Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إعداد مصفوفات 3D Decellularized من العضلات الهيكلية للفأر الجنيني لزراعة الخلايا

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65069
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

Summary

في هذا العمل ، تم تحسين بروتوكول إزالة الخلايا للحصول على مصفوفات منزوعة الخلايا لعضلات الهيكل العظمي للفأر الجنيني. يمكن للخلايا العضلية C2C12 استعمار هذه المصفوفات والتكاثر والتمايز. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة سلوك الخلية في سياق أمراض العضلات الهيكلية مثل ضمور العضلات.

Abstract

تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في توفير الدعم الهيكلي للخلايا ونقل الإشارات المهمة لمختلف العمليات الخلوية. تبالغ نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في تبسيط التفاعلات المعقدة بين الخلايا و ECM ، حيث أن عدم وجود دعم ثلاثي الأبعاد (3D) كامل يمكن أن يغير سلوك الخلية ، مما يجعلها غير كافية لفهم العمليات في الجسم الحي . تعد أوجه القصور في تكوين ECM وتفاعلات الخلايا ECM من المساهمين المهمين في مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة.

أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل العضلي الخلقي LAMA2 (LAMA2-CMD) ، حيث يمكن أن يؤدي غياب أو تقليل اللامينين الوظيفي 211 و 221 إلى نقص شديد في التوتر ، يمكن اكتشافه عند الولادة أو بعدها بفترة وجيزة. يشير العمل السابق باستخدام نموذج فأر للمرض إلى أن ظهوره يحدث أثناء تكوين عضل الجنين. تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير نموذج 3D في المختبر يسمح بدراسة التفاعلات بين خلايا العضلات وعضلة الجنين ECM ، ومحاكاة البيئة المكروية الأصلية. يستخدم هذا البروتوكول عضلات الظهر العميقة التي تم تشريحها من أجنة الفئران E18.5 ، ومعالجتها بمخزن مؤقت منخفض التوتر ، ومنظف أنيوني ، و DNase. احتفظت المصفوفات الناتجة عن إزالة الخلايا (dECMs) بجميع بروتينات ECM التي تم اختبارها (laminin α2 ، و laminins الكلي ، و fibronectin ، والكولاجين I ، والكولاجين IV) مقارنة بالأنسجة الأصلية.

عندما تم زرع الخلايا العضلية C2C12 فوق هذه dECMs ، اخترقت واستعمرت dECMs ، مما دعم انتشارها وتمايزها. علاوة على ذلك ، أنتجت خلايا C2C12 بروتينات ECM ، مما ساهم في إعادة تشكيل مكانتها داخل dECMs. يوفر إنشاء هذه المنصة في المختبر نهجا واعدا جديدا لكشف العمليات التي ينطوي عليها ظهور LAMA2-CMD ، ولديه القدرة على التكيف مع أمراض العضلات الهيكلية الأخرى حيث تساهم أوجه القصور في الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية في تطور المرض.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون رئيسي للأنسجة ، تمثل مكونها غير الخلوي. لا يوفر هذا الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) الدعم المادي للخلايا فحسب ، بل يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات الكيميائية الحيوية التي ينطوي عليها تطور الكائناتالحية 1. يحدث تكوين ECM خاص بالأنسجة أثناء التطور ، نتيجة للتفاعلات المعقدة بين الخلايا ومنافذها ، والتي تتأثر بمحفزات مختلفة داخل وخارج الخلية. ECM هو هيكل ديناميكي للغاية يخضع لإعادة ترتيب كيميائية وميكانيكية بطريقة زمنية مكانية ويؤثر بشكل مباشر على مصير الخلية2. واحدة من أبرز خصائص ECM هي تنوعها الوظيفي ، حيث يعرض كل نسيج ECM مزيجا فريدا من الجزيئات التي توفر طوبولوجيا وخصائص مختلفة مصممة خصيصا للخلايا التي تحتوي عليها1.

تعد إشارات ودعم ECM أمرا بالغ الأهمية للتطور والتوازن ، وعندما تتعطل يمكن أن تؤدي إلى حالات مرضية متعددة 3,4. أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل الخلقي الناقص LAMA2 (LAMA2-CMD) ، وهو الشكل الأكثر شيوعا للضمور العضلي الخلقي. يشفر جين LAMA2 لسلسلة laminin α2 ، الموجودة في laminin 211 و laminin 221 ، وعندما يتحور يمكن أن يؤدي إلى LAMA2-CMD 5. Laminin 211 هو الشكل المتماثل الرئيسي الموجود في الغشاء القاعدي المحيط بألياف العضلات الهيكلية. عندما يكون laminin 211 غير طبيعي أو غائب ، يتم تعطيل الرابط بين الغشاء القاعدي وخلايا العضلات ، مما يؤدي إلى ظهور المرض6. يظهر المرضى الذين يعانون من LAMA2-CMD نمطا ظاهريا خفيفا إلى شديد اعتمادا على نوع الطفرة في جين LAMA2.

عندما تتأثر وظيفة بروتين laminin α2 ، يمكن للمرضى تجربة نقص التوتر العضلي الشديد عند الولادة وتطوير التهاب مزمن وتليف وضمور العضلات ، مما يؤدي إلى انخفاض متوسط العمر المتوقع. حتى الآن ، لم يتم تطوير أي علاجات مستهدفة وتقتصر الأساليب العلاجية على تخفيف أعراض المرض7. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية الأساسية التي ينطوي عليها ظهور هذا المرض أمر بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية المناسبة 6,8. يشير العمل السابق باستخدام فأر dyW 9 ، وهو نموذج ل LAMA2-CMD ، إلى أن ظهور المرض يبدأ في الرحم ، وتحديدا أثناء تكوين عضل الجنين10. إن الفهم الأفضل لكيفية ظهور عيب تكوين عضل الجنين سيكون بمثابة تغيير لقواعد اللعبة في توليد مناهج علاجية جديدة ل LAMA2-CMD.

توفر الأنظمة في المختبر بيئة خاضعة للرقابة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM ، لكن نماذج ثقافة 2D تفتقر إلى تعقيد الأنسجة الأصلية. ينتج عن إزالة الخلايا من الأنسجة سقالات ECM غير الخلوية الخاصة بالأنسجة ومرحلة النمو والتي تحاكي بدقة أكبر البيئة الدقيقة للخلايا الطبيعية مقارنة بنماذج 2D والسقالات الهندسية / الاصطناعية. المصفوفات منزوعة الخلايا (dECMs) لديها القدرة على الحفاظ على الإشارات الجزيئية والميكانيكية للأنسجة المضيفة ، مما يجعلها نماذج بديلة أفضل لفهم العمليات في الجسم الحي 11.

