Summary
在这项工作中，优化了脱细胞方案以获得胎鼠骨骼肌的脱细胞基质。C2C12成肌细胞可以在这些基质中定植，增殖和分化。这种 体外 模型可用于研究骨骼肌疾病（如肌肉萎缩症）背景下的细胞行为。
Abstract
细胞外基质（ECM）在为细胞提供结构支持和传递对各种细胞过程很重要的信号方面起着至关重要的作用。二维（2D）细胞培养模型过度简化了细胞与ECM之间的复杂相互作用，因为缺乏完整的三维（3D）支持会改变细胞行为，使其不足以理解 体内 过程。ECM组成和细胞 - ECM相互作用的缺陷是导致各种不同疾病的重要因素。
一个例子是LAMA2先天性肌营养不良症（LAMA2-CMD），其中功能性层粘连蛋白211和221的缺失或减少可导致严重的肌张力低下，可在出生时或出生后不久检测到。先前使用该疾病的小鼠模型的研究表明，其发病发生在胎儿肌生成期间。本研究旨在开发一种3D 体外 模型，允许研究肌肉细胞和胎儿肌肉ECM之间的相互作用，模拟天然微环境。该协议使用从E18.5小鼠胎儿解剖的深背部肌肉，用低渗缓冲液，阴离子洗涤剂和DNase处理。与天然组织相比，所得的脱细胞化基质（dECM）保留了测试的所有ECM蛋白（层粘连蛋白α2，总层粘连蛋白，纤连蛋白，胶原蛋白I和胶原蛋白IV）。
当C2C12成肌细胞接种在这些dECM上时，它们穿透并定植了dECM，从而支持了它们的增殖和分化。此外，C2C12细胞产生ECM蛋白，有助于重塑其在dECM中的生态位。这种 体外 平台的建立为揭示LAMA2-CMD发病过程中涉及的过程提供了一种新的有前途的方法，并有可能适应其他骨骼肌疾病，其中ECM和骨骼肌细胞之间的沟通缺陷有助于疾病进展。
Introduction
细胞外基质（ECM）是组织的主要成分，代表其非细胞成分。这种三维（3D）结构不仅为细胞提供物理支持，而且在生物体发育所涉及的生化过程中起着至关重要的作用1。组织特异性ECM的形成发生在发育过程中，这是细胞与其壁龛之间复杂相互作用的结果，受到各种细胞内和细胞外刺激的影响。ECM是一种高度动态的结构，以时空方式经历化学和机械重排，直接影响细胞命运2。ECM最显着的特征之一是其功能多样性，因为每个组织ECM都显示出独特的分子组合，这些分子提供了针对其所含细胞量身定制的不同拓扑结构和特性1。
ECM信号传导和支持对于发育和体内平衡至关重要，当中断时可导致多种病理状况3，4。一个例子是LAMA2缺陷性先天性营养不良症（LAMA2-CMD），这是先天性肌营养不良症最常见的形式。LAMA2基因编码层粘连蛋白α2链，该链存在于层粘连蛋白211和层粘连蛋白221中，当突变时可导致 LAMA2-CMD 5。层粘连蛋白211是在骨骼肌纤维周围的基底膜中发现的主要亚型。当层粘连蛋白211异常或不存在时，基底膜和肌肉细胞之间的联系被破坏，导致疾病的发作6。LAMA2-CMD患者表现出轻度至重度表型，具体取决于 LAMA2 基因突变的类型。
当层粘连蛋白α2蛋白的功能受到影响时，患者在出生时会出现严重的肌肉张力减退，并发生慢性炎症、纤维化和肌肉萎缩，导致预期寿命缩短。迄今为止，尚未开发出有针对性的治疗方法，治疗方法仅限于缓解疾病的症状7。因此，了解参与这种疾病发作的潜在分子机制对于制定适当的治疗策略至关重要6，8。先前使用LAMA2-CMD模型dy W小鼠9的工作表明，该疾病的发作始于子宫内，特别是在胎儿肌发生期间10。更好地了解胎儿肌生成缺陷是如何出现的，将是为LAMA2-CMD产生新治疗方法的游戏规则改变者。
体外 系统为研究细胞-细胞和细胞-ECM相互作用提供了受控环境，但2D培养模型缺乏天然组织的复杂性。组织的去细胞化产生组织和发育阶段特异性无细胞ECM支架，与2D模型和工程/合成支架相比，它更准确地模拟天然细胞微环境。脱细胞基质（dECM）有可能保留宿主组织的分子和机械线索，使其成为理解 体内 过程的更好替代模型11。
有多种技术、试剂和条件可用于脱细胞12，13。在这项研究中，由Silva等人描述的胎鼠心脏脱细胞方案14，15适用于胎鼠骨骼肌，并发现保留所有测试的ECM成分（层粘连蛋白α2，总层粘连蛋白，纤连蛋白，胶原蛋白I和胶原蛋白IV）。该方案包括三个步骤：渗透休克细胞裂解（低渗缓冲液），质膜溶解和蛋白质解离（0.05%十二烷基硫酸钠[SDS]）和DNA的酶促破坏（DNase处理）。据我们所知，这是第一个建立的小鼠胎儿骨骼肌去细胞化的方案。
为了使用该3D体外系统研究LAMA2-CMD，在脱细胞后维持层粘连蛋白α2链至关重要。因此，实施了优化方案，其中测试了不同的洗涤剂（SDS和Triton X-100）和浓度（0.02%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%）（数据未显示）。细胞去除和保存层粘连蛋白α2蛋白的最佳选择是0.05%SDS。C2C12细胞是一种成熟的肌母细胞系16，17，用于接种dECM。这些细胞侵入dECM，在这些支架内增殖和分化，合成新的ECM蛋白。这种3D体外模型的成功生产提供了一种新方法来理解胎儿肌生成，LAMA2-CMD的发作所涉及的分子和细胞过程，并且可以扩展到ECM和骨骼肌细胞之间的通信被破坏的其他肌肉疾病。
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Protocol
所描述的所有方法均已获得里斯本大学理学院动物福利委员会（ORBEA）和兽医协会（DGAV;ref. 0421/000/000/2022）的批准，并符合欧洲指令2010/63 / EU。
1. 脱细胞缓冲液和试剂的制备
注意：除非另有说明，否则在脱细胞方案期间使用的所有溶液都应通过高压灭菌灭菌并储存长达3个月。
- 通过添加 10 mM 的氯化钠 （NaCl）、2.68 mM 的氯化钾 （KCl）、8.1 mM 的磷酸二氢钾 （KH 2 PO 4） 和 1.47 mM 的二钠磷酸氢二水合物 （Na 2 HPO4） 到软化水 （dH2O） 中制备 10x 磷酸盐缓冲盐水 （10x PBS），并将 pH 值调节至 6.8。将 100 mL 的 10x PBS 加入 900 mL 的脱矿质 H2O 中，以生成 1x PBS。高压灭菌并在室温（RT）下储存。使用前加入无菌青霉素/链霉素储备溶液（10，000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素 [笔/链球菌]），终浓度为 1%。
- 通过将1.21g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）和1g乙二胺四乙酸（EDTA）溶解在1L dH2O（10mM Tris碱0.1%EDTA）中来制备低渗缓冲液。使用磁力搅拌器直至溶解，并用NaOH / HCl将pH调节至7.8。 通过高压灭菌灭菌并储存在室温下。 使用前加入笔/链球菌至终浓度为1%。
- 通过将1.21gTris碱溶解在1L的dH2O（10mM Tris碱）中来制备低渗洗涤缓冲液。使用磁力搅拌器直至溶解，并用NaOH / HCl将pH值调节至7.8。 高压灭菌并储存在室温下。 使用前加入笔/链球菌至1%。
- 通过将 0.05 g 十二烷基硫酸钠 （SDS） 加入 100 mL 低渗洗涤缓冲液中制备阴离子洗涤剂处理，以产生 0.05% SDS 处理溶液。通过0.22μm膜过滤器过滤。在室温下储存长达 1 个月。
注意：SDS溶液不应高压灭菌，因为SDS在高压灭菌时会沉淀和降解。 - 通过将 1.21 g Tris 碱溶解在 0.5 mL dH 2 O 中并加入 1 mL 1 M 氯化镁 （MgCl2） 来制备 DNase 处理溶液。用NaOH / HCl将pH值调节至7.8。 高压灭菌并储存在室温下。 使用前加入脱氧核糖核酸酶I（50 U / mL）。
2. 样品采集
注意：研究中使用了野生型C57 / BL6小鼠。所有技术均在无菌条件下在层流罩中进行。
- 在怀孕的胚胎日（E）18.5使用异氟醚吸入然后颈椎脱位对成年怀孕雌性小鼠实施安乐死。对小鼠进行终末解剖以提取胎儿。
- 用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
- 使用手术镊子和剪刀，提起下腹部的皮肤褶皱，并做一个U形切口以露出腹腔18。
- 通过切割输卵管和子宫颈来收集含有 E18.5 胎儿的子宫角，并立即将它们转移到带有冰冷 1x PBS 和 1% 笔/链球菌18 的培养皿中。
- 快速将胎儿从子宫和胚胎外组织中取出，并使用剪刀斩首对它们实施安乐死18.
- 一次将一个胎儿转移到带有冰冷的 1x PBS 的培养皿中。使用体视显微镜去除皮肤并切断四肢。从腹侧切开胸腔并移除胸骨和下层器官。
- 将胎儿躯干背侧向上翻转。去除椎体的颈部部分、背侧脂肪沉积物和背部深层肌肉顶部的结缔组织。
- 使用手术镊固定胸腔，并使用微型手术刀小心地从周围组织中刮擦和分离背部深层肌肉10。该手术导致每个胎儿（左和右）分离两个肌肉块，这两个肌肉 主要由长 肌和 髂 肋肌组成，包括一些 横腹 肌和 肋提 肌。
- 将肌肉样品储存在4°C下用1%笔/链球菌的1x PBS中短期储存（<1周），或在-80°C下储存更长时间。
注意：使用新鲜收集的样品以获得最佳效果。长时间冷冻（>3个月）的样品显示出较低的脱细胞效率和更多的蛋白质降解。外轴肌质量用于去细胞化实验，但其他肌肉（例如，肢体肌肉）可以使用相同的方案进行处理以进行脱细胞化。
3.胎儿骨骼肌脱细胞
注意：所有技术均在无菌条件下在层流罩中进行。有关详细的原理图表示，请参见 图1A。除非另有说明，否则所有步骤均在直径为120mm（165rpm）的轨道振荡器中在25°C下搅拌进行。使用前在溶液中加入 1% 笔/链球菌。取出溶液时，请小心吸出以避免样品滞留在移液器中。
- 第 1 天 - 从外轴肌块中准备大约 2 mm x 1 mm x 1 mm （~3.5 mg） 的组织碎片。向 12 孔板的每个孔中加入 3 mL 含有 1% 笔/链球菌的低渗缓冲液，每孔添加一块完整的肌肉组织碎片。
- 将组织碎片在低渗缓冲液中搅拌18小时（过夜）（O / N）。
- 第 2 天 - 使用细尖移液管吸出低渗缓冲液，每次搅拌用 3 mL 的 1x PBS 洗涤样品 3 x 1 小时。
- 将样品与3mL的0.05%SDS洗涤剂溶液搅拌孵育24小时。
注意：（检查点）SDS孵育后，样品的外观应该是透明的。样品显示出类似明胶的稠度，因此在去除液体时更容易粘附在移液器上。
- 将样品与3mL的0.05%SDS洗涤剂溶液搅拌孵育24小时。
- 第 3 天 - 使用细尖移液管取出 SDS 洗涤剂溶液，每次搅拌用 3 mL 低渗洗涤缓冲液洗涤组织碎片 3 x 20 分钟。
注意：（暂停点）样品可以在4°C的低渗洗涤缓冲液中保持18小时（O / N）。确保在洗涤步骤中充分去除SDS，因为残留的SDS可能具有细胞毒性。- 将组织碎片与2mL DNase溶液在37°C下搅拌孵育3小时。
- 使用细尖移液管取出 DNase 溶液，每次搅拌用 3 mL 的 1x PBS 洗涤组织碎片 3 x 20 分钟。最后，搅拌（60 rpm）洗涤O / N。
注意：在DNase处理后，由于DNA残基的存在，dECM变得粘稠。因此，必须仔细清洗。 - 将dECM储存在4°C下用1%笔/链球菌的1x PBS中，直到细胞再生（<1周）。对于其他用途，储存在-80°C。
4. 脱细胞质量评估
注意：进行DNA定量，DAPI /甲基绿染色和鬼笔环肽染色以评估脱细胞后残留细胞内容物的存在。进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析以评估脱细胞后关键ECM蛋白的保留情况。
- 定量 dECM 中存在的 DNA
注意：应将dECM与天然组织进行比较，以检测DNA的存在。- 在脱细胞之前，在高精度数字秤上称量 1.5 mL 微量离心管。在将肌肉样本转移到试管之前，使用纸巾取出所有剩余的 1x PBS。称量试管和样品。使用公式（1）计算样品的湿重：
样品湿 重=带样品的配重管-配重空管（1） - 按照第3节中描述的方案对样品进行去细胞化。
- 将样品放入 2 mL 微量离心管中。
注意：样品可以保持在-20°C，直到DNA提取和定量。 - 使用基于离心柱的试剂盒对 dECM 和天然组织样品进行 DNA 提取。根据制造商的说明添加消化缓冲液。
- 在珠磨机中均质样品两次，每次2.5分钟（翻转镶座），每管使用一个碳化钨珠（使用冷冻管镶座）。
- 加入蛋白酶K并在56°C下缓慢搅拌孵育O / N。
- 按照制造商说明中的说明继续执行协议。
- 用制造商提供的缓冲液洗脱，并在4°C下以≥6，000× g离心2 x 1分钟以提高DNA产量。
注意：DNA可以储存在-20°C直至定量。 - 按照制造商的说明，使用荧光 dsDNA 检测试剂盒定量样品中存在的 DNA。
- 将DNA含量标准化为每毫克原始湿重样品的DNA纳克。
- 使用双尾学生 t 检验分析数据，并表示为平均值 （SEM） 的平均值±标准误差。
- 在脱细胞之前，在高精度数字秤上称量 1.5 mL 微量离心管。在将肌肉样本转移到试管之前，使用纸巾取出所有剩余的 1x PBS。称量试管和样品。使用公式（1）计算样品的湿重：
- 免疫组化
注意：溶液 1、2 和 3 以及固定溶液应在使用前制备，并且可以冷冻长达 6 个月。所有使用的抗体和染料以及相应的稀释液列在 表1.- 溶液的制备
- 通过加入 2 g 多聚甲醛 （PFA）、8 g 蔗糖和 24 μL 1 M CaCl 2 至 77 mL 的 0.2 M Na 2 HPO 4 和 23 mL 的 0.2 M NaH 2 PO 4 制备固定溶液，通过加入 dH2 O 使最终体积为 200 mL。 将 pH 值调节至7.4。
- 通过将 13.5 g Na 2 HPO 4 和 3.2 g NaH 2 PO4 加入 1 L dH 2O 中制备 0.12 M 磷酸盐缓冲液。
- 通过将 4 g 蔗糖加入 100 mL 的 0.12 M 磷酸盐缓冲液中来制备溶液 1。
- 通过将 15 g 蔗糖加入 100 mL 的 0.12 M 磷酸盐缓冲液中来制备溶液 2。
- 通过将 15 g 蔗糖和 7.5 g 明胶加入 100 mL 的 0.12 M 磷酸盐缓冲液中来制备溶液 3。在37°C下加热直至明胶溶解。
- 制备甲基绿储备溶液（2%甲基绿粉末溶解在dH2O中）19。
- 免疫检测
- 使用固定剂溶液在4°C下固定样品至少4小时。
- 用1x PBS洗涤样品2次10分钟。
- 将O / N或超过1天保持在4°C的溶液1中。
- 洗涤并在4°C的溶液2中保持O / N或超过1天。 让样品加热至室温。
- 在37°C的溶液3中孵育3小时。 将额外的溶液3保持在37°C以备后用。
- 用铝箔模制小（2 厘米 x 1 厘米 x 1 厘米）容器。将一层薄薄的溶液3放入模制容器中，使其凝固。将样品放在固化溶液3上，并用温溶液3覆盖。定向样品并让它们凝固。用彩色笔标记固化溶液3上的位置。
- 通过将容器放在干冰冷却或液氮冷却异戊烷的表面上来冷冻。
- 使用最佳切割温度 （O.C.T.） 化合物，将含有样品的冷冻明胶立方体固定到低温恒温器支架上。
- 将冷冻明胶方切片并将组织切片转移到载玻片上。让它们干燥60分钟。
- 使用疏水标记在截面周围描摹一条线。
- 在1x PBS中清洗载玻片3 x 10分钟。
- 用 1% 牛血清白蛋白 （BSA）、1% 山羊血清和 0.05% Triton X-100 在 1x PBS（封闭溶液）中稀释 30 分钟（封闭步骤）覆盖切片。
- 在封闭溶液中稀释一抗并覆盖切片。将O / N在4°C的封闭盒子中孵育，用湿纸，以防止切片干燥。
- 用1x PBS清洗载玻片3 x 10分钟。
- 在封闭溶液中稀释二抗并覆盖切片。在室温下在黑暗中孵育1.5小时。
注意：避免光照以防止荧光基团降解。 - 用 4x PBS 清洗载玻片 3 x 10 分钟。
注意：当存在强背景时，可以使用更高浓度的PBS。 - 将载玻片浸没在DAPI溶液（5μg/ mL 1，4-二氮杂双环-2，2，2-辛烷值在0.1%Triton X-100 / 1x PBS中）中，每次30秒。
- 用 1x PBS 冲洗。
- 将切片安装在防褪色培养基（50 mg/mL 没食子酸正丙酯在 1x PBS：甘油 [1：9] 中）中，并用盖玻片密封。储存在4°C直至在荧光显微镜20中观察和图像采集。
注意：对于 toto免疫 组织化学实验，使用相同的方案（参见步骤4.2.2.12-4.2.2.18），除了样品先前固定在4%PFA中，在室温下用1x PBS稀释3小时。 表1列出了所有使用的抗体和染料及其各自的稀释液。然后将样品安装在由钢环隔开的两个盖玻片之间的防褪色介质中，用蜂蜡粘合在一起，并使用共聚焦显微镜21获取100μm图像堆栈。
- 溶液的制备
- 蛋白质印迹分析
注意：所有使用的抗体和相应的稀释液列在 表1.- 溶液的制备
- 通过将 20 mL 甘油、4 g SDS 和 0.2 mL 溴酚蓝加入 80 mL 100 mM Tris 碱溶液中来制备 2x SDS-PAGE 上样缓冲液。将pH值调节至6.8。使用前加入新鲜的二硫苏糖醇（DTT）。
- 用吐温 20 （TBST） 溶液制备 Tris 缓冲盐水洗涤缓冲液，将 2.4 g Tris 碱、8.8 g NaCl 和 1 mL 吐温-20 至 dH2O 至最终体积为 1 L。
- 通过将 30.2 g Tris 碱、144.2 g 甘氨酸和 10 g SDS 添加到 1 L dH2O 中来制备 10x 电泳缓冲液 （RB）。使用前，将 100 mL 的 10x RB 加入 900 mL 的 dH2O 中，以制备 1x RB（工作溶液）。
注意：虽然 10x RB 可以在室温下存储数月，但 1x RB 可以在不同的运行中重复使用。 - 通过将 5.82 g Tris 碱、2.93 g 甘氨酸和 0.5 g SDS 加入 800 mL dH2O 中来制备转膜缓冲液 （TB）。组分溶解后，加入200 mL甲醇。在4°C冷却。
注意：TB应在每次使用前新鲜制备。
- 蛋白质提取
- 从E18.5小鼠收集外轴肌肉，并立即将它们放入含有2x SDS-PAGE上样缓冲液和新鲜添加的DTT（100mM DTT）的微量离心管（2mL）中。以相同的方式处理 E18.5 dECM。
- 每管添加一个碳化钨珠。每次在珠磨机中均质2倍2.5分钟（翻转支架）。
- 在超声波浴中超声处理样品5分钟。
- 将样品在50°C下加热10分钟。
- 将样品在4°C下以12，000× g 离心15分钟。
- 将上清液转移到新鲜的 1.5 mL 微量离心管中。
- 使用微量分光光度计定量蛋白质。
- 储存在-20°C直至进一步使用。
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 使用预制丙烯酰胺梯度凝胶（4%-20%）
- 将凝胶安装在电泳槽中。小心地取下梳子。加入1x RB，直到电泳槽中显示的线。确保孔中充满了RB。
- 在孔中每个样品上样100μg蛋白质。上样 12 μL 高分子量蛋白质标准品。
- 在恒定电压下总共运行 100 分钟（150 V 时 10 分钟，185 V 下 90 分钟）。
- 转移
- 在凝胶电泳时，用冷冻结核病（4°C）浸泡过滤垫和海绵。
- 将聚偏二氟乙烯膜切割成凝胶大小。用甲醇激活它们并用dH2O洗涤，浸泡在TB中。
- 根据制造商的说明，将转印盒与海绵、过滤垫、凝胶和活化的膜一起安装。
- 将暗盒放入装有冷冻结核病的电泳槽中（在冰床上）。添加冷却装置。在 100 V 下运行 90 分钟。
- 转印后，用考马斯蓝替代品染色以评估转印质量。
- 免疫检测
- 准备封闭溶液（TBST含5%低脂牛奶）。在室温下搅拌孵育膜1小时。
- 用TBST冲洗3 x 5秒。
- 将膜O / N与在TBST中稀释的一抗与2%BSA和0.02%叠氮化钠（每膜3mL）在冷室（4°C）中搅拌孵育。
- 第二天，用TBST洗涤3 x 5分钟。
- 将膜与在TBST中稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗与5%低脂牛奶（每个膜5mL）在室温下孵育1小时。
- 用TBST清洗膜3 x 5分钟。保持TBST直到检测步骤。
- 使用市售开发试剂盒可视化蛋白质。根据制造商的说明添加检测试剂。获取波段的图像。
- 为了测试每个膜的多个抗体，在检测步骤之后，使用TBST进行三次洗涤（每次5分钟）剥离前一种抗体，并重复步骤4.3.5.2-4.3.5.7。
- 溶液的制备
表1：用于免疫组织化学和蛋白质印迹分析的抗体和染料以及相应的稀释液。请按此下载此表格。10，22
5. 去细胞化基质中的细胞培养
注意：所有技术均在无菌条件下在层流罩中进行。所有孵育均在37°C和5%CO2下进行。
- 制备细胞培养基，高葡萄糖Dulbecco的改良鹰培养基，含有稳定的谷氨酰胺和丙酮酸钠（DMEM），并补充有10%胎牛血清（FBS）和1%笔/链球菌（完全培养基）。
- 将dECMs放入层流罩中用1%笔/链球菌在1x PBS中的培养皿中，并使用微型手术刀和镊子将它们分成约500μm x 500μm x 250μm的碎片。
注意：dECM具有柔软的质地，因此通常更容易使用镊子将它们分成大致相同大小的碎片，而不是用微型手术刀切割它们。 - 将片段转移到带有200μL完全培养基的96孔板（每孔三或四件）中，先前加热至37°C。 在培养箱中孵育2小时。
- 将 500 μL 胰蛋白酶加入接种有亚汇合 （~70%） C2C12 细胞的 T25 烧瓶中。重悬于1 mL完全培养基中。
- 将 10 μL 重悬液加入 10 μL 台盼蓝染料中，并上样到血细胞计数器中。计数并计算细胞数量并确认细胞活力。
- 从含有dECM的96孔板中吸出培养基，并加入200μL含有50，000个活C2C12细胞的完整培养基。
- 孵育 2 天，然后使用镊子将 dECM（带细胞）转移到装有 400 μL 完整培养基的 48 孔板中。每 2 天，用微量移液器小心地吸出培养基，以防止 dECM 从孔底分离，并加入新鲜培养基直到第 8 天。
注意：将基质在96孔板中保存2天以促进C2C12细胞对dECM的粘附，然后转移到48孔板中以允许获得更大体积的含有营养物质的培养基。dECM应粘附在井底。 - 对于分化实验，在第8天用分化培养基（DMEM补充有2%马血清和1%笔/链球菌）替换完整的培养基，然后在分化培养基中孵育4天，直到第12天。
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Representative Results
去细胞化方案的目标是产生与天然组织组成非常相似的dECM。为了确定去细胞化过程的有效性，采用了各种方法，包括检查组织形态，测量DNA水平，染色F-肌动蛋白以及使用免疫组织化学和蛋白质印迹技术分析关键ECM组分。具体而言，分析了骨骼肌组织的五种主要ECM成分。
在整个协议中，样品的外观会发生变化（图1B 1-4）。分离后，由于肌红蛋白的存在，肌肉组织呈红色（图1B1）。在低渗缓冲液中孵育后，其裂解细胞并去除大部分细胞质蛋白，样品变为白色（图1B2）。SDS是一种阴离子洗涤剂，常用于组织脱细胞12，可有效去除细胞质和核物质以及膜。结果，SDS处理后样品变得更加透明（图1B3）。然而，高浓度或长时间接触这种洗涤剂会导致蛋白质变性、糖胺聚糖损失和胶原纤维破坏12。使用0.05%SDS24小时实现细胞去除和ECM保存之间的最佳平衡，如图2和图3所示。最后，通过DNase处理去除DNA，产生比SDS处理后略小的透明dECM支架（图1B4）。
去细胞化方案的成功由该过程后基质中存在的残留DNA量表示。DNA定量显示，与天然组织相比，dECM减少了近100%（图1C）。DAPI染色也证实了dECM中没有DNA（图2B，D，F，H，J）。
通过免疫组织化学和脱细胞后的蛋白质印迹评估五种主要ECM蛋白的存在，并与天然组织进行比较。层粘连蛋白α2亚基（图2A，B）和总层粘连蛋白（图2C，D）的免疫染色显示dECM显示这些蛋白质的管状染色（图2B，D中的箭头），类似于天然组织中围绕肌管的层粘连蛋白基质（图2A，C中的箭头）。层粘连蛋白α2亚基的蛋白质印迹分析显示天然组织中存在两条条带（图2A'），而在dECM中可以检测到分子量小于预期的三个条带（图2B'）。这可能是脱细胞过程中蛋白质降解或去除的结果。总层粘连蛋白的蛋白质印迹分析显示，与来自天然组织的样品相比，这些蛋白质在dECM中的一些片段化（图2C'，D'）。
图1：胎儿骨骼肌脱细胞程序以及组织形态和DNA含量的评估。 （A）脱细胞方案的示意图。（B）整个方案中的组织形态，从新鲜收集的组织到脱细胞组织。比例尺 = 1 mm。 （C） 与天然组织相比，dECM 中存在的 DNA 的定量。数据表示为SEM±平均值。 学生t检验，双尾**p <0.01。脱细胞化方案有效地去除产生无细胞dECM的核含量。缩写：dECMs = 去细胞化基质;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;SDS = 十二烷基硫酸钠;NT = 天然组织。请点击此处查看此图的大图。
纤连蛋白（图2E，F）和胶原蛋白I（图2G，H）的免疫染色显示这些蛋白质存在于天然组织细胞之间的间隙中（图2E，G中的箭头）和dECM中的类似染色（箭头图2F，H）。蛋白质印迹分析显示，在两种情况下纤连蛋白的条带相似（图2E'，F'），表明该蛋白不受脱细胞过程的特别影响。然而，在胶原蛋白I（图2G'，H'）的情况下，dECM中的条带较少，表明一定程度的降解。胶原蛋白IV的免疫染色在天然组织中显示出管状染色模式（图2I中的箭头）和dECM中的类似染色，尽管管状结构较窄（图2J中的箭头）。胶原蛋白IV的蛋白质印迹分析显示天然组织中存在三个条带（图2I'）。虽然在dECM中观察到相同的三个条带（图2J'），但它们的分子量低于预期。与层粘连蛋白α2类似，这可能是脱细胞过程中蛋白质降解或去除的结果。
然后将dECM接种C2C12成肌细胞并在完全培养基中培养8天。C2C12细胞定植dECM并增殖，如磷酸化组蛋白3核染色所示（图3A中的箭头）。在分化培养基中再培养4天后，C2C12细胞分化并融合成表达肌球蛋白重链（图3B中的虚线）的多核（图3B中的蓝色箭头）肌管。有趣的是，在完全培养基中培养的C2C12细胞中可以检测到层粘连蛋白α2链（图3C，D中的黄色箭头），总层粘连蛋白（图3C中的洋红色箭头）和纤连蛋白（图3D中的洋红色箭头）的细胞内和/或细胞周染色，这表明这些细胞能够从头合成这些ECM蛋白，因此有助于形成他们的利基市场。这些结果表明，去细胞化方案产生dECM微环境，其中C2C12成肌细胞可以增殖，分化并形成多核肌管。
图 2：评估天然与去细胞化 E18.5 胎肌组织中的五种 ECM 蛋白。 对天然组织切片 （A、C、E、G、I） 进行免疫组织化学，并用 DAPI、DNA 标记物、鬼笔环肽检测 F-肌动蛋白和 ECM 蛋白对 dECM （B、D、F、H、J） 进行染色。比例尺 = 15 μm。在天然组织中，肌纤维周围存在层粘连蛋白和胶原IV的免疫染色（A，C，I;黄色箭头），并且在肌纤维之间的间隙中检测到纤连蛋白和胶原I的染色（E，G;黄色箭头）。在dECM中，层粘连蛋白和胶原IV（B，D，J;黄色箭头）的染色显示出管状图案，围绕肌纤维在脱细胞后留下的空间。dECM的纤连蛋白和胶原I免疫染色与其在间质间隙中的存在一致（F，H;黄色箭头）。（A'-J'）天然组织（A'，C'，E'，G'，I'）和dECM样品（B'，D'，F'，H'，J'）中的五种ECM蛋白的蛋白质印迹分析。两种方法都显示脱细胞后的蛋白质保存。使用的抗体和相应的稀释度列于 表1中。缩写：LNα2 = 层粘连蛋白α2链;LNp = 泛肌层粘连蛋白;FN = 纤连蛋白;Col I = 胶原蛋白 I;Col IV = 胶原蛋白 IV;MHC = 肌球蛋白重链。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用肌母细胞系（C2C12肌母细胞）进行dECM细胞再细胞化 。 （A） 100 μm 细胞再生基质堆栈的共聚焦图像的最大强度投影，定植用甲基绿染色 DNA 标记的 C2C12 细胞、鬼笔环肽检测 F-肌动蛋白和抗 pH3 抗体，增殖标志物（洋红色箭头）。比例尺 = 35 μm。 （B）100μm堆栈共聚焦图像的最大强度投影，显示培养过程中形成的多核（蓝色箭头表示细胞核）肌球蛋白重链阳性肌管（虚线）。比例尺 = 35 μm。 （C，D） 免疫组化共聚焦图像显示细胞母细胞中层粘连蛋白 α2 链（黄色箭头）、总层粘连蛋白（ C 中的洋红色箭头）和纤连蛋白（ D 中的洋红色箭头）的细胞内或细胞周染色，提示从 头 蛋白质合成。比例尺 = 10 μm。使用的抗体和相应的稀释度列于 表1中。缩写：pH3 = 磷酸组蛋白 3;LNα2 = 层粘连蛋白α2链;LNp = 泛肌层粘连蛋白;FN = 纤连蛋白;MHC = 肌球蛋白重链。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
ECM是一个复杂的大分子网络，存在于所有组织中，在调节细胞行为和功能方面起着至关重要的作用2。ECM充当细胞附着的物理支架，并提供主动调节细胞过程（如增殖，运动，分化和凋亡）的线索。因此，ECM的正确形成和维持对于发育和体内平衡都至关重要1。
虽然2D细胞培养模型已被广泛使用，但它们正越来越多地被更先进的3D平台所取代。这是因为2D培养缺乏影响细胞行为的化学和物理线索，而3D培养被认为是研究天然组织中分子和细胞动力学的更现实的替代方案11。组织的去细胞化导致产生更接近生物组织微环境的支架，正如跨各种组织或器官系统的多项研究所证明的那样14，15，23，24，25。dECM复制天然组织微环境的能力对于研究正常发育，各种疾病状态以及药物或毒素对组织的影响具有巨大的潜力11。
本研究中使用的方案建立在Silva等人开发的用于将胎儿心脏组织14 脱细胞的方案基础上作为起点。它涉及低渗缓冲液、阴离子洗涤剂 （SDS） 处理和 DNase 处理的组合。脱细胞方案的主要挑战之一是在去除细胞和保留ECM蛋白组成之间找到平衡。鉴于我们专注于使用这种3D细胞培养系统来研究LAMA2-CMD的早期阶段，因此特别注意在脱细胞过程中保存层粘连蛋白211。Silva等人的方案14 导致脱细胞胎儿肌肉中层粘连蛋白α2链免疫反应性丧失;这可能是由于使用的SDS浓度。因此，测试了0.2%SDS洗涤剂溶液步骤的替代品，例如较低浓度的SDS（0.1%，0.05%和0.02%）以及用不同浓度的Triton X-100（0.5%和0.2%）替代SDS。使用0.05%SDS洗涤剂处理24 h获得最佳结果。该浓度有效地去除了细胞内容物，同时保留了去细胞后层粘连蛋白α2链的免疫反应性。该协议可重复地产生不含细胞残基（包括DNA）的无细胞dECM。
本研究中使用的方案保留了间质基质蛋白（纤连蛋白和胶原蛋白I）和基底膜蛋白（层粘连蛋白和胶原蛋白IV）。未来的研究应该评估胶原蛋白VI是否也被保留，因为它也是肌肉萎缩症的参与者26。众所周知，SDS可以破坏蛋白质超微结构并损害胶原蛋白12;对于胎儿骨骼肌，重要的是使用低浓度的SDS（0.05%）来维持层粘连蛋白α2免疫反应性。然而，蛋白质印迹结果表明，与天然组织相比，免疫检测层粘连蛋白和胶原蛋白后，脱细胞样品显示出更多的条带，表明脱细胞过程发生了一些蛋白质降解27。
重要的是，细胞再化实验表明，这些基质是可靠的支架，始终支持细胞粘附、增殖和分化。据报道，SDS具有细胞毒性28，因此，如果要将基质用于细胞再生，则协议中包含的洗涤步骤至关重要。这些支架被C2C12细胞有效地定植，表明它们适合作为细胞3D培养的模型系统。对C2C12细胞周围ECM蛋白的细胞内和细胞周染色的观察进一步表明，细胞正在积极促进dECM内的微环境。此外，当放置在分化培养基中时，C2C12细胞在dECM内分化，融合并形成肌管。
此过程的一个重大挑战是在整个协议中对样品进行操作。样品非常小且柔软，需要小心和熟练处理，以防止卡在细尖移液器中和样品丢失。当用新鲜组织开始方案时，获得最佳结果。使用冷冻、储存的样品会阻碍细胞含量的去除，导致蛋白质降解增加，阻碍蛋白质检测并降低脱细胞效率。
只有少数研究报告了胎儿组织的去细胞化15，29，30，31。具体来说，关于胎儿骨骼肌的去细胞化，只有一项先前的研究报道了真皮、皮下组织和肉牛脂31复合样品的去细胞化。据作者所知，这是首次建立了分离的胎儿小鼠骨骼肌的去细胞化方案。该协议可以作为为其他物种（例如猪和人类）的胎儿肌肉组织创建类似协议的基础13。
目前用于去细胞化E18.5小鼠骨骼肌的方案与Silva等人14的程序非常相似，后者将其应用于E18小鼠心脏。唯一的区别是使用的SDS浓度，其远低于用于胎儿心脏的浓度（0.05%对0.2%），可能是由于这两种胎儿组织的物理性质不同。
这种 体外 模型的开发不仅可以研究正常胎儿肌肉发育所涉及的过程，还可以平行研究早发性肌营养不良症和肌病，例如LAMA2-CMD，其在 dyW 小鼠模型10中表现为E18.5处的肌生成缺陷。然而，应该注意的是，该系统是有限的，因为它只包括ECM和肌肉细胞，不包含其他细胞类型，如神经元、内皮细胞和成纤维细胞。这些额外细胞类型的相关性可能因疾病而异，可能需要对培养系统进行修改以包括它们。总体而言，本研究中描述的dECM的使用可以应用于各种早发性肌营养不良症和肌病的研究。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作由法国反肌病协会（AFM-Téléthon;合同号23049），MATRIHEALTH项目和cE3c单位资助UIDB / 00329 / 2020资助。我们要感谢我们的捐助者Henrique Meirelles选择支持MATRIHEALTH项目。这项工作得益于科学学院显微镜设施的基础设施，该设施是葡萄牙生物成像平台的一个节点（参考PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122），我们感谢路易斯·马克斯在图像采集和处理方面的帮助。最后，我们感谢玛尔塔·帕尔马的技术支持和我们的研究团队的慷慨贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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