Summary
I dette arbeidet ble en decellulariseringsprotokoll optimalisert for å oppnå decellulariserte matriser av fostermusens skjelettmus. C2C12 myoblaster kan kolonisere disse matrisene, spre seg og differensiere. Denne in vitro-modellen kan brukes til å studere celleadferd i sammenheng med skjelettmuskelsykdommer som muskeldystrofi.
Abstract
Den ekstracellulære matrisen (ECM) spiller en avgjørende rolle i å gi strukturell støtte til celler og formidle signaler som er viktige for ulike cellulære prosesser. Todimensjonale (2D) cellekulturmodeller overforenkler de komplekse interaksjonene mellom celler og ECM, da mangelen på en komplett tredimensjonal (3D) støtte kan endre celleadferd, noe som gjør dem utilstrekkelige for forståelse in vivo-prosesser . Mangler i ECM-sammensetning og celle-ECM-interaksjoner er viktige bidragsytere til en rekke forskjellige sykdommer.
Et eksempel er LAMA2-medfødt muskeldystrofi (LAMA2-CMD), hvor fravær eller reduksjon av funksjonell laminin 211 og 221 kan føre til alvorlig hypotoni, påviselig ved eller kort tid etter fødselen. Tidligere arbeid ved hjelp av en musemodell av sykdommen antyder at utbruddet oppstår under fosterets myogenese. Denne studien hadde som mål å utvikle en 3D in vitro-modell som tillater studiet av samspillet mellom muskelceller og fostermuskelen ECM, som etterligner det opprinnelige mikromiljøet. Denne protokollen bruker dype ryggmuskler dissekert fra E18.5 musefostre, behandlet med en hypoton buffer, et anionisk vaskemiddel og DNase. De resulterende decellulariserte matrisene (dECM) beholdt alle ECM-proteiner som ble testet (laminin α2, totale lamininer, fibronektin, kollagen I og kollagen IV) sammenlignet med det opprinnelige vevet.
Når C2C12-myoblaster ble sådd på toppen av disse dECM-ene, penetrerte og koloniserte de dECM-ene, noe som støttet deres spredning og differensiering. Videre produserte C2C12-cellene ECM-proteiner, noe som bidro til ombyggingen av deres nisje i dECM-ene. Etableringen av denne in vitro-plattformen gir en ny lovende tilnærming til å avdekke prosessene som er involvert i utbruddet av LAMA2-CMD, og har potensial til å bli tilpasset andre skjelettmuskelsykdommer der mangler i kommunikasjon mellom ECM og skjelettmuskelceller bidrar til sykdomsprogresjon.
Introduction
Den ekstracellulære matrisen (ECM) er en viktig bestanddel av vev, som representerer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensjonale (3D) strukturen gir ikke bare fysisk støtte til celler, men spiller også en avgjørende rolle i de biokjemiske prosessene som er involvert i utviklingen av organismer1. Dannelsen av en vevsspesifikk ECM skjer under utvikling, som et resultat av de komplekse interaksjonene mellom celler og deres nisjer, påvirket av ulike intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en svært dynamisk struktur som gjennomgår kjemiske og mekaniske omorganiseringer på en temporal-romlig måte og direkte påvirker celleskjebne2. En av de mest bemerkelsesverdige egenskapene til ECM er dens funksjonelle mangfold, da hvert vev ECM viser en unik kombinasjon av molekyler som gir forskjellige topologier og egenskaper som er skreddersydd for cellene den inneholder1.
ECM-signalering og støtte er avgjørende for utvikling og homeostase, og når det forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstander 3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfull medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den vanligste formen for medfødt muskeldystrofi. LAMA2-genet koder for laminin α2-kjeden, som er tilstede i laminin 211 og laminin 221, og når mutert kan føre til LAMA2-CMD5. Laminin 211 er den viktigste isoformen som finnes i kjellermembranen som omgir skjelettmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, blir koblingen mellom kjellermembranen og muskelcellene forstyrret, noe som fører til sykdomsutbruddet6. Pasienter med LAMA2-CMD viser en mild til alvorlig fenotype avhengig av type mutasjon i LAMA2-genet.
Når funksjonen til laminin α2-proteinet påvirkes, kan pasienter oppleve alvorlig muskelhypotoni ved fødselen og utvikle kronisk betennelse, fibrose og muskelatrofi, noe som fører til redusert forventet levealder. Til dags dato har ingen målrettede behandlinger blitt utviklet, og terapeutiske tilnærminger er begrenset til å lindre symptomene på sykdommen7. Derfor er forståelse av de underliggende molekylære mekanismene som er involvert i utbruddet av denne sykdommen avgjørende for å utvikle hensiktsmessige terapeutiske strategier 6,8. Tidligere arbeid med dyW-mus 9, en modell for LAMA2-CMD, antyder at sykdomsutbruddet starter i utero, spesielt under fostermyogenese10. En bedre forståelse av hvordan fostermyogenesedefekten oppstår, ville være en spillveksler i å generere nye terapeutiske tilnærminger for LAMA2-CMD.
In vitro-systemer gir et kontrollert miljø for å studere celle-celle- og celle-ECM-interaksjoner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten til innfødte vev. Decellularisering av vev produserer vevs- og utviklingsstadiespesifikke acellulære ECM-stillaser som mer nøyaktig etterligner det naturlige cellemikromiljøet sammenlignet med 2D-modeller og konstruerte/syntetiske stillas. Decellulariserte matriser (dECM) har potensial til å bevare de molekylære og mekaniske signalene til vertsvevet, noe som gjør dem til bedre alternative modeller for forståelse in vivo-prosesser 11.
Det finnes ulike teknikker, reagenser og forhold som kan brukes til decellularisering12,13. I denne studien er en decellulariseringsprotokoll for fostermushjertet, beskrevet av Silva et al.14,15, tilpasset fostermusens skjelettmus og funnet å beholde alle testede ECM-komponenter (laminin α2, totale lamininer, fibronektin, kollagen I og kollagen IV). Protokollen inneholder tre trinn: cellelyse ved osmotisk sjokk (hypoton buffer), plasmamembranoppløsning og proteindissosiasjon (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]), og enzymatisk ødeleggelse av DNA (DNase-behandling). Så vidt vi vet, er dette den første etablerte protokollen for decellularisering av mus føtal skjelettmuskulatur.
For å bruke dette 3D in vitro-systemet til å studere LAMA2-CMD, er det avgjørende å opprettholde laminin α2-kjeden etter decellularisering. Derfor ble det implementert en optimaliseringsprotokoll der forskjellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og konsentrasjoner (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) ble testet (data ikke vist). Det optimale valget for cellefjerning og konservering av laminin α2-proteinet ble funnet å være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletablert myoblastcellelinje16,17, ble brukt til å frø dECM. Disse cellene invaderer dECM, sprer seg og differensierer inne i disse stillasene, og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produksjonen av denne 3D in vitro-modellen gir en ny tilnærming til å forstå molekylære og cellulære prosesser involvert i fostermyogenese, utbruddet av LAMA2-CMD, og kan utvides til andre muskelsykdommer der kommunikasjonen mellom ECM og skjelettmuskelceller forstyrres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet ble godkjent av dyrevelferdskomiteen (ORBEA) ved Det naturvitenskapelige fakultet, Universitetet i Lisboa, og Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), og er i samsvar med EU-direktivet 2010/63 / EU.
1. Fremstilling av decellulariseringsbuffere og reagenser
MERK: Alle løsninger som brukes under decellulariseringsprotokollen skal steriliseres ved autoklavering og lagres i opptil 3 måneder med mindre annet er angitt.
- Forbered 10x fosfatbufret saltvann (10x PBS) ved å tilsette natriumklorid (NaCl) ved 137 mM, kaliumklorid (KCl) ved 2,68 mM, kaliumdihydrogenfosfat (KH 2 PO 4) ved 8,1 mM og dinatrium-hydrogenfosfatdihydrat (Na 2 HPO4) ved 1,47 mM til demineralisert vann (dH2O) og juster pH til 6,8. Tilsett 100 ml 10x PBS til 900 ml demineralisert H2O for å generere 1x PBS. Autoklav og oppbevares ved romtemperatur (RT). Tilsett steril penicillin/streptomycin stamløsning (10 000 E/ml penicillin og 10 mg/ml streptomycin [penn/streptokokker]) til en endelig konsentrasjon på 1 % før bruk.
- Forbered den hypotoniske bufferen ved å oppløse 1,21 g Tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris base) og 1 g etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 1 liter dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Bruk en magnetisk omrører til den er oppløst og juster pH til 7,8 med NaOH/HCl. Steriliser ved autoklavering og oppbevar ved RT. Legg penn / streptokokker til en endelig konsentrasjon på 1% før bruk.
- Forbered den hypotoniske vaskebufferen ved å oppløse 1,21 g Tris-base i 1 liter dH2O (10 mM Tris base). Bruk en magnetisk omrører til den er oppløst og juster pH til 7,8 med NaOH/HCl. Autoklav og oppbevares ved RT. Tilsett penn/streptokokker til 1 % før bruk.
- Forbered anionisk vaskemiddelbehandling ved å tilsette 0,05 g natriumdodecylsulfat (SDS) til 100 ml hypoton vaskebuffer for å produsere en 0,05% SDS-behandlingsløsning. Filtrer gjennom et 0,22 μm membranfilter. Oppbevares på RT i opptil 1 måned.
MERK: SDS-løsningen bør ikke autoklaveres, da SDS felles ut og nedbrytes ved autoklavering. - Forbered DNase-behandlingsløsningen ved å oppløse 1,21 g Tris-base i 0,5 mldH2O,og tilsett 1 ml 1 M magnesiumklorid (MgCl2). Juster pH til 7,8 med NaOH/HCl. Autoklav og lagre ved RT. Legg til DNase I før bruk (50 U/ml).
2. Prøveinnsamling
MERK: Wild-type C57 / BL6 mus ble brukt i studien. Alle teknikkene ble utført i en laminær strømningshette under sterile forhold.
- Avlive voksne drektige hunnmus på embryonale dag (E) 18,5 av svangerskapet ved bruk av inhalasjon av isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon. Utsett musene for terminal disseksjon for å trekke ut fostrene.
- Spray magen på musen med 70% etanol.
- Bruk kirurgisk tang og saks, løft en hudfold i underlivet og lag et U-formet snitt for å eksponere bukhulen18.
- Samle livmorhornene som inneholder E18.5-fostrene ved å kutte oviduktene og livmorhalsen og umiddelbart overføre dem til en petriskål med iskald 1x PBS med 1% penn / streptokokker18.
- Fjern fostrene raskt fra livmor og ekstraembryonale vev og avlive dem ved halshugging ved hjelp av saks18.
- Overfør ett foster om gangen til en petriskål med iskald 1x PBS. Bruk et stereomikroskop, fjern huden og kutt av lemmer. Fra ventralsiden, kutt gjennom brystkassen og fjern brystbenet og de underliggende organene.
- Vend fosterstammen dorsalsiden opp. Fjern den cervicale delen av vertebral kolonnen, dorsale fettavsetninger og bindevev på toppen av de dype ryggmusklene.
- Bruk kirurgisk tang for å forankre brystkassen og skrap forsiktig og løsne de dype ryggmusklene fra det omkringliggende vevet ved hjelp av en mikroskalpell10. Denne prosedyren resulterer i isolering av to muskelstykker per foster (venstre og høyre), begge hovedsakelig sammensatt av longissimus og iliocostalis muskler, med noen av transversospinalis og levator costarum muskler inkludert.
- Oppbevar muskelprøvene i 1x PBS med 1 % penn/streptokokker ved 4 °C ved kortvarig oppbevaring (<1 uke), eller ved -80 °C i lengre perioder.
MERK: Bruk nyinnsamlede prøver for best resultat. Prøver frosset i lengre perioder (>3 måneder) viser lavere decellulariseringseffektivitet og mer proteinnedbrytning. Epaxiale muskelmasser ble brukt til decellulariseringsforsøkene, men andre muskler (f.eks. Lemmermuskler) kan behandles for decellularisering ved hjelp av samme protokoll.
3. Fosterets skjelettmuskulatur decellularisering
MERK: Alle teknikkene ble utført i en laminær hette under sterile forhold. For en detaljert skjematisk fremstilling, se figur 1A. Alle trinnene ble utført med omrøring i en orbital shaker med en diameter på 120 mm (165 rpm) ved 25 °C med mindre annet er angitt. Legg 1% penn / streptokokker til løsninger før bruk. Når oppløsningene fjernes, må du suge forsiktig for å unngå at prøven fanges opp i pipetten.
- Dag 1 - Klargjør ca. 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) vevsfragmenter fra de epaksiale muskelmassene. Legg til 3 ml hypotonisk buffer med 1% penn / streptokokker til hver brønn på en 12-brønnsplate og legg til ett helt muskelvevfragment per brønn.
- Inkuber vevsfragmentene i hypoton buffer med omrøring i 18 timer (over natten) (O/N).
- Dag 2 - Aspirer den hypotone bufferen med en pipette med finspiss og vask prøvene 3 x 1 time med 3 ml 1x PBS hver gang under omrøring.
- Inkuber prøvene i 24 timer med 3 ml 0,05% SDS vaskemiddelløsning med omrøring.
MERK: (SJEKKPUNKT) Etter SDS-inkubasjon skal prøvene være gjennomsiktige i utseende. Prøvene viser en gelatinlignende konsistens og er derfor mer tilbøyelige til å feste seg til pipetten når væskene fjernes.
- Inkuber prøvene i 24 timer med 3 ml 0,05% SDS vaskemiddelløsning med omrøring.
- Dag 3 - Fjern SDS-vaskemiddeloppløsningen med en pipette med finspiss og vask vevsfragmentene 3 x 20 minutter med 3 ml hypoton vaskebuffer hver gang under omrøring.
MERK: (PAUSEPUNKT) Prøvene kan oppbevares i hypoton vaskebuffer ved 4 °C i 18 timer (O/N). Forsikre deg om at SDS fjernes godt under vasketrinn, da gjenværende SDS kan være cytotoksisk.- Inkuber vevsfragmentene i 3 timer med 2 ml DNase-oppløsning under omrøring ved 37 °C.
- Fjern DNase-løsningen med en pipette med finspiss og vask vevsfragmentene 3 x 20 minutter med 3 ml 1x PBS hver gang under omrøring. Vask til slutt O/N med omrøring (60 o / min).
MERK: Etter DNase-behandlingen blir dECMene klissete på grunn av tilstedeværelsen av DNA-rester. Derfor er forsiktig vask nødvendig. - Oppbevar dECM i 1x PBS med 1 % penn/streptokokker ved 4 °C inntil recellularisering (<1 uke). Til annen bruk, oppbevares ved -80 °C.
4. Kvalitetsvurdering av decellularisering
MERK: DNA-kvantifisering, DAPI / metylgrønn farging og falloidinfarging ble utført for å evaluere tilstedeværelsen av gjenværende celleinnhold etter decellularisering. Immunhistokjemi og western blot-analyser ble utført for å vurdere retensjon av viktige ECM-proteiner etter decellularisering.
- Kvantifisering av DNA tilstede i dECM
MERK: dECM bør sammenlignes med det opprinnelige vevet for å oppdage tilstedeværelsen av DNA.- Før decellularisering må du veie et 1,5 ml mikrosentrifugerør på en digital vekt med høy presisjon. Før du overfører muskelprøven til røret, fjern alle de resterende 1x PBS ved hjelp av et papirhåndkle. Vei røret med prøven. Beregn våtvekten av prøvene ved hjelp av ligning (1):
Prøvevåtvekt = vekt rørmed prøver-vekt tomt rør (1) - Decellulariser prøvene etter protokollen beskrevet i avsnitt 3.
- Plasser prøvene i 2 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Prøvene kan oppbevares ved -20 °C inntil DNA-ekstraksjon og kvantifisering. - Utfør DNA-ekstraksjon av dECM og innfødte vevsprøver ved hjelp av et spinnkolonnebasert sett. Legg til fordøyelsesbufferen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Homogeniser prøvene i en perlemølle to ganger i 2,5 min hver gang (snu festene) ved hjelp av en wolframkarbidperle per rør (bruk kjølte rørfester).
- Tilsett proteinase K og inkuber O/N ved langsom omrøring ved 56 °C.
- Fortsett med protokollen som beskrevet i produsentens instruksjoner.
- Elute med bufferen levert av produsenten og sentrifuge 2 x 1 min ved ≥ 6000 x g, hver gang ved 4 ° C for å øke DNA-utbyttet.
MERK: DNA kan lagres ved -20 °C til kvantifisering. - Kvantifiser DNA som er tilstede i prøvene ved hjelp av et fluorescerende dsDNA-deteksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Normaliser DNA-innholdet som nanogram DNA per milligram opprinnelig våtvekt av prøven.
- Analyser dataene ved hjelp av en tosidig Student t-test og uttrykk som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM).
- Før decellularisering må du veie et 1,5 ml mikrosentrifugerør på en digital vekt med høy presisjon. Før du overfører muskelprøven til røret, fjern alle de resterende 1x PBS ved hjelp av et papirhåndkle. Vei røret med prøven. Beregn våtvekten av prøvene ved hjelp av ligning (1):
- Immunhistokjemi
MERK: Løsning 1, 2 og 3 og fikseringsmiddeloppløsningen skal tilberedes før bruk og kan oppbevares frosset i opptil 6 måneder. Alle anvendte antistoffer og fargestoffer og respektive fortynninger er listet opp i Tabell 1.- Forberedelse av løsninger
- Forbered fiksativ løsning ved å tilsette 2 g paraformaldehyd (PFA), 8 g sukrose og 24 μL 1 M CaCl 2 til 77 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 og 23 ml 0,2 M NaH 2 PO4, til et endelig volum på 200 ml ved å tilsette dH2 O. Juster pH til7,4.
- Forbered 0,12 M fosfatbuffer ved å tilsette 13,5 gNa2HPO 4 og 3,2 g NaH 2 PO 4 til 1 L dH2O. Juster pH til7,4.
- Forbered løsning 1 ved å tilsette 4 g sukrose til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer.
- Forbered oppløsning 2 ved å tilsette 15 g sukrose til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer.
- Forbered oppløsning 3 ved å tilsette 15 g sukrose og 7,5 g gelatin til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer. Varm opp ved 37 °C til gelatinen er oppløst.
- Tilbered metylgrønn stamløsning (2 % metylgrønt pulver oppløst idH2O)19.
- Immunodeteksjon
- Fest prøvene med fikseringsmiddelet i minst 4 timer ved 4 °C.
- Vask prøvene 2x i 10 min med 1x PBS.
- Oppbevar O/N, eller over 1 dag, i oppløsning 1 ved 4 °C.
- Vask og oppbevar O/N eller over 1 dag i oppløsning 2 ved 4 °C. La prøvene varme til RT.
- Inkuber i 3 timer i oppløsning 3 ved 37 °C. Oppbevar ekstra oppløsning 3 ved 37 °C for senere bruk.
- Form små (2 cm x 1 cm x 1 cm) beholdere i aluminiumsfolie. Legg et tynt lag med løsning 3 i den støpte beholderen og la den stivne. Legg prøvene på den størknede oppløsningen 3 og dekk til med varm oppløsning 3. Orienter prøvene og la dem stivne. Merk plasseringen på den størknede oppløsningen 3 med en fargepenn.
- Frys ved å plassere beholderne på overflaten av tørriskjølt eller flytende nitrogenkjølt isopentan.
- Bruk optimal skjæretemperatur (O.C.T.) forbindelse, fest de frosne gelatinkubene som inneholder prøvene til kryostatfestet.
- Seksjoner de frosne gelatinterningene og overfør vevsseksjonene til lysbildene. La dem tørke i 60 min.
- Bruk en hydrofob markør til å spore en linje rundt seksjonene.
- Vask lysbildene 3 x 10 min i 1x PBS.
- Dekk seksjonene med 1% bovint serumalbumin (BSA), 1% geitserum og 0,05% Triton X-100 fortynnet i 1x PBS (blokkeringsløsning) i 30 minutter (blokkeringstrinn).
- Fortynn de primære antistoffene i blokkeringsoppløsning og dekk seksjonene. Inkuber O/N ved 4 °C i en lukket boks, med fuktig papir, for å forhindre at seksjonene tørker ut.
- Vask lysbildene 3 x 10 min med 1x PBS.
- Fortynn de sekundære antistoffene i blokkeringsløsning og dekk seksjonene. Inkuber i 1,5 t ved RT i mørket.
MERK: Unngå lyseksponering for å forhindre nedbrytning av fluoroforer. - Vask lysbildene 3 x 10 min med 4x PBS.
MERK: Høyere konsentrasjon av PBS kan brukes når en sterk bakgrunn er tilstede. - Senk lysbildene i DAPI-løsning (5 μg / ml 1,4-diazabicyclo-2,2,2-oktan i 0,1% Triton X-100 / 1x PBS) i 30 s hver.
- Skyll i 1x PBS.
- Monter seksjonene i anti-fading medium (50 mg / ml n-propylgallat i 1x PBS: glyserol [1: 9]) og forsegle med et deksel. Oppbevares ved 4 °C inntil observasjon og bildeopptak i fluorescensmikroskop20.
MERK: For in toto immunhistokjemi eksperimenter ble samme protokoll (se trinn 4.2.2.12-4.2.2.18) brukt, bortsett fra at prøvene tidligere ble fiksert i 4% PFA fortynnet i 1x PBS i 3 timer ved RT. DNA-farging ble utført ved å tilsette metylgrønn til den sekundære antistoffløsningen. Alle antistoffer og fargestoffer som brukes, og deres respektive fortynninger, er oppført i tabell 1. Prøvene ble deretter montert i anti-fading medium mellom to coverslips adskilt av stålringer, limt sammen med bivoks, og 100 μm bildestabler ble samlet inn ved hjelp av et konfokalmikroskop21.
- Forberedelse av løsninger
- Western blot analyse
MERK: Alle anvendte antistoffer og respektive fortynninger er listet opp i Tabell 1.- Forberedelse av løsninger
- Forbered 2x SDS-PAGE lastebuffer ved å tilsette 20 ml glyserol, 4 g SDS og 0,2 ml bromfenolblått til 80 ml 100 mM Tris baseløsning. Juster pH til 6,8. Tilsett fersk dithiothreitol (DTT) før bruk.
- Forbered Tris bufret saltvannsvaskebuffer med Tween 20 (TBST) -løsning ved å tilsette 2,4 g Tris-base, 8,8 g NaCl og 1 ml Tween-20 til dH2O til et endelig volum på 1 L. Juster pH til 7,4-7,6 ved bruk av HCl.
- Forbered 10x løpende buffer (RB) ved å tilsette 30,2 g Tris-base, 144,2 g glycin og 10 g SDS til 1 liter dH2O. Før bruk, tilsett 100 ml 10x RB til 900 ml dH2O for å forberede 1x RB (arbeidsløsning).
MERK: Mens 10x RB kan lagres på RT i flere måneder, kan 1x RB gjenbrukes på forskjellige løp. - Forbered overføringsbufferen (TB) ved å tilsette 5,82 g Tris-base, 2,93 g glycin og 0,5 g SDS til 800 mldH2O. Etter at komponentene er oppløst, tilsett 200 ml metanol. Avkjøl ved 4 °C.
MERK: TB bør tilberedes fersk før hver bruk.
- Protein ekstraksjon
- Samle epaxiale muskler fra E18.5-mus og plasser dem umiddelbart i et mikrosentrifugerør (2 ml) som inneholder 2x SDS-PAGE lastebuffer med nylig tilsatt DTT (100 mM DTT). Behandle E18.5 dECM på samme måte.
- Legg til en wolframkarbidperle per rør. Homogeniser 2x i en perlemølle i 2,5 min hver gang (vend festene).
- Sonikere prøvene i 5 minutter i et ultralydbad.
- Varm prøvene i 10 min ved 50 °C.
- Sentrifuger prøvene ved 12 000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Kvantifiser proteinet ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer.
- Oppbevares ved -20 °C inntil videre bruk.
- Polyakrylamidgelelektroforese
- Bruk prefabrikert akrylamidgradientgel (4%-20%)
- Monter gelen i elektroforesetanken. Fjern kammen forsiktig. Legg til 1x RB til linjen som vises i elektroforesetanken. Sørg for at brønnene er fylt med RB.
- Laster 100 μg protein per prøve i brønnene. Last 12 μL protein med høy molekylvekt standard.
- Løp totalt 100 minutter med konstant spenning (10 min ved 150 V og 90 min ved 185 V).
- Overføre
- Bløtlegg filterputene og svampene med avkjølt TB (4 °C) mens gelen går.
- Klipp polyvinylidendifluoridmembranene til størrelsen på gelen. Aktiver dem med metanol og vask med dH2O. Bløtlegg i TB.
- Monter overføringskassetten med svamper, filterputer, geler og aktiverte membraner i henhold til produsentens instruksjoner.
- Plasser kassetten i elektroforesetanken som inneholder kjølt TB (på en isseng). Tilsett kjøleenheten. Kjør i 90 min på 100 V.
- Etter overføringen, flekk med en Coomassie blå erstatning for å vurdere overføringskvaliteten.
- Immunodeteksjon
- Klargjør blokkeringsløsningen (TBST med 5 % lettmelk). Inkuber membranene med omrøring i 1 time ved RT.
- Skyll 3 x 5 s med TBST.
- Inkuber membranene O/N med de primære antistoffene fortynnet i TBST med 2 % BSA og 0,02 % natriumazid (3 ml per membran) i et kaldt kammer (4 °C) under omrøring.
- Neste dag, vask 3 x 5 min med TBST.
- Inkuber membranene med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet i TBST med 5% lettmelk (5 ml for hver membran) i 1 time ved RT.
- Vask membranene med TBST 3 x 5 min. Oppbevares i TBST til deteksjonstrinnet.
- Visualiser proteinet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig utviklingssett. Legg til deteksjonsreagenser i henhold til produsentens instruksjoner. Skaff bilder av bandene.
- For å teste mer enn ett antistoff per membran, etter deteksjonstrinnet, strip de tidligere antistoffene med tre vasker (5 min hver) ved hjelp av TBST og gjenta trinn 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Forberedelse av løsninger
Tabell 1: Antistoffer og fargestoffer brukt i immunhistokjemi og western blot-analyse og de respektive fortynningene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.10,22
5. Cellekultur i decellulariserte matriser
MERK: Alle teknikkene ble utført under sterile forhold i en laminær strømningshette. Alle inkubasjoner ble utført ved 37 °C og med 5 % CO2.
- Forbered cellekulturmediet, høy glukose Dulbeccos modifiserte ørnemedium med stabilt glutamin og med natriumpyruvat (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penn / streptokokker (komplett kulturmedium).
- Legg dECMene i en petriskål i 1x PBS med 1 % penn/streptokokker i en laminær avtrekkshette og skill dem i biter på ca. 500 μm x 500 μm x 250 μm, ved hjelp av en mikroskalpell og pinsett.
MERK: dECM har en myk tekstur, og derfor er det ofte lettere å bruke pinsett for å skille dem i omtrent like store biter i stedet for å kutte dem med mikroskalpellen. - Overfør fragmentene til en 96-brønns plate (tre eller fire stykker per brønn) med 200 μL komplett kulturmedium, tidligere oppvarmet til 37 °C. Inkubere i 2 timer i inkubatoren.
- Tilsett 500 μL trypsin til en T25-kolbe frøet med subkonfluente (~ 70%) C2C12-celler. Resuspender i 1 ml komplett medium.
- Tilsett 10 μL av resuspensjonen til 10 μL Trypan blått fargestoff og legg inn i et hemocytometer. Telle og beregne cellenummeret og bekreft cellens levedyktighet.
- Aspirer mediet fra 96-brønnsplaten som inneholder dECMene og tilsett 200 μL komplett kulturmedium som inneholder 50 000 levedyktige C2C12-celler.
- Inkuber i 2 dager, og overfør deretter dECMene (med cellene) ved hjelp av pinsett til en 48-brønnplate med 400 μL komplett kulturmedium. Hver 2. dag, aspirer mediet forsiktig med en mikropipette for å forhindre at dECM løsner fra bunnen av brønnen og tilsett nytt medium til dag 8.
MERK: Matriser holdes i 2 dager i 96-brønnsplater for å fremme C2C12-celleadhesjon til dECM-ene, og overføres deretter til en 48-brønnsplate for å gi tilgang til et større volum medium med næringsstoffer. dECM skal feste seg til bunnen av brønnene. - For differensieringsforsøket erstattes det komplette dyrkningsmediet med differensieringsmedium (DMEM supplert med 2 % hesteserum og 1 % penn/streptokokker) på dag 8, etterfulgt av inkubasjon i differensieringsmedium i 4 dager frem til dag 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med decellulariseringsprotokollen er å produsere dECM som ligner sammensetningen av innfødt vev. For å bestemme effektiviteten av decellulariseringsprosessen ble forskjellige metoder anvendt, inkludert undersøkelse av vevsmorfologi, måling av DNA-nivåer, farging for F-aktin og analyse av viktige ECM-komponenter ved bruk av immunhistokjemi og vestlige blottingsteknikker. Spesielt ble fem store ECM-komponenter i skjelettmuskulaturvev analysert.
Gjennom hele protokollen endrer prøvene utseende (figur 1B 1-4). Etter isolering fremstår muskelvevet rødlig på grunn av myoglobinforekomst (figur 1B1). Etter inkubasjon i den hypotone bufferen, som lyserer celler og fjerner de fleste cytoplasmatiske proteiner, blir prøvene hvite (figur 1B2). SDS, et anionisk vaskemiddel som vanligvis brukes i vevsdecellularisering12, fjerner effektivt cytoplasmatisk og nukleært materiale, samt membraner. Som et resultat blir prøvene mer gjennomsiktige etter SDS-behandling (figur 1B3). Imidlertid kan høye konsentrasjoner eller langvarig eksponering for dette vaskemiddelet forårsake proteindenaturering, tap av glykosaminoglykaner og forstyrrelse av kollagenfibre12. Den optimale balansen mellom cellefjerning og konservering av ECM oppnås ved bruk av 0,05 % SDS i 24 timer, som vist i figur 2 og figur 3. Til slutt fjernes DNA gjennom DNase-behandling, noe som resulterer i gjennomsiktige dECM-stillas som er litt mindre enn etter SDS-behandling (figur 1B4).
Suksessen til decellulariseringsprotokollen indikeres av mengden gjenværende DNA tilstede i matrisene etter prosessen. DNA-kvantifisering viser en nesten 100% reduksjon i dECM sammenlignet med det opprinnelige vevet (figur 1C). DAPI-farging bekrefter også fraværet av DNA i dECMene (figur 2B,D,F,H,J).
Tilstedeværelsen av fem store ECM-proteiner ble evaluert ved immunhistokjemi og ved western blot etter decellularisering og sammenlignet med det opprinnelige vevet. Immunfarging for underenheten laminin α2 (figur 2A,B) og totale lamininer (figur 2C,D) viser at dECMene viser en rørformet farging for disse proteinene (piler i figur 2B,D), tilsvarende lamininmatrisen som omgir myotuber i det opprinnelige vevet (piler i figur 2A,C). Western blot-analyse for laminin α2-subenheten avslører tilstedeværelsen av to bånd i det opprinnelige vevet (figur 2A'), mens tre bånd, med mindre molekylvekt enn forventet, kan detekteres i dECM (figur 2B'). Dette kan være et resultat av proteinnedbrytning eller fjerning under decellulariseringsprosessen. Western blot-analyse for totale lamininer viser en viss fragmentering av disse proteinene i dECM sammenlignet med prøver fra det opprinnelige vevet (figur 2C', D').
Figur 1 Decellulariseringsprosedyre for fosterskjelettmuskulatur og evaluering av vevsmorfologi og DNA-innhold. (A) Skjematisk fremstilling av decellulariseringsprotokollen. (B) Vevsmorfologi gjennom hele protokollen, fra nyoppsamlet til decellularisert vev. Skalastang = 1 mm. (C) Kvantifisering av DNA tilstede i dECM sammenlignet med det opprinnelige vevet. Data uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Student t-test, tosidig **p < 0,01. Decellulariseringsprotokollen fjerner effektivt kjernefysisk innhold som produserer acellulære dECM-er. Forkortelser: dECM = decellulariserte matriser; PBS = fosfatbufret saltvann; SDS = natriumdodecylsulfat; NT = naturlig vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Immunfarging for fibronektin (figur 2E,F) og kollagen I (figur 2G,H) viser tilstedeværelsen av disse proteinene i det interstitielle rommet mellom celler i det opprinnelige vevet (piler i figur 2E,G) og en lignende farging i dECM (piler figur 2F,H). Western blot-analyse viser lignende bånd for fibronektin under begge forhold (figur 2E ', F '), noe som indikerer at dette proteinet ikke er spesielt påvirket av decellulariseringsprosessen. Når det gjelder kollagen I (figur 2G',H') er det imidlertid færre bånd i dECM-ene, noe som indikerer en viss grad av nedbrytning. Immunfarging for kollagen IV viser et rørformet fargemønster i det opprinnelige vevet (pil i figur 2I) og en lignende farging i dECM, selv om de rørformede strukturene er smalere (pil i figur 2J). Western blot-analyse for kollagen IV avslører tilstedeværelsen av tre bånd i det opprinnelige vevet (figur 2I'). Mens de samme tre båndene er observert i dECM (figur 2J'), er molekylvekten av disse lavere enn forventet. På samme måte som laminin α2, kan dette være et resultat av proteinnedbrytning eller fjerning under decellulariseringen.
dECM blir deretter sådd med C2C12 myoblaster og dyrket i 8 dager i komplett dyrkningsmedium. C2C12-celler koloniserer dECMene og sprer seg, som vist ved fosfo-histon 3 kjernefysisk farging (piler i figur 3A). Etter ytterligere 4 dager med dyrkning i differensieringsmedium, skiller C2C12-celler seg ut og smelter sammen til multinukleerte (blå piler i figur 3B) myotuber som uttrykker en myosintung kjede (stiplet linje i figur 3B). Interessant nok kan intracellulær og/eller pericellulær farging for laminin α2-kjeden (gule piler i figur 3C,D), totale lamininer (magenta pil i figur 3C) og fibronektin (magenta pil i figur 3D) detekteres i C2C12-celler dyrket i komplett kulturmedium, noe som tyder på at disse cellene er i stand til å syntetisere disse ECM-proteinene de novo , og bidrar derfor til dannelsen av deres nisje. Disse resultatene viser at decellulariseringsprotokollen genererer et dECM-mikromiljø der C2C12-myoblaster kan proliferere, differensiere og danne multinukleerte myorør.
Figur 2: Vurdering av fem ECM-proteiner i naturlig versus decellularisert E18.5 fostermuskelvev. Immunhistokjemi på seksjoner av naturlig vev (A,C,E,G,I) og farging av dECM (B,D,F,H,J) med DAPI, en DNA-markør, falloidin som påviser F-aktin og for ECM-proteiner. Skala bar = 15 μm. I det opprinnelige vevet er immunfarging for lamininer og kollagen IV tilstede rundt myofibrene (A,C,I; gule piler) og farging for fibronektin og kollagen I detekteres i det interstitielle rommet mellom myofibre (E,G; gule piler). I dECM viser farging for lamininer og kollagen IV (B,D,J; gule piler) et rørformet mønster som omgir mellomrommene som er igjen av myofibrene etter decellularisering. Fibronektin og kollagen I-immunfarging av dECM er forenlig med deres tilstedeværelse i interstitialrommet (F,H; gule piler). (A'-J') Western blot-analyse for fem ECM-proteiner i naturlig vev (A', C', E', G', I') og i dECM-prøver (B', D', F', H', J'). Begge tilnærmingene viser proteinkonservering etter decellularisering. Antistoffer brukt og respektive fortynninger er listet opp i tabell 1. Forkortelser: LNα2 = laminin α2 kjede; LNp = pan-muskel lamininer; FN = fibronektin; Kol I = kollagen I; Kol IV = kollagen IV; MHC = myosin tung kjede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: dECM-recellularisering med myoblastcellelinje (C2C12-myoblaster). (A) Projeksjon av maksimal intensitet av et konfokalt bilde av en 100 μm stabel med recellularisert matrise, kolonisert med C2C12-celler merket med metylgrønt fargings-DNA, falloidindetekterende F-aktin og anti-pH3-antistoff, en proliferasjonsmarkør (magenta piler). Skala bar = 35 μm. (B) Maksimal intensitetsprojeksjon av et konfokalt bilde av en 100 μm stabel som viser en multinukleert (blå piler indikerer kjernene) myosin tung kjede-positiv myotube (stiplet linje) dannet under kultur. Skala bar = 35 μm. (C,D) Immunhistokjemi konfokalt bilde som viser intra- eller pericellulær farging for laminin α2-kjede (gule piler), totale lamininer (magenta piler i C) og fibronektin (magenta piler i D) i myoblaster, noe som tyder på de novo proteinsyntese. Skala bar = 10 μm. Antistoffer brukt og respektive fortynninger er listet opp i tabell 1. Forkortelser: pH3 = fosfo-histon 3; LNα2 = laminin α2 kjede; LNp = pan-muskel lamininer; FN = fibronektin; MHC = myosin tung kjede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM er et komplekst nettverk av makromolekyler som er tilstede i alle vev og spiller en avgjørende rolle i å regulere celleadferd og funksjon2. ECM fungerer som et fysisk stillas for celler å feste seg til og gir signaler som aktivt modulerer cellulære prosesser som spredning, motilitet, differensiering og apoptose. Dermed er riktig dannelse og vedlikehold av ECM avgjørende for både utvikling og homeostase1.
Mens 2D-cellekulturmodeller har blitt mye brukt, blir de i økende grad erstattet av mer avanserte 3D-plattformer. Dette skyldes at 2D-kulturer mangler kjemiske og fysiske signaler som påvirker celleadferd, mens 3D-kulturer anses som et mer realistisk alternativ for å studere molekylær og cellulær dynamikk i innfødte vev11. Decellularisering av vev resulterer i produksjon av stillaser som nærmere etterligner mikromiljøene i biologiske vev, som demonstrert i en rekke studier på tvers av forskjellige vevs- eller organsystemer 14,15,23,24,25. DECMs evne til å replikere innfødte vevsmikromiljøer har stort potensial for forskning på normal utvikling, ulike sykdomstilstander og effekten av legemidler eller toksiner på vev11.
Protokollen som er brukt i denne studien bygger på protokollen utviklet av Silva et al. for decellularisering av fosterets hjertevev14 som utgangspunkt. Det innebærer en kombinasjon av en hypotonisk buffer, behandling med et anionisk vaskemiddel (SDS) og en DNase-behandling. En av hovedutfordringene i decellulariseringsprotokoller er å finne en balanse mellom å fjerne celler og bevare ECM-proteinsammensetningen. Gitt vårt fokus på å bruke dette 3D-cellekultursystemet til å studere de tidlige stadiene av LAMA2-CMD, ble det lagt spesiell vekt på å bevare laminin 211 under decellularisering. Protokollen til Silva et al.14 førte til tap av laminin a2-kjedeimmunoreaktivitet i de decellulariserte føtale musklene; Dette kan skyldes konsentrasjonen av SDS som brukes. Derfor ble alternativer til trinnet med 0,2 % SDS-vaskemiddeloppløsning testet, slik som lavere konsentrasjoner av SDS (0,1 %, 0,05 % og 0,02 %) og substitusjon av SDS med forskjellige konsentrasjoner av Triton X-100 (0,5 % og 0,2 %). De beste resultatene ble oppnådd ved å bruke 0,05 % SDS-vaskemiddelbehandling i 24 timer. Denne konsentrasjonen fjernet effektivt celleinnholdet samtidig som laminin α2-kjedeimmunoreaktiviteten ble bevart etter decellularisering. Denne protokollen produserer reproduserbart acellulære dECM som er fri for cellulære rester, inkludert DNA.
Protokollen som ble brukt i denne studien bevarer både interstitielle matriksproteiner (fibronektin og kollagen I) og kjellermembranproteiner (lamininer og kollagen IV). Fremtidige studier bør vurdere om kollagen VI også er bevart, da det også er en aktør i muskeldystrofier26. Det er kjent at SDS kan forstyrre proteinets ultrastruktur og skade kollagener12; For fosterets skjelettmuskulatur var det viktig å bruke en lav konsentrasjon av SDS (0,05 %) for å opprettholde laminin α2 immunoreaktivitet. Imidlertid viser western blot-resultatene at de decellulariserte prøvene viser flere bånd etter immunodeteksjon av lamininer og kollagener sammenlignet med det opprinnelige vevet, noe som indikerer at noe proteinnedbrytning oppstod som et resultat av decellulariseringsprosessen27.
Det er viktig at recellulariseringseksperimentene viser at disse matrisene er pålitelige stillaser som konsekvent støtter celleadhesjon, spredning og differensiering. SDS er rapportert å være cytotoksisk28, og vasketrinnene som er inkludert i protokollen er derfor avgjørende for at matrisene skal brukes til recellularisering. Disse stillasene ble effektivt kolonisert av C2C12-celler, noe som indikerer deres egnethet som et modellsystem for 3D-kultur av celler. Observasjonen av intracellulær og pericellulær farging for ECM-proteiner som omgir C2C12-cellene, antyder videre at cellene aktivt bidrar til deres mikromiljø i dECM. I tillegg, når de ble plassert i differensieringsmedium, differensierte, smeltet C2C12-cellene sammen og dannet myorør i dECM-ene.
En betydelig utfordring i denne prosedyren er manipulering av prøvene gjennom hele protokollen. Prøvene er svært små og myke, og krever forsiktighet og dyktighet i håndtering for å forhindre innfesting i finspisspipetten og tap av prøvene. De beste resultatene oppnås når du starter protokollen med ferskt vev. Bruk av frosne, lagrede prøver kan hindre fjerning av cellulært innhold og føre til økt proteinnedbrytning, hindre proteindeteksjon og redusere decellulariseringseffektiviteten.
Bare noen få studier har rapportert decellularisering av fostervev 15,29,30,31. Spesielt når det gjelder decellularisering av fosterets skjelettmuskulatur, har bare en tidligere studie rapportert om decellularisering av sammensatte prøver av dermis, subkutant vev og panniculus carnosus31. Så vidt forfatterne kjenner til, er dette første gang det er etablert en decellulariseringsprotokoll for isolert skjelettmusmus hos fostermus. Denne protokollen kan tjene som grunnlag for opprettelsen av lignende protokoller for føtal muskelvev av andre arter, som griser og mennesker13.
Den nåværende protokollen for decellularisering av E18.5 museskjelettmuskulatur ligner veldig på prosedyren til Silva et al.14, som brukte den på et E18-musehjerte. Den eneste forskjellen er konsentrasjonen av SDS som brukes, som er betydelig lavere enn den som brukes til fosterets hjerte (0,05% vs. 0,2%), muligens på grunn av forskjellige fysiske egenskaper av disse to føtale vev.
Utviklingen av denne in vitro-modellen tillater ikke bare studier av prosessene som er involvert i normal fostermuskelutvikling, men muliggjør også parallell undersøkelse av tidlig begynnende muskeldystrofier og myopatier, som LAMA2-CMD, som manifesterer seg som en myogenesedefekt ved E18.5 i dyW-musemodell 10. Det skal imidlertid bemerkes at dette systemet er begrenset ved at det bare inkluderer ECM og muskelceller og ikke inneholder andre celletyper som nevroner, endotelceller og fibroblaster. Relevansen av disse ekstra celletyper kan variere avhengig av sykdommen, og det kan være nødvendig med modifikasjoner i kultursystemet for å inkludere dem. Samlet sett kan bruk av dECM som beskrevet i denne studien anvendes i studiet av ulike muskeldystrofier og myopatier med tidlig debut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr. 23049), MATRIHEALTH-prosjektet og cE3c enhetsfinansiering UIDB/00329/2020. Vi vil gjerne takke vår giver Henrique Meirelles som valgte å støtte MATRIHEALTH-prosjektet. Dette arbeidet dro nytte av infrastrukturen til Det naturvitenskapelige fakultets mikroskopianlegg, en node i den portugisiske plattformen for BioImaging (referanse PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), og vi takker Luís Marques for hans hjelp med bildeinnsamling og behandling. Til slutt takker vi Marta Palma for teknisk støtte og vårt forskningsteam for deres sjenerøse bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
