Summary
For observasjon av murine neonatale gallekanalforstyrrelser, er det nødvendig med en intakt gallekanal og effektiv forberedelse. Derfor ble en ny tilnærming for å isolere hele det ekstrahepatiske gallekanalsystemet i murine nyfødte vellykket utviklet samtidig som gallekanalens integritet ble opprettholdt.
Abstract
Disseksjonen av murine neonatale gallekanaler har blitt beskrevet som vanskelig. Hovedmålet med den beskrevne standard operasjonsprosedyren er isolering av den ekstrahepatiske gallekanalen (EBD) hos musenyfødte uten å skade gallekanalen under tilberedning. På grunn av sin eksepsjonelt tette forberedelse sammenlignet med kolangiocyttcellelinjen og høsting av hele ekstrahepatisk gallekanalsystem (EBDS), er den beskrevne tilnærmingen ekstremt nyttig ved forskning på dyremodeller av nyfødte gallekanalforstyrrelser, som galde atresi. Etter eutanasi ble bukhulen tilgjengelig, og gallekanalsystemet, tolvfingertarmen og leveren ble ekstrahert med den unike En-bloc-Resection (EbR). Den ekstraherte prøven plasseres på en skummatte, og EBD dissekeres fra forurensende celler atraumatisk uten nødvendig berøring. Disseksjonen av hele EBDS er en betydelig fordel ved denne metoden. Forsiktighet må utvises på grunn av den lille størrelsen og mengden gallekanalvev. Ved hjelp av den beskrevne teknikken er det ingen skade på kolangiocytter. Videre er renheten av teknikken reproduserbar (n = 10). Derfor kan optimalt sammenlignbare prøver høstes. Videre er ingen gallekanalvev skadet, fordi enhver kontakt med gallekanalsystemet kan unngås under tilberedning, og etterlater gallevæsken inne i galleblæren. Viktigst, mens du utfører den endelige galleblæren og gallegangsdisseksjonen, ble atraumatiske mikroinstrumenter bare brukt litt lateral av gallekanalen uten å klemme den. Dette er nøkkelen til en ren og intakt prøve, og avgjørende for videre histologisk undersøkelse eller isolering av kolangiocytter. For å oppsummere, gjør den beskrevne innovative disseksjonsteknikken det mulig for spesielt uerfarne operatører med nødvendig utstyr å isolere EBDS så rent som mulig.
Introduction
Opprinnelsen og progresjonen av kolangiopatier som biliær atresi, primær skleroserende kolangitt (PSC) og primær biliær kolangitt (PBC) er enten ukjent eller ufullstendig 1,2. Den begrensede forståelsen av opprinnelsen og progresjonen av disse sykdommene fører til mangel på behandlingsalternativer3. Det vanskeligste hinderet for å studere neonatale gallegangsforstyrrelser er å få en molekylær forståelse av patofysiologien. En av de viktigste nøklene til en bedre forståelse av molekylær patologi er best mulig observasjon av berørt vev. For å unngå redusert sammenlignbarhet og avvik mellom forskning, for eksempel å observere potensiell viral etiologi av biliær atresi4, oppstår behovet for best mulig forberedelse og deling av de utførte disseksjonsteknikkene. En ren fremstilling av målvevet er nødvendig for senere mikroskopiske undersøkelser eller avl av celle- og 3D-organoidkulturer. Men i murine neonatale lidelser er vevsprøver sjeldne og forekommer bare i liten mengde på grunn av den svært små størrelsen. Når det gjelder gallegangsforstyrrelser, er det beskrevet vanskeligheter med rent preparat av gallekanaler hos murine nyfødte5. På grunn av det neonatale utviklingsstadiet er vevsdifferensiering ikke altfor avansert, noe som kompliserer forberedelsen og øker vanskeligheten sammenlignet med utarbeidelsen av voksenprøver. Derfor undersøkte operasjonsarbeidsgruppen en ny strategi for å forberede EBDS i en neonatal musemodell. I denne studien tillater teknikken en effektivdisseksjon av hver prøve.
