Summary
この研究では、脱細胞化プロトコルを最適化して、マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックスを取得しました。C2C12筋芽細胞は、これらのマトリックスにコロニーを形成し、増殖し、分化することができます。この in vitro モデルは、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患の状況における細胞の挙動を研究するために使用できます。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の構造的サポートを提供し、さまざまな細胞プロセスに重要なシグナルを伝達する上で重要な役割を果たします。2次元(2D)細胞培養モデルは、完全な3次元(3D)サポートがないため、細胞の挙動が変化し、 in vivo プロセスの理解に不十分になるため、細胞とECMの間の複雑な相互作用を単純化しすぎます。ECM組成と細胞-ECM相互作用の欠損は、さまざまな異なる疾患の重要な原因です。
一例はLAMA2-先天性筋ジストロフィー(LAMA2-CMD)であり、機能的なラミニン211および221の不在または減少は、出生時または出生直後に検出可能な重度の低張症につながる可能性があります。この疾患のマウスモデルを用いた以前の研究は、その発症が胎児の筋形成中に起こることを示唆している。本研究は、筋肉細胞と胎児の筋肉ECMとの間の相互作用の研究を可能にする3D インビトロ モデルを開発することを目的としており、ネイティブの微小環境を模倣しています。このプロトコルは、E18.5マウス胎児から解剖し、低張緩衝液、陰イオン界面活性剤、およびDNaseで処理した深部背筋を使用します。得られた脱細胞化マトリックス(dECM)は、天然組織と比較して、テストされたすべてのECMタンパク質(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持していました。
C2C12筋芽細胞がこれらのdECMの上に播種されると、それらはdECMに浸透してコロニーを形成し、増殖と分化をサポートしました。さらに、C2C12細胞はECMタンパク質を産生し、dECM内のニッチのリモデリングに寄与した。この in vitro プラットフォームの確立は、LAMA2-CMDの発症に関与するプロセスを解明するための新しい有望なアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションの欠陥が疾患の進行に寄与する他の骨格筋疾患に適応する可能性があります。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の主要な構成要素であり、それらの非細胞成分を表す。この3次元(3D)構造は、細胞を物理的にサポートするだけでなく、生物の発生に関与する生化学的プロセスにおいても重要な役割を果たします1。組織特異的ECMの形成は、細胞とそれらのニッチとの間の複雑な相互作用の結果として、様々な細胞内および細胞外の刺激の影響を受ける発生中に起こる。ECMは、時間空間的に化学的および機械的再配列を起こし、細胞の運命に直接影響を与える非常に動的な構造です2。ECMの最も顕著な特徴の1つは、各組織ECMが、それに含まれる細胞に合わせた異なるトポロジーおよび特性を提供する分子の固有の組み合わせを示すため、その機能の多様性である1。
ECMシグナル伝達とサポートは、発生と恒常性に不可欠であり、破壊されると複数の病理学的状態につながる可能性があります3,4。一例は、先天性筋ジストロフィーの最も一般的な形態であるLAMA2欠損先天性ジストロフィー(LAMA2-CMD)です。LAMA2遺伝子は、ラミニン211およびラミニン221に存在するラミニンα2鎖をコードし、変異するとLAMA2-CMD5につながる可能性があります。ラミニン211は、骨格筋線維を取り囲む基底膜に見られる主要なアイソフォームです。ラミニン211が異常または不在の場合、基底膜と筋細胞との間のリンクが破壊され、疾患の発症につながる6。LAMA2-CMDの患者は、LAMA2遺伝子の突然変異の種類に応じて軽度から重度の表現型を示します。
ラミニンα2タンパク質の機能に影響を与えると、患者は出生時に重度の筋緊張低下を経験し、慢性炎症、線維症、筋萎縮を発症し、平均余命を縮める可能性があります。今日まで、標的療法は開発されておらず、治療アプローチは病気の症状を緩和することに限定されています7。したがって、この病気の発症に関与する根本的な分子メカニズムを理解することは、適切な治療戦略を開発するために重要です6,8。LAMA2-CMDのモデルであるdyWマウス9を用いた以前の研究では、この病気の発症は子宮内、特に胎児の筋形成10の間に始まることが示唆されています。胎児の筋形成障害がどのように現れるかをよりよく理解することは、LAMA2-CMDの新しい治療アプローチを生み出す上でのゲームチェンジャーとなるでしょう。
in vitro システムは、細胞-細胞および細胞-ECM相互作用を研究するための制御された環境を提供しますが、2D培養モデルにはネイティブ組織の複雑さが欠けています。組織の脱細胞化により、2Dモデルや人工/合成足場と比較して、自然の細胞微小環境をより正確に模倣する組織および発生段階特異的な無細胞ECM足場が生成されます。脱細胞化マトリックス(dECM)は、宿主組織の分子的および機械的手がかりを保存する可能性があり、 in vivo プロセスを理解するためのより良い代替モデルになります11。
