकी लाभ साबित हुआ और पेट की गुहा से ईबीडी को विशेष रूप से हटाने की तुलना में कम कठिन था। ईबीआर के बाद, एन-ब्लॉक नमूने को यकृत ऊतक के आंदोलन और दूषित अवशेषों के लिए फोम मैट में स्थानांतरित कर दिया गया था।
इच्छामृत्यु के बाद माउस की तैयारी के लिए पूर्ण एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली प्रणाली को हटाने के लिए वैकल्पिक शल्य चिकित्सा तकनीकों के उपयोग पर विचार नहीं किया जा सकता है। इसका कारण ऑपरेशन आंदोलनों का अनुक्रम है; टॉप-डाउन तैयारी, जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, शीर्ष पर शुरू होती है (इस मामले में, पित्ताशय) और ग्रहणी और डक्टस कोलेडोचस के जंक्शन तक प्रगति करता है। शुरू करने के लिए, यकृत ऊतक से पित्ताशय को हटा दें, फिर सिस्टिक वाहिनी, और अंत में आम यकृत और डक्टस कोलेडोचस को ग्रहणी और डक्टस कोलेडोचस के जंक्शन पर ले जाएं। नवजात चूहों के पेट में इंट्राऑपरेटिव रूप से उपयोग की जाने वाली इस अलगाव तकनीक के परिणामस्वरूप पित्त नली की चोट या पृथक पित्त नली का कुंडलन हुआ। पकड़ बहुत ढीली होने के परिणामस्वरूप कॉइलिंग हुई थी। कॉइलिंग के बाद पित्त नली का पता लगाना बेहद मुश्किल है। आगे के विच्छेदन में कॉइलिंग से बचने का प्रयास करते हुए, पित्त नली या जुड़े फाल्सीफॉर्म लिगामेंट को अधिक मजबूती से कस दिया गया था, जो अवांछित कॉइलिंग को रोकता है लेकिन बाद में हिस्टोलॉजिकल परीक्षा पर खराब परिणामों के साथ सेलुलर क्षति का परिणाम हो सकता है। एकल पित्ताशय विच्छेदन के लिए, टॉप-डाउन विच्छेदन की सलाह दी जाती है।
एक वैकल्पिक तकनीक में, निचले क्रम में तैयारी विपरीत क्रम में की जाती है। तैयारी ग्रहणी और डक्टस कोलेडोचस के जंक्शन पर शुरू होती है। दूसरा, ग्रहणी को दाहिने हाथ से दर्दनाक बल का उपयोग करके पुच्छल रूप से नीचे खींचने की आवश्यकता होती है, जिससे हेपेटोडोडोडेनल लिगामेंट का खिंचाव होता है और इस प्रकार पित्त नली का पता चलता है। इस बीच, ओमेंटल बर्सा तक पहुंचने और हेपेटोडोडेनल लिगामेंट पर तनाव बनाए रखने के लिए बाएं हाथ में एट्रोमेटिक फोर्सप्स का उपयोग करें। ग्रहणी से शुरू होकर, सिस्टिक और सामान्य यकृत वाहिनी के संगम तक एक सटीक तैयारी प्राप्त करने योग्य है। हालांकि, यकृत की सिस्टिक नली और पित्ताशय को आगे विच्छेदित करते समय, एक बिंदु पर तनाव का निर्माण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप पित्त नली फट और कुंडलित हो सकती है। प्रयोगों से पता चला कि निचले स्तर की तैयारी केवल नवजात चूहों में डक्टस कोलेडोचस के विच्छेदन के लिए सलाह दी जाती है।
संक्षेप में, ऊपर-नीचे और नीचे-ऊपर की तैयारी ने नवजात चूहों को तैयार करने में महत्वपूर्ण कमियों का प्रदर्शन किया। नतीजतन, नए मॉडल को पूर्ण ईबीडीएस के विच्छेदन को आसान बनाने के लिए विकसित किया गया था, जो पित्त नली के स्थानों को पहचानने और स्थानांतरित करने की अनुमति देता है ताकि बाद में हिस्टोलॉजिकल संदर्भों की विश्वसनीय और कुशलता से जांच की जा सके।
यांत्रिक और शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण के अलावा, एंजाइमेटिक पाचन पिछले दशकों में ऊतक प्रसंस्करण में अधिक प्रासंगिक हो गया है। अत्यधिक शुद्ध एंजाइम आगे के प्रयोगों के लिए चुनी गई कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना विशिष्ट संरचनाओं को लक्षित करने के लिए एक सटीक विकल्प प्रदान करते हैं।
चूहों और चूहों में 5,13,14,15,16 अतिरिक्त और इंट्राहेपेटिक कोलेंजियोसाइट्स का अलगाव सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है। हालांकि, दोनों तकनीकें एकल कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देती हैं जब एक बरकरार पित्त नली कुछ तकनीकों के लिए महत्वपूर्ण होती है- विशेष रूप से हिस्टोलॉजिकल दृष्टिकोण में। इसके अतिरिक्त, सेल संस्कृति दृष्टिकोण के लिए भी, सभी प्रकाशित अध्ययनों को एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किए बिना एंजाइमेटिक पाचन से पहले एक यांत्रिक विच्छेदन चरण की आवश्यकता होती है। पूर्ववर्ती विच्छेदन के परिणामस्वरूप सेल संस्कृति संदूषण में कमी आती है, यह साबित करते हुए कि विच्छेदन तकनीक हिस्टोलॉजिकल और विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के लिए फायदेमंद होगी।
शुरुआत में, तकनीक को प्रशिक्षण के लिए कुछ समय की आवश्यकता हो सकती है। अभ्यास करने से गति और परिणाम में वृद्धि होगी। ऑपरेटरों को विश्वास हो सकता है कि केवल चरण-दर-चरण दृष्टिकोण का पालन करने से आसान प्रजनन क्षमता और सटीक अलगाव होगा।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
लेखकों ने जोहाना हेगन्स, पॉलीन शूपर्ट, क्लारा फिलिपी, पीडी डॉ मेड क्रिश्चियन टॉमसचैट, स्वेन्जा वार्नके, पीडी डॉ डायना लिंडनर, प्रोफेसर डॉ डिर्क वेस्टरमैन, मिरियम टॉमकज़क, निकोल लुडर, नादिन कुर्ज़ावा, डॉ। हंस क्रिश्चियन श्मिट को एल्स क्रोनर-फ्रेसेनियस-स्टिफटंग आईप्रिम छात्रवृत्ति (2021_EKPK.10), यूकेई, हैम्बर्ग द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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