Gallekanalsystemet er intraperitonealt plassert i høyre øvre del av magen, som oppstår fra leveren. Galleblæren ligger under den viscerale overflaten av leverens høyre lobe. Gallekanalen, sammen med portalvenen og leverarterien, er innebygd i hepatoduodenal ligament. Den forbinder leveren og tolvfingertarmen direkte og drenerer gallevæske inn i tolvfingertarmen6. Anatomisk er gallekanalen delt inn i høyre og venstre leverkanaler, den vanlige leverkanalen, den cystiske kanalen og Ductus choledochus, som dannes ved sammenløpet av den cystiske kanalen og den vanlige leverkanalen7. Denne tømmer til slutt gallevæske og spytt fra bukspyttkjertelen inn i tolvfingertarmen via Ampulla of Vater.
Kolangiocytter strekker gallekanalen intra- og ekstrahepatisk, og bor i en komplisert anatomisk nisje hvor de bistår i galleproduksjon og homeostase8. Gallevæske passerer disse spesialiserte epitelceller i høye konsentrasjoner daglig. Spesielt er HCO3-paraplyvedlikeholdet svært viktig for å beskytte mot gallesyretoksisitet9. Kolangiocytter er den første forsvarslinjen i hepatobiliærsystemet mot for eksempel luminale mikroorganismer10. Kolangiocyttenes forsvarseffekt mot toksiske overgrep kan svekkes av genetisk disposisjon. En giftig overbelastning forårsaker skade og ødeleggelse og kan derfor føre til kolangiopatier. Videre er den utviklende gallekanalen ikke helt i stand til alle selvbeskyttende mekanismer, noe som fører til høyere følsomhet for miljøgifter i neonatale gallekanaler11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etter etisk godkjenning (N045/2021) ble hann- og hunnmus C57BL/6-mus observert til de var 9 dager gamle. Dyrene ble født og gitt til eksperimentelle formål av dyreanlegget ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland. De nyfødte ble plassert i et bur sammen med sine foreldredyr. Miljøforholdene ble kontrollert i temperatur (20-24 ° C), 12:12 timers lys-mørk syklus og relativ fuktighet på 40% -70%.
1. Eksperimentell forberedelse
- Forbered det nødvendige utstyret for kirurgisk operasjon, inkludert saks, tang, etc. (se Materialtabell).
- Plasser desinfiserte og autoklaverte instrumenter på en steril overflate ved siden av operasjonsbordet.
- Avliv en P9-alderen neonatal mus raskt ved halshugging med en operasjonssaks. Plasser kroppen til den euthaniserte nyfødte musen på et sterilt operasjonsfelt. Disseker EBDS-ene i 9 dager gamle musenyfødte (trinn 5).
MERK: Den beskrevne disseksjonsprosedyren gir enhver forsker de riktige verktøyene for å fjerne EBDS fra neonatale og eldre mus. Jo eldre musen, desto lettere er preparatet.
2. Tilgang til bukhulen
- Ta tak i huden over plasseringen av urinblæren med tang. Snitt et hull på 2 mm diameter inn i huden ved hjelp av saks, uten å skade bukhinnen og underliggende strukturer. Utvid kuttet til stedet for halshuggingen, ved å følge venstre fremre aksillallinje. Fjern huden fra venstre til høyre side med atraumatisk tang.
- Ta tak i bukhinnen rundt milten. Løft den forsiktig opp til bukhinnen ligner en teltlignende struktur og kutt et hull på 1 mm i midten. Vent til "bukteltet" fylles opp med luft. Bruk en 10x mikroskopisk forstørrelse for dette og følgende trinn.
- Klipp av bukhinnen i et vindu innrammet av de nedre ribbeina, begge laterale bukregioner, og det nedre blæreområdet for å sikre full tilgang til leveren, gallekanalsystemet, magen, tynntarmen og tykktarmen.
MERK: For å forbedre tilgangen til leveren, kan et ekstra snitt utføres, fjerne de tre laveste ribbeina mens du forlater xiphoidprosessen, falciform ligament, lever og gallekanalstrukturer intakt. Utsikten over leveren er lett å få tak i.
3. Undersøkelse av galleblæren og gallekanalene
MERK: Sørg for å holde prøven våt regelmessig under alle de følgende trinnene.
- Trekk forsiktig xiphoidprosessen i en kranioventral stilling for å undersøke galleblæren.
MERK: Spenningen på falciform ligament øker med denne bevegelsen, og den vedlagte galleblæren blir synlig.- Utfør bare et lite trekk for å unngå ukontrollabel rive av falciform ligament, noe som kan føre til at galleblæren rives fra gallekanalsystemet. Slipp trekket av xiphoidprosessen før neste trinn.
- Trekk forsiktig ned tolvfingertarmen for å frigjøre gallekanalsystemet.
MERK: Når spenningen på hepatoduodenal ligament øker, blir gallegangsvevet synlig.
4. En-bloc-reseksjon
- Utfør den lavere en-bloc-mobiliseringen ved å følge trinnene nedenfor.
- Identifiser duodenal papilla, som forbinder gallekanalsystemet til tolvfingertarmen.
- Skjær gjennom tolvfingertarmen ca 2 cm fra til høyre lateral side av papillen.
- Skjær gjennom pylorisk område. Sørg for at mageinnholdet er tilstede i pylorisk område mellom skjærestedet og duodenal papilla.
MERK: Dette er et viktig skritt for senere orienteringssikkerhet for riktig plassering av orale og aborale duodenale deler.
- Utfør den øvre en-bloc-mobiliseringen.
- Trekk forsiktig xiphoidprosessen og få tilgang til falciform ligament.
- Utfør en 1 cm lang kutt gjennom falciform ligamentet, så nært som mulig til xiphoid-prosessen, mellom galleblæren og xiphoid-prosessen. Pass på at du ikke skader galleblæren.
- Skjær gjennom følgende forbindelsesstrukturer mellom leveren og thoraxen: spiserør, dårligere vena cava, thorax aorta, alle leddbånd som omgir det nakne området av leveren, og alle dorsalt gjenværende vevforbindelser.
MERK: En-bloc-prøven er fullstendig dissekert. Den inneholder leveren, gallekanalsystemet og duodenal corpus, som er forbundet med pylorisk region i magen.
5. Endelig galleblære og gallegangsdisseksjon
- Utfør bruttopreparatet ved å følge trinnene nedenfor.
- Plasser en-bloc-prøven på en skumpute som vanligvis brukes til dehydrering. Bruk en 20x mikroskopisk forstørrelse og to mikrokirurgiske atraumatiske tang med en maksimal spissstørrelse på 6 mm for dette og følgende trinn.
- Monter prøven på skumputen. Omorganiser prøven i riktig anatomisk posisjon. Flat den muntlige og aborale delen av tolvfingertarmen, og utfør en mild bevegelse.
- Start bevegelsen ved duodenal papilla og fortsett til forkantene ved hjelp av atraumatiske tang. Glatt ut det hvite masseinnholdet i magen, som bare vil forekomme i den orale delen av tolvfingertarmen. Sørg for å identifisere den orale og aborale delen av tolvfingertarmen for å utelukke sannsynlig gallekanalrotasjon.
- Klipp bort store rester av levervev for å begynne disseksjon av galdekanalen.
- Utfør den endelige isolasjonen.
- Trykk forsiktig det gjenværende levervevet inn i porene i skummatten. Sørg for at skrapebevegelsene starter fra gallekanalsystemet og fører til levergrensene.
- Overfør prøven til en renere posisjon på skummatten etter noen skrapebevegelser i forskjellige retninger. Bruk fordelen med mindre presset levervev i bakgrunnen for å optimalisere visningen for best mulig differensiering mellom EBDS og uønskede celler. Skrap levervevet fra gallekanalen til ingenting, eller så lite som mulig, av levervevet forblir.
- Behandle hepatoduodenal ligament til den isolerte EBDS forblir. Fjern intraligamentale blodkar som leverarterien, portalvenen og små rester. Fjern dette delikate filamentet, med et forsiktig trekk og høy pleie, til venstre sideside. Dette disseksjonstrinnet kan allerede ha startet utilsiktet eller delvis fullført under tidligere fjerning av levervev, noe som til slutt fører til samme resultat.
MERK: Blodkarene fremstår som et hvitt og veldig delikat filament ca. 3-5 mm oralt av duodenal papilla og blir med i hepatoduodenal ligament fra venstre sideside, akkumuleres med gallekanalen til glissonian triaden. Når dette trinnet er fullført, er den endelige prøven helt isolert. Hvis det er behov for en registrering, kan bilder tas etter at gallekanalstrukturene er organisert i sin anatomiske posisjon (figur 1). Det anbefales å gjøre de siste forberedelsestrinnene på en skummatte fordi prøven ikke vil feste seg så mye til overflaten av operasjonsfeltet. Hvis porene er våte, svever eller flyter gallekanalen. Når du flytter prøven, vil den ikke feste seg så fast som den ville gjort med forberedelse på operasjonsduken, noe som resulterer i ingen ripping mens du flytter prøven.
6. Forberedelse til histologisk analyse
- Sett den isolerte prøven i en bufret løsning, spesialmedium eller formalinholdige fiksativer (se materialtabell) så snart som mulig etter disseksjonen.
- Velg en egnet lagringsløsning avhengig av videre planlagte behandlingstrinn.
FORSIKTIG: Bruk formalinholdige fiksativer bare under en luftventil på grunn av akutt toksisitet, korrosivitet og ulike helsefarer.
MERK: I den presenterte studien har EBDS-prøvene blitt satt inn i paraformaldehyd, dehydrert og innebygd i paraffin. De har blitt oppbevart i romtemperatur og avkjølt før seksjonering. I et varmeskap ble 2 μm skiver holdt over natten og farget ved hjelp av konvensjonelt hematoksylin og eosin4 (se Materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser EBDS hos en murine nyfødt, som ble dissekert med den beskrevne teknikken. Mikroskopisk er ikke ytterligere levervev synlig. Levervevet er fjernet i løpet av de siste isolasjonstrinnene i protokollen og kan lett skilles fra gallegangsvev med hensyn til farge og konsistens. Figur 1B viser den isolerte prøven sammenlignet med en millimeterskala. EBDs lengde (målt fra galleblære til duodenal papilla) er mindre enn 10 mm. Diameteren på den meget delikate Ductus choledochus varierte fra 0,05-0,2 mm. Figur 2 viser hematoksylin-eosinfarging av en langsgående del av EBDS med et åpent lumen. Kolangiocyttene kan identifiseres rundt lumen som et monolag og farges mørkere. Mikroskopi ble utført med 20x forstørrelse. Tallene viser at bruk av den beskrevne disseksjonsprotokollen gjør det mulig for operatøren å mikroskopisk dissekere EBDS nær kanalens marginer, selv hos nyfødte mus. Prøvene ble tatt fra 9 dager gamle murine nyfødte.
Figur 1: EBDS-disseksjon . (A) Endelig EBDS-prøve av en murine nyfødt. (1) Galleblære, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Skalalinje = 500 μm. (B) Størrelsesdimensjon for den dissekerte EBDS sammenlignet med en millimeterskala. Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Longitudinell del av EBDS. Hematoksylin-eosinfarging viser EBDS som inneholder et åpent lumen. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Vektutvikling av C57BL/6-nyfødte til niende levedag. Nyfødte ble veid opptil to ganger om dagen. Gitte data viser vekten av kontrolldyr (n = 5). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen rapporterte og diskuterte opprettelsen og valideringen av en ny kirurgisk tilnærming for å fjerne EBDS av euthaniserte neonatale mus. Mikroskopiske og histologiske funn avslører at tilnærmingen raskt oppdager EBD og dissekerer dem nær kanalens marginer, selv hos nyfødte mus. Bare kirurgiske instrumenter og et mikroskop med 20x forstørrelse er nødvendig for den beskrevne protokollen. Videre tillater tilnærmingen isolering av hele EBDS. Teknikken er svært effektiv, grei og enkel å replikere.
For studier av gallegangssykdommer som galdeatresi, PSC og PBC, er det ofte nødvendig med mekanisk ekstraksjon av hele gallekanalsystemet. På grunn av den lille størrelsen, spesielt hos nyfødte, er det vanskelig å dissekere, behandle og analysere. Isoleringen av ekstrahepatiske duktale celler av 1 dag gamle nyfødte mus EBD er allerede etablert, men metoden har blitt beskrevet som vanskelig. Vanligvis sliter personer som er nye i denne prosedyren på grunn av tekniske utfordringer med disseksjonsteknikkene samt rensing av de små gallegangene5. Derfor undersøkte operasjonsarbeidsgruppen en ny strategi for å forberede EBDS i en neonatal musemodell. I denne studien tillater teknikken en effektivdisseksjon av hver prøve. Nyfødte ble ofret ved 9 dagers alder og gallekanaler ble høstet som beskrevet i protokollen. Videre var teknikken også anvendelig hos yngre nyfødte. Noen døde eller måtte ofres før de nådde dag ni, inkludert nyfødte som veide mindre enn 2 g (supplerende figur 1). Operatører bør vurdere en lengre driftstid på grunn av det nyfødte utviklingsstadiet. Vevsdifferensieringen er ikke altfor avansert, noe som kompliserer forberedelsen og øker vanskeligheten sammenlignet med fremstillingen av voksenprøver.
En ytterligere bivirkning angående vanskeligheten med preparatet er den høye muligheten for uønskede celler i prøven, noe som kan føre til forurensning i cellekulturer. I motsetning til dette gjør den nye disseksjonsteknikken det mulig for uerfarne operatører med nødvendig utstyr å fjerne EBDS så rent som mulig. Som et resultat er det enda mer kritisk å bruke den beste tilnærmingen som er mulig for EBD-disseksjon hos nyfødte mus. Hvis det brukes som angitt i protokollen, vil det atraumatiske utstyret, ledsaget av en skummatte, ikke, eller bare veldig lite, skade gallekanalen. Skumputen vil mykt motvirke operatørens bevegelser mens du dissekerer det uønskede vevet, som inneholder celler som hepatocytter og fibroblaster av EBD uten å skade det. Faktisk kan selv gallen bevares. I tillegg beskriver protokollen sikker tilgang til gallekanalsystemet på grunn av forsiktig fremgang lag for lag. Som et resultat vil medfødte abnormiteter og peritoneale adhesjoner være synlige før noe vev er skadet.
Et viktig kirurgisk prinsipp under operasjonen med sikte på fjerning (f.eks. Tumorreseksjon eller cholecystektomi hos levende individer) er å spare så mye sunt vev som mulig. Anvendelsen av dette prinsippet må etterspørres for utførelse av kirurgisk forberedelse hos euthanatiserte mus. For EBD-disseksjonen ble det besluttet å ikke spare levervevet, men heller utføre en EbR av EBDS, lever og duodenal corpus, som viste seg å være en stor teknisk fordel og å være mindre vanskelig enn utelukkende å fjerne EBD fra bukhulen. Etter EbR ble en-bloc-prøven overført til en skummatte for bevegelse av levervev og forurensende rester.
Bruk av alternative kirurgiske teknikker for å fjerne det komplette ekstrahepatiske gallekanalsystemet kan ikke vurderes for musepreparasjon etter eutanasi. Årsaken til dette er sekvensen av operasjonsbevegelser; top-down forberedelse, som navnet antyder, begynner øverst (i dette tilfellet galleblæren) og utvikler seg til krysset mellom tolvfingertarmen og Ductus choledochus. For å begynne, fjern galleblæren fra levervevet, deretter den cystiske kanalen, og til slutt den vanlige leveren og ductus choledochus til krysset mellom tolvfingertarmen og ductus choledochus. Denne isolasjonsteknikken som ble brukt intraoperativt i magen til nyfødte mus, resulterte i gallekanalskade eller kveiling av den isolerte gallekanalen. Spolingen ble forårsaket som et resultat av at grepet var for løst. Det er ekstremt vanskelig å lokalisere gallekanalen etter kveiling. Gallekanalen eller det koblede falciforme ligamentet ble forsøkt å unngå spoling i ytterligere disseksjoner, noe som stopper uønsket spolering, men kan resultere i cellulær skade med dårlig utfall ved den påfølgende histologiske undersøkelsen. For enkelt galleblæredisseksjon anbefales ovenfra og ned disseksjon.
I en alternativ teknikk gjøres bottom-up-forberedelsen i motsatt rekkefølge. Preparatet starter ved krysset mellom tolvfingertarmen og Ductus choledochus. For det andre må tolvfingertarmen trekkes ned kaudalt ved hjelp av atraumatiske tang med høyre hånd, noe som forårsaker en strekning av hepatoduodenal ligament og dermed avslører gallekanalen. I mellomtiden bruker du atraumatiske tang i venstre hånd for å få tilgang til omental bursa og opprettholde spenning på hepatoduodenal ligament. Fra og med tolvfingertarmen er et nøyaktig preparat opp til sammenløpet av den cystiske og den vanlige leverkanalen oppnåelig. Imidlertid, mens ytterligere dissekering av leverens cystiske kanal og galleblære, kan spenningen bygge seg opp på et tidspunkt, noe som resulterer i at gallekanalen rives og kveiles. Forsøkene viste at bottom-up preparat kun anbefales for disseksjon av Ductus choledochus hos nyfødte mus.
For å oppsummere viste top-down og bottom-up preparater betydelige ulemper ved å forberede nyfødte mus. Som et resultat ble den nye modellen utviklet for å oppnå disseksjon av hele EBDS lettere, noe som gjør det mulig å identifisere og overføre gallekanalsteder for senere å undersøke histologiske sammenhenger pålitelig og effektivt.
I tillegg til mekaniske og kirurgiske tilnærminger har enzymatisk fordøyelse blitt mer relevant i vevsbehandling de siste tiårene 5,12. Høyt rensede enzymer gir et presist alternativ til å målrette mot spesifikke strukturer uten å skade cellene som er valgt for videre eksperimenter.
Isoleringen av ekstra- og intrahepatiske kolangiocytter er vellykket etablert hos mus og rotter 5,13,14,15,16. Imidlertid tillater begge teknikkene å isolere enkeltceller når en intakt gallekanal er kritisk for visse teknikker - spesielt histologiske tilnærminger. I tillegg, selv for cellekulturtilnærminger, krever alle publiserte studier et mekanisk disseksjonstrinn før enzymatisk fordøyelse uten å gi en detaljert trinnvis protokoll. Foregående disseksjon resulterer i en reduksjon av cellekulturforurensning, noe som viser at disseksjonsteknikken vil være fordelaktig for histologiske og ulike eksperimentelle tilnærminger.
I begynnelsen kan teknikken kreve litt tid til trening. Øvelse vil øke hastigheten og utfallet. Operatører kan være sikre på at bare å følge trinnvis tilnærming vil føre til enkel reproduserbarhet og nøyaktig isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl og Magdalena Trochimiuk for deres bidrag. Hans Christian Schmidt ble økonomisk støttet av Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