هناك العديد من التقنيات والكواشف والظروف التي يمكن استخدامها لإزالة الخلايا12,13. في هذه الدراسة ، تم تكييف بروتوكول إزالة الخلايا لقلب فأر الجنين ، الذي وصفه Silva et al.14،15 ، مع العضلات الهيكلية للفأر الجنيني ووجد أنه يحتفظ بجميع مكونات ECM المختبرة (laminin α2 ، الصفيحات الكلية ، الفبرونيكتين ، الكولاجين I ، والكولاجين IV). يتضمن البروتوكول ثلاث خطوات: تحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية (العازلة منخفضة التوتر) ، وانحلال غشاء البلازما وتفكك البروتين (0.05٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) ، والتدمير الأنزيمي للحمض النووي (علاج DNase). على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تم إنشاؤه لإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية للفأر.

لاستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد في المختبر لدراسة LAMA2-CMD ، من الضروري الحفاظ على سلسلة laminin α2 بعد إزالة الخلايا. لذلك ، تم تنفيذ بروتوكول التحسين حيث تم اختبار المنظفات المختلفة (SDS و Triton X-100) والتركيزات (0.02٪ و 0.05٪ و 0.1٪ و 0.2٪ و 0.5٪) (البيانات غير معروضة). تم العثور على الخيار الأمثل لإزالة الخلايا والحفاظ على بروتين laminin α2 ليكون 0.05 ٪ SDS. تم استخدام خلايا C2C12 ، وهي خط خلايا عضلية راسخة16,17 ، لزرع dECMs. تغزو هذه الخلايا dECM ، وتتكاثر ، وتتمايز داخل هذه السقالات ، وتوليف بروتينات ECM جديدة. يوفر الإنتاج الناجح لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجا جديدا لفهم العمليات الجزيئية والخلوية التي ينطوي عليها تكوين عضل الجنين ، وبداية LAMA2-CMD ، ويمكن أن يمتد إلى أمراض العضلات الأخرى حيث يتم تعطيل الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع المنهجيات الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان (ORBEA) التابعة لكلية العلوم ، جامعة لشبونة ، و Direção Geral de Veterinária (DGAV ؛ المرجع 0421/000/000/2022) ، وهي متوافقة مع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU.

1. إعداد المخازن المؤقتة لإزالة الخلايا والكواشف

ملاحظة: يجب تعقيم جميع المحاليل المستخدمة أثناء بروتوكول إزالة الخلايا عن طريق التعقيم وتخزينها لمدة تصل إلى 3 أشهر ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (10x PBS) بإضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) عند 137 mM ، كلوريد البوتاسيوم (KCl) عند 2.68 mM ، فوسفات البوتاسيوم والهيدروجين (KH 2 PO 4) عند 8.1 mM ، وثنائي هيدرات ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات (Na 2 HPO4) عند 1.47 mM إلى الماء منزوع المعادن (dH2O) وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. أضف 100 مل من 10x PBS إلى 900 مل من H2O منزوع المعادن لتوليد 1x PBS. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف محلول مخزون البنسلين / الستربتومايسين المعقم (10000 وحدة / مل من البنسلين و 10 مجم / مل من الستربتومايسين [قلم / بكتيريا العقدية]) إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ قبل الاستخدام.
  2. تحضير المخزن المؤقت منخفض التوتر عن طريق إذابة 1.21 جم من تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (قاعدة تريس) و 1 جم من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في 1 لتر من dH2O (10 mM Tris base 0.1٪ EDTA). استخدم محرك مغناطيسي حتى يذوب واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك. تعقيم عن طريق التعقيم وتخزينها في RT. أضف القلم/البكتيريا العقدية إلى تركيز نهائي قدره 1٪ قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل منخفض التوتر عن طريق إذابة 1.21 جم من قاعدة Tris في 1 لتر من dH2O (قاعدة Tris 10 mM). استخدم محرك مغناطيسي حتى يذوب واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام NaOH / HCl. الأوتوكلاف وتخزينها في RT. أضف القلم/البكتيريا إلى 1٪ قبل الاستخدام.
  4. قم بإعداد معالجة المنظفات الأنيونية بإضافة 0.05 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى 100 مل من محلول الغسيل منخفض التوتر لإنتاج محلول معالجة SDS بنسبة 0.05٪. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. تخزينها في RT لمدة تصل إلى 1 شهر.
    ملاحظة: لا ينبغي تعقيم محلول SDS ، حيث يترسب SDS ويتحلل عند التعقيم.
  5. تحضير محلول معالجة DNase عن طريق إذابة 1.21 g من قاعدة Tris في 0.5 mL من dH 2 O وإضافة 1مل من 1 M كلوريد المغنيسيوم (MgCl2). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام NaOH / HCl. الأوتوكلاف وتخزينها في RT. أضف DNase I قبل الاستخدام (50 وحدة / مل).

2. جمع العينات

ملاحظة: تم استخدام الفئران من النوع البري C57 / BL6 في الدراسة. أجريت جميع التقنيات في غطاء التدفق الصفحي تحت ظروف معقمة.

  1. القتل الرحيم للإناث الحوامل البالغات في اليوم الجنيني (E) 18.5 من الحمل باستخدام استنشاق الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم. إخضاع الفئران للتشريح النهائي لاستخراج الأجنة.
    1. رش بطن الفأر بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
    2. باستخدام ملقط جراحي ومقص ، ارفع طية الجلد في أسفل البطن وقم بعمل شق على شكل حرف U لكشف تجويف البطن18.
    3. اجمع قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة E18.5 عن طريق قطع قنوات البيض وعنق الرحم ونقلها على الفور إلى طبق بتري مع الثلج البارد 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا18.
    4. قم بإزالة الأجنة بسرعة من الرحم والأنسجة خارج الجنين والقتل الرحيم عن طريق قطع الرأس باستخدام المقص18.
  2. نقل جنين واحد في وقت واحد إلى طبق بتري مع الثلج البارد 1x PBS. باستخدام مجهر ستيريو ، قم بإزالة الجلد وقطع الأطراف. من الجانب البطني ، قطع من خلال القفص الصدري وإزالة القص والأعضاء الأساسية.
  3. اقلب الجانب الظهري لجذع الجنين لأعلى. قم بإزالة الجزء العنقي من العمود الفقري ، ورواسب الدهون الظهرية ، والنسيج الضام أعلى عضلات الظهر العميقة.
  4. استخدم الملقط الجراحي لتثبيت القفص الصدري وكشط عضلات الظهر العميقة بعناية وفصلها عن الأنسجة المحيطة باستخدام مشرط دقيق10. ينتج عن هذا الإجراء عزل قطعتين عضليتين لكل جنين (يسار ويمين) ، وكلاهما يتكون بشكل أساسي من عضلات لونجيسيموس وعضلات الحرقفية ، مع تضمين بعض العضلات المحورية الشوكية والرافعة الضلعية.
  5. قم بتخزين عينات العضلات في 1x PBS مع قلم / بكتيريا 1٪ عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير المدى (<أسبوع واحد) ، أو عند -80 درجة مئوية لفترات أطول.
    ملاحظة: استخدم العينات التي تم جمعها حديثا للحصول على أفضل النتائج. تظهر العينات المجمدة لفترات طويلة (>3 أشهر) كفاءة أقل في إزالة الخلايا والمزيد من تدهور البروتين. تم استخدام كتل العضلات المحورية لتجارب إزالة الخلايا ، ولكن يمكن معالجة العضلات الأخرى (على سبيل المثال ، عضلات الأطراف) لإزالة الخلايا باستخدام نفس البروتوكول.

3. إزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية

ملاحظة: تم إجراء جميع التقنيات في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة. للحصول على تمثيل تخطيطي مفصل ، انظر الشكل 1 أ. تم تنفيذ جميع الخطوات مع التحريض في شاكر مداري بقطر 120 مم (165 دورة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك. أضف 1٪ قلم / بكتيريا إلى المحاليل قبل الاستخدام. عند إزالة المحاليل ، قم بالنضح بعناية لتجنب انحباس العينة في الماصة.

  1. اليوم الأول - تحضير ما يقرب من 2 مم × 1 مم × 1 مم (~ 3.5 مجم) شظايا الأنسجة من كتل العضلات المحورية. أضف 3 مل من المخزن المؤقت منخفض التوتر مع 1٪ قلم / بكتيريا إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا وأضف جزءا كاملا من الأنسجة العضلية لكل بئر.
    1. احتضان شظايا الأنسجة في العازلة منخفضة التوتر مع التحريض لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) (O / N).
  2. اليوم 2 - نضح المخزن المؤقت منخفض التوتر باستخدام ماصة دقيقة الطرف وغسل العينات 3 × 1 ساعة مع 3 مل من 1x PBS في كل مرة مع الإثارة.
    1. احتضان العينات لمدة 24 ساعة مع 3 مل من محلول منظف SDS 0.05٪ مع تحريك.
      ملاحظة: (نقطة تفتيش) بعد حضانة SDS ، يجب أن تكون العينات شفافة في المظهر. تظهر العينات تناسقا يشبه الجيلاتين ، وبالتالي فهي أكثر عرضة للالتصاق بالماصة عند إزالة السوائل.
  3. اليوم الثالث - قم بإزالة محلول منظف SDS باستخدام ماصة دقيقة الطرف واغسل شظايا الأنسجة 3 × 20 دقيقة مع 3 مل من محلول الغسيل منخفض التوتر في كل مرة مع التقليب.
    ملاحظة: (نقطة التوقف) يمكن الاحتفاظ بالعينات في مخزن مؤقت للغسيل منخفض التوتر عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة (O / N). تأكد من إزالة SDS جيدا أثناء خطوات الغسيل ، حيث يمكن أن تكون SDS المتبقية سامة للخلايا.
    1. احتضان شظايا الأنسجة لمدة 3 ساعات مع 2 مل من محلول DNase مع التقليب عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة محلول DNase باستخدام ماصة ذات طرف دقيق واغسل شظايا الأنسجة 3 × 20 دقيقة مع 3 مل من 1x PBS في كل مرة مع التقليب. أخيرا ، اغسل O / N بالتحريك (60 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: بعد معالجة DNase ، تصبح dECMs لزجة بسبب وجود بقايا الحمض النووي. لذلك ، الغسيل الدقيق ضروري.
    3. قم بتخزين dECMs في 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا عند 4 درجات مئوية حتى إعادة التوصيل (< أسبوع واحد). للاستخدامات الأخرى، يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. تقييم جودة إزالة الخلايا

ملاحظة: تم إجراء قياس كمية الحمض النووي ، وتلطيخ DAPI / الميثيل الأخضر ، وتلطيخ القضيب لتقييم وجود محتويات الخلية المتبقية بعد إزالة الخلايا. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتحليلات اللطخة الغربية لتقييم الاحتفاظ ببروتينات ECM الرئيسية بعد إزالة الخلايا.

  1. القياس الكمي للحمض النووي الموجود في dECM
    ملاحظة: يجب مقارنة dECMs بالأنسجة الأصلية للكشف عن وجود الحمض النووي.
    1. قبل إزالة الخلايا ، قم بوزن أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على مقياس رقمي عالي الدقة. قبل نقل عينة العضلات إلى الأنبوب ، قم بإزالة كل ما تبقى من 1x PBS باستخدام منشفة ورقية. وزن الأنبوب مع العينة. احسب الوزن الرطب للعينات باستخدام المعادلة (1):
      عينة الوزنالرطب = أنبوب الوزنمع العينات -الوزن أنبوب فارغ (1)
    2. إزالة الخلايا من العينات باتباع البروتوكول الموضح في القسم 3.
    3. ضع العينات في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات عند -20 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي وتحديده.
    4. قم بإجراء استخراج الحمض النووي ل dECMs وعينات الأنسجة الأصلية باستخدام مجموعة قائمة على عمود الدوران. أضف محلول الهضم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    5. تجانس العينات في مطحنة الخرز مرتين لمدة 2.5 دقيقة في كل مرة (قلب الحوامل) باستخدام حبة كربيد التنجستن واحدة لكل أنبوب (استخدم حوامل الأنبوب المبرد).
    6. أضف البروتيناز K واحتضان O / N مع التقليب البطيء عند 56 درجة مئوية.
    7. تابع البروتوكول كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.
    8. استخدم المخزن المؤقت الذي توفره الشركة المصنعة وأجهزة الطرد المركزي 2 × 1 دقيقة عند ≥6000 × جم ، في كل مرة عند 4 درجات مئوية لزيادة إنتاجية الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية حتى القياس الكمي.
    9. حدد كمية الحمض النووي الموجود في العينات باستخدام مجموعة الكشف عن dsDNA الفلورية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    10. تطبيع محتوى الحمض النووي على شكل نانوجرام من الحمض النووي لكل ملليغرام من الوزن الرطب الأصلي للعينة.
    11. قم بتحليل البيانات باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الطرف والتعبير عنها كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
  2. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    ملاحظة: يجب تحضير المحاليل 1 و 2 و 3 والمحلول المثبت قبل الاستخدام ويمكن الاحتفاظ به مجمدا لمدة تصل إلى 6 أشهر. يتم سرد جميع الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1.
    1. إعداد الحلول
      1. تحضير محلول مثبت بإضافة 2 جم من بارافورمالدهيد (PFA) و 8 جم من السكروز و 24 ميكرولتر من 1 M CaCl2 إلى 77 مل من 0.2 M Na 2 HPO 4 و 23 مل من 0.2 M NaH 2 PO 4 ، إلى حجم نهائي قدره 200 مل بإضافة dH2O. اضبطالرقم الهيدروجيني على7.4.
      2. تحضير 0.12 M فوسفات العازلة بإضافة 13.5 g من Na 2 HPO 4 و3.2 g من NaH 2 PO 4 إلى 1 L من dH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على7.4.
      3. تحضير المحلول 1 بإضافة 4 جم من السكروز إلى 100 مل من محلول فوسفات 0.12 M.
      4. تحضير المحلول 2 بإضافة 15 جم من السكروز إلى 100 مل من محلول فوسفات 0.12 M.
      5. تحضير المحلول 3 بإضافة 15 جم من السكروز و 7.5 جم من الجيلاتين إلى 100 مل من محلول الفوسفات 0.12 M. يسخن على حرارة 37 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين.
      6. تحضير محلول مخزون الميثيل الأخضر (2٪ مسحوق أخضر ميثيل مذاب في dH2O) 19.
    2. الكشف المناعي
      1. ثبت العينات باستخدام المحلول المثبت لمدة 4 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية.
      2. اغسل العينات 2x لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
      3. احتفظ ب O / N ، أو أكثر من يوم واحد ، في المحلول 1 عند 4 درجات مئوية.
      4. اغسل واحتفظ ب O / N أو أكثر من يوم واحد في محلول 2 عند 4 درجات مئوية. دع العينات دافئة إلى RT.
      5. احتضان لمدة 3 ساعات في محلول 3 عند 37 درجة مئوية. احتفظ بالمحلول الإضافي 3 عند 37 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
      6. قالب حاويات صغيرة (2 سم × 1 سم × 1 سم) في رقائق الألومنيوم. ضع طبقة رقيقة من المحلول 3 في الحاوية المقولبة واتركها ثابتة. ضع العينات على المحلول المتصلب 3 وقم بتغطيتها بمحلول دافئ 3. توجيه العينات والسماح لهم تصلب. ضع علامة على الموقع على المحلول المتصلب 3 بقلم ملون.
      7. قم بالتجميد عن طريق وضع الحاويات على سطح الأيزوبنتان الجاف المبرد بالثلج أو المبرد بالنيتروجين السائل.
      8. باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) ، ثبت مكعبات الجيلاتين المجمدة التي تحتوي على العينات في حامل cryostat.
      9. قسم مكعبات الجيلاتين المجمدة وانقل أقسام الأنسجة إلى الشرائح. اتركيها تجف لمدة 60 دقيقة.
      10. استخدم علامة كارهة للماء لتتبع خط حول الأقسام.
      11. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق في 1x PBS.
      12. قم بتغطية الأقسام ب 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 1٪ مصل الماعز ، و 0.05٪ Triton X-100 المخفف في 1x PBS (محلول مانع) لمدة 30 دقيقة (خطوة حجب).
      13. تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل منع وتغطية الأقسام. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية في صندوق مغلق ، بورق رطب ، لمنع المقاطع من الجفاف.
      14. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
      15. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل حجب وتغطية الأقسام. احتضان لمدة 1.5 ساعة في RT في الظلام.
        ملاحظة: تجنب التعرض للضوء لمنع تدهور الفلوروفور.
      16. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق باستخدام 4x PBS.
        ملاحظة: يمكن استخدام تركيز أعلى من PBS عند وجود خلفية قوية.
      17. اغمر الشرائح في محلول DAPI (5 ميكروغرام / مل 1،4-ديازابيسيكلو -2،2،2-أوكتان في 0.1٪ Triton X-100 / 1x PBS) لمدة 30 ثانية لكل منهما.
      18. شطف في 1x PBS.
      19. قم بتركيب الأقسام في وسط مضاد للبهتان (50 مجم / مل n-propyl-gallate في 1x PBS: الجلسرين [1: 9]) وأغلقها بغطاء سليب. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى المراقبة والحصول على الصور في المجهر الفلوري20.
        ملاحظة: بالنسبة لتجارب الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة ، تم استخدام نفس البروتوكول (انظر الخطوات 4.2.2.12-4.2.2.18) ، باستثناء العينات التي تم تثبيتها مسبقا في 4٪ PFA مخففة في 1x PBS لمدة 3 ساعات في RT. تم إجراء تلطيخ الحمض النووي عن طريق إضافة الميثيل الأخضر إلى محلول الجسم المضاد الثانوي. يتم سرد جميع الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة ، والتخفيفات الخاصة بها ، في الجدول 1. ثم تم تركيب العينات في وسط مضاد للبهتان بين غطاءين مفصولين بحلقات فولاذية ، تم لصقها معا بشمع العسل ، وتم الحصول على مكدسات صور 100 ميكرومتر باستخدام مجهر متحد البؤر21.
  3. تحليل اللطخة الغربية
    ملاحظة: يتم سرد جميع الأجسام المضادة المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1.
    1. إعداد الحلول
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل 2x SDS-PAGE بإضافة 20 مل من الجلسرين و 4 جم من SDS و 0.2 مل من البروموفينول الأزرق إلى 80 مل من محلول قاعدة Tris 100 mM. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8. أضف ديثيوثريتول الطازج (DTT) قبل الاستخدام.
      2. قم بإعداد محلول الغسيل الملحي المخزن Tris بمحلول Tween 20 (TBST) بإضافة 2.4 جم من قاعدة Tris ، و 8.8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من Tween-20 إلى dH2O إلى حجم نهائي قدره 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4-7.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
      3. قم بإعداد المخزن المؤقت 10x (RB) بإضافة 30.2 جم من قاعدة Tris ، و 144.2 جم من الجلايسين ، و 10 جم من SDS إلى 1 لتر من dH2O. قبل الاستخدام ، أضف 100 مل من 10x RB إلى 900 مل من dH2O لتحضير 1x RB (حل العمل).
        ملاحظة: بينما يمكن تخزين 10x RB في RT لعدة أشهر ، يمكن إعادة استخدام 1x RB في عمليات تشغيل مختلفة.
      4. قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل (TB) بإضافة 5.82 جم من قاعدة Tris ، و 2.93 جم من الجلايسين ، و 0.5 جم من SDS إلى 800 مل من dH2O. بعد إذابة المكونات ، أضف 200 مل من الميثانول. تبرد على حرارة 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: يجب تحضير السل طازجا قبل كل استخدام.
    2. استخراج البروتين
      1. اجمع العضلات المحورية من الفئران E18.5 وضعها على الفور في أنبوب طرد مركزي دقيق (2 مل) يحتوي على 2x SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت مع DTT المضافة حديثا (100 mM DTT). معالجة E18.5 dECM بنفس الطريقة.
      2. أضف حبة كربيد التنجستن لكل أنبوب. تجانس 2x في مطحنة الخرز لمدة 2.5 دقيقة في كل مرة (اقلب الحوامل).
      3. قم بتقطيع العينات لمدة 5 دقائق في حمام الموجات فوق الصوتية.
      4. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية.
      5. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      6. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
      7. تحديد كمية البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume.
      8. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    3. بولي أكريلاميد جل الكهربائي
      1. استخدم جل التدرج الأكريلاميد مسبق الصب (4٪ -20٪)
      2. جبل الجل في خزان الكهربائي. قم بإزالة المشط بعناية. أضف 1x RB حتى الخط المعروض في خزان الكهربائي. تأكد من ملء الآبار ب RB.
      3. تحميل 100 ميكروغرام من البروتين لكل عينة في الآبار. تحميل 12 ميكرولتر من معيار البروتين عالي الوزن الجزيئي.
      4. تشغيل لمدة 100 دقيقة مع الجهد المستمر (10 دقائق في 150 فولت و 90 دقيقة في 185 فولت).
    4. نقل
      1. انقع ضمادات الفلتر والإسفنج بالسل المبرد (4 درجات مئوية) أثناء تشغيل الجل.
      2. قطع أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيليدين إلى حجم الجل. تنشيطها بالميثانول واغسلها ب dH2O. نقع في السل.
      3. قم بتركيب كاسيت النقل باستخدام الإسفنج ووسادات الترشيح والمواد الهلامية والأغشية المنشطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      4. ضع الكاسيت في خزان الكهربائي الذي يحتوي على السل المبرد (على طبقة من الثلج). أضف وحدة التبريد. اركض لمدة 90 دقيقة عند 100 فولت.
      5. بعد النقل ، تلطخ ببديل Coomassie الأزرق لتقييم جودة النقل.
    5. الكشف المناعي
      1. تحضير محلول الحجب (TBST مع 5 ٪ حليب قليل الدسم). احتضان الأغشية مع التحريض لمدة 1 ساعة في RT.
      2. شطف 3 × 5 ثانية مع TBST.
      3. احتضان الأغشية O / N مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في TBST مع 2٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم (3 مل لكل غشاء) في غرفة باردة (4 درجات مئوية) مع التقليب.
      4. في اليوم التالي ، اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام TBST.
      5. احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة من بيروكسيديز الفجل (HRP) المخففة في TBST مع 5٪ حليب قليل الدسم (5 مل لكل غشاء) لمدة 1 ساعة في RT.
      6. اغسل الأغشية باستخدام TBST 3 × 5 دقائق. احتفظ في TBST حتى خطوة الكشف.
      7. تصور البروتين باستخدام مجموعة تطوير متاحة تجاريا. أضف كواشف الكشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحصول على صور للفرق.
      8. لاختبار أكثر من جسم مضاد واحد لكل غشاء ، بعد خطوة الكشف ، قم بتجريد الأجسام المضادة السابقة بثلاث غسلات (5 دقائق لكل منها) باستخدام TBST وكرر الخطوات 4.3.5.2-4.3.5.7.

الجدول 1: الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة في الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتحليل اللطخة الغربية والتخفيفات ذات الصلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.10,22

5. زراعة الخلايا في المصفوفات منزوعة الخلايا

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التقنيات في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي. تم إجراء جميع عمليات الحضانة عند 37 درجة مئوية وبنسبة 5٪ CO2.

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا ، وسط النسر المعدل عالي الجلوكوز من Dulbecco مع الجلوتامين المستقر ومع بيروفات الصوديوم (DMEM) ، مع استكمال مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ قلم / بكتيريا (وسط زراعة كامل).
  2. ضع dECMs في طبق بتري في 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا في غطاء التدفق الصفحي وافصلها إلى قطع من حوالي 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر × 250 ميكرومتر ، باستخدام مشرط دقيق وملاقط.
    ملاحظة: تتميز dECMs بقوام ناعم ، وبالتالي غالبا ما يكون من الأسهل استخدام الملقط لفصلها إلى قطع بنفس الحجم تقريبا بدلا من تقطيعها بالمشرط الدقيق.
  3. انقل الشظايا إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا (ثلاث أو أربع قطع لكل بئر) مع 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل ، تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 2 ساعة في الحاضنة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى قارورة T25 المصنفة بخلايا C2C12 الفرعية (~ 70٪). أعد التعليق في 1 مل من الوسط الكامل.
  5. أضف 10 ميكرولتر من إعادة التعليق إلى صبغة تريبان الزرقاء 10 ميكرولتر وقم بتحميلها في مقياس الدم. عد وحساب رقم الخلية وتأكيد صلاحية الخلية.
  6. نضح الوسط من لوحة 96 بئرا تحتوي على dECMs وأضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على 50000 خلية C2C12 قابلة للحياة.
  7. احتضان لمدة 2 أيام وبعد ذلك ، باستخدام ملاقط ، ونقل dECMs (مع الخلايا) إلى لوحة 48 بئر مع 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل. كل 2 أيام ، استنشاق الوسط بعناية باستخدام ماصة صغيرة لمنع dECMs من الانفصال عن قاع البئر وإضافة وسط جديد حتى اليوم 8.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالمصفوفات لمدة يومين في لوحات 96 بئرا لتعزيز التصاق الخلايا C2C12 ب dECMs ، ثم يتم نقلها إلى لوحة 48 بئرا للسماح بالوصول إلى حجم أكبر من الوسط مع العناصر الغذائية. يجب أن تلتصق dECMs بقاع الآبار.
  8. بالنسبة لتجربة التمايز، استبدل وسط الاستزراع الكامل بوسط التمايز (DMEM المكمل بمصل حصان 2٪ و 1٪ قلم / جرثم) في اليوم 8، يليه الحضانة في وسط التمايز لمدة 4 أيام حتى اليوم 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الهدف من بروتوكول إزالة الخلايا هو إنتاج dECMs التي تشبه إلى حد كبير تكوين الأنسجة الأصلية. لتحديد فعالية عملية إزالة الخلايا ، تم استخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك فحص مورفولوجيا الأنسجة ، وقياس مستويات الحمض النووي ، وتلطيخ F-actin ، وتحليل مكونات ECM الرئيسية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتقنيات النشاف الغربية. على وجه التحديد ، تم تحليل خمسة مكونات رئيسية ل ECM لأنسجة العضلات الهيكلية.

في جميع أنحاء البروتوكول ، تتغير العينات في المظهر (الشكل 1B 1-4). بعد العزلة ، تظهر الأنسجة العضلية حمراء بسبب وجود الميوغلوبين (الشكل 1B1). بعد الحضانة في المخزن المؤقت منخفض التوتر ، الذي يحلل الخلايا ويزيل معظم البروتينات السيتوبلازمية ، تتحول العينات إلى اللون الأبيض (الشكل 1B2). SDS ، وهو منظف أنيوني شائع الاستخدام في إزالة الأنسجةالخلوية 12 ، يزيل بشكل فعال المواد السيتوبلازمية والنووية ، وكذلك الأغشية. نتيجة لذلك ، تصبح العينات أكثر شفافية بعد معالجة SDS (الشكل 1B3). ومع ذلك ، فإن التركيزات العالية أو التعرض المطول لهذا المنظف يمكن أن يسبب تمسخ البروتين ، وفقدان الجليكوزامينوجليكان ، وتعطيل ألياف الكولاجين12. يتم تحقيق التوازن الأمثل بين إزالة الخلايا والحفاظ على ECM باستخدام 0.05٪ SDS لمدة 24 ساعة ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3. أخيرا ، تتم إزالة الحمض النووي من خلال معالجة DNase ، مما ينتج عنه سقالات dECM شفافة أصغر قليلا مما كانت عليه بعد معالجة SDS (الشكل 1B4).

يشار إلى نجاح بروتوكول إزالة الخلايا من خلال كمية الحمض النووي المتبقي الموجود في المصفوفات بعد العملية. يكشف القياس الكمي للحمض النووي عن انخفاض بنسبة 100٪ تقريبا في dECMs مقارنة بالأنسجة الأصلية (الشكل 1C). يؤكد تلطيخ DAPI أيضا عدم وجود الحمض النووي في dECMs (الشكل 2B ، D ، F ، H ، J).

تم تقييم وجود خمسة بروتينات ECM رئيسية بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية واللطخة الغربية بعد إزالة الخلايا ومقارنتها بالأنسجة الأصلية. يظهر التلوين المناعي للوحدة الفرعية laminin α2 (الشكل 2A ، B) وإجمالي الصفيحات (الشكل 2C ، D) أن dECMs تعرض تلطيخا أنبوبيا لهذه البروتينات (الأسهم في الشكل 2B ، D) ، على غرار مصفوفة الصفيحة المحيطة بالأنابيب العضلية في الأنسجة الأصلية (الأسهم في الشكل 2A ، C). يكشف تحليل اللطخة الغربية للوحدة الفرعية laminin α2 عن وجود شريطين في الأنسجة الأصلية (الشكل 2A) ، بينما يمكن اكتشاف ثلاثة نطاقات ، ذات وزن جزيئي أصغر من المتوقع ، في dECM (الشكل 2B'). قد يكون هذا نتيجة لتدهور البروتين أو إزالته أثناء عملية إزالة الخلايا. يظهر تحليل اللطخة الغربية للصفائح الكلية بعض التجزئة لهذه البروتينات في dECM مقارنة بعينات من الأنسجة الأصلية (الشكل 2C '، D').

Figure 1
الشكل 1: إجراء إزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية وتقييم مورفولوجيا الأنسجة ومحتوى الحمض النووي. أ: تمثيل تخطيطي لبروتوكول إزالة الخلايا. (ب) مورفولوجيا الأنسجة في جميع أنحاء البروتوكول ، من الأنسجة التي تم جمعها حديثا إلى الأنسجة منزوعة الخلايا. شريط المقياس = 1 مم. (ج) القياس الكمي للحمض النووي الموجود في dECMs مقارنة بالأنسجة الأصلية. البيانات المعبر عنها كمتوسط ± SEM. اختبار t للطالب ، ثنائي الطرف ** p < 0.01. يزيل بروتوكول إزالة الخلايا بكفاءة المحتوى النووي الذي ينتج dECMs اللاخلوية. الاختصارات: dECMs = المصفوفات غير الخلوية. PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم ؛ NT = الأنسجة الأصلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر التلوين المناعي للفيبرونيكتين (الشكل 2E ، F) والكولاجين I (الشكل 2G ، H) وجود هذه البروتينات في الفراغ الخلالي بين الخلايا في الأنسجة الأصلية (الأسهم في الشكل 2E ، G) وتلطيخ مماثل في dECMs (الأسهم الشكل 2F ، H). يظهر تحليل اللطخة الغربية نطاقات مماثلة للفيبرونيكتين في كلتا الحالتين (الشكل 2E '، F') ، مما يشير إلى أن هذا البروتين لا يتأثر بشكل خاص بعملية إزالة الخلايا. ومع ذلك ، في حالة الكولاجين I (الشكل 2G '، H') ، هناك عدد أقل من النطاقات في dECMs ، مما يشير إلى درجة معينة من التدهور. يظهر التلوين المناعي للكولاجين IV نمط تلطيخ أنبوبي في الأنسجة الأصلية (السهم في الشكل 2I) وتلطيخ مماثل في dECM ، على الرغم من أن الهياكل الأنبوبية أضيق (السهم في الشكل 2J). يكشف تحليل اللطخة الغربية للكولاجين الوريدي عن وجود ثلاثة أشرطة في الأنسجة الأصلية (الشكل 2I). بينما لوحظت نفس النطاقات الثلاثة في dECMs (الشكل 2J) ، فإن الوزن الجزيئي لهذه أقل من المتوقع. على غرار laminin α2 ، يمكن أن يكون هذا نتيجة لتدهور البروتين أو إزالته أثناء إزالة الخلايا.

ثم يتم زرع dECMs مع الأرومات العضلية C2C12 وزراعتها لمدة 8 أيام في وسط استزراع كامل. تستعمر خلايا C2C12 dECMs وتتكاثر، كما هو موضح في تلطيخ فوسفو هيستون 3 النووي (الأسهم في الشكل 3 أ). بعد 4 أيام إضافية من المزرعة في وسط التمايز ، تتمايز خلايا C2C12 وتندمج في أنابيب عضلية متعددة النوى (أسهم زرقاء في الشكل 3 ب) تعبر عن سلسلة الميوسين الثقيلة (خط متقطع في الشكل 3 ب). ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن اكتشاف تلطيخ داخل الخلايا و / أو حول الخلية لسلسلة laminin α2 (الأسهم الصفراء في الشكل 3C ، D) ، والصفيحات الكلية (السهم الأرجواني في الشكل 3C) ، والفبرونيكتين (السهم الأرجواني في الشكل 3D) في خلايا C2C12 المزروعة في وسط استزراع كامل ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا قادرة على تصنيع بروتينات ECM هذه من جديد.، وبالتالي المساهمة في تشكيل مكانتها. توضح هذه النتائج أن بروتوكول إزالة الخلايا يولد بيئة مجهرية dECM حيث يمكن للخلايا العضلية C2C12 أن تتكاثر وتتمايز وتشكل أنابيب عضلية متعددة النوى.

Figure 2
الشكل 2: تقييم خمسة بروتينات ECM في الأنسجة العضلية الجنينية الأصلية مقابل الأنسجة العضلية الجنينية E18.5 منزوعة الخلايا. الكيمياء الهيستولوجية المناعية على أقسام الأنسجة الأصلية (A ، C ، E ، G ، I) وتلطيخ dECMs (B ، D ، F ، H ، J) باستخدام DAPI ، وعلامة الحمض النووي ، واكتشاف القضيب F-actin ، وبروتينات ECM. شريط المقياس = 15 ميكرومتر. في الأنسجة الأصلية ، يوجد تلطيخ مناعي لللامينين والكولاجين الوريدي يحيط بالألياف العضلية (A ، C ، I ؛ الأسهم الصفراء) ويتم الكشف عن تلطيخ الفبرونيكتين والكولاجين I في الفراغ الخلالي بين الألياف العضلية (E ، G ؛ الأسهم الصفراء). في dECMs ، يظهر تلطيخ الصفيحات والكولاجين الرابع (B ، D ، J ؛ الأسهم الصفراء) نمطا أنبوبيا يحيط بالفراغات التي خلفتها الألياف العضلية بعد إزالة الخلايا. يتوافق تلطيخ الفبرونيكتين والكولاجين المناعي الأول ل dECMs مع وجودهما في الفضاء الخلالي (F ، H ؛ الأسهم الصفراء). (أ - ي) تحليل اللطخة الغربية لخمسة بروتينات ECM في الأنسجة الأصلية (A'، C'، E'، G'، I') وفي عينات dECM (B'، D'، F'، H'، J'). كلا النهجين يظهران الحفاظ على البروتين بعد إزالة الخلايا. يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1. الاختصارات: LNα2 = سلسلة لامينين α2 ؛ LNp = الصفيحات العضلية ؛ FN = فيبرونيكتين. العقيد الأول = الكولاجين الأول ؛ العقيد الرابع = الكولاجين الرابع ؛ MHC = سلسلة الميوسين الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعادة تنظيم الخلايا باستخدام خط خلية الأرومة العضلية (الأرومات العضلية C2C12). (أ) الإسقاط الأقصى لشدة صورة متحدة البؤر لكومة 100 ميكرومتر من المصفوفة المعاد خليتها، مستعمرة بخلايا C2C12 موسومة بالحمض النووي الملطخ بلون أخضر الميثيل، واكتشاف القضيب للأكتين، والأجسام المضادة للأس الهيدروجيني 3، وهي علامة انتشار (أسهم أرجوانية). شريط المقياس = 35 ميكرومتر. (ب) الإسقاط الأقصى للكثافة لصورة متحدة البؤر لكومة 100 ميكرومتر تظهر أنبوب عضلي ميوسين ثقيل السلسلة موجب السلسلة (خط متقطع) متعدد النوى (تشير الأسهم الزرقاء إلى النوى) يتكون أثناء الثقافة. شريط المقياس = 35 ميكرومتر. (C، D) صورة متحدة البؤر للكيمياء الهيستولوجية المناعية تظهر تلطيخا داخل أو شبه خلوي لسلسلة laminin α2 (الأسهم الصفراء) ، والصفيحات الكلية (الأسهم الأرجواني في C) ، والفبرونيكتين (الأسهم الأرجواني في D) في الأرومات العضلية ، مما يشير إلى تخليق البروتين من جديد. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1. الاختصارات: pH3 = فوسفو هيستون 3 ؛ LNα2 = سلسلة لامينين α2 ؛ LNp = الصفيحات العضلية ؛ FN = فيبرونيكتين. MHC = سلسلة الميوسين الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ECM عبارة عن شبكة معقدة من الجزيئات الكبيرة الموجودة في جميع الأنسجة وتلعب دورا حاسما في تنظيم سلوك الخلية ووظيفتها2. يعمل ECM بمثابة سقالة مادية للخلايا للالتصاق بها ويوفر إشارات تعدل بنشاط العمليات الخلوية مثل الانتشار والحركة والتمايز وموت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، فإن التكوين السليم وصيانة ECM أمر ضروري لكل من التنمية والتوازن1.

في حين تم استخدام نماذج زراعة الخلايا 2D على نطاق واسع ، يتم استبدالها بشكل متزايد بمنصات 3D أكثر تقدما. وذلك لأن الثقافات ثنائية الأبعاد تفتقر إلى الإشارات الكيميائية والفيزيائية التي تؤثر على سلوك الخلية ، في حين تعتبر الثقافات ثلاثية الأبعاد بديلا أكثر واقعية لدراسة الديناميات الجزيئية والخلوية في الأنسجة الأصلية11. يؤدي نزع الخلايا من الأنسجة إلى إنتاج سقالات تحاكي بشكل أوثق البيئات الدقيقة للأنسجة البيولوجية ، كما هو موضح في عدد من الدراسات عبر مختلف أنظمة الأنسجة أو الأعضاء 14،15،23،24،25. تحمل قدرة dECMs على تكرار البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية إمكانات كبيرة للبحث في التطور الطبيعي ، وحالات المرض المختلفة ، وتأثير الأدوية أو السموم على الأنسجة11.

يعتمد البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة على البروتوكول الذي طوره Silva et al. لإزالة الخلايا من أنسجة قلب الجنين14 كنقطة انطلاق. وهو ينطوي على مزيج من العازلة منخفضة التوتر ، والعلاج مع المنظفات الأنيونية (SDS) ، والعلاج DNase. أحد التحديات الرئيسية في بروتوكولات إزالة الخلايا هو إيجاد توازن بين إزالة الخلايا والحفاظ على تركيبة بروتين ECM. نظرا لتركيزنا على استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد هذا لدراسة المراحل المبكرة من LAMA2-CMD ، تم إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على laminin 211 أثناء إزالة الخلايا. أدى بروتوكول Silva et al.14 إلى فقدان النشاط المناعي لسلسلة laminin α2 في عضلات الجنين المنزوعة الخلايا. وقد يعزى ذلك إلى تركيز مخزونات النشر الاستراتيجي المستخدمة. لذلك ، تم اختبار بدائل لخطوة محلول المنظفات SDS بنسبة 0.2٪ ، مثل تركيزات أقل من SDS (0.1٪ و 0.05٪ و 0.02٪) واستبدال SDS بتركيزات مختلفة من Triton X-100 (0.5٪ و 0.2٪). تم تحقيق أفضل النتائج باستخدام 0.05٪ SDS معالجة المنظفات لمدة 24 ساعة. أزال هذا التركيز محتويات الخلية بشكل فعال مع الحفاظ على النشاط المناعي لسلسلة laminin α2 بعد إزالة الخلايا. ينتج هذا البروتوكول بشكل متكرر dECMs اللاخلوية الخالية من المخلفات الخلوية ، بما في ذلك الحمض النووي.

يحافظ البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة على كل من بروتينات المصفوفة الخلالية (الفبرونيكتين والكولاجين الأول) وبروتينات الغشاء القاعدي (اللامينين والكولاجين الرابع). يجب أن تقيم الدراسات المستقبلية ما إذا كان الكولاجين السادس محفوظا أيضا ، لأنه أيضا لاعب في ضمور العضلات26. من المعروف أن SDS يمكن أن يعطل البنية التحتية للبروتين ويتلف الكولاجين12 ؛ بالنسبة لعضلات الهيكل العظمي الجنينية ، كان من المهم استخدام تركيز منخفض من SDS (0.05٪) للحفاظ على النشاط المناعي laminin α2. ومع ذلك ، تظهر نتائج اللطخة الغربية أن العينات المنزوعة الخلايا تظهر المزيد من النطاقات بعد الكشف المناعي عن الصفيحات والكولاجين مقارنة بالأنسجة الأصلية ، مما يشير إلى أن بعض تدهور البروتين حدث نتيجة لعملية إزالة الخلايا27.

الأهم من ذلك ، أن تجارب إعادة التركيب تظهر أن هذه المصفوفات هي سقالات موثوقة تدعم باستمرار التصاق الخلايا وتكاثرها وتمايزها. تم الإبلاغ عن أن SDS سامةللخلايا 28 ، وبالتالي فإن خطوات الغسيل المدرجة في البروتوكول حاسمة إذا كان سيتم استخدام المصفوفات لإعادة الخلية. تم استعمار هذه السقالات بشكل فعال بواسطة خلايا C2C12 ، مما يشير إلى ملاءمتها كنظام نموذجي لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تشير ملاحظة التلوين داخل الخلايا وحول الخلايا لبروتينات ECM المحيطة بخلايا C2C12 إلى أن الخلايا تساهم بنشاط في بيئتها المكروية داخل dECMs. بالإضافة إلى ذلك ، عند وضعها في وسط التمايز ، تتمايز خلايا C2C12 وتنصهر وتشكل أنابيب عضلية داخل dECMs.

التحدي الكبير في هذا الإجراء هو التلاعب بالعينات في جميع أنحاء البروتوكول. العينات صغيرة جدا وناعمة ، وتتطلب عناية ومهارة في التعامل لمنع الانحباس في الماصة ذات الطرف الرفيع وفقدان العينات. يتم الحصول على أفضل النتائج عند بدء البروتوكول بأنسجة جديدة. يمكن أن يؤدي استخدام العينات المجمدة والمخزنة إلى إعاقة إزالة المحتوى الخلوي ويؤدي إلى زيادة تدهور البروتين ، مما يعيق اكتشاف البروتين ويقلل من كفاءة إزالة الخلايا.

أبلغت دراسات قليلة فقط عن إزالة الخلايا من أنسجة الجنين15،29،30،31. على وجه التحديد ، فيما يتعلق بإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية ، أبلغت دراسة سابقة واحدة فقط عن إزالة الخلايا من العينات المركبة من الأدمة والأنسجة تحت الجلد و panniculus carnosus31. على حد علم المؤلفين ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها إنشاء بروتوكول إزالة الخلايا لعضلات الهيكل العظمي الجنيني المعزولة. يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لإنشاء بروتوكولات مماثلة لأنسجة عضلات الجنين من الأنواع الأخرى ، مثل الخنازير والبشر13.

البروتوكول الحالي لإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية للفأر E18.5 مشابه جدا لإجراء Silva et al.14 ، الذي طبقه على قلب الفأر E18. الفرق الوحيد هو تركيز SDS المستخدم ، وهو أقل بكثير من التركيز المستخدم لقلب الجنين (0.05٪ مقابل 0.2٪) ، ربما بسبب الخصائص الفيزيائية المختلفة لهذين النسجين الجنينيين.

لا يسمح تطوير هذا النموذج في المختبر بدراسة العمليات التي ينطوي عليها نمو عضلات الجنين الطبيعي فحسب ، بل يتيح أيضا التحقيق الموازي في الحثل العضلي المبكر والاعتلالات العضلية ، مثل LAMA2-CMD ، والذي يظهر كعيب في تكوين العضلات في E18.5 في نموذج الماوس dyW 10. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذا النظام محدود من حيث أنه يشمل فقط ECM وخلايا العضلات ولا يحتوي على أنواع أخرى من الخلايا مثل الخلايا العصبية والخلايا البطانية والخلايا الليفية. قد تختلف أهمية هذه الأنواع الإضافية من الخلايا اعتمادا على المرض ، وقد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على نظام المزرعة لتضمينها. بشكل عام ، يمكن تطبيق استخدام dECMs كما هو موضح في هذه الدراسة في دراسة مختلف ضمور العضلات المبكر والاعتلالات العضلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الفرنسية لمكافحة الاعتلال العضلي (AFM-Téléthon ؛ عقد رقم 23049) ، ومشروع MATRIHEALTH ، وتمويل وحدة cE3c UIDB / 00329/2020. نود أن نشكر المتبرع هنريك ميريليس الذي اختار دعم مشروع MATRIHEALTH. استفاد هذا العمل من البنى التحتية لمرفق الفحص المجهري بكلية العلوم ، وهو عقدة تابعة للمنصة البرتغالية للتصوير الحيوي (المرجع PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ، ونشكر لويس ماركيز على مساعدته في الحصول على الصور ومعالجتها. أخيرا ، نشكر مارتا بالما على الدعم الفني وفريق البحث لدينا على مساهماتهم السخية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ،
إعداد مصفوفات 3D Decellularized من العضلات الهيكلية للفأر الجنيني لزراعة الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gameiro dos Santos, P., Soares, A.… More

Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter