Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65069
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

Summary

בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.

Abstract

המטריצה החוץ תאית (ECM) ממלאת תפקיד מכריע במתן תמיכה מבנית לתאים ובהעברת אותות החשובים לתהליכים תאיים שונים. מודלים דו-ממדיים (2D) של תרביות תאים מפשטים יתר על המידה את האינטראקציות המורכבות בין תאים לבין ECM, שכן היעדר תמיכה תלת-ממדית מלאה (3D) יכול לשנות את התנהגות התא, מה שהופך אותם לבלתי מספיקים להבנה של תהליכי in vivo . ליקויים בהרכב ECM ובאינטראקציות בין תאים ל-ECM הם תורמים חשובים למגוון מחלות שונות.

דוגמה אחת היא ניוון שרירים מולד LAMA2 (LAMA2-CMD), שבו היעדר או הפחתה של למינין פונקציונלי 211 ו 221 יכול להוביל היפוטוניות חמורה, לגילוי או מיד לאחר הלידה. עבודה קודמת באמצעות מודל עכבר של המחלה מציעה כי הופעתה מתרחשת במהלך מיוגנזה עוברית. המחקר הנוכחי נועד לפתח מודל תלת ממדי במבחנה שיאפשר לחקור את יחסי הגומלין בין תאי שריר לבין ECM שריר העובר, תוך חיקוי המיקרו-סביבה הטבעית. פרוטוקול זה משתמש בשרירי גב עמוקים שנותחו מעוברי עכבר E18.5, מטופלים בחיץ היפוטוני, חומר ניקוי אניוני ו- DNase. כתוצאה מכך, המטריצות הדה-צלולריות (dECMs) שמרו על כל חלבוני ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV) בהשוואה לרקמה הטבעית.

כאשר מיובלסטים C2C12 נזרעו על גבי dECMs אלה, הם חדרו והתיישבו ב-dECMs, מה שתמך בהתרבות ובהתמיינות שלהם. יתר על כן, תאי C2C12 ייצרו חלבוני ECM, ותרמו לעיצוב מחדש של הנישה שלהם בתוך dECMs. הקמת פלטפורמת מבחנה זו מספקת גישה חדשה ומבטיחה לפענוח התהליכים המעורבים בהופעת LAMA2-CMD, ויש לה פוטנציאל להיות מותאמת למחלות שרירי שלד אחרות שבהן ליקויים בתקשורת בין ECM לתאי שריר השלד תורמים להתקדמות המחלה.

Introduction

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב עיקרי של רקמות, המייצג את המרכיב הלא-תאי שלהן. מבנה תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה לא רק מספק תמיכה פיזית לתאים, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתהליכים הביוכימיים המעורבים בהתפתחות אורגניזמים1. היווצרות ECM ספציפי לרקמה מתרחשת במהלך ההתפתחות, כתוצאה מהאינטראקציות המורכבות בין התאים לנישות שלהם, המושפעות מגירויים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים. ECM הוא מבנה דינמי ביותר העובר סידורים כימיים ומכניים באופן זמני-מרחבי ומשפיע ישירות על גורל התא2. אחד המאפיינים הבולטים של ECM הוא המגוון התפקודי שלו, שכן כל ECM רקמה מציג שילוב ייחודי של מולקולות המספקות טופולוגיות ותכונות שונות המותאמות לתאים שהוא מכיל1.

איתות ותמיכה ב-ECM חיוניים להתפתחות ולהומאוסטזיס, וכאשר הם משובשים הם עלולים להוביל למצבים פתולוגיים מרובים 3,4. דוגמה אחת היא ניוון מולד חסר LAMA2 (LAMA2-CMD), שהיא הצורה הנפוצה ביותר של ניוון שרירים מולד. הגן LAMA2 מקודד לשרשרת למינין α2, אשר קיים בלמינין 211 ולמינין 221, וכאשר הוא עובר מוטציה יכול להוביל ל- LAMA2-CMD 5. למינין 211 הוא האיזופורם העיקרי שנמצא בקרום המרתף המקיף את סיבי שרירי השלד. כאשר למינין 211 אינו תקין או נעדר, הקשר בין קרום המרתף לתאי השריר משתבש, מה שמוביל להתפרצות המחלה6. חולים עם LAMA2-CMD מראים פנוטיפ קל עד חמור בהתאם לסוג המוטציה בגן LAMA2.

כאשר תפקודו של חלבון α2 למינין מושפע, חולים יכולים לחוות היפוטוניה חמורה בשרירים בלידה ולפתח דלקת כרונית, פיברוזיס וניוון שרירים, מה שמוביל לקיצור תוחלת החיים. עד היום לא פותחו טיפולים ממוקדים והגישות הטיפוליות מוגבלות להקלה על תסמיני המחלה7. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המעורבים בהתפרצות מחלה זו חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מתאימות 6,8. עבודה קודמת שהשתמשה בעכבר dy W 9, מודל עבור LAMA2-CMD, מציעה כי הופעת המחלה מתחילה ברחם, במיוחד במהלך מיוגנזה עוברית10. הבנה טובה יותר של האופן שבו מופיע פגם המיוגנזה העוברית תשנה את כללי המשחק ביצירת גישות טיפוליות חדשניות עבור LAMA2-CMD.

מערכות במבחנה מספקות סביבה מבוקרת לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM תא, אך מודלים של תרביות דו-ממדיות חסרים את המורכבות של רקמות טבעיות. דה-צלולריזציה של רקמות מייצרת פיגומים אצלולריים אצלולריים ספציפיים לרקמות ולשלבי התפתחות, המחקים בצורה מדויקת יותר את המיקרו-סביבה הטבעית של התא בהשוואה למודלים דו-ממדיים ופיגומים מהונדסים / סינתטיים. למטריצות דה-תאיות (dECMs) יש פוטנציאל לשמר את הרמזים המולקולריים והמכניים של הרקמה המארחת, מה שהופך אותן למודלים חלופיים טובים יותר להבנת תהליכים in vivo 11.

ישנן טכניקות, ריאגנטים ותנאים שונים שניתן להשתמש בהם לדצלולריזציה12,13. במחקר זה, פרוטוקול דה-צלולריזציה של לב עכבר העובר, שתואר על ידי Silva et al.14,15, מותאם לשרירי השלד של עכבר העובר ונמצא כי הוא שומר על כל רכיבי ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV). הפרוטוקול כולל שלושה שלבים: ליזה של תאים על ידי הלם אוסמוטי (חיץ היפוטוני), המסת קרום פלזמה ודיסוציאציה של חלבונים (0.05% נתרן דודציל סולפט [SDS]), והרס אנזימטי של DNA (טיפול DNase). למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון שנקבע לפירוק שרירי השלד העוברי של עכבר.

כדי להשתמש במערכת תלת-ממדית זו במבחנה לחקר LAMA2-CMD, חיוני לשמור על שרשרת α2 למינין לאחר דה-צלולריזציה. לכן, יושם פרוטוקול אופטימיזציה שבו נבדקו דטרגנטים שונים (SDS וטריטון X-100) וריכוזים (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% ו-0.5%) (הנתונים לא מוצגים). הבחירה האופטימלית להסרת תאים ושימור של חלבון למינין α2 נמצאה 0.05% SDS. תאי C2C12, קו תאי מיובלסטמבוסס היטב 16,17, שימשו לזרע dECMs. תאים אלה פולשים ל-dECM, מתרבים ומתמיינים בתוך פיגומים אלה, תוך סינתזה של חלבוני ECM חדשים. הייצור המוצלח של מודל תלת-ממדי זה במבחנה מציע גישה חדשה להבנת התהליכים המולקולריים והתאיים המעורבים במיוגנזה עוברית, הופעת LAMA2-CMD, וניתן להרחיב אותו למחלות שרירים אחרות שבהן התקשורת בין ECM לתאי שריר השלד משובשת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המתודולוגיות המתוארות אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים (ORBEA) של הפקולטה למדעים, אוניברסיטת ליסבון ו- Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), והן בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU.

1. הכנת מאגרי דה-צלולריזציה וריאגנטים

הערה: יש לעקר את כל הפתרונות המשמשים במהלך פרוטוקול דה-צלולריזציה על ידי autoclaving ולאחסן למשך עד 3 חודשים, אלא אם צוין אחרת.

  1. הכן 10x מלח חוצץ פוספט (10x PBS) על ידי הוספת נתרן כלורי (NaCl) ב 137 mM, אשלגן כלורי (KCl) ב 2.68 mM, אשלגן דימימן פוספט (KH 2 PO 4) ב 8.1 mM, ודיסודיום-מימן-פוספט dihydrate (Na 2 HPO4) ב 1.47 mM למים demineralized (dH2O) ולהתאים את ה- pH ל 6.8. הוסף 100 מ"ל של 10x PBS ל- 900 מ"ל של H2O נטול מינרלים כדי ליצור PBS 1x. Autoclave ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT). יש להוסיף תמיסת מלאי סטרילית של פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין ו-10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין [עט/סטרפטוקו]) לריכוז סופי של 1% לפני השימוש.
  2. הכן את המאגר ההיפוטוני על ידי המסת 1.21 גרם של Tris(hydroxymethyl)aminomethane (בסיס Tris) ו 1 גרם של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 1 L של dH2O (10 mM Tris בסיס 0.1% EDTA). יש להשתמש במערבל מגנטי עד להמסה ולהתאים את רמת החומציות ל-7.8 עם NaOH/HCl. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ולאחסן ב-RT. יש להוסיף עט/סטרפטוקוקוס לריכוז סופי של 1% לפני השימוש.
  3. הכן את חיץ הכביסה ההיפוטוני על ידי המסת 1.21 גרם של בסיס Tris ב 1 L של dH2O (10 mM בסיס Tris). יש להשתמש במערבל מגנטי עד להמסה ולהתאים את רמת החומציות ל-7.8 עם NaOH/HCl. Autoclave ולאחסן ב-RT. יש להוסיף עט/סטרפטוקוקוס ל-1% לפני השימוש.
  4. הכן את הטיפול בדטרגנט אניוני על ידי הוספת 0.05 גרם נתרן דודציל סולפט (SDS) ל -100 מ"ל של חיץ כביסה היפוטוני כדי לייצר פתרון טיפול 0.05% SDS. יש לסנן דרך מסנן ממברנות בגודל 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-RT למשך עד חודש אחד.
    הערה: אין לבצע autoclaving של פתרון SDS, מכיוון ש-SDS מזרז ומתפרק בעת autoclaving.
  5. הכן את פתרון הטיפול DNase על ידי המסת 1.21 גרם של בסיס Tris ב 0.5 מ"ל של dH 2 O ולהוסיף 1 מ"ל של 1 M מגנזיום כלורי (MgCl2). כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם NaOH/HCl. Autoclave ואחסן ב- RT. הוסף DNase I לפני השימוש (50 U/mL).

2. איסוף דוגמאות

הערה: עכברי בר מסוג C57/BL6 שימשו במחקר. כל הטכניקות נערכו במכסה מנוע זרימה למינרי בתנאים סטריליים.

  1. יש להרדים עכברות בוגרות בהריון ביום העוברי (E) 18.5 להריון באמצעות שאיפת איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם. יש להעביר את העכברים לדיסקציה סופנית כדי לחלץ את העוברים.
    1. לרסס את הבטן של העכבר עם 70% אתנול.
    2. בעזרת מלקחיים כירורגיים ומספריים מרימים קפל עור בבטן התחתונה ומבצעים חתך בצורת U כדי לחשוף את חלל הבטן18.
    3. אספו את קרני הרחם המכילות את עוברי E18.5 על ידי חיתוך האובידוקט וצוואר הרחם והעבירו אותם מיד לצלחת פטרי עם PBS 1x קר כקרח עם 1% עט/סטרפטוקוקוס18.
    4. הוציאו במהירות את העוברים מהרחם ומהרקמות החוץ-עובריות והרדימו אותם על ידי עריפת ראשים באמצעות מספריים18.
  2. העבירו עובר אחד בכל פעם לצלוחית פטרי עם PBS 1x קר כקרח. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את העור לחתוך את הגפיים. מהצד הגחוני, לחתוך דרך כלוב הצלעות ולהסיר את עצם החזה ואת האיברים הבסיסיים.
  3. הפכו את החדק העוברי כלפי מעלה. הסר את החלק הצווארי של עמוד השדרה, את מצבורי השומן הגבי ואת רקמת החיבור על גבי שרירי הגב העמוקים.
  4. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לעגן את כלוב הצלעות ולגרד בזהירות ולנתק את שרירי הגב העמוקים מהרקמות שמסביב באמצעות מיקרו אזמל10. הליך זה מביא לבידוד של שתי חתיכות שריר לכל עובר (שמאל וימין), שתיהן מורכבות בעיקר משרירי לונגיסימוס ואיליוקוסטליס , כאשר חלק משרירי הטרנסוורסוסספינליס והלבטור קוסטרום כלולים.
  5. אחסנו את דגימות השריר ב-PBS 1x עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ב-4°C לאחסון לטווח קצר (<1 שבוע), או ב-80°C לפרקי זמן ארוכים יותר.
    הערה: השתמש בדוגמאות חדשות שנאספו לקבלת התוצאות הטובות ביותר. דגימות שהוקפאו לתקופות ממושכות (>3 חודשים) מראות יעילות דה-צלולריזציה נמוכה יותר ויותר פירוק חלבונים. מסות שריר אפאקסיאליות שימשו לניסויי דה-צלולריזציה, אך שרירים אחרים (למשל, שרירי הגפיים) יכולים להיות מעובדים לדצלולריזציה באמצעות אותו פרוטוקול.

3. דה-צלולריזציה של שרירי השלד העוברי

הערה: כל הטכניקות בוצעו במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים. לייצוג סכמטי מפורט, ראו איור 1A. כל השלבים בוצעו בתסיסה בשייקר מסלולי, בקוטר של 120 מ"מ (165 סל"ד) ב-25°C, אלא אם צוין אחרת. יש להוסיף 1% עט/סטרפטוקוקוס לתמיסות לפני השימוש. בעת הסרת התמיסות, יש לשאוף בזהירות כדי למנוע מלכודת דגימה בפיפטה.

  1. יום 1 - הכינו כ-2 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ (~3.5 מ"ג) שברי רקמות ממסת השריר האפקסיאלית. הוסף 3 מ"ל של חיץ היפוטוני עם 1% עט / סטרפטוקוקוס לכל באר של צלחת 12 בארות והוסף שבר רקמת שריר שלם אחד לכל באר.
    1. לדגור על שברי הרקמה בחיץ היפוטוני עם תסיסה במשך 18 שעות (לילה) (O/N).
  2. יום 2 - שאפו את החיץ ההיפוטוני באמצעות פיפטה עדינה ושטפו את הדגימות 3 x 1 שעות עם 3 מ"ל של 1x PBS בכל פעם עם תסיסה.
    1. לדגור את הדגימות במשך 24 שעות עם 3 מ"ל של 0.05% SDS דטרגנט פתרון עם תסיסה.
      הערה: (נקודת ביקורת) לאחר דגירה של SDS, הדגימות צריכות להיות שקופות במראה. הדגימות מציגות עקביות דמוית ג'לטין ולכן נוטות יותר להיצמד לפיפטה בעת הסרת הנוזלים.
  3. יום 3 - הסר את תמיסת חומרי הניקוי SDS באמצעות פיפטה עדינה ושטוף את שברי הרקמה 3 x 20 דקות עם 3 מ"ל של חיץ שטיפה היפוטוני בכל פעם עם תסיסה.
    הערה: (נקודת השהיה) ניתן לשמור את הדגימות במאגר שטיפה היפוטוני ב-4°C למשך 18 שעות (O/N). ודא ש-SDS מוסר היטב במהלך שלבי הכביסה, מכיוון ששאריות SDS יכולות להיות ציטוטוקסיות.
    1. לדגור על שברי הרקמה במשך 3 שעות עם 2 מ"ל של תמיסת DNase עם תסיסה ב 37 ° C.
    2. הסר את תמיסת DNase באמצעות פיפטה עדינה ושטוף את שברי הרקמה 3 x 20 דקות עם 3 מ"ל של 1x PBS בכל פעם עם תסיסה. לבסוף, לשטוף O/N עם תסיסה (60 סל"ד).
      הערה: לאחר הטיפול ב- DNase, ה- dECMs הופכים לדביקים עקב נוכחות של שאריות DNA. לכן, כביסה זהירה היא הכרחית.
    3. אחסנו את ה-dECM ב-1x PBS עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ב-4°C עד לרצלולריזציה (<1 שבוע). לשימושים אחרים, יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.

4. הערכת איכות דה-סלולריזציה

הערה: כימות DNA, צביעת DAPI/מתיל ירוק וצביעת פלואדין בוצעו כדי להעריך את נוכחותם של תוכן תאים שיורית לאחר דה-צלולריזציה. אימונוהיסטוכימיה וניתוחי כתמים מערביים נערכו כדי להעריך את השימור של חלבוני ECM מרכזיים לאחר דה-צלולריזציה.

  1. כימות הדנ"א הקיים ב-dECM
    הערה: יש להשוות את dECMs לרקמה המקורית כדי לזהות נוכחות של DNA.
    1. לפני דה-צלולריזציה, יש לשקול צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בקנה מידה דיגיטלי ברמת דיוק גבוהה. לפני העברת דגימת השריר לצינור, הסר את כל 1x PBS הנותרים באמצעות מגבת נייר. לשקול את הצינור עם הדגימה. חשב את המשקל הרטוב של הדגימות באמצעות משוואה (1):
      משקלרטוב לדוגמה = צינור משקלעם דוגמיות- צינור ריק משקל (1)
    2. בטל את הסלולריות של הדגימות בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 3.
    3. מניחים את הדגימות בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל.
      הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של -20°C עד למיצוי וכימות DNA.
    4. בצע מיצוי DNA של dECMs ודגימות רקמה מקוריות באמצעות ערכה מבוססת עמודת ספין. מוסיפים את מאגר העיכול בהתאם להוראות היצרן.
    5. הומוגניזציה של הדגימות בטחנת חרוזים פעמיים במשך 2.5 דקות בכל פעם (היפוך התושבות) באמצעות חרוז טונגסטן קרביד אחד לכל צינור (השתמש בתושבות צינור מקוררות).
    6. מוסיפים פרוטאינאז K ודגרים על O/N עם תסיסה איטית ב-56°C.
    7. המשך עם הפרוטוקול כמתואר בהוראות היצרן.
    8. יש להצמיד עם החיץ שסופק על ידי היצרן ולצנטריפוגה 2 x 1 דקות ב ≥6,000 x גרם, בכל פעם ב 4 ° C כדי להגדיל את תפוקת ה- DNA.
      הערה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C עד כימות.
    9. כמת את הדנ"א הקיים בדגימות באמצעות ערכת זיהוי dsDNA פלואורסצנטית בהתאם להוראות היצרן.
    10. לנרמל את תכולת ה- DNA כננוגרם של DNA למיליגרם של משקל רטוב מקורי של דגימה.
    11. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי ובטא כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
  2. אימונוהיסטוכימיה
    הערה: יש להכין את תמיסות 1, 2 ו-3 ואת התמיסה המקבעת לפני השימוש וניתן לשמור אותן קפואות עד 6 חודשים. כל הנוגדנים והצבעים המשמשים והדילולים המתאימים מפורטים ב טבלה 1.
    1. הכנת פתרונות
      1. הכן תמיסה מקבעת על ידי הוספת 2 גרם של paraformaldehyde (PFA), 8 גרם של סוכרוז, ו 24 μL של 1 M CaCl 2 עד 77 מ"ל של 0.2 M Na 2 HPO 4 ו 23 מ"ל של 0.2 M NaH 2 PO 4, לנפח סופי של 200 מ"ל על ידי הוספת dH2O. התאם את ה- pH ל7.4.
      2. הכן מאגר פוספט 0.12 M על ידי הוספת 13.5 גרם של Na 2 HPO 4 ו- 3.2 גרם של NaH 2 PO 4 עד 1 L של dH2O. התאם את ה- pH ל-7.4.
      3. הכן תמיסה 1 על ידי הוספת 4 גרם סוכרוז ל 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 M.
      4. הכינו תמיסה 2 על ידי הוספת 15 גרם סוכרוז ל-100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 מ'.
      5. הכינו תמיסה 3 על ידי הוספת 15 גרם סוכרוז ו 7.5 גרם ג'לטין ל 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 M. מחממים ב-37°C עד שהג'לטין מתמוסס.
      6. הכינו תמיסת מתיל גרין סטוק (2% אבקת מתיל גרין מומסת ב-dH2O)19.
    2. זיהוי חיסוני
      1. תקן את הדגימות באמצעות פתרון קיבוע לפחות 4 שעות ב 4 ° C.
      2. שטפו את הדגימות 2x במשך 10 דקות עם 1x PBS.
      3. יש לשמור O/N, או מעל יום אחד, בתמיסה 1 בטמפרטורה של 4°C.
      4. יש לשטוף ולשמור O/N או מעל יום אחד בתמיסה 2 ב-4°C. תנו לדגימות להתחמם ל-RT.
      5. יש לדגור במשך 3 שעות בתמיסה 3 בטמפרטורה של 37°C. יש לשמור תמיסה נוספת 3 בטמפרטורה של 37°C לשימוש מאוחר יותר.
      6. מיכלי עובש קטנים (2 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) ברדיד אלומיניום. מניחים שכבה דקה של תמיסה 3 במיכל היצוק ומניחים לה להתייצב. מניחים את הדגימות על תמיסה מוצקה 3 ומכסים בתמיסה חמה 3. לכוון את הדגימות ולתת להם להתמצק. סמן את המיקום בתמיסה 3 המוצקה באמצעות עט צבעוני.
      7. להקפיא על ידי הנחת המיכלים על פני השטח של isopentane יבש מקורר קרח או חנקן נוזלי.
      8. באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.), קבע את קוביות הג'לטין הקפואות המכילות את הדגימות לתושבת ההקפאה.
      9. מחלקים את קוביות הג'לטין הקפואות ומעבירים את חלקי הרקמה לשקופיות. תנו להם להתייבש במשך 60 דקות.
      10. השתמש סמן הידרופובי כדי לעקוב אחר קו סביב המקטעים.
      11. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות ב-1x PBS.
      12. כסו את המקטעים באלבומין 1% בסרום בקר (BSA), 1% סרום עיזים ו-0.05% Triton X-100 מדולל ב-1x PBS (פתרון חוסם) למשך 30 דקות (שלב החסימה).
      13. לדלל את הנוגדנים העיקריים בתמיסת החסימה ולכסות את הסעיפים. יש לדגור על O/N בטמפרטורה של 4°C בקופסה סגורה, עם נייר לח, כדי למנוע מהחלקים להתייבש.
      14. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות עם 1x PBS.
      15. לדלל את הנוגדנים המשניים בתמיסה חוסמת ולכסות את הסעיפים. דגרו במשך 1.5 שעות ב-RT בחושך.
        הערה: יש להימנע מחשיפה לאור כדי למנוע התפרקות פלואורופור.
      16. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות עם 4x PBS.
        הערה: ניתן להשתמש בריכוז גבוה יותר של PBS כאשר קיים רקע חזק.
      17. שקעו את השקופיות בתמיסת DAPI (5 מיקרוגרם/מ"ל 1,4-diazabicyclo-2,2,2,2-אוקטן ב-0.1% Triton X-100/1x PBS) למשך 30 שניות כל אחת.
      18. יש לשטוף ב-PBS אחד.
      19. הרכיבו את החלקים במדיום מונע דהייה (50 מ"ג/מ"ל n-פרופיל-גלאט ב-1x PBS:גליצרול [1:9]) ואטמו עם כיסוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לתצפית ורכישת תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי20.
        הערה: בניסויים באימונוהיסטוכימיה בטוטו , נעשה שימוש באותו פרוטוקול (ראה שלבים 4.2.2.12-4.2.2.18), למעט הדגימות שתוקנו בעבר ב-4% PFA מדולל ב-1x PBS למשך 3 שעות ב-RT. צביעת DNA בוצעה על ידי הוספת מתיל ירוק לתמיסת הנוגדנים המשנית. כל הנוגדנים והצבעים שבהם נעשה שימוש, והדילולים המתאימים להם, מפורטים בטבלה 1. לאחר מכן הותקנו הדגימות בתווך נגד דהייה בין שתי כיסויים המופרדים על ידי טבעות פלדה, הודבקו יחד עם שעוות דבורים, וערימות תמונה של 100 מיקרומטר נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי21.
  3. ניתוח כתמים מערביים
    הערה: כל הנוגדנים המשמשים והדילולים המתאימים מפורטים ב טבלה 1.
    1. הכנת פתרונות
      1. הכן את מאגר הטעינה 2x SDS-PAGE על-ידי הוספת 20 מ"ל גליצרול, 4 גרם SDS ו-0.2 מ"ל ברומופנול כחול ל-80 מ"ל של תמיסת הבסיס Tris של 100 מילימול. התאם את ה- pH ל- 6.8. יש להוסיף dithiothreitol טרי (DTT) לפני השימוש.
      2. הכינו את מאגר שטיפת המלח האגירה של Tris עם תמיסת Tween 20 (TBST) על ידי הוספת 2.4 גרם בסיס Tris, 8.8 גרם NaCl ו-1 מ"ל של Tween-20 ל-dH2O לנפח סופי של 1 L. כוונן את ה-pH ל-7.4-7.6 באמצעות HCl.
      3. הכן את מאגר הריצה (RB) 10x על ידי הוספת 30.2 גרם בסיס Tris, 144.2 גרם גליצין ו- 10 גרם SDS ל- 1 L של dH2O. לפני השימוש, הוסף 100 מ"ל של 10x RB ל 900 מ"ל של dH2O כדי להכין 1x RB (פתרון עבודה).
        הערה: בעוד שניתן לאחסן RB 10x ב- RT למשך מספר חודשים, ניתן לעשות שימוש חוזר ב- RB אחד בריצות שונות.
      4. הכן את מאגר ההעברה (TB) על ידי הוספת 5.82 גרם בסיס Tris, 2.93 גרם גליצין ו- 0.5 גרם SDS ל- 800 מ"ל של dH2O. לאחר המסת הרכיבים, להוסיף 200 מ"ל של מתנול. מצננים ב 4 °C.
        הערה: יש להכין את השחפת טרי לפני כל שימוש.
    2. מיצוי חלבונים
      1. אספו שרירים אפאקסיאליים מעכברי E18.5 והניחו אותם מיד בצינור מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל) המכיל 2x SDS-PAGE מאגר טעינה עם DTT טרי שנוסף (100 mM DTT). תהליך E18.5 dECM באותו אופן.
      2. הוסף חרוז טונגסטן קרביד אחד לכל צינור. הומוגניזציה 2x בטחנת חרוזים במשך 2.5 דקות בכל פעם (להפוך את התושבות).
      3. סוניק את הדגימות במשך 5 דקות באמבט אולטרסאונד.
      4. חממו את הדגימות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 50°C.
      5. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
      6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
      7. כמת את החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      8. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש חדש.
    3. אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד
      1. יש להשתמש בג'ל הדרגתי אקרילאמיד פריקאסט (4%-20%)
      2. הר את הג'ל במיכל האלקטרופורזה. מוציאים את המסרק בזהירות. הוסף RB 1x עד לקו המוצג במיכל האלקטרופורזה. ודא שהבארות מלאות RB.
      3. יש להעמיס 100 מק"ג חלבון לדגימה בבארות. עומס 12 μL של חלבון במשקל מולקולרי גבוה סטנדרטי.
      4. לרוץ בסך הכל 100 דקות עם מתח קבוע (10 דקות ב 150 V ו 90 דקות ב 185 V).
    4. העברה
      1. השרו את רפידות המסנן והספוגים בשחפת צוננת (4°C) בזמן שהג'ל פועל.
      2. חותכים את קרום polyvinylidene difluoride לגודל של ג'ל. הפעל אותם עם מתנול ולשטוף עם dH2O. להשרות את השחפת.
      3. הרכיבו את קסטת ההעברה עם הספוגים, רפידות הפילטר, הג'לים והקרומים הפעילים בהתאם להוראות היצרן.
      4. הניחו את הקלטת במיכל האלקטרופורזה המכיל את השחפת המצוננת (על מצע קרח). הוסיפו את יחידת הקירור. לרוץ במשך 90 דקות ב 100 V.
      5. לאחר ההעברה, כתם עם תחליף כחול קומאסי כדי להעריך את איכות ההעברה.
    5. זיהוי חיסוני
      1. הכינו את תמיסת החסימה (TBST עם חלב דל שומן 5%). לדגור את הממברנות עם תסיסה במשך 1 שעה ב RT.
      2. יש לשטוף 3 x 5 שניות עם TBST.
      3. לדגור על הממברנות O/N עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-TBST עם 2% BSA ו-0.02% נתרן אזיד (3 מ"ל לממברנה) בתא קר (4°C) עם תסיסה.
      4. למחרת, שטפו 3X5 דקות עם TBST.
      5. לדגור על הממברנות עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) מדוללים ב-TBST עם חלב דל שומן 5% (5 מ"ל לכל ממברנה) למשך שעה אחת ב-RT.
      6. שטפו את הממברנות עם TBST 3 x 5 דקות. שמור ב-TBST עד לשלב הזיהוי.
      7. דמיינו את החלבון באמצעות ערכת פיתוח מסחרית. הוסף ריאגנטים לגילוי בהתאם להוראות היצרן. רכוש תמונות של הלהקות.
      8. כדי לבדוק יותר מנוגדן אחד לכל ממברנה, לאחר שלב הזיהוי, הפשיט את הנוגדנים הקודמים בשלוש שטיפות (5 דקות כל אחת) באמצעות TBST וחזור על שלבים 4.3.5.2-4.3.5.7.

טבלה 1: נוגדנים וצבעים המשמשים באימונוהיסטוכימיה ובניתוח כתמים מערביים והדילולים המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.10,22

5. תרבית תאים במטריצות דה-סלולריות

הערה: כל הטכניקות בוצעו בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית. כל הדגירות בוצעו ב 37 ° C ועם 5% CO2.

  1. הכינו את מדיום תרבית התאים ועתיר הגלוקוז מדיום הנשר המעובד של דולבקו עם גלוטמין יציב ועם נתרן פירובט (DMEM), בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% עט/סטרפטוקוקוס (מדיום תרבית שלם).
  2. הניחו את ה-dECM בצלוחית פטרי ב-1x PBS עם 1% עט/סטרפטוקוקוס במכסה מנוע של זרימה למינרית והפרידו אותם לחתיכות של כ-500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר x 250 מיקרומטר, באמצעות מיקרו אזמל ופינצטה.
    הערה: ל-dECMs יש מרקם רך, ולכן לעתים קרובות קל יותר להשתמש בפינצטה כדי להפריד אותם לחתיכות בערך באותו גודל במקום לחתוך אותם עם אזמל המיקרו.
  3. מעבירים את השברים לתוך צלחת 96 באר (שלוש או ארבע חתיכות לכל באר) עם 200 μL של מדיום תרבית שלם, שחומם בעבר ל 37 מעלות צלזיוס. דגירה במשך שעתיים באינקובטור.
  4. הוסף 500 μL של טריפסין לבקבוק T25 זרע עם תת-מפגש (~ 70%) C2C12 תאים. Resuspend ב 1 מ"ל של מדיום מלא.
  5. הוסף 10 μL של המתלה ל 10 μL צבע כחול Trypan ולטעון לתוך hemocytometer. ספור וחשב את מספר התא ואשר את כדאיות התא.
  6. שאפו את התווך מלוח 96 הקידוחים המכיל את ה-dECMs והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם המכיל 50,000 תאי C2C12 בני קיימא.
  7. לדגור במשך 2 ימים ולאחר מכן, באמצעות פינצטה, להעביר את dECMs (עם התאים) צלחת 48 באר עם 400 μL של מדיום תרבית שלם. כל יומיים, בזהירות לשאוף את המדיום עם micropipette כדי למנוע dECMs להתנתק מתחתית הבאר ולהוסיף מדיום טרי עד יום 8.
    הערה: מטריצות נשמרות במשך יומיים בצלחות של 96 בארות כדי לקדם הידבקות תאי C2C12 ל-dECMs, ולאחר מכן מועברות לצלחת של 48 בארות כדי לאפשר גישה לנפח גדול יותר של תווך עם חומרים מזינים. dECMs צריך לדבוק בתחתית הבארות.
  8. עבור ניסוי ההתמיינות, החלף את מדיום התרבית המלא במדיום התמיינות (DMEM בתוספת 2% נסיוב סוסים ו-1% עט/סטרפטוקו) ביום 8, ולאחר מכן דגירה במדיום התמיינות במשך 4 ימים עד יום 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת פרוטוקול הדה-צלולריזציה היא לייצר dECMs הדומים מאוד להרכב הרקמה הטבעית. כדי לקבוע את יעילות תהליך הדה-צלולריזציה, נעשה שימוש בשיטות שונות, כולל בדיקת מורפולוגיה של רקמות, מדידת רמות DNA, צביעה עבור F-actin, וניתוח של רכיבי ECM מרכזיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה וטכניקות הכתמה מערביות. באופן ספציפי, חמישה רכיבי ECM עיקריים של רקמות שרירי השלד נותחו.

במהלך הפרוטוקול, הדגימות משתנות במראה (איור 1B 1-4). לאחר בידוד, רקמת השריר נראית אדמדמה עקב נוכחות של מיוגלובין (איור 1B1). לאחר הדגירה במאגר ההיפוטוני, אשר מנקה תאים ומסיר את רוב החלבונים הציטופלזמטיים, הדגימות הופכות לבנות (איור 1B2). SDS, חומר ניקוי אניוני המשמש בדרך כלל בדה-צלולריזציהשל רקמות 12, מסיר ביעילות חומר ציטופלזמי וגרעיני, כמו גם ממברנות. כתוצאה מכך, הדגימות נעשות שקופות יותר לאחר טיפול ב-SDS (איור 1B3). עם זאת, ריכוזים גבוהים או חשיפה ממושכת לחומר ניקוי זה עלולים לגרום לדנטורציה של חלבונים, אובדן גליקוזאמינוגליקנים ושיבוש סיבי הקולגן12. האיזון האופטימלי בין הסרת תאים ושימור של ECM מושג באמצעות 0.05% SDS במשך 24 שעות, כפי שמוצג באיור 2 ובאיור 3. לבסוף, דנ"א מוסר באמצעות טיפול DNase, והתוצאה היא פיגומים שקופים של dECM שהם מעט קטנים יותר מאשר לאחר טיפול SDS (איור 1B4).

הצלחת פרוטוקול הדה-צלולריזציה מסומנת על ידי כמות הדנ"א השיורי הקיימת במטריצות לאחר התהליך. כימות דנ"א מגלה ירידה של כמעט 100% ב-dECM בהשוואה לרקמה הטבעית (איור 1C). צביעת DAPI גם מאשרת את היעדר הדנ"א ב-dECM (איור 2B,D,F,H,J).

נוכחותם של חמישה חלבוני ECM עיקריים הוערכה על ידי אימונוהיסטוכימיה ועל ידי כתם מערבי לאחר דה-צלולריזציה והושוותה לרקמה הטבעית. צביעה חיסונית של תת-היחידה α2 של למינין (איור 2A,B) וסך כל הלמינינים (איור 2C,D) מראה שה-dECMs מציגים צביעה צינורית עבור החלבונים האלה (חיצים באיור 2B,D), בדומה למטריצת הלמינינים שמקיפה את המיו-צינוריות ברקמה הטבעית (החיצים באיור 2A,C). ניתוח כתם מערבי עבור תת-יחידה α2 של למינין מגלה נוכחות של שני פסים ברקמה הטבעית (איור 2A'), בעוד ששלושה פסים, עם משקל מולקולרי קטן מהצפוי, יכולים להיות מזוהים ב-dECM (איור 2B'). זה יכול להיות תוצאה של פירוק או הסרת חלבון במהלך תהליך decellularization. ניתוח כתמים מערביים עבור סך כל הלמינינים מראה פיצול מסוים של החלבונים האלה ב-dECM בהשוואה לדגימות מהרקמה הטבעית (איור 2C',D').

Figure 1
איור 1: הליך דה-צלולריזציה של שרירי השלד העוברי והערכת המורפולוגיה של הרקמה ותכולת הדנ"א. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול דה-צלולריזציה. (B) מורפולוגיית רקמות לאורך כל הפרוטוקול, מרקמה שזה עתה נאספה ועד רקמה דה-צלולרית. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) כימות הדנ"א הקיים ב-dECM בהשוואה לרקמה הטבעית. הנתונים מבוטא כממוצע ± SEM. מבחן t של סטודנט, דו-זנבי **p < 0.01. פרוטוקול דה-צלולריזציה מסיר ביעילות תוכן גרעיני המייצר dECM אצלולרי. קיצורים: dECMs = מטריצות decellularized; PBS = מלח חוצץ פוספט; SDS = סודיום דודציל סולפט; NT = רקמה מקורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

צביעה חיסונית של פיברונקטין (איור 2E,F) וקולגן I (איור 2G,H) מראה נוכחות של החלבונים האלה בחלל הבין-תאי בין תאים ברקמה הטבעית (חיצים באיור 2E,G) וצביעה דומה ב-dECMs (חיצים איור 2F,H). ניתוח כתמים מערביים מראה פסים דומים לפיברונקטין בשני התנאים (איור 2E',F'), מה שמצביע על כך שהחלבון הזה אינו מושפע במיוחד מתהליך הדה-צלולריזציה. אולם במקרה של קולגן I (איור 2G',H') יש פחות רצועות ב-dECMs, מה שמצביע על מידה מסוימת של התפרקות. צביעה חיסונית של קולגן IV מראה דפוס צביעה צינורית ברקמה הטבעית (חץ באיור 2I) וצביעה דומה ב-dECM, אף על פי שהמבנים הצינוריים צרים יותר (חץ באיור 2J). ניתוח כתמים מערביים עבור קולגן IV מגלה נוכחות של שלושה פסים ברקמה הטבעית (איור 2I'). בעוד שאותם שלושה פסים נצפים ב-dECMs (איור 2J'), המשקל המולקולרי שלהם נמוך מהצפוי. בדומה ללמינין α2, זה יכול להיות תוצאה של פירוק או הסרה של חלבונים במהלך decellularization.

לאחר מכן זורעים dECMs עם מיובלסטים C2C12 ומתורבתים במשך 8 ימים במדיום תרבית שלם. תאי C2C12 מאכלסים את ה-dECMs ומתרבים, כפי שניתן לראות על-ידי צביעה גרעינית של פוספו-היסטון 3 (חיצים באיור 3A). לאחר 4 ימים נוספים של תרבית בתווך התמיינות, תאי C2C12 מתמיינים ומתמזגים לצינורות מיו-צינור מרובי גרעינים (חיצים כחולים באיור 3B) המבטאים שרשרת מיוזין כבדה (קו מקווקו באיור 3B). באופן מעניין, צביעה תוך-תאית ו/או פריתאית עבור שרשרת α2 של למינין (חיצים צהובים באיור 3C,D), סך כל הלמינינים (חץ מגנטה באיור 3C) ופיברונקטין (חץ מג'נטה באיור 3D) יכולים להיות מזוהים בתאי C2C12 שגודלו בתרבית מלאה, מה שמרמז על כך שהתאים האלה מסוגלים לסנתז את חלבוני ה-ECM האלה דה נובו ובכך תורם להיווצרות הנישה שלהם., תוצאות אלה מראות כי פרוטוקול דה-צלולריזציה יוצר מיקרו-סביבה של dECM שבה מיובלסטים C2C12 יכולים להתרבות, להתמיין וליצור צינורות מיו-צינור מרובי גרעינים.

Figure 2
איור 2: הערכה של חמישה חלבוני ECM ברקמת שריר עוברית E18.5 טבעית לעומת דה-צלולרית. אימונוהיסטוכימיה על מקטעים של רקמה מקומית (A,C,E,G,I) וצביעה של DECMs (B,D,F,H,J) עם DAPI, סמן DNA, פאלואדין המזהה F-אקטין וחלבוני ECM. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. ברקמה הטבעית, קיימת צביעה חיסונית עבור למינינים וקולגן IV סביב המיוסיבים (A,C,I; חיצים צהובים) וצביעה עבור פיברונקטין וקולגן I מזוהה בחלל הביניים בין myofibers (E,G; חיצים צהובים). ב-dECMs, צביעה עבור למינינים וקולגן IV (B,D,J; חיצים צהובים) מראה תבנית צינורית, המקיפה את החללים שהותירו המיוסיבים לאחר דה-צלולריזציה. פיברונקטין וקולגן I immunostaining של dECMs עקבי עם נוכחותם בחלל interstitial (F,H; חיצים צהובים). (א'-ג') ניתוח כתמים מערביים עבור חמישה חלבוני ECM ברקמה טבעית (A',C',E',G',I') ובדגימות DECM (B',D',F',H',J'). שתי הגישות מראות שימור חלבונים לאחר דה-צלולריזציה. נוגדנים בשימוש ודילולים בהתאמה מפורטים בטבלה 1. קיצורים: LNα2 = שרשרת α2 למינין; LNp = למינינים של שריר פאן; FN = פיברונקטין Col I = קולגן I; Col IV = קולגן IV; MHC = שרשרת כבדה מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רה-צלולריזציה של dECM עם קו תאי מיובלסט (מיובלסטים C2C12). (A) הקרנה בעוצמה מרבית של תמונה קונפוקלית של ערימה של 100 מיקרומטר של מטריצה שעברה תא, מאוכלסת בתאי C2C12 המסומנים בדנ"א מכתים ירוק מתיל, פאלואדין המזהה F-אקטין ונוגדן אנטי-pH3, סמן התפשטות (חיצי מגנטה). סרגל קנה מידה = 35 מיקרומטר. (B) הקרנה בעוצמה מרבית של תמונה קונפוקלית של ערימה של 100 מיקרומטר המציגה מיו-צינור (קו מקווקו) מיוזין מרובה גרעינים (חיצים כחולים מציינים את הגרעינים) מיוזין כבד שרשרת חיובית (קו מקווקו) שנוצר במהלך התרבית. סרגל קנה מידה = 35 מיקרומטר. (C,D) תמונה קונפוקלית של אימונוהיסטוכימיה המציגה צביעה תוך-תאית או פרי-תאית עבור שרשרת α2 למינין (חיצים צהובים), סך כל הלמינינים (חיצי מגנטה ב-C) ופיברונקטין (חיצי מגנטה ב-D) במיובלסטים, מה שמרמז על סינתזת חלבון דה נובו. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. נוגדנים בשימוש ודילולים בהתאמה מפורטים בטבלה 1. קיצורים: pH3 = פוספו-היסטון 3; LNα2 = שרשרת α2 למינין; LNp = למינינים של שריר פאן; FN = פיברונקטין MHC = שרשרת כבדה מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ECM היא רשת מורכבת של מקרומולקולות הקיימת בכל הרקמות וממלאת תפקיד מכריע בוויסות התנהגות התא ותפקודו2. ה-ECM משמש כפיגום פיזי שאליו תאים יכולים להיצמד ומספק רמזים המווסתים באופן פעיל תהליכים תאיים כגון התפשטות, תנועתיות, התמיינות ואפופטוזיס. לפיכך, היווצרות נכונה ותחזוקה של ECM חיונית הן לפיתוח והן להומאוסטזיס1.

בעוד מודלים דו-ממדיים של תרביות תאים נמצאים בשימוש נרחב, הם מוחלפים יותר ויותר על ידי פלטפורמות תלת-ממדיות מתקדמות יותר. הסיבה לכך היא שתרביות דו-ממדיות חסרות את הרמזים הכימיים והפיזיקליים המשפיעים על התנהגות התא, בעוד שתרביות תלת-ממדיות נחשבות לחלופה מציאותית יותר לחקר דינמיקה מולקולרית ותאית ברקמות טבעיות11. דה-צלולריזציה של רקמות גורמת לייצור פיגומים המחקים באופן הדוק יותר את המיקרו-סביבות של רקמות ביולוגיות, כפי שהודגם במספר מחקרים במערכות רקמות או איברים שונים 14,15,23,24,25. היכולת של dECMs לשכפל מיקרו-סביבות טבעיות של רקמות טומנת בחובה פוטנציאל גדול למחקר על התפתחות תקינה, מצבי מחלה שונים והשפעת תרופות או רעלים על רקמות11.

הפרוטוקול המשמש במחקר זה מתבסס על הפרוטוקול שפותח על ידי סילבה ועמיתיו לפירוק רקמת לב עוברית14 כנקודת מוצא. זה כולל שילוב של חיץ היפוטוני, טיפול עם דטרגנט אניוני (SDS), וטיפול DNase. אחד האתגרים המרכזיים בפרוטוקולי דה-צלולריזציה הוא מציאת איזון בין הסרת תאים לבין שימור הרכב חלבון ECM. בהתחשב בהתמקדות שלנו בשימוש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית זו כדי לחקור את השלבים המוקדמים של LAMA2-CMD, תשומת לב מיוחדת הוקדשה לשימור למינין 211 במהלך דה-צלולריזציה. הפרוטוקול של Silva et al.14 הוביל לאובדן תגובתיות חיסונית של שרשרת α2 למינין בשרירי העובר ללא תאים; זה יכול להיות בגלל ריכוז SDS בשימוש. לפיכך, נבדקו חלופות לשלב תמיסת הדטרגנטים SDS 0.2%, כגון ריכוזים נמוכים יותר של SDS (0.1%, 0.05% ו-0.02%) והחלפת SDS בריכוזים שונים של Triton X-100 (0.5% ו-0.2%). התוצאות הטובות ביותר הושגו על ידי שימוש בטיפול 0.05% SDS דטרגנט במשך 24 שעות. ריכוז זה הסיר ביעילות את תכולת התא תוך שמירה על תגובתיות חיסונית של שרשרת למינין α2 לאחר דה-צלולריזציה. פרוטוקול זה מייצר dECM אצלולרי ללא שאריות תאים, כולל DNA.

הפרוטוקול המשמש במחקר זה משמר הן את חלבוני המטריצה הבין-תאית (פיברונקטין וקולגן I) והן את חלבוני קרום המרתף (למינינים וקולגן IV). מחקרים עתידיים צריכים להעריך אם קולגן VI נשמר גם, כפי שהוא גם שחקן ניוון שרירים26. ידוע כי SDS יכול לשבש את מבנה העל של החלבונים ולפגוע בקולגן12; עבור שרירי השלד העוברי, היה חשוב להשתמש בריכוז נמוך של SDS (0.05%) כדי לשמור על תגובתיות חיסונית של למינין α2. עם זאת, תוצאות הכתם המערבי מראות כי הדגימות decellularized להציג יותר פסים לאחר זיהוי חיסוני של laminins וקולגן בהשוואה לרקמה הטבעית, דבר המצביע על כך שחלק מפירוק החלבונים התרחש כתוצאה מתהליך decellularization27.

חשוב לציין כי ניסויי הרצלולריזציה מראים כי מטריצות אלה הן פיגומים אמינים התומכים באופן עקבי בהידבקות, התרבות והתמיינות תאים. SDS דווח כציטוטוקסי28, ולכן שלבי השטיפה הכלולים בפרוטוקול הם קריטיים אם המטריצות ישמשו לרצלולריזציה. פיגומים אלה יושבו למעשה על ידי תאי C2C12, דבר המעיד על התאמתם כמערכת מודל לתרבית תלת-ממדית של תאים. התצפית של צביעה תוך-תאית ופריתאית של חלבוני ECM המקיפים את תאי C2C12 מצביעה עוד יותר על כך שהתאים תורמים באופן פעיל למיקרו-סביבה שלהם בתוך dECMs. בנוסף, כאשר מוקמו בתווך התמיינות, תאי C2C12 התמיינו, התמזגו ויצרו צינורות מיו-צינור בתוך dECMs.

אתגר משמעותי בהליך זה הוא מניפולציה של הדגימות לאורך הפרוטוקול. הדגימות קטנות מאוד ורכות, ודורשות טיפול ומיומנות בטיפול כדי למנוע לכידה בפיפטה העדינה ואובדן הדגימות. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר מתחילים את הפרוטוקול עם רקמה טרייה. שימוש בדגימות קפואות ומאוחסנות עלול לעכב את הסרת התוכן התאי ולהוביל לפירוק מוגבר של חלבונים, לעכב את זיהוי החלבונים ולהפחית את יעילות הדה-צלולריזציה.

רק מחקרים מעטים דיווחו על דה-צלולריזציה של רקמות העובר 15,29,30,31. באופן ספציפי, לגבי דה-צלולריזציה של שרירי השלד העוברי, רק מחקר קודם אחד דיווח על דה-צלולריזציה של דגימות מורכבות של דרמיס, רקמה תת-עורית ו-panniculus carnosus31. למיטב ידיעת המחברים, זו הפעם הראשונה שנקבע פרוטוקול דה-צלולריזציה לשרירי שלד עובריים מבודדים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס ליצירת פרוטוקולים דומים לרקמות שריר עובריות של מינים אחרים, כגון חזירים ובני אדם13.

הפרוטוקול הנוכחי לפירוק שריר השלד של עכבר E18.5 דומה מאוד להליך של סילבה ואחרים 14, שיישמו אותו על לב עכבר E18. ההבדל היחיד הוא ריכוז SDS בשימוש, שהוא נמוך משמעותית מזה המשמש עבור לב העובר (0.05% לעומת 0.2%), אולי בשל תכונות פיזיות שונות של שתי רקמות עובריות אלה.

פיתוח מודל זה במבחנה לא רק מאפשר לחקור את התהליכים המעורבים בהתפתחות תקינה של שרירי העובר, אלא גם מאפשר חקירה מקבילה של ניוון שרירים ומיופתיה מוקדמים, כגון LAMA2-CMD, המתבטא בפגם מיוגנזה ב-E18.5 בעכבר dy W מודל10. עם זאת, יש לציין כי מערכת זו מוגבלת בכך שהיא כוללת רק את ECM ותאי שריר ואינה מכילה סוגי תאים אחרים כגון נוירונים, תאי אנדותל ופיברובלסטים. הרלוונטיות של סוגי תאים נוספים אלה עשויה להשתנות בהתאם למחלה, וייתכן שיהיה צורך בשינויים במערכת התרבית כדי לכלול אותם. בסך הכל, השימוש ב- dECMs כפי שמתואר במחקר זה יכול להיות מיושם במחקר של ניוון שרירים ומיופתיה מוקדמים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Téléthon; חוזה מס' 23049), פרויקט MATRIHEALTH, ויחידת cE3c מימון UIDB/00329/2020. ברצוננו להודות לתורם שלנו הנריקה מיירלס שבחר לתמוך בפרויקט MATRIHEALTH. עבודה זו נהנתה מהתשתיות של מתקן המיקרוסקופיה של הפקולטה למדעים, צומת של הפלטפורמה הפורטוגזית של הדמיה ביולוגית (סימוכין PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), ואנו מודים לואיס מרקס על עזרתו ברכישת ועיבוד תמונה. לבסוף, אנו מודים למרתה פלמה על התמיכה הטכנית ולצוות המחקר שלנו על תרומתם הנדיבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 193
הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gameiro dos Santos, P., Soares, A.… More

Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter