Summary
Voor de observatie van muizennenatale galwegaandoeningen zijn een intact galkanaal en een efficiënte voorbereiding vereist. Daarom werd met succes een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het isoleren van het gehele extrahepatische galkanaalsysteem bij muizenne neonaten met behoud van de integriteit van het galkanaal.
Abstract
De dissectie van murine neonatale galwegen is beschreven als moeilijk. Het belangrijkste doel van de beschreven standaard operatieprocedure is de isolatie van het extrahepatische galkanaal (EBD) bij muizennexanen zonder het galkanaal tijdens de bereiding te beschadigen. Vanwege de uitzonderlijk nauwe voorbereiding in vergelijking met de cellijn van cholangiocyten en het oogsten van het gehele extrahepatische galwegsysteem (EBDS), is de beschreven aanpak uiterst nuttig bij het onderzoeken van diermodellen van pasgeboren galwegaandoeningen, zoals galwegesie. Na euthanasie werd de peritoneale holte ontsloten en werden het galwegsysteem, de twaalfvingerige darm en de lever geëxtraheerd met de unieke En-bloc-Resectie (EbR). Het geëxtraheerde monster wordt op een schuimmat geplaatst en de EBD wordt atraumatisch ontleed van verontreinigende cellen zonder noodzakelijke aanraking. De dissectie van de gehele EBDS is een belangrijk voordeel van deze methode. Voorzichtigheid is geboden vanwege de kleine omvang en hoeveelheid galwegweefsel. Met behulp van de beschreven techniek is er geen schade aan de cholangiocyten. Verder is de zuiverheid van de techniek reproduceerbaar (n = 10). Hierdoor kunnen optimaal vergelijkbare monsters worden geoogst. Bovendien wordt geen galwegweefsel beschadigd, omdat elk contact met het galwegsysteem tijdens de voorbereiding kan worden vermeden, waardoor de galvloeistof in de galblaas achterblijft. Het belangrijkste is dat tijdens het uitvoeren van de uiteindelijke galblaas- en galwegdissectie, atraumatische micro-instrumenten slechts licht lateraal van het galkanaal werden gebruikt zonder erin te knijpen. Dit is de sleutel tot een schoon en intact monster en essentieel voor verder histologisch onderzoek of de isolatie van cholangiocyten. Samenvattend stelt de beschreven innovatieve dissectietechniek vooral onervaren operators met de nodige apparatuur in staat om de EBDS zo schoon mogelijk te isoleren.
Introduction
Het ontstaan en de progressie van cholangiopathieën zoals galatresie, primaire scleroserende cholangitis (PSC) en primaire gal cholangitis (PBC) zijn onbekend of onvolledig 1,2. Het beperkte begrip van de oorsprong en progressie van die ziekten leidt tot een gebrek aan therapiemogelijkheden3. Het moeilijkste obstakel bij het bestuderen van neonatale galwegaandoeningen is het verkrijgen van een moleculair begrip van de pathofysiologie. Een van de essentiële sleutels tot een beter begrip van moleculaire pathologie is de best mogelijke observatie van aangetast weefsel. Om verminderde vergelijkbaarheid en discrepanties tussen onderzoek te voorkomen, zoals het observeren van potentiële virale etiologie van galatresie4, ontstaat de behoefte aan de best mogelijke voorbereiding en het delen van de uitgevoerde dissectietechnieken. Een zuivere voorbereiding van het doelweefsel is noodzakelijk voor latere microscopische onderzoeken of het kweken van cel- en 3D-organoïde culturen. Bij muizennenatale aandoeningen zijn weefselmonsters echter zeldzaam en komen ze slechts in een kleine hoeveelheid voor vanwege de zeer kleine omvang. Met betrekking tot galwegaandoeningen zijn problemen beschreven bij een schone voorbereiding van galwegen bij muizenne neonaten5. Vanwege het neonatale stadium van ontwikkeling is weefseldifferentiatie niet overdreven geavanceerd, wat de voorbereiding bemoeilijkt en de moeilijkheid verhoogt in vergelijking met de voorbereiding van volwassen monsters. Daarom onderzocht de operationele werkgroep een nieuwe strategie voor het bereiden van de EBDS in een neonatale muismodel. In deze studie maakt de techniek een efficiënte verdeling van elk monster mogelijk.
Het galwegsysteem wordt intraperitoneaal in de rechter bovenbuik geplaatst, voortkomend uit de lever. De galblaas bevindt zich onder het viscerale oppervlak van de rechterkwab van de lever. Het galkanaal is samen met de poortader en de leverslagader ingebed in het hepatoduodenale ligament. Het verbindt de lever en de twaalfvingerige darm rechtstreeks en voert galvloeistof af naar de twaalfvingerige darm6. Anatomisch is het galkanaal verdeeld in de rechter- en linkerhepatische kanalen, het gemeenschappelijke leverkanaal, het cystische kanaal en het Ductus choledochus, dat wordt gevormd door de samenvloeiing van het cystische kanaal en het gemeenschappelijke leverkanaal7. Deze leegt uiteindelijk galvocht en speeksel uit het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm via de Ampulla van Vater.
Cholangiocyten bekleden het galkanaal intra- en extrahepatisch en wonen in een gecompliceerde anatomische niche waar ze helpen bij galproductie en homeostase8. Galvloeistof passeert deze gespecialiseerde epitheelcellen dagelijks in hoge concentraties. Met name het onderhoud van de HCO3-paraplu is erg belangrijk voor de bescherming tegen galzuurtoxiciteit9. Cholangiocyten zijn de eerste verdedigingslinie in het hepatobiliaire systeem tegen bijvoorbeeld luminale micro-organismen10. De afweereffectiviteit van de cholangiocyten tegen toxische aanvallen kan worden verzwakt door genetische aanleg. Een toxische overbelasting veroorzaakt schade en vernietiging en kan daarom leiden tot cholangiopathieën. Bovendien is het zich ontwikkelende galkanaal niet volledig in staat tot alle zelfbeschermende mechanismen, wat leidt tot een hogere gevoeligheid voor milieutoxines in neonatale galwegen11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Na ethische goedkeuring (N045/2021) werden mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen neonaten waargenomen tot 9 dagen oud. De dieren werden geboren en voor experimentele doeleinden verstrekt door de dierenfaciliteit van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland. De pasgeborenen werden samen met hun ouderdieren in een kooi gehuisvest. De omgevingsomstandigheden werden gecontroleerd in temperatuur (20-24 °C), 12:12 uur licht-donkercyclus en relatieve vochtigheid van 40% -70%.
1. Experimentele voorbereiding
- Bereid de vereiste apparatuur voor chirurgische ingrepen voor, inclusief een schaar, tang, enz. (zie Materiaaltabel).
- Plaats gedesinfecteerde en geautoclaveerde instrumenten op een steriel oppervlak naast de operatietafel.
- Euthanaseer een P9-verouderde neonatale muis snel door onthoofding met een operatieschaar. Plaats het lichaam van de geëuthanaseerde neonatale muis op een steriel operatieveld. Ontleed de EBDS'en bij 9 dagen oude muizenne neonaten (stap 5).
OPMERKING: De beschreven dissectieprocedure geeft elke wetenschapper de juiste hulpmiddelen om de EBDS van neonatale en oudere muizen te verwijderen. Hoe ouder de muis, hoe gemakkelijker de voorbereiding.
2. Toegang tot de peritoneale holte
- Grijp de huid boven de locatie van de urineblaas met een tang. Snijd een gat met een diameter van 2 mm in de huid met een schaar, zonder het peritoneum en de onderliggende structuren te beschadigen. Breid de snede uit naar de locatie van de onthoofding, volgens de linker voorste axillarlijn. Verwijder de huid van links naar rechts met de atraumatische tang.
- Houd het peritoneum rond de milt vast. Til het voorzichtig op totdat het peritoneum lijkt op een tentachtige structuur en snijd een gat met een diameter van 1 mm in het midden. Wacht tot de "peritoneale tent" zich vult met lucht. Gebruik hiervoor een vergroting van 10x microscopisch klein en de volgende stappen.
- Snijd het peritoneum af in een venster omlijst door de onderste ribben, beide laterale buikgebieden en het onderste blaasgebied om volledige toegang tot de lever, het galwegsysteem, de maag, de dunne darm en de dikke darm te garanderen.
OPMERKING: Om de toegang tot de lever te verbeteren, kan een extra incisie worden uitgevoerd, waarbij de drie onderste ribben worden verwijderd terwijl het xiphoid-proces, falciforme ligament- en lever- en galwegstructuren intact blijven. Het zicht op de lever is gemakkelijk te verkrijgen.
3. Onderzoek van de galblaas en galwegen
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het monster regelmatig nat houdt tijdens alle volgende stappen.
- Trek voorzichtig het xiphoid-proces in een cranioventrale positie om de galblaas te onderzoeken.
OPMERKING: De spanning op het falciforme ligament neemt toe met deze beweging en de aangehechte galblaas wordt zichtbaar.- Voer slechts een lichte trek uit om oncontroleerbare scheuren van het falciforme ligament te voorkomen, wat kan leiden tot het scheuren van de galblaas uit het galwegsysteem. Laat de pull van het xiphoid-proces los voor de volgende stap.
- Trek de twaalfvingerige darm voorzichtig naar beneden om het galwegsysteem te bevrijden.
OPMERKING: Naarmate de spanning op het hepatoduodenale ligament toeneemt, wordt het galwegweefsel zichtbaar.
4. En-bloc-resectie
- Voer de lagere en-bloc-mobilisatie uit volgens de onderstaande stappen.
- Identificeer de duodenale papilla, die het galwegsysteem verbindt met de twaalfvingerige darm.
- Snijd door de twaalfvingerige darm ongeveer 2 cm van naar de rechter laterale kant van de papillen.
- Snijd door het pylorische gebied. Zorg ervoor dat de maaginhoud aanwezig is in het pylorische gebied tussen de snijlocatie en de duodenale papilla.
OPMERKING: Dit is een belangrijke stap voor latere oriëntatiebeveiliging voor de juiste locatie van orale en abortale duodenale delen.
- Voer de bovenste en-bloc-mobilisatie uit.
- Trek voorzichtig aan het xiphoid-proces en krijg toegang tot het falciforme ligament.
- Voer een 1 cm lange snede uit door het falciforme ligament, zo dicht mogelijk bij het xiphoid-proces, tussen de galblaas en het xiphoid-proces. Zorg ervoor dat u de galblaas niet beschadigt.
- Snijd door de volgende verbindingsstructuren tussen de lever en de thorax: slokdarm, inferieure vena cava, thoracale aorta, alle ligamenten die het kale gebied van de lever omringen en alle dorsaal resterende weefselverbindingen.
OPMERKING: Het en-bloc monster is volledig ontleed. Het bevat de lever, het galwegsysteem en het duodenale corpus, dat verbonden is met het pylorische gebied van de maag.
5. Uiteindelijke galblaas en galwegdissectie
- Voer de brutovoorbereiding uit volgens de onderstaande stappen.
- Plaats het en-bloc monster op een schuimkussen dat meestal wordt gebruikt voor uitdroging. Gebruik hiervoor een 20x microscopische vergroting en twee microchirurgische atraumatische tangen met een maximale tipgrootte van 6 mm.
- Monteer het monster op de schuimrubberen pad. Reorganiseer het monster in de juiste anatomische positie. Vlak het orale en aborale deel van de twaalfvingerige darm af en voer een zachte beweging uit.
- Start de beweging bij de duodenale papilla en ga verder naar de snijkanten met behulp van een atraumatische tang. Strijk de witte pulpachtige inhoud van de maag glad, die alleen in het orale deel van de twaalfvingerige darm zal voorkomen. Zorg ervoor dat u het orale en het aborale deel van de twaalfvingerige darm identificeert om een waarschijnlijke galwegrotatie uit te sluiten.
- Snijd grote resten van leverweefsel weg om de dissectie van het galkanaal te beginnen.
- Voer de laatste isolatie uit.
- Druk het resterende leverweefsel voorzichtig in de poriën van de schuimmat. Zorg ervoor dat de schraapbewegingen beginnen bij het galwegsysteem en leiden naar de levergrenzen.
- Breng het monster na een paar schraapbewegingen in verschillende richtingen over naar een schonere positie op de schuimmat. Gebruik het voordeel van minder geperst leverweefsel op de achtergrond om het beeld te optimaliseren voor de best mogelijke differentiatie tussen EBDS en ongewenste cellen. Schraap het leverweefsel uit het galkanaal totdat er niets of zo weinig mogelijk van het leverweefsel overblijft.
- Verwerk het hepatoduodenale ligament totdat de geïsoleerde EBDS overblijft. Verwijder intraligamenteuze bloedvaten zoals de leverslagader, poortader en kleine overblijfselen. Verwijder dit delicate filament, met een zachte trek en hoge zorg, naar de linker laterale kant. Deze dissectiestap kan al onbedoeld of gedeeltelijk zijn begonnen tijdens de voorafgaande verwijdering van leverweefsel, wat uiteindelijk tot hetzelfde resultaat leidt.
OPMERKING: De bloedvaten komen tevoorschijn als een witte en zeer delicate gloeidraad ongeveer 3-5 mm oraal van de duodenale papilla en verbinden het hepatoduodenale ligament vanaf de linker laterale kant, accumulerend met het galkanaal naar de glissoniaanse triade. Met de voltooiing van deze stap wordt het uiteindelijke monster volledig geïsoleerd. Als er behoefte is aan een record, kunnen beelden worden vastgelegd nadat de galwegstructuren in hun anatomische positie zijn georganiseerd (figuur 1). Het uitvoeren van de laatste voorbereidingsstappen op een schuimmat wordt aanbevolen omdat het monster niet zoveel aan het oppervlak van het operatieveld zal blijven plakken. Als de poriën nat zijn, zweeft of zweeft het galkanaal. Bij het verplaatsen van het monster zal het niet zo stevig plakken als bij de voorbereiding op het operatiedoekje, wat resulteert in geen scheuren tijdens het verplaatsen van het monster.
6. Voorbereiding voor histologische analyse
- Breng het geïsoleerde monster zo snel mogelijk na de dissectie in een gebufferde oplossing, speciaal medium of formalinehoudende fixatieven (zie materiaaltabel).
- Kies een geschikte opslagoplossing, afhankelijk van verdere geplande verwerkingsstappen.
LET OP: Gebruik formaline-bevattende fixatieven alleen onder een ventilatieopening vanwege acute toxiciteit, corrosie en diverse gezondheidsrisico's.
OPMERKING: In de gepresenteerde studie zijn de EBDS-monsters ingebracht in paraformaldehyde, gedehydrateerd en ingebed in paraffine. Ze zijn bij kamertemperatuur bewaard en afgekoeld voordat ze in sectie worden genomen. In een warmhoudkast werden plakjes van 2 μm 's nachts bewaard en gekleurd met conventionele hematoxyline en eosine4 (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont de EBDS van een muizenneaat, die met de beschreven techniek werd ontleed. Microscopisch is er geen verder leverweefsel zichtbaar. Het leverweefsel is verwijderd tijdens de laatste isolatiestappen van het protocol en kon gemakkelijk worden onderscheiden van galwegweefsel met betrekking tot kleur en consistentie. Figuur 1B toont het geïsoleerde monster in vergelijking met een millimeterschaal. De lengte van de EBD (gemeten van galblaas tot duodenale papilla) is minder dan 10 mm. De diameter van de zeer delicate Ductus choledochus varieerde van 0,05-0,2 mm. Figuur 2 toont hematoxyline-eosinekleuring van een lengtegedeelte van de EBDS met een open lumen. De cholangiocyten kunnen rond het lumen worden geïdentificeerd als een monolaag en donkerder worden geverfd. Microscopie werd uitgevoerd met behulp van 20x vergroting. De cijfers tonen aan dat het gebruik van het beschreven dissectieprotocol de operator in staat stelt om de EBDS microscopisch te ontleden in de buurt van de marges van het kanaal, zelfs bij neonatale muizen. De monsters werden genomen van 9 dagen oude muizenne neonaten.
Figuur 1: EBDS-dissectie. (A) Laatste EBDS-monster van een muizenneaat. (1) Galblaas, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Twaalfvingerige darm. Schaalbalk = 500 μm. (B) Groottedimensie van de ontleedde EBDS in vergelijking met een millimeterschaal. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Longitudinale sectie van de EBDS. Hematoxyline-eosinekleuring toont EBDS met een open lumen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Gewichtsontwikkeling van C57BL/6-pasgeborenen tot hun negende levensdag. Neonaten werden tot twee keer per dag gewogen. De verstrekte gegevens tonen het gewicht van de controledieren (n = 5). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel rapporteerde en besprak de creatie en validatie van een nieuwe chirurgische aanpak voor het verwijderen van de EBDS van geëuthanaseerde neonatale muizen. Microscopische en histologische bevindingen onthullen dat de aanpak snel EBD's detecteert en ze ontleedt in de buurt van de marges van het kanaal, zelfs bij neonatale muizen. Alleen chirurgische instrumenten en een microscoop met een vergroting van 20x zijn vereist voor het beschreven protocol. Bovendien maakt de aanpak de isolatie van de gehele EBDS mogelijk. De techniek is zeer efficiënt, eenvoudig en eenvoudig te repliceren.
Voor de studie van galwegaandoeningen zoals galwegatresie, PSC en PBC is vaak de mechanische extractie van het gehele galwegsysteem vereist. Vanwege het kleine formaat, vooral bij pasgeborenen, is het moeilijk om te ontleden, verwerken en analyseren. De isolatie van extrahepatische ductale cellen van 1 dag oude pasgeboren muis EBD's is al vastgesteld, maar de methode is beschreven als moeilijk. Over het algemeen worstelen personen die nieuw zijn in deze procedure vanwege technische uitdagingen met de dissectietechnieken en het reinigen van de kleine galwegen5. Daarom onderzocht de operationele werkgroep een nieuwe strategie voor het bereiden van de EBDS in een neonatale muismodel. In deze studie maakt de techniek een efficiënte verdeling van elk monster mogelijk. Pasgeborenen werden geofferd op de leeftijd van 9 dagen en galwegen werden geoogst zoals beschreven in het protocol. Verder was de techniek ook toepasbaar bij jongere pasgeborenen. Sommige personen stierven of moesten worden geofferd voordat dag negen werd bereikt, waaronder pasgeborenen die minder dan 2 g wogen (aanvullende figuur 1). Operators moeten rekening houden met een langere bedrijfstijd vanwege het neonatale stadium van ontwikkeling. De weefseldifferentiatie is niet overdreven geavanceerd, wat de voorbereiding bemoeilijkt en de moeilijkheid verhoogt in vergelijking met de voorbereiding van volwassen monsters.
Een andere bijwerking met betrekking tot de moeilijkheid van het preparaat is de grote kans op ongewenste cellen in het monster, wat kan leiden tot besmetting in celculturen. De nieuwe dissectietechniek daarentegen stelt onervaren operators met de nodige apparatuur in staat om de EBDS zo schoon mogelijk te verwijderen. Als gevolg hiervan is het nog belangrijker om de beste aanpak te gebruiken die haalbaar is voor EBD-dissectie bij neonatale muizen. Indien gebruikt zoals vermeld in het protocol, zal de atraumatische apparatuur, vergezeld van een schuimmat, het galkanaal niet of slechts zeer licht beschadigen. Het schuimkussen zal zachtjes de bewegingen van de operator tegengaan terwijl het ongewenste weefsel wordt ontleed, met cellen zoals hepatocyten en fibroblasten van de EBD zonder het te schaden. In feite kan zelfs de gal worden bewaard. Daarnaast beschrijft het protocol een veilige toegang tot het galwegsysteem door het voorzichtig doorlopen van laag voor laag. Als gevolg hiervan zullen aangeboren afwijkingen en peritoneale verklevingen zichtbaar zijn voordat weefsel wordt beschadigd.
Een belangrijk chirurgisch principe tijdens de operatie met als doel verwijdering (bijv. Tumorresectie of cholecystectomie bij levende personen) is om zoveel mogelijk gezond weefsel te sparen. De toepasbaarheid van dit principe moet worden gevraagd voor de uitvoering van chirurgische voorbereiding bij geëuthanaseerde muizen. Voor de EBD-dissectie werd besloten om het leverweefsel niet te sparen, maar eerder een EbR van de EBDS, lever en duodenale corpus uit te voeren, wat een groot technisch voordeel bleek te zijn en minder moeilijk was dan het uitsluitend verwijderen van de EBD uit de buikholte. Na de EbR werd het en-bloc monster overgebracht naar een schuimmat voor verplaatsing van leverweefsel en contaminerende resten.
Het gebruik van alternatieve chirurgische technieken om het volledige extrahepatische galwegsysteem te verwijderen, kan niet worden overwogen voor muisvoorbereiding na euthanasie. De reden hiervoor is de volgorde van de bedieningsbewegingen; top-down voorbereiding, zoals de naam al aangeeft, begint aan de bovenkant (in dit geval de galblaas) en gaat verder naar de kruising van de twaalfvingerige darm en de Ductus choledochus. Verwijder om te beginnen de galblaas uit het leverweefsel, vervolgens het cystische kanaal en ten slotte de gewone lever en ductus choledochus naar de kruising van de twaalfvingerige darm en ductus choledochus. Deze isolatietechniek die intraoperatief werd gebruikt in de buik van neonatale muizen resulteerde in galwegletsel of oprol van het geïsoleerde galkanaal. Het oprollen werd veroorzaakt doordat de greep te los zat. Het is uiterst moeilijk om het galkanaal te lokaliseren na het oprollen. In een poging om de coiling in verdere dissecties te voorkomen, werd het galkanaal of het gekoppelde falciforme ligament steviger aangespannen, wat ongewenste coiling stopt, maar kan resulteren in cellulaire schade met slechte resultaten bij het daaropvolgende histologische onderzoek. Voor enkelvoudige galblaasdissectie wordt top-down dissectie geadviseerd.
In een alternatieve techniek wordt de bottom-up bereiding in de tegenovergestelde volgorde gedaan. De voorbereiding begint op de kruising van de twaalfvingerige darm en de Ductus choledochus. Ten tweede moet de twaalfvingerige darm caudaal naar beneden worden getrokken met behulp van een atraumatische tang met de rechterhand, waardoor een rek van het hepatoduodenale ligament ontstaat en zo het galkanaal wordt onthuld. Gebruik in de tussentijd de atraumatische tang in de linkerhand om toegang te krijgen tot de omentale slijmbeurs en de spanning op het hepatoduodenale ligament te behouden. Te beginnen met de twaalfvingerige darm, is een nauwkeurige voorbereiding tot aan de samenvloeiing van de cystische en de gemeenschappelijke leverkanaal haalbaar. Tijdens het verder ontleden van het cystische kanaal en de galblaas van de lever, kan de spanning zich op een gegeven moment opbouwen, wat resulteert in het scheuren en oprollen van het galkanaal. De experimenten toonden aan dat bottom-up voorbereiding alleen wordt geadviseerd voor dissectie van de Ductus choledochus bij pasgeboren muizen.
Samenvattend, top-down en bottom-up preparaten vertoonden significante nadelen bij het bereiden van pasgeboren muizen. Als gevolg hiervan is het nieuwe model ontwikkeld om de dissectie van de complete EBDS gemakkelijker te maken, waardoor galweglocaties betrouwbaar en efficiënt kunnen worden geïdentificeerd en overgedragen aan later onderzochte histologische contexten.
Naast mechanische en chirurgische benaderingen is enzymatische spijsvertering de afgelopen decennia relevanter geworden in weefselverwerking 5,12. Sterk gezuiverde enzymen bieden een nauwkeurig alternatief om specifieke structuren aan te pakken zonder de cellen te beschadigen die zijn geselecteerd voor verdere experimenten.
De isolatie van extra- en intrahepatische cholangiocyten is met succes vastgesteld bij muizen en ratten 5,13,14,15,16. Beide technieken maken het echter mogelijk om afzonderlijke cellen te isoleren wanneer een intact galkanaal van cruciaal belang is voor bepaalde technieken, met name histologische benaderingen. Bovendien vereisen alle gepubliceerde studies, zelfs voor celkweekbenaderingen, een mechanische dissectiestap voorafgaand aan enzymatische spijsvertering zonder een gedetailleerd stapsgewijs protocol te bieden. Voorafgaande dissectie resulteert in een vermindering van celkweekbesmetting, wat bewijst dat de dissectietechniek voordelig zal zijn voor histologische en verschillende experimentele benaderingen.
In het begin kan de techniek enige tijd nodig hebben voor training. Oefenen zal de snelheid en het resultaat verhogen. Operators kunnen erop vertrouwen dat het simpelweg volgen van de stapsgewijze aanpak zal leiden tot eenvoudige reproduceerbaarheid en nauwkeurige isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl en Magdalena Trochimiuk voor hun bijdragen. Hans Christian Schmidt werd financieel ondersteund door de Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
