Summary
In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo cruciale nel fornire supporto strutturale per le cellule e trasmettere segnali importanti per vari processi cellulari. I modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) semplificano eccessivamente le complesse interazioni tra cellule e ECM, poiché la mancanza di un supporto tridimensionale completo (3D) può alterare il comportamento cellulare, rendendoli inadeguati per la comprensione dei processi in vivo . Le carenze nella composizione della ECM e nelle interazioni cellula-ECM sono importanti contributori a una varietà di malattie diverse.
Un esempio è la distrofia muscolare congenita LAMA2 (LAMA2-CMD), dove l'assenza o la riduzione della laminina funzionale 211 e 221 può portare a grave ipotonia, rilevabile alla nascita o subito dopo. Lavori precedenti che utilizzano un modello murino della malattia suggeriscono che la sua insorgenza si verifica durante la miogenesi fetale. Il presente studio mirava a sviluppare un modello 3D in vitro che permettesse lo studio delle interazioni tra cellule muscolari e ECM muscolare fetale, imitando il microambiente nativo. Questo protocollo utilizza muscoli profondi della schiena sezionati da feti di topo E18.5, trattati con un tampone ipotonico, un detergente anionico e DNasi. Le matrici decellularizzate risultanti (dECM) hanno mantenuto tutte le proteine ECM testate (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV) rispetto al tessuto nativo.
Quando i mioblasti C2C12 sono stati seminati sopra questi dECM, sono penetrati e hanno colonizzato i dECM, che hanno supportato la loro proliferazione e differenziazione. Inoltre, le cellule C2C12 hanno prodotto proteine ECM, contribuendo al rimodellamento della loro nicchia all'interno delle dECM. L'istituzione di questa piattaforma in vitro fornisce un nuovo approccio promettente per svelare i processi coinvolti nell'insorgenza di LAMA2-CMD e ha il potenziale per essere adattato ad altre malattie del muscolo scheletrico in cui le carenze nella comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche contribuiscono alla progressione della malattia.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) è un costituente importante dei tessuti, che rappresenta la loro componente non cellulare. Questa struttura tridimensionale (3D) non solo fornisce supporto fisico per le cellule, ma svolge anche un ruolo cruciale nei processi biochimici coinvolti nello sviluppo degli organismi1. La formazione di una ECM tessuto-specifica avviene durante lo sviluppo, come risultato delle complesse interazioni tra le cellule e le loro nicchie, influenzate da vari stimoli intra ed extracellulari. L'ECM è una struttura altamente dinamica che subisce riarrangiamenti chimici e meccanici in modo temporale-spaziale e influisce direttamente sul destino cellulare2. Una delle caratteristiche più notevoli della MEC è la sua diversità funzionale, poiché ogni ECM tissutale mostra una combinazione unica di molecole che forniscono diverse topologie e proprietà adattate alle cellule che contiene1.
La segnalazione e il supporto della ECM sono cruciali per lo sviluppo e l'omeostasi e, se interrotti, possono portare a molteplici condizioni patologiche 3,4. Un esempio è la distrofia congenita con deficit di LAMA2 (LAMA2-CMD), che è la forma più comune di distrofia muscolare congenita. Il gene LAMA2 codifica per la catena α2 della laminina, che è presente nella laminina 211 e nella laminina 221, e quando mutato può portare a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 è l'isoforma principale presente nella membrana basale che circonda le fibre muscolari scheletriche. Quando la laminina 211 è anormale o assente, il legame tra la membrana basale e le cellule muscolari viene interrotto, portando all'insorgenza della malattia6. I pazienti con LAMA2-CMD mostrano un fenotipo da lieve a grave a seconda del tipo di mutazione nel gene LAMA2.
Quando la funzione della proteina α2 della laminina è compromessa, i pazienti possono sperimentare una grave ipotonia muscolare alla nascita e sviluppare infiammazione cronica, fibrosi e atrofia muscolare, portando a una ridotta aspettativa di vita. Ad oggi, non sono stati sviluppati trattamenti mirati e gli approcci terapeutici sono limitati ad alleviare i sintomi della malattia7. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti coinvolti nell'insorgenza di questa malattia è cruciale per lo sviluppo di strategie terapeutiche appropriate 6,8. Precedenti lavori che utilizzano il topo dyW 9, un modello per LAMA2-CMD, suggeriscono che l'insorgenza della malattia inizia in utero, in particolare durante la miogenesi fetale10. Una migliore comprensione di come emerge il difetto della miogenesi fetale sarebbe un punto di svolta nella generazione di nuovi approcci terapeutici per LAMA2-CMD.
I sistemi in vitro forniscono un ambiente controllato per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, ma i modelli di coltura 2D mancano della complessità dei tessuti nativi. La decellularizzazione dei tessuti produce scaffold ECM acellulari specifici per il tessuto e lo stadio di sviluppo che imitano in modo più accurato il microambiente cellulare naturale rispetto ai modelli 2D e agli scaffold ingegnerizzati / sintetici. Le matrici decellularizzate (dECM) hanno il potenziale di preservare i segnali molecolari e meccanici del tessuto ospite, rendendoli migliori modelli alternativi per la comprensione dei processi in vivo 11.
Esistono varie tecniche, reagenti e condizioni che possono essere utilizzate per la decellularizzazione12,13. In questo studio, un protocollo di decellularizzazione per il cuore fetale di topo, descritto da Silva et al.14,15, è adattato al muscolo scheletrico fetale del topo e si trova a conservare tutti i componenti ECM testati (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV). Il protocollo prevede tre fasi: lisi cellulare mediante shock osmotico (tampone ipotonico), dissoluzione della membrana plasmatica e dissociazione proteica (0,05% sodio dodecilsolfato [SDS]) e distruzione enzimatica del DNA (trattamento con DNasi). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo stabilito per decellularizzare il muscolo scheletrico fetale del topo.
Per utilizzare questo sistema 3D in vitro per lo studio di LAMA2-CMD, è fondamentale mantenere la catena α2 della laminina dopo la decellularizzazione. Pertanto, è stato implementato un protocollo di ottimizzazione in cui sono stati testati diversi detergenti (SDS e Triton X-100) e concentrazioni (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) (dati non mostrati). La scelta ottimale per la rimozione cellulare e la conservazione della proteina laminina α2 è risultata essere lo 0,05% di SDS. Le cellule C2C12, una linea cellulare di mioblasti ben consolidata16,17, sono state utilizzate per seminare i dECM. Queste cellule invadono la dECM, proliferano e si differenziano all'interno di questi scaffold, sintetizzando nuove proteine ECM. Il successo della produzione di questo modello 3D in vitro offre un nuovo approccio alla comprensione dei processi molecolari e cellulari coinvolti nella miogenesi fetale, l'insorgenza di LAMA2-CMD e può essere esteso ad altre malattie muscolari in cui la comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche viene interrotta.
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Protocol
Tutte le metodologie descritte sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (ORBEA) della Facoltà di Scienze dell'Università di Lisbona e dalla Direção Geral de Veterinária (DGAV; rif. 0421/000/000/2022) e sono conformi alla Direttiva Europea 2010/63/UE.
1. Preparazione di tamponi e reagenti di decellularizzazione
NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate durante il protocollo di decellularizzazione devono essere sterilizzate in autoclave e conservate per un massimo di 3 mesi, salvo diversa indicazione.
- Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS) aggiungendo cloruro di sodio (NaCl) a 137 mM, cloruro di potassio (KCl) a 2,68 mM, potassio-diidrogeno fosfato (KH 2 PO 4) a 8,1 mM e disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na 2 HPO4) a 1,47 mM in acqua demineralizzata (dH2O) e regolareil pH a 6,8. Aggiungere 100 ml di 10x PBS a 900 mL di H2O demineralizzato per generare 1x PBS. Autoclave e conservare a temperatura ambiente (RT). Aggiungere la soluzione madre sterile di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina [penna/streptococco]) ad una concentrazione finale dell'1% prima dell'uso.
- Preparare il tampone ipotonico sciogliendo 1,21 g di Tris(idrossimetil)amminometano (Tris base) e 1 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 1 L di dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Utilizzare un agitatore magnetico fino alla dissoluzione e regolare il pH a 7,8 con NaOH / HCl. Sterilizzare in autoclave e conservare a RT. Aggiungere penna/streptococco ad una concentrazione finale dell'1% prima dell'uso.
- Preparare il tampone di lavaggio ipotonico sciogliendo 1,21 g di Tris base in 1 L di dH2O (10 mM Tris base). Utilizzare un agitatore magnetico fino a dissoluzione e regolare il pH a 7,8 con NaOH / HCl. Autoclave e conservare presso RT. Aggiungere penna/streptococco all'1% prima dell'uso.
- Preparare il trattamento detergente anionico aggiungendo 0,05 g di sodio dodecilsolfato (SDS) a 100 ml di tampone di lavaggio ipotonico per produrre una soluzione di trattamento SDS allo 0,05%. Filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Conservare su RT per un massimo di 1 mese.
NOTA: la soluzione SDS non deve essere autoclavata, poiché la SDS precipita e si degrada durante l'autoclave. - Preparare la soluzione di trattamento con DNasi sciogliendo 1,21 g di Tris base in 0,5 mL di dH 2 O eaggiungere 1 mL di cloruro di magnesio 1 M (MgCl2). Regolare il pH a 7,8 con NaOH/HCl. Autoclave e conservare a RT. Aggiungere DNasi I prima dell'uso (50 U/mL).
2. Raccolta dei campioni
NOTA: Nello studio sono stati utilizzati topi selvatici C57 / BL6. Tutte le tecniche sono state condotte in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Eutanasia di topi femmina adulti gravidi al giorno embrionale (E) 18.5 di gravidanza usando inalazione di isoflurano seguita da lussazione cervicale. Sottoporre i topi alla dissezione terminale per estrarre i feti.
- Spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70%.
- Usando una pinza chirurgica e le forbici, sollevare una piega di pelle nell'addome inferiore e fare un'incisione a forma di U per esporre la cavità addominale18.
- Raccogliere le corna uterine contenenti i feti E18.5 tagliando gli ovidotti e la cervice e trasferirli immediatamente in una capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato con penna / streptococco18% ghiacciato.
- Rimuovere rapidamente i feti dall'utero e dai tessuti extraembrionali e eutanasizzarli per decapitazione usando le forbici18.
- Trasferire un feto alla volta in una capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato. Usando un microscopio stereo, rimuovere la pelle e tagliare gli arti. Dal lato ventrale, tagliare la gabbia toracica e rimuovere lo sterno e gli organi sottostanti.
- Capovolgere il lato dorsale del tronco fetale verso l'alto. Rimuovere la porzione cervicale della colonna vertebrale, i depositi di grasso dorsale e il tessuto connettivo sopra i muscoli profondi della schiena.
- Utilizzare una pinza chirurgica per ancorare la gabbia toracica e raschiare e staccare con cura i muscoli profondi della schiena dai tessuti circostanti usando un micro bisturi10. Questa procedura comporta l'isolamento di due pezzi muscolari per feto (sinistro e destro), entrambi composti principalmente da muscoli longissimus e iliocostali , con alcuni dei muscoli trasversospinali e elevatore costarum inclusi.
- Conservare i campioni muscolari in 1x PBS con penna/streptococco all'1% a 4 °C per la conservazione a breve termine (<1 settimana) o a -80 °C per periodi più lunghi.
NOTA: Utilizzare campioni appena raccolti per ottenere i migliori risultati. I campioni congelati per periodi prolungati (>3 mesi) mostrano una minore efficienza di decellularizzazione e una maggiore degradazione delle proteine. Le masse muscolari epaxiali sono state utilizzate per gli esperimenti di decellularizzazione, ma altri muscoli (ad esempio, i muscoli degli arti) possono essere elaborati per la decellularizzazione utilizzando lo stesso protocollo.
3. Decellularizzazione del muscolo scheletrico fetale
NOTA: Tutte le tecniche sono state condotte in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Per una rappresentazione schematica dettagliata, vedere la Figura 1A. Tutti i passaggi sono stati eseguiti con agitazione in uno scuotitore orbitale con un diametro di 120 mm (165 giri / min) a 25 °C se non diversamente specificato. Aggiungere penna/streptococco all'1% alle soluzioni prima dell'uso. Quando si rimuovono le soluzioni, aspirare con cautela per evitare l'intrappolamento del campione nella pipetta.
- Giorno 1 - Preparare circa 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) frammenti di tessuto dalle masse muscolari epaxiali. Aggiungere 3 ml di tampone ipotonico con penna/streptococco all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e aggiungere un intero frammento di tessuto muscolare per pozzetto.
- Incubare i frammenti di tessuto in tampone ipotonico agitando per 18 ore (durante la notte) (O/N).
- Giorno 2 - Aspirare il tampone ipotonico con una pipetta a punta fine e lavare i campioni 3 x 1 h con 3 ml di 1x PBS ogni volta agitando.
- Incubare i campioni per 24 ore con 3 ml di soluzione detergente SDS allo 0,05% agitando.
NOTA: (PUNTO DI CONTROLLO) Dopo l'incubazione SDS, i campioni dovrebbero avere un aspetto trasparente. I campioni mostrano una consistenza simile alla gelatina e sono, quindi, più inclini ad aderire alla pipetta quando si rimuovono i liquidi.
- Incubare i campioni per 24 ore con 3 ml di soluzione detergente SDS allo 0,05% agitando.
- Giorno 3 - Rimuovere la soluzione detergente SDS con una pipetta a punta fine e lavare i frammenti di tessuto 3 x 20 minuti con 3 ml di tampone ipotonico ogni volta agitando.
NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I campioni possono essere conservati in tampone di lavaggio ipotonico a 4 °C per 18 ore (O/N). Assicurarsi che la SDS sia ben rimossa durante le fasi di lavaggio, poiché la SDS residua può essere citotossica.- Incubare i frammenti di tessuto per 3 ore con 2 mL di soluzione di DNasi agitando a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione di DNasi utilizzando una pipetta a punta fine e lavare i frammenti di tessuto 3 x 20 minuti con 3 ml di 1x PBS ogni volta agitando. Infine, lavare O/N agitando (60 rpm).
NOTA: Dopo il trattamento con DNasi, i dECM diventano appiccicosi a causa della presenza di residui di DNA. Pertanto, è necessario un lavaggio accurato. - Conservare i dECM in 1x PBS con penna/streptococco all'1% a 4 °C fino alla ricellularizzazione (<1 settimana). Per altri usi, conservare a -80 °C.
4. Valutazione della qualità della decellularizzazione
NOTA: La quantificazione del DNA, la colorazione DAPI/verde metile e la colorazione con falloidina sono state eseguite per valutare la presenza di contenuti cellulari residui dopo la decellularizzazione. Sono state condotte analisi immunoistochimiche e western blot per valutare la ritenzione delle proteine chiave della ECM dopo la decellularizzazione.
- Quantificazione del DNA presente nella dECM
NOTA: I dECM devono essere confrontati con il tessuto nativo per rilevare la presenza di DNA.- Prima della decellularizzazione, pesare una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml su una bilancia digitale ad alta precisione. Prima di trasferire il campione muscolare al tubo, rimuovere tutto il restante 1x PBS usando un tovagliolo di carta. Pesare il tubo con il campione. Calcolare il peso umido dei campioni utilizzando l'equazione (1):
Peso umido del campione = tubo di pesocon campioni - pesotubo vuoto (1) - Decellularizzare i campioni seguendo il protocollo descritto nella sezione 3.
- Posizionare i campioni in provette da microcentrifuga da 2 ml.
NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C fino all'estrazione e alla quantificazione del DNA. - Eseguire l'estrazione del DNA dei dECM e dei campioni di tessuto nativo utilizzando un kit basato su colonna di spin. Aggiungere il tampone di digestione secondo le istruzioni del produttore.
- Omogeneizzare i campioni in un mulino a perline due volte per 2,5 minuti ogni volta (capovolgendo i supporti) utilizzando un cordone di carburo di tungsteno per tubo (utilizzare supporti per tubi refrigerati).
- Aggiungere la proteinasi K e incubare O/N agitando lentamente a 56 °C.
- Procedere con il protocollo come descritto nelle istruzioni del produttore.
- Eluire con il tampone fornito dal produttore e centrifugare 2 x 1 min a ≥6.000 x g, ogni volta a 4 °C per aumentare la resa del DNA.
NOTA: il DNA può essere conservato a -20 °C fino alla quantificazione. - Quantificare il DNA presente nei campioni utilizzando un kit di rilevamento dsDNA fluorescente seguendo le istruzioni del produttore.
- Normalizzare il contenuto di DNA come nanogrammi di DNA per milligrammo di peso umido originale del campione.
- Analizzare i dati utilizzando un test t di Student a due code ed esprimere come media ± errore standard della media (SEM).
- Prima della decellularizzazione, pesare una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml su una bilancia digitale ad alta precisione. Prima di trasferire il campione muscolare al tubo, rimuovere tutto il restante 1x PBS usando un tovagliolo di carta. Pesare il tubo con il campione. Calcolare il peso umido dei campioni utilizzando l'equazione (1):
- Immunoistochimica
NOTA: le soluzioni 1, 2 e 3 e la soluzione fissativa devono essere preparate prima dell'uso e possono essere conservate congelate per un massimo di 6 mesi. Tutti gli anticorpi e i coloranti utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati in Tabella 1.- Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione fissativa aggiungendo 2 g di paraformaldeide (PFA), 8 g di saccarosio e 24 μL di 1 M CaCl 2 a 77 ml di 0,2 M Na 2 HPO 4 e 23 ml di 0,2 M NaH2 PO 4, ad un volume finale di 200 mL aggiungendo dH2 O. Regolare ilpH a7,4.
- Preparare un tampone fosfato 0,12 M aggiungendo 13,5 g di Na 2 HPO 4 e 3,2 g di NaH 2 PO 4 a 1 L didH2O. Regolare il pH a7,4.
- Preparare la soluzione 1 aggiungendo 4 g di saccarosio a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M.
- Preparare la soluzione 2 aggiungendo 15 g di saccarosio a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M.
- Preparare la soluzione 3 aggiungendo 15 g di saccarosio e 7,5 g di gelatina a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M. Riscaldare a 37 °C fino a quando la gelatina non si scioglie.
- Preparare la soluzione madre verde metile (polvere verde metile al 2% disciolta in dH2O)19.
- Immunorilevazione
- Fissare i campioni con la soluzione fissativa per almeno 4 ore a 4 °C.
- Lavare i campioni 2x per 10 minuti con 1x PBS.
- Conservare O/N, o più di 1 giorno, in soluzione 1 a 4 °C.
- Lavare e conservare O/N o più di 1 giorno in soluzione 2 a 4 °C. Lasciare riscaldare i campioni a RT.
- Incubare per 3 ore in soluzione 3 a 37 °C. Conservare la soluzione supplementare 3 a 37 °C da utilizzare in seguito.
- Stampo piccoli (2 cm x 1 cm x 1 cm) contenitori in foglio di alluminio. Posizionare un sottile strato di soluzione 3 nel contenitore stampato e lasciarlo fissare. Posizionare i campioni sulla soluzione solidificata 3 e coprire con la soluzione calda 3. Orientare i campioni e lasciarli solidificare. Contrassegnare la posizione sulla soluzione solidificata 3 con una penna colorata.
- Congelare posizionando i contenitori sulla superficie dell'isopentano secco refrigerato con ghiaccio o azoto liquido.
- Utilizzando il composto O.C.T. con temperatura di taglio ottimale, fissare i cubetti di gelatina congelati contenenti i campioni al supporto del criostato.
- Sezionare i cubetti di gelatina congelati e trasferire le sezioni di tessuto sui vetrini. Lasciateli asciugare per 60 min.
- Utilizzare un marcatore idrofobo per tracciare una linea attorno alle sezioni.
- Lavare i vetrini 3 x 10 minuti in 1x PBS.
- Coprire le sezioni con albumina sierica bovina (BSA) all'1%, siero di capra all'1% e Triton X-100 allo 0,05% diluito in 1x PBS (soluzione bloccante) per 30 minuti (fase di blocco).
- Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante e coprire le sezioni. Incubare O/N a 4 °C in una scatola chiusa, con carta umida, per evitare che le sezioni si secchino.
- Lavare i vetrini 3 x 10 minuti con 1x PBS.
- Diluire gli anticorpi secondari in soluzione bloccante e coprire le sezioni. Incubare per 1,5 ore a RT al buio.
NOTA: Evitare l'esposizione alla luce per prevenire la degradazione dei fluorofori. - Lavare i vetrini 3 x 10 minuti con 4x PBS.
NOTA: una maggiore concentrazione di PBS può essere utilizzata quando è presente uno sfondo forte. - Immergere i vetrini in soluzione DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-ottano in 0,1% Triton X-100/1x PBS) per 30 s ciascuno.
- Risciacquare in 1x PBS.
- Montare le sezioni in mezzo anti-sbiadimento (50 mg/mL di n-propil-gallato in 1x PBS:glicerolo [1:9]) e sigillare con un vetrino. Conservare a 4 °C fino all'osservazione e all'acquisizione dell'immagine in un microscopio a fluorescenza20.
NOTA: Per gli esperimenti di immunoistochimica in toto, è stato utilizzato lo stesso protocollo (vedere i punti 4.2.2.12-4.2.2.18), tranne che i campioni sono stati precedentemente fissati in PFA al 4% diluito in 1x PBS per 3 ore a RT. La colorazione del DNA è stata eseguita aggiungendo verde metile alla soluzione anticorpale secondaria. Tutti gli anticorpi e i coloranti utilizzati, e le rispettive diluizioni, sono elencati nella Tabella 1. I campioni sono stati quindi montati in mezzo anti-sbiadimento tra due vetrini separati da anelli di acciaio, incollati insieme con cera d'api, e sono state acquisite pile di immagini da 100 μm utilizzando un microscopio confocale21.
- Preparazione delle soluzioni
- Analisi Western blot
NOTA: Tutti gli anticorpi utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati in Tabella 1.- Preparazione delle soluzioni
- Preparare il tampone di carico 2x SDS-PAGE aggiungendo 20 ml di glicerolo, 4 g di SDS e 0,2 ml di blu di bromofenolo a 80 ml di soluzione base Tris da 100 mM. Regolare il pH a 6,8. Aggiungere ditiotreitolo fresco (DTT) prima dell'uso.
- Preparare il tampone di lavaggio salino tamponato Tris con soluzione Tween 20 (TBST) aggiungendo 2,4 g di base Tris, 8,8 g di NaCl e 1 ml di Tween-20 a dH2O a un volume finale di 1 L. Regolare il pH a 7,4-7,6 utilizzando HCl.
- Preparare il tampone di corsa 10x (RB) aggiungendo 30,2 g di Tris base, 144,2 g di glicina e 10 g di SDS a 1 L di dH2O. Prima dell'uso, aggiungere 100 mL di 10x RB a 900 mL di dH2O per preparare 1x RB (soluzione di lavoro).
NOTA: mentre 10x RB può essere memorizzato in RT per diversi mesi, 1x RB può essere riutilizzato su diverse esecuzioni. - Preparare il tampone di trasferimento (TB) aggiungendo 5,82 g di Tris base, 2,93 g di glicina e 0,5 g di SDS a 800 mL di dH2O. Dopo aver sciolto i componenti, aggiungere 200 ml di metanolo. Raffreddare a 4 °C.
NOTA: La tubercolosi deve essere preparata al momento prima di ogni utilizzo.
- Estrazione di proteine
- Raccogliere i muscoli epaxiali dai topi E18.5 e posizionarli immediatamente in una provetta di microcentrifuga (2 ml) contenente 2 tampone di carico SDS-PAGE con DTT appena aggiunto (100 mM DTT). Elabora E18.5 dECM allo stesso modo.
- Aggiungere un cordone in carburo di tungsteno per tubo. Omogeneizzare 2 volte in un mulino per perline per 2,5 minuti ogni volta (capovolgere i supporti).
- Sonicare i campioni per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni.
- Riscaldare i campioni per 10 minuti a 50 °C.
- Centrifugare i campioni a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Quantificare la proteina utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
- Conservare a -20 °C fino a ulteriore utilizzo.
- Elettroforesi su gel di poliacrilammide
- Utilizzare gel prefabbricato con gradiente acrilammidico (4% -20%)
- Montare il gel nel serbatoio di elettroforesi. Rimuovere accuratamente il pettine. Aggiungere 1x RB fino alla linea visualizzata nel serbatoio di elettroforesi. Assicurati che i pozzi siano pieni di RB.
- Caricare 100 μg di proteine per campione nei pozzetti. Carico 12 μL di proteine standard ad alto peso molecolare.
- Funzionamento per un totale di 100 minuti con tensione costante (10 min a 150 V e 90 min a 185 V).
- Trasferimento
- Immergere i tamponi filtranti e le spugne con TB refrigerata (4 °C) mentre il gel è in funzione.
- Tagliare le membrane di difluoruro di polivinilidene alla dimensione del gel. Attivarli con metanolo e lavare con dH2O. Immergere nella tubercolosi.
- Montare la cassetta di trasferimento con le spugne, i cuscinetti filtranti, i gel e le membrane attivate secondo le istruzioni del produttore.
- Posizionare la cassetta nel serbatoio di elettroforesi contenente la TB refrigerata (su un letto di ghiaccio). Aggiungere l'unità di raffreddamento. Correre per 90 minuti a 100 V.
- Dopo il trasferimento, colorare con un sostituto blu Coomassie per valutare la qualità del trasferimento.
- Immunorilevazione
- Preparare la soluzione bloccante (TBST con latte magro al 5%). Incubare le membrane con agitazione per 1 ora a RT.
- Risciacquare 3 x 5 s con TBST.
- Incubare le membrane O/N con gli anticorpi primari diluiti in TBST con 2% BSA e 0,02% di azoturo di sodio (3 mL per membrana) in una camera fredda (4 °C) agitando.
- Il giorno successivo, lavare 3 x 5 minuti con TBST.
- Incubare le membrane con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluiti in TBST con latte magro al 5% (5 ml per ogni membrana) per 1 ora a RT.
- Lavare le membrane con TBST 3 x 5 min. Conservare in TBST fino alla fase di rilevamento.
- Visualizza la proteina utilizzando un kit di sviluppo disponibile in commercio. Aggiungere i reagenti di rilevamento secondo le istruzioni del produttore. Acquisisci immagini delle band.
- Per testare più di un anticorpo per membrana, dopo la fase di rilevazione, rimuovere gli anticorpi precedenti con tre lavaggi (5 minuti ciascuno) utilizzando TBST e ripetere i passaggi 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Preparazione delle soluzioni
Tabella 1: Anticorpi e coloranti utilizzati nell'immunoistochimica e nell'analisi western blot e nelle rispettive diluizioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.10,22
5. Coltura cellulare in matrici decellularizzate
NOTA: Tutte le tecniche sono state eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Tutte le incubazioni sono state eseguite a 37 °C e con il 5% di CO2.
- Preparare il terreno di coltura cellulare, Modified Eagle Medium ad alto contenuto di glucosio Dulbecco con glutammina stabile e con piruvato di sodio (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penna/streptococco (terreno di coltura completo).
- Posizionare i dECM in una capsula di Petri in 1x PBS con penna/streptococco all'1% in una cappa a flusso laminare e separarli in pezzi di circa 500 μm x 500 μm x 250 μm, usando un microbisturi e una pinzetta.
NOTA: i dECM hanno una consistenza morbida, e quindi è spesso più facile usare una pinzetta per separarli in pezzi approssimativamente delle stesse dimensioni invece di tagliarli con il micro bisturi. - Trasferire i frammenti in una piastra da 96 pozzetti (tre o quattro pezzi per pozzetto) con 200 μL di terreno di coltura completo, precedentemente riscaldato a 37 °C. Incubare per 2 ore nell'incubatore.
- Aggiungere 500 μL di tripsina a un matraccio T25 seminato con cellule C2C12 subconfluenti (~70%). Risospendere in 1 mL di terreno completo.
- Aggiungere 10 μL della risospensione a 10 μL di colorante blu Trypan e caricare in un emocitometro. Contare e calcolare il numero di celle e confermare la vitalità della cella.
- Aspirare il terreno dalla piastra a 96 pozzetti contenente i dECM e aggiungere 200 μL di terreno di coltura completo contenente 50.000 cellule vitali C2C12.
- Incubare per 2 giorni e poi, utilizzando una pinzetta, trasferire i dECM (con le cellule) su una piastra da 48 pozzetti con 400 μL di terreno di coltura completo. Ogni 2 giorni, aspirare con cura il terreno con una micropipetta per evitare che i dECM si stacchino dal fondo del pozzetto e aggiungere terreno fresco fino al giorno 8.
NOTA: Le matrici vengono conservate per 2 giorni in piastre a 96 pozzetti per promuovere l'adesione delle cellule C2C12 ai dECM e vengono quindi trasferite su una piastra a 48 pozzetti per consentire l'accesso a un volume maggiore di terreno con sostanze nutritive. I dECM dovrebbero aderire al fondo dei pozzi. - Per l'esperimento di differenziazione, sostituire il terreno di coltura completo con terreno di differenziazione (DMEM integrato con siero di cavallo al 2% e penna/streptococco all'1%, seguito dall'incubazione nel terreno di differenziazione per 4 giorni fino al giorno 12.
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Representative Results
L'obiettivo del protocollo di decellularizzazione è quello di produrre dECM che assomiglino molto alla composizione del tessuto nativo. Per determinare l'efficacia del processo di decellularizzazione, sono stati impiegati vari metodi, tra cui l'esame della morfologia dei tessuti, la misurazione dei livelli di DNA, la colorazione per F-actina e l'analisi dei componenti chiave della ECM utilizzando l'immunoistochimica e le tecniche di western blotting. In particolare, sono stati analizzati cinque principali componenti ECM dei tessuti muscolari scheletrici.
Durante tutto il protocollo, l'aspetto dei campioni cambia (Figura 1B 1-4). Dopo l'isolamento, il tessuto muscolare appare rossastro a causa della presenza di mioglobina (Figura 1B1). Dopo l'incubazione nel tampone ipotonico, che lisa le cellule e rimuove la maggior parte delle proteine citoplasmatiche, i campioni diventano bianchi (Figura 1B2). SDS, un detergente anionico comunemente usato nella decellularizzazione dei tessuti12, rimuove efficacemente il materiale citoplasmatico e nucleare, nonché le membrane. Di conseguenza, i campioni diventano più trasparenti dopo il trattamento SDS (Figura 1B3). Tuttavia, alte concentrazioni o esposizione prolungata a questo detergente possono causare denaturazione delle proteine, perdita di glicosaminoglicani e rottura delle fibre di collagene12. L'equilibrio ottimale tra rimozione cellulare e conservazione della ECM viene raggiunto utilizzando SDS allo 0,05% per 24 ore, come mostrato in Figura 2 e Figura 3. Infine, il DNA viene rimosso attraverso il trattamento con DNasi, ottenendo scaffold dECM trasparenti leggermente più piccoli rispetto al trattamento con SDS (Figura 1B4).
Il successo del protocollo di decellularizzazione è indicato dalla quantità di DNA residuo presente nelle matrici dopo il processo. La quantificazione del DNA rivela una diminuzione di quasi il 100% dei dECM rispetto al tessuto nativo (Figura 1C). La colorazione DAPI conferma anche l'assenza di DNA nei dECM (Figura 2B,D,F,H,J).
La presenza di cinque principali proteine ECM è stata valutata mediante immunoistochimica e western blot dopo decellularizzazione e confrontata con il tessuto nativo. L'immunocolorazione per la subunità α2 della laminina (Figura 2A,B) e le laminine totali (Figura 2C,D) mostra che i dECM mostrano una colorazione tubolare per queste proteine (frecce in Figura 2B,D), simile alla matrice di laminina che circonda i miotubi nel tessuto nativo (frecce in Figura 2A,C). L'analisi Western blot per la subunità della laminina α2 rivela la presenza di due bande nel tessuto nativo (Figura 2A'), mentre tre bande, con un peso molecolare inferiore al previsto, possono essere rilevate nel dECM (Figura 2B'). Questo può essere il risultato della degradazione o della rimozione delle proteine durante il processo di decellularizzazione. L'analisi Western blot per le laminine totali mostra una certa frammentazione di queste proteine nel dECM rispetto ai campioni provenienti dal tessuto nativo (Figura 2C',D').
Figura 1: Procedura di decellularizzazione del muscolo scheletrico fetale e valutazione della morfologia tissutale e del contenuto di DNA. (A) Rappresentazione schematica del protocollo di decellularizzazione. (B) Morfologia tissutale in tutto il protocollo, dal tessuto appena raccolto a quello decellularizzato. Barra della scala = 1 mm. (C) Quantificazione del DNA presente nei dECM rispetto al tessuto nativo. Dati espressi come media ± SEM. Test t di Student, a due code **p < 0,01. Il protocollo di decellularizzazione rimuove efficacemente il contenuto nucleare che produce dECM acellulari. Abbreviazioni: dECMs = matrici decellularizzate; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; SDS = sodio dodecilsolfato; NT = tessuto nativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'immunocolorazione per fibronectina (Figura 2E,F) e collagene I (Figura 2G,H) mostra la presenza di queste proteine nello spazio interstiziale tra le cellule nel tessuto nativo (frecce in Figura 2E,G) e una colorazione simile nei dECM (frecce Figura 2F,H). L'analisi Western blot mostra bande simili per la fibronectina in entrambe le condizioni (Figura 2E',F'), indicando che questa proteina non è particolarmente influenzata dal processo di decellularizzazione. Tuttavia, nel caso del collagene I (Figura 2G',H') ci sono meno bande nei dECM, indicando un certo grado di degradazione. L'immunocolorazione per il collagene IV mostra un modello di colorazione tubolare nel tessuto nativo (freccia nella Figura 2I) e una colorazione simile nel dECM, sebbene le strutture tubolari siano più strette (freccia nella Figura 2J). L'analisi Western blot per il collagene IV rivela la presenza di tre bande nel tessuto nativo (Figura 2I'). Mentre le stesse tre bande sono osservate nei dECM (Figura 2J'), il peso molecolare di questi è inferiore al previsto. Analogamente alla laminina α2, questo può essere il risultato della degradazione o della rimozione delle proteine durante la decellularizzazione.
I dECM vengono quindi seminati con mioblasti C2C12 e coltivati per 8 giorni in terreno di coltura completo. Le cellule C2C12 colonizzano i dECM e proliferano, come mostrato dalla colorazione nucleare del fosfo-istone 3 (frecce in Figura 3A). Dopo altri 4 giorni di coltura nel mezzo di differenziazione, le cellule C2C12 si differenziano e si fondono in miotubi multinucleati (frecce blu in Figura 3B) che esprimono una catena pesante di miosina (linea tratteggiata in Figura 3B). È interessante notare che la colorazione intracellulare e / o pericellulare per la catena α2 della laminina (frecce gialle in Figura 3C, D), le laminine totali (freccia magenta in Figura 3C) e la fibronectina (freccia magenta in Figura 3D) possono essere rilevate nelle cellule C2C12 coltivate in terreno di coltura completo, suggerendo che queste cellule sono in grado di sintetizzare queste proteine ECM de novo., contribuendo così alla formazione della loro nicchia. Questi risultati dimostrano che il protocollo di decellularizzazione genera un microambiente dECM in cui i mioblasti C2C12 possono proliferare, differenziarsi e formare miotubi multinucleati.
Figura 2: Valutazione di cinque proteine ECM nel tessuto muscolare fetale E18.5 nativo rispetto a quello decellularizzato. Immunoistochimica su sezioni di tessuto nativo (A,C,E,G,I) e colorazione di dECM (B,D,F,H,J) con DAPI, un marcatore del DNA, falloidina che rileva F-actina, e per proteine ECM. Barra della scala = 15 μm. Nel tessuto nativo, l'immunocolorazione per laminine e collagene IV è presente intorno alle miofibre (A, C, I; frecce gialle) e la colorazione per fibronectina e collagene I è rilevata nello spazio interstiziale tra miofibre (E, G; frecce gialle). Nei dECM, la colorazione per laminine e collagene IV (B, D, J; frecce gialle) mostra un modello tubolare, che circonda gli spazi lasciati dalle miofibre dopo la decellularizzazione. L'immunocolorazione di fibronectina e collagene I delle dECM è coerente con la loro presenza nello spazio interstiziale (F,H; frecce gialle). (A'-J') Analisi Western blot per cinque proteine ECM in tessuti nativi (A',C',E',G',I') e in campioni di dECM (B',D',F',H',J'). Entrambi gli approcci mostrano la conservazione delle proteine dopo la decellularizzazione. Gli anticorpi utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati nella Tabella 1. Abbreviazioni: LNα2 = catena laminina α2; LNp = laminine panmuscolari; FN = fibronectina; Col I = collagene I; Col IV = collagene IV; MHC = catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: ricellularizzazione dECM con una linea cellulare di mioblasti (mioblasti C2C12). (A) Proiezione di massima intensità di un'immagine confocale di una pila di 100 μm di matrice ricellularizzata, colonizzata con cellule C2C12 marcate con DNA colorante verde metile, falloidina che rileva F-actina e anticorpo anti-pH3, un marcatore di proliferazione (frecce magenta). Barra di scala = 35 μm. (B) Proiezione di massima intensità di un'immagine confocale di una pila di 100 μm che mostra un miotubo multinucleato (frecce blu indicano i nuclei) miosina pesante positiva a catena (linea tratteggiata) formatosi durante la coltura. Barra della scala = 35 μm. (C,D) Immagine confocale immunoistochimica che mostra la colorazione intra- o peri-cellulare per la catena α2 della laminina (frecce gialle), le laminine totali (frecce magenta in C) e la fibronectina (frecce magenta in D) nei mioblasti, suggerendo la sintesi proteica de novo. Barra della scala = 10 μm. Gli anticorpi utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati nella Tabella 1. Abbreviazioni: pH3 = fosfo-istone 3; LNα2 = catena α2 della laminina; LNp = laminine panmuscolari; FN = fibronectina; MHC = catena pesante della miosina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La ECM è una complessa rete di macromolecole che è presente in tutti i tessuti e svolge un ruolo cruciale nella regolazione del comportamento e della funzione cellulare2. L'ECM agisce come un'impalcatura fisica a cui le cellule possono attaccarsi e fornisce segnali che modulano attivamente i processi cellulari come proliferazione, motilità, differenziazione e apoptosi. Pertanto, una corretta formazione e mantenimento della ECM è essenziale sia per lo sviluppo che per l'omeostasi1.
Mentre i modelli di coltura cellulare 2D sono stati ampiamente utilizzati, vengono sempre più sostituiti da piattaforme 3D più avanzate. Questo perché le colture 2D mancano dei segnali chimici e fisici che influenzano il comportamento cellulare, mentre le colture 3D sono considerate un'alternativa più realistica per studiare le dinamiche molecolari e cellulari nei tessuti nativi11. La decellularizzazione dei tessuti si traduce nella produzione di scaffold che imitano più da vicino i microambienti dei tessuti biologici, come dimostrato in una serie di studi su vari sistemi di tessuti o organi 14,15,23,24,25. La capacità dei dECM di replicare microambienti tissutali nativi ha un grande potenziale per la ricerca sullo sviluppo normale, vari stati patologici e l'effetto di farmaci o tossine