脱細胞化に使用できる様々な技術、試薬、および条件がある12、13。この研究では、Silvaら14,15によって記述された胎児マウス心臓の脱細胞化プロトコルがマウス胎児骨格筋に適合し、テストされたすべてのECM成分(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持することが判明しました。このプロトコルには、浸透圧ショックによる細胞溶解(低張緩衝液)、原形質膜溶解およびタンパク質解離(0.05%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])、およびDNAの酵素的破壊(DNase処理)の3つのステップが含まれます。我々の知る限り、これはマウス胎児骨格筋を脱細胞化するための最初の確立されたプロトコルである。
この3DインビトロシステムをLAMA2-CMDの研究に使用するには、脱細胞化後のラミニンα2鎖を維持することが重要です。したがって、異なる洗剤(SDSおよびTriton X-100)および濃度(0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、および0.5%)がテストされた最適化プロトコルが実装された(データは示されていない)。ラミニンα2タンパク質の細胞除去および保存のための最適な選択は、0.05%SDSであることがわかった。十分に確立された筋芽細胞株であるC2C12細胞16,17を使用して、dECMを播種しました。これらの細胞はdECMに侵入し、増殖し、これらの足場内で分化し、新しいECMタンパク質を合成します。この3Din vitroモデルの作成の成功は、胎児の筋形成、LAMA2-CMDの発症に関与する分子および細胞プロセスを理解するための新しいアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションが破壊される他の筋肉疾患に拡張することができます。
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Protocol
記載されているすべての方法論は、リスボン大学理学部の動物福祉委員会(ORBEA)およびDireção Geral de Veterinária(DGAV、ref. 0421/000/000/2022)によって承認されており、欧州指令2010/63 / EUに準拠しています。
1. 脱細胞化バッファーおよび試薬の調製
注:脱細胞化プロトコル中に使用されるすべての溶液は、特に明記されていない限り、オートクレーブ滅菌し、最大3か月間保管する必要があります。
- 脱塩水(dH2O)に塩化ナトリウム(NaCl)を137 mM、塩化カリウム(KCl)を2.68 mM、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)を8.1 mM、リン酸二水素二水和物(Na2HPO4)を1.47 mMで添加し、pHを6.8に調整して、リン酸緩衝生理食塩水10倍(PBS10倍)を調製します。100 mLの10x PBSを900 mLの脱塩H2Oに加えて、1x PBSを生成します。オートクレーブし、室温(RT)で保存します。滅菌ペニシリン/ストレプトマイシンストック溶液(10,000 U / mLペニシリンおよび10 mg / mLストレプトマイシン[ペン/連鎖球菌])を使用前に最終濃度1%まで加えます。.
- 1.21 gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス塩基)と1 gのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を1 LのdH2O(10 mMトリス塩基0.1%EDTA)に溶解して、低張緩衝液を調製します。溶解するまでマグネチックスターラーを使用し、NaOH / HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブ滅菌し、RTで保管します。 使用前にペン/連鎖球菌を最終濃度1%まで追加します。
- 1.21 gのトリス塩基を1 LのdH2O(10 mMトリス塩基)に溶解して、低張洗浄バッファーを調製します。溶解するまでマグネチックスターラーを使用し、NaOH / HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブしてRTで保管します。 使用前にペン/連鎖球菌を1%まで加えます。
- 0.05 gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を100 mLの低張洗浄液に加えて陰イオン界面活性剤処理を調製し、0.05%SDS処理液を生成します。0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。RTで最大1か月間保管してください。
注:SDS溶液はオートクレーブ時に沈殿および分解するため、オートクレーブしないでください。 - 1.21 gのトリス塩基を0.5 mLのdH 2 Oに溶解し、1 mLの1 M塩化マグネシウム(MgCl2)を加えてDNase処理液を調製します。NaOH/HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブでRTで保存し、使用前にDNase Iを加えてください(50 U/mL)。
2. サンプル収集
注:野生型C57 / BL6マウスが研究に利用されました。全ての技術は、無菌条件下で層流フード内で実施した。
- 妊娠の胚の日(E)18.5に成体の妊娠中の雌マウスをイソフルラン吸入とそれに続く頸部脱臼を使用して安楽死させます。.マウスを終末解剖に供し、胎児を抽出する。
- マウスの腹部に70%エタノールをスプレーします。
- 外科用鉗子とはさみを用いて、下腹部の皮膚のひだを持ち上げ、U字型の切開を行い、腹腔を露出させる18。
- 卵管と子宮頸部を切断してE18.5胎児を含む子宮角を収集し、すぐに1%ペン/連鎖球菌18を含む氷冷1x PBSのペトリ皿に移します。
- 子宮や胚外組織から胎児をすばやく取り除き、ハサミを使用して斬首して安楽死させます18。
- 一度に1人の胎児を氷のように冷たい1x PBSのペトリ皿に移します。実体顕微鏡を使用して、皮膚を取り除き、手足を切り取ります。腹側から、胸郭を切り裂き、胸骨とその下にある臓器を取り除きます。
- 胎児体幹の背側を上にします。脊柱の頸部、背側脂肪沈着物、および背中の深部筋肉の上にある結合組織を取り除きます。
- 外科用鉗子を使用して胸郭を固定し、マイクロメス10を使用して周囲の組織から背中の深部の筋肉を注意深くこすり、切り離します。この手順により、胎児ごとに2つの筋肉片(左右)が分離され、どちらも主に 長 肋筋と 腸肋 筋で構成され、 横棘 筋と 挙筋 の一部が含まれます。
- 筋肉サンプルを1%ペン/連鎖球菌を含む1x PBSに4°Cで短期保存(<1週間)、または-80°Cで長期間保存します。
注意: 最良の結果を得るには、新しく収集したサンプルを使用してください。長期間(>3ヶ月)凍結されたサンプルは、より低い脱細胞化効率およびより多くのタンパク質分解を示す。エパキシャル筋量は脱細胞化実験に使用されたが、他の筋肉(例えば、四肢の筋肉)は同じプロトコルを使用して脱細胞化のために処理することができる。
3.胎児骨格筋脱細胞化
注:すべての技術は、無菌条件下で層流フードで実施されました。詳細な回路図については、 図1Aを参照してください。全ての工程は、特に断りのない限り、直径120mm(165rpm)のオービタルシェーカー中で25°Cで攪拌しながら行った。使用前に1%ペン/連鎖球菌を溶液に加えます。溶液を除去するときは、サンプルがピペットに閉じ込められないように慎重に吸引してください。
- 1日目 - 上軸筋量から約2 mm x 1 mm x 1 mm(~3.5 mg)の組織片を準備します。12ウェルプレートの各ウェルに1%ペン/連鎖球菌を含む3 mLの低張バッファーを追加し、ウェルごとに1つの筋肉組織断片全体を追加します。
- 組織断片を低張バッファー中で18時間(一晩)撹拌しながらインキュベートします(O / N)。
- 2日目 -ファインチップピペットを使用して低張バッファーを吸引し、サンプルを攪拌しながら毎回3 mLの1x PBSで3 x 1時間洗浄します。
- サンプルを3 mLの0.05%SDS洗剤溶液で攪拌しながら24時間インキュベートします。
注:(チェックポイント)SDSインキュベーション後、サンプルの外観は透明である必要があります。サンプルはゼラチンのような粘稠度を示すため、液体を除去するときにピペットに付着する傾向があります。
- サンプルを3 mLの0.05%SDS洗剤溶液で攪拌しながら24時間インキュベートします。
- 3日目-ファインチップピペットを使用してSDS洗剤溶液を取り除き、組織断片を3 mLの低張洗浄バッファーで3 x 20分洗浄します。
注:(一時停止ポイント)サンプルは、低張洗浄バッファーで4°Cで18時間(O/N)維持できます。残留SDSは細胞毒性である可能性があるため、洗浄ステップ中にSDSが十分に除去されていることを確認してください。- 組織断片を2 mLのDNase溶液で3時間インキュベートし、37°Cで攪拌します。
- ファインチップピペットを使用してDNase溶液を取り出し、組織断片を攪拌しながら毎回3 mLの1x PBSで3 x 20分洗浄します。最後に、攪拌(60 rpm)でO / Nを洗浄します。
注:DNase処理後、DNA残基が存在するため、dECMは粘着性になります。したがって、慎重な洗浄が必要です。 - dECMは、再細胞化(<1週間)まで、1%ペン/連鎖球菌を用いて4°Cで1x PBSで保存します。その他の用途は-80°Cで保管してください。
4. 脱細胞化品質評価
注:DNA定量、DAPI/メチルグリーン染色、およびファロイジン染色を実施して、脱細胞化後の残留細胞含有量の存在を評価しました。免疫組織化学およびウェスタンブロット解析を実施して、脱細胞化後の重要なECMタンパク質の保持を評価しました。
- dECM中に存在するDNAの定量
注:DNAの存在を検出するには、dECMを天然組織と比較する必要があります。- 脱細胞化の前に、1.5 mLの微量遠心チューブを高精度のデジタルスケールで計量します。筋肉サンプルをチューブに移す前に、ペーパータオルを使用して残りの1x PBSをすべて取り除きます。チューブとサンプルの重量を量ります。式(1)を使用してサンプルの湿重量を計算します。
サンプル湿 重量=サンプル付き重量チューブ-重量空のチューブ(1) - セクション3で説明されているプロトコルに従ってサンプルを脱細胞化します。
- サンプルを2 mLの微量遠心チューブに入れます。
注:サンプルは、DNAの抽出と定量まで-20°Cに保つことができます。 - スピンカラムベースのキットを使用して、dECMおよびネイティブ組織サンプルのDNA抽出を実行します。製造元の指示に従って消化バッファーを追加します。
- チューブごとに1つの炭化タングステンビーズを使用して、ビーズミルで2回2.5分間サンプルを均質化します(マウントを反転させます)。
- プロテイナーゼKを添加し、56°Cでゆっくりと攪拌しながらO/Nをインキュベートします。
- 製造元の指示に記載されているプロトコルを続行します。
- メーカーが提供するバッファーで溶出し、4°Cで毎回≥6,000 x gで2 x 1分間遠心分離して、DNA収量を増やします。
注:DNAは定量するまで-20°Cで保存できます。 - 製造元の指示に従って、蛍光dsDNA検出キットを使用してサンプル中に存在するDNAを定量します。
- DNA含有量を、サンプルの元の湿重量のミリグラムあたりのDNAナノグラムとして正規化します。
- 両側スチューデントの t検定を使用してデータを分析し、平均の平均±標準誤差(SEM)として表します。
- 脱細胞化の前に、1.5 mLの微量遠心チューブを高精度のデジタルスケールで計量します。筋肉サンプルをチューブに移す前に、ペーパータオルを使用して残りの1x PBSをすべて取り除きます。チューブとサンプルの重量を量ります。式(1)を使用してサンプルの湿重量を計算します。
- 免疫組織化学
注意: 溶液1、2、および3と固定液は使用前に準備する必要があり、最大6か月間凍結しておくことができます。使用したすべての抗体と色素、およびそれぞれの希釈液は、 テーブル 1.- 溶液の調製
- パラホルムアルデヒド(PFA)2 g、スクロース8 g、および24 μLの1 M CaCl 2を77 mLの0.2 M Na 2 HPO 4および23 mLの0.2 M NaH 2 PO 4を加えて固定液を調製し、dH2 Oを加えて最終容量200 mLにします。 pHを7.4に調整します。
- 13.5 gのNa2HPO 4および3.2 gのNaH 2 PO 4を1 LのdH2Oに添加することにより、0.12 Mリン酸緩衝液を調製し、pHを7.4に調整します。
- 100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に4 gのスクロースを加えて溶液1を調製します。
- 15 gのスクロースを100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に加えて溶液2を調製します。
- 100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に15 gのスクロースと7.5 gのゼラチンを加えて溶液3を調製します。ゼラチンが溶解するまで37°Cで加熱する。
- メチルグリーンストック溶液(dH 2 Oに溶解した2%メチルグリーン粉末)19を準備します。
- 免疫検出
- 固定液を使用してサンプルを4°Cで少なくとも4時間固定します。
- サンプルを1x PBSで2回10分間洗浄します。
- O / Nを1日以上、溶液1に4°Cで保ちます。
- 洗浄し、O / Nまたは溶液2で4日以上4日以上保持します。 サンプルをRTまで温めます。
- 溶液3中で37°Cで3時間インキュベートします。 後で使用するために、追加の溶液3を37°Cに保管してください。
- 小さな容器(2 cm x 1 cm x 1 cm)をアルミホイルで成形します。溶液3の薄層を成形容器に入れ、固めます。固化溶液3の上にサンプルを置き、温かい溶液3で覆います。サンプルの向きを変えて固化させます。固化溶液3上の箇所をカラーペンで印する。
- ドライアイスチルドまたは液体窒素チルドイソペンタンの表面に容器を置いて凍結します。
- 最適な切断温度(O.C.T.)コンパウンドを使用して、サンプルを含む凍結ゼラチンキューブをクライオスタットマウントに固定します。
- 凍結ゼラチンキューブを切断し、組織切片をスライドに移します。60分間乾かします。
- 疎水性マーカーを使用して、セクションの周りの線をトレースします。
- スライドを1x PBSで3 x 10分洗浄します。
- 切片を1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1%ヤギ血清、および1x PBS(ブロッキング溶液)で希釈した0.05%Triton X-100で30分間覆います(ブロッキングステップ)。
- 一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、切片を覆います。切片が乾燥するのを防ぐために、湿った紙を入れた密閉箱の中で4°CでO / Nをインキュベートします。
- スライドを1x PBSで3 x 10分洗浄します。
- 二次抗体をブロッキング溶液で希釈し、切片を覆います。暗所でRTで1.5時間インキュベートします。
注:蛍光色素の劣化を防ぐため、光への暴露は避けてください。 - スライドを4x PBSで3 x 10分洗浄します。
注意: 強いバックグラウンドが存在する場合は、高濃度のPBSを使用できます。 - スライドをDAPI溶液(5 μg/mL 1,4-ジアザビシクロ-2,2,2-オクタン、0.1%トリトンX-100/1x PBS溶液)にそれぞれ30秒間沈めます。
- 1x PBSですすいでください。
- 切片を退色防止培地(1x PBS:グリセロール[1:9]に50 mg / mL n-プロピルガレート)で取り付け、カバーガラスで密封します。蛍光顕微鏡20で観察・画像取得するまで4°Cで保存する。
注: toto 免疫組織化学実験では、サンプルを1x PBSで希釈した4%PFAでRTで3時間固定したことを除いて、同じプロトコル(ステップ4.2.2.12-4.2.2.18を参照)を使用しました。使用した全ての抗体および色素、ならびにそれらのそれぞれの希釈液を 、表1に列挙する。次に、サンプルをスチールリングで分離された2つのカバーガラスの間に退色防止媒体にマウントし、蜜蝋で接着し、共焦点顕微鏡21を使用して100μmの画像スタックを取得しました。
- 溶液の調製
- ウェスタンブロット解析
注:使用したすべての抗体とそれぞれの希釈液は、 テーブル 1.- 溶液の調製
- グリセロール20 mL、SDS4 g、ブロモフェノールブルー0.2 mLを100 mM Tris塩基溶液80 mLに加えて、2x SDS-PAGEローディングバッファーを調製します。pHを6.8に調整します。使用前に新鮮なジチオスレイトール(DTT)を追加してください。.
- 2.4 gのトリス塩基、8.8 gのNaCl、および1 mLのTween-20をdH2Oに最終容量1 Lまで加えることにより、Tween 20(TBST)溶液でトリス緩衝生理食塩水洗浄バッファーを調製します。 HClを使用してpHを7.4〜7.6に調整します。
- 10 LのdH 2 Oに30.2 gのトリス塩基、144.2 gのグリシン、および10 gのSDSを加えて、10xランニングバッファー(RB)を調製します。使用前に、100 mLの10x RBを900 mLのdH2Oに加えて、1x RB(作業溶液)を調製します。
注:10x RBはRTで数か月間保存できますが、1x RBはさまざまな実行で再利用できます。 - 5.82 gのトリス塩基、2.93 gのグリシン、および0.5 gのSDSを800 mLのdH2Oに加えることにより、トランスファーバッファー(TB)を調製します。成分が溶解したら、メタノール200mLを加える。4°Cで冷却します。
注意: TBは、毎回使用する前に新たに準備する必要があります。
- タンパク質抽出
- E18.5マウスから上軸筋を採取し、新たにDTT(100 mM DTT)を添加した2x SDS-PAGEローディングバッファーを含むマイクロ遠心チューブ(2 mL)に直ちに入れます。同じ方法でE18.5 dECMを処理します。
- チューブごとに1つのタングステンカーバイドビーズを追加します。ビーズミルで毎回2.5分間2倍ホモジナイズします(マウントを裏返します)。
- 超音波浴中で5分間サンプルを超音波処理する。
- サンプルを50°Cで10分間加熱します。
- サンプルを12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- 微量分光光度計を用いてタンパク質を定量する。
- さらに使用するまで-20°Cで保管してください。
- ポリアクリルアミドゲル電気泳動
- プレキャストアクリルアミドグラジエントゲルを使用(4%-20%)
- ゲルを電気泳動タンクにマウントします。櫛を慎重に取り外します。電気泳動タンクにラインが表示されるまで1x RBを追加します。ウェルがRBで満たされていることを確認してください。
- サンプルあたり100 μgのタンパク質をウェルにロードします。12 μLの高分子量タンパク質標準物質をロードします。
- 定電圧で合計100分間実行します(150Vで10分、185Vで90分)。
- 移転
- ゲルが流れている間、フィルターパッドとスポンジを冷やしたTB(4°C)に浸します。
- ポリビニリデン二フッ化膜をゲルのサイズにカットします。メタノールで活性化し、dH2Oで洗浄します。
- 製造元の指示に従って、スポンジ、フィルターパッド、ゲル、および活性膜を使用してトランスファーカセットを取り付けます。
- カセットを冷やしたTBの入った電気泳動タンク(氷床の上)に入れます。冷却ユニットを追加します。100Vで90分間動作します。
- 移し替え後、クーマシーブルーの代用品で染色して転写品質を評価します。
- 免疫検出
- ブロッキング溶液(5%低脂肪牛乳を含むTBST)を準備します。RTで1時間攪拌しながら膜をインキュベートします。
- TBSTで3 x 5秒すすぎます。
- TBSTで希釈した一次抗体を2%BSAおよび0.02%アジ化ナトリウム(メンブレンあたり3 mL)でメンブレンO/Nをコールドチャンバー(4°C)で撹拌しながらインキュベートします。
- 翌日、TBSTで3 x 5分洗浄します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体をTBSTで希釈し、5%低脂肪ミルク(各メンブレンに5 mL)を加えてメンブレンをRTで1時間インキュベートします。
- TBSTで膜を3 x 5分洗浄します。検出ステップまでTBSTに保管してください。
- 市販の開発キットを使用してタンパク質を視覚化します。製造元の指示に従って検出試薬を追加してください。バンドの画像を取得します。
- メンブレンごとに複数の抗体を検査するには、検出ステップの後、TBSTを使用して3回の洗浄(各5分)で前者の抗体を取り除き、ステップ4.3.5.2-4.3.5.7を繰り返します。
- 溶液の調製
表1:免疫組織化学およびウェスタンブロット分析に用いた抗体および色素ならびにそれぞれの希釈液。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。10.22
5. 脱細胞化マトリックスにおける細胞培養
注:すべての技術は、層流フード内の無菌条件下で実行されました。全てのインキュベーションは、37°Cおよび5%CO2を用いて行った。
- 細胞培養培地、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地を安定グルタミンとピルビン酸ナトリウム(DMEM)で調製し、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペン/連鎖球菌(完全培養培地)を添加します。
- dECMを層流フードに1%ペン/ストレプトを入れた1x PBSのペトリ皿に入れ、マイクロメスとピンセットを使用して約500 μm x 500 μm x 250 μmの断片に分離します。
注:dECMは柔らかい質感を持っているため、マイクロメスで切断するよりも、ピンセットを使用してほぼ同じサイズの断片に分離する方が簡単なことがよくあります。 - 断片を、あらかじめ37°Cに温めた200 μLの完全培養培地を含む96ウェルプレート(ウェルあたり3個または4個)に移します。 インキュベーターで2時間インキュベートします。
- サブコンフルエント(~70%)C2C12細胞を播種したT25フラスコに500 μLのトリプシンを加えます。1 mLの完全培地に再懸濁します。.
- 10 μLの再懸濁液を10 μLのトリパンブルー色素に加え、血球計算盤にロードします。細胞数をカウントして計算し、細胞の生存率を確認します。
- dECMを含む96ウェルプレートから培地を吸引し、50,000個の生存C2C12細胞を含む200 μLの完全培養培地を追加します。
- 2日間インキュベートした後、ピンセットを使用して、dECM(細胞を含む)を400 μLの完全培養培地を含む48ウェルプレートに移します。2日ごとに、マイクロピペットで培地を注意深く吸引して、dECMがウェルの底から剥離しないようにし、8日目まで新しい培地を追加します。
注:マトリックスは、dECMへのC2C12細胞の接着を促進するために96ウェルプレートで2日間保持され、その後、栄養素を含むより多くの培地にアクセスできるように48ウェルプレートに移されます。dECMはウェルの底に付着する必要があります。 - 分化実験では、8日目に完全培養培地を分化培地(2%ウマ血清と1%ペン/連鎖球菌を添加したDMEM)に交換し、その後分化培地で12日目まで4日間インキュベートします。
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Representative Results
脱細胞化プロトコルの目標は、天然組織の組成によく似たdECMを産生することです。脱細胞化プロセスの有効性を判断するために、組織形態の検査、DNAレベルの測定、F-アクチンの染色、免疫組織化学およびウェスタンブロッティング技術を使用した主要なECM成分の分析など、さまざまな方法が採用されました。具体的には、骨格筋組織の5つの主要なECM成分を分析しました。
プロトコル全体を通して、サンプルの外観が変化します(図1B 1-4)。単離後、ミオグロビンの存在により筋肉組織は赤みがかったように見えます(図1B1)。細胞を溶解し、ほとんどの細胞質タンパク質を除去する低張バッファーでインキュベートすると、サンプルは白色に変わります(図1B2)。組織の脱細胞化12で一般的に使用される陰イオン界面活性剤であるSDSは、細胞質および核物質、ならびに膜を効果的に除去します。その結果、SDS処理後にサンプルはより透明になります(図1B3)。しかしながら、この洗剤への高濃度または長期暴露は、タンパク質変性、グリコサミノグリカンの喪失、およびコラーゲン線維の破壊を引き起こす可能性がある12。細胞除去とECMの保存の最適なバランスは、図2および図3に示すように、0.05% SDSを24時間使用して達成されます。最後に、DNase処理によってDNAが除去され、SDS処理後よりもわずかに小さい透明なdECM足場が得られます(図1B4)。
脱細胞化プロトコルの成功は、プロセス後のマトリックスに存在する残留DNAの量によって示されます。DNA定量により、天然組織と比較してdECMがほぼ100%減少していることが明らかになりました(図1C)。DAPI染色により、dECMにDNAがないことも確認されます(図2B、D、F、H、J)。
5つの主要なECMタンパク質の存在を免疫組織化学および脱細胞化後のウェスタンブロットによって評価し、天然組織と比較しました。ラミニンα2サブユニット(図2A、B)および総ラミニン(図2C、D)の免疫染色は、dECMがこれらのタンパク質(図2B、Dの矢印)に対して、天然組織の筋管細胞を囲むラミニンマトリックス(図2A、Cの矢印)と同様に尿細管染色を示すことを示しています。ラミニンα2サブユニットのウェスタンブロット分析では、天然組織に2つのバンドが存在することが明らかになり(図2A ')、dECMでは予想よりも分子量が小さい3つのバンドが検出されます(図2B ')。これは、脱細胞化プロセス中のタンパク質分解または除去の結果である可能性があります。総ラミニンについてのウェスタンブロット分析は、天然組織からのサンプルと比較して、dECMにおけるこれらのタンパク質のいくらかの断片化を示しています(図2C'、D ')。
図1:胎児骨格筋の脱細胞化手順と組織形態およびDNA含有量の評価。 (A)脱細胞化プロトコルの概略図。(B)新たに採取された組織から脱細胞化組織まで、プロトコル全体の組織形態。スケールバー= 1 mm。 (C)天然組織と比較したdECMに存在するDNAの定量。SEM±平均値として表されたデータ。 スチューデントのt検定、両側**p < 0.01。脱細胞化プロトコルは、無細胞dECMを産生する核コンテンツを効率的に除去します。略語:dECM =脱細胞化マトリックス;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;SDS =ドデシル硫酸ナトリウム;NT =天然組織。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
フィブロネクチン(図2E、F)およびコラーゲンI(図2G、H)の免疫染色は、天然組織の細胞間質腔におけるこれらのタンパク質の存在(図2E、Gの矢印)およびdECMにおける同様の染色(図2F、Hの矢印)を示す。ウェスタンブロット分析は、両方の条件でフィブロネクチンについて同様のバンドを示し(図2E'、F ')、このタンパク質が脱細胞化プロセスの影響を特に受けないことを示しています。しかし、コラーゲンI(図2G'、H')の場合、dECMのバンドは少なく、ある程度の分解を示しています。IV型コラーゲンの免疫染色は、天然組織における管状染色パターン(図2Iの矢印)およびdECMにおける同様の染色を示すが、管状構造はより狭い(図2Jの矢印)。コラーゲンIVのウェスタンブロット分析により、天然組織に3つのバンドが存在することが明らかになりました(図2I ')。dECMでは同じ3つのバンドが観察されますが(図2J ')、これらの分子量は予想よりも低くなっています。ラミニンα2と同様に、これは脱細胞化中のタンパク質分解または除去の結果であり得る。
次に、dECMにC2C12筋芽細胞を播種し、完全培養培地で8日間培養します。C2C12細胞は、ホスホヒストン3核染色によって示されるように、dECMsにコロニーを形成し、増殖する(図3Aの矢印)。分化培地中でさらに4日間培養した後、C2C12細胞は分化し、ミオシン重鎖を発現する多核(図3Bの青い矢印)筋管(図3Bの破線)に融合する。興味深いことに、ラミニンα2鎖(図3C、Dの黄色矢印)、総ラミニン(図3Cのマゼンタ矢印)、およびフィブロネクチン(図3Dのマゼンタ矢印)の細胞内および/または細胞周囲染色は、完全培養培地で培養されたC2C12細胞で検出でき、これらの細胞がこれらのECMタンパク質をde novoで合成できることを示唆しています。したがって、彼らのニッチの形成に貢献しています。これらの結果は、脱細胞化プロトコルが、C2C12筋芽細胞が増殖、分化、および多核筋管を形成できるdECM微小環境を生成することを示しています。
図2:天然および脱細胞化E18.5胎児筋肉組織における5つのECMタンパク質の評価。 天然組織(A、C、E、G、I)の切片の免疫組織化学、およびDNAマーカーであるDAPI、ファロイジン検出F-アクチン、およびECMタンパク質によるdECM(B、D、F、H、J)の染色。スケールバー= 15μm。天然組織では、筋線維の周囲にラミニンとコラーゲンIVの免疫染色が存在し(A、C、I、黄色の矢印)、フィブロネクチンとコラーゲンIの染色が筋線維の間質腔に検出されます(E、G、黄色の矢印)。dECMでは、ラミニンとコラーゲンIVの染色(B、D、J、黄色の矢印)は、脱細胞化後に筋線維が残した空間を囲む管状のパターンを示しています。dECMのフィブロネクチンおよびコラーゲンI免疫染色は、間質腔におけるそれらの存在と一致している(F、H;黄色の矢印)。(A'-J')天然組織(A'、C'、E'、G'、I')およびdECMサンプル(B'、D'、F'、H'、J')中の5つのECMタンパク質のウェスタンブロット解析。どちらのアプローチも、脱細胞化後のタンパク質保存を示しています。使用した抗体および各希釈液を 表1に記載する。略語:LNα2=ラミニンα2鎖;LNp =汎筋肉ラミニン;FN =フィブロネクチン;コルI =コラーゲンI;コルIV =コラーゲンIV;MHC = ミオシン重鎖。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:筋芽細胞株(C2C12筋芽細胞)によるdECM再細胞化。 (A)メチルグリーン染色DNAで標識されたC2C12細胞、F-アクチンを検出するファロイジン、および増殖マーカーである抗pH3抗体(マゼンタ矢印)でコロニーを形成した再細胞化マトリックスの100μmスタックの共焦点画像の最大強度投影。スケールバー= 35μm。 (b)培養中に形成された多核(青い矢印は核を示す)ミオシン重鎖陽性筋管(破線)を示す100μmスタックの共焦点画像の最大強度投影。スケールバー = 35 μm。 (C,D)筋芽細胞のラミニンα2鎖(黄色矢印)、総ラミニン(Cのマゼンタ矢印)、およびフィブロネクチン(Dのマゼンタ矢印)の細胞内または細胞外染色を示す免疫組織化学共焦点画像は、de novoタンパク質合成を示唆しています。スケールバー= 10μm。使用した抗体および各希釈液を表1に記載する。略語:pH3 =ホスホヒストン3;LNα2=ラミニンα2鎖;LNp =汎筋肉ラミニン;FN =フィブロネクチン;MHC = ミオシン重鎖。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ECMは、すべての組織に存在する高分子の複雑なネットワークであり、細胞の挙動と機能の調節に重要な役割を果たします2。ECMは、細胞が付着するための物理的な足場として機能し、増殖、運動性、分化、アポトーシスなどの細胞プロセスをアクティブに調節する手がかりを提供します。したがって、ECMの適切な形成と維持は、発生と恒常性の両方にとって不可欠です1。
2D細胞培養モデルは広く使用されていますが、より高度な3Dプラットフォームに取って代わられることも増えています。これは、2D培養には細胞の挙動に影響を与える化学的および物理的手がかりがないためですが、3D培養は、ネイティブ組織の分子および細胞ダイナミクスを研究するためのより現実的な代替手段と見なされているためです11。組織の脱細胞化は、様々な組織または器官系にわたる多数の研究において実証されているように、生物学的組織の微小環境をより厳密に模倣する足場の産生をもたらす14、15、23、24、25。天然の組織微小環境を再現するdECMの能力は、正常な発達、さまざまな病状、および組織に対する薬物または毒素の影響に関する研究に大きな可能性を秘めています11。
この研究で使用されたプロトコルは、出発点として胎児の心臓組織14 を脱細胞化するためにSilvaらによって開発されたプロトコルに基づいています。これには、低張バッファー、陰イオン界面活性剤(SDS)による処理、およびDNase処理の組み合わせが含まれます。脱細胞化プロトコルにおける主な課題の1つは、細胞の除去とECMタンパク質組成の保存のバランスを見つけることです。この3D細胞培養システムを使用してLAMA2-CMDの初期段階を研究することに焦点を当てているため、脱細胞化中のラミニン211の保存に特別な注意が払われました。Silvaら14 のプロトコルは、脱細胞化された胎児の筋肉におけるラミニンα2鎖免疫反応性の喪失をもたらした。これは、使用されているSDSの濃度が原因である可能性があります。したがって、低濃度のSDS(0.1%、0.05%、および0.02%)および異なる濃度のTriton X-100(0.5%および0.2%)によるSDSの置換など、0.2%SDS洗剤溶液ステップの代替案がテストされました。最良の結果は、0.05%SDS洗剤処理を24時間使用することによって達成されました。この濃度は、脱細胞化後のラミニンα2鎖免疫反応性を維持しながら、細胞内容物を効果的に除去した。このプロトコルは、DNAを含む細胞残留物を含まない無細胞dECMを再現性よく生成します。
この研究で使用されたプロトコルは、間質マトリックスタンパク質(フィブロネクチンとコラーゲンI)と基底膜タンパク質(ラミニンとコラーゲンIV)の両方を保存します。今後の研究では、VI型コラーゲンも筋ジストロフィーのプレーヤーであるため、保存されているかどうかを評価する必要があります26。SDSはタンパク質の微細構造を破壊し、コラーゲンを損傷する可能性があることが知られています12。胎児骨格筋では、ラミニンα2の免疫反応性を維持するために低濃度のSDS(0.05%)を使用することが重要でした。しかしながら、ウェスタンブロットの結果は、脱細胞化サンプルが、天然組織と比較してラミニンおよびコラーゲンの免疫検出後により多くのバンドを示すことを示し、脱細胞化プロセスの結果としていくらかのタンパク質分解が起こったことを示している27。
重要なことに、再細胞化実験は、これらのマトリックスが細胞の接着、増殖、および分化を一貫してサポートする信頼性の高い足場であることを示しています。SDSは細胞毒性であると報告されているため28、マトリックスを再細胞化に使用する場合は、プロトコルに含まれる洗浄ステップが重要です。これらの足場はC2C12細胞によって効果的にコロニー形成され、細胞の3D培養のモデルシステムとしての適合性を示しています。C2C12細胞を取り巻くECMタンパク質の細胞内および細胞周囲染色の観察は、細胞がdECM内の微小環境に積極的に貢献していることをさらに示唆しています。さらに、分化培地に入れると、C2C12細胞は分化し、融合し、dECM内で筋管を形成しました。
この手順における重要な課題は、プロトコル全体でサンプルを操作することです。サンプルは非常に小さくて柔らかいため、チップピペットへの閉じ込めやサンプルの損失を防ぐために、取り扱いに注意とスキルが必要です。新鮮な組織でプロトコルを開始すると、最良の結果が得られます。凍結保存されたサンプルを使用すると、細胞含有量の除去が妨げられ、タンパク質分解が増加し、タンパク質の検出が妨げられ、脱細胞化効率が低下する可能性があります。
胎児組織の脱細胞化を報告している研究はごくわずかです15,29,30,31。具体的には、胎児骨格筋の脱細胞化に関して、真皮、皮下組織、およびパンニクルスカルノサスの複合サンプルの脱細胞化について報告された以前の研究は1つだけです31。著者の知る限り、単離された胎児マウス骨格筋の脱細胞化プロトコルが確立されたのはこれが初めてです。このプロトコルは、ブタやヒトなどの他の種の胎児の筋肉組織に対する同様のプロトコルを作成するための基礎として役立ちます13。
E18.5マウス骨格筋を脱細胞化するための本プロトコルは、E18マウス心臓に適用したSilvaら14の手順と非常によく似ています。唯一の違いは、使用されるSDSの濃度であり、おそらくこれら2つの胎児組織の物理的特性が異なるため、胎児の心臓に使用されるものよりもかなり低い(0.05%対0.2%)。
この in vitro モデルの開発により、正常な胎児の筋肉の発達に関与するプロセスの研究が可能になるだけでなく、 dyW マウスモデル10のE18.5で筋形成障害として現れるLAMA2-CMDなどの早期発症型筋ジストロフィーとミオパチーの並行調査も可能になります。ただし、このシステムは、ECMと筋細胞のみを含み、ニューロン、内皮細胞、線維芽細胞などの他の細胞型を含まないという点で制限されていることに注意してください。これらの追加の細胞型の関連性は疾患によって異なり、それらを含めるには培養システムの修正が必要になる場合があります。全体として、この研究に記載されているdECMの使用は、さまざまな早期発症型筋ジストロフィーおよびミオパチーの研究に適用できます。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon;契約番号23049)、MATRIHEALTHプロジェクト、およびcE3cユニット資金UIDB/00329/2020によって資金提供されました。MATRIHEALTHプロジェクトを支援することを選択したドナーのエンリケ・メイレレスに感謝します。この作業は、ポルトガルのバイオイメージングプラットフォーム(参照PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のノードである理学部顕微鏡施設のインフラストラクチャの恩恵を受けており、画像の取得と処理を支援してくれたルイスマルケスに感謝します。最後に、技術サポートを提供してくれたマルタパルマと寛大な貢献をしてくれた研究チームに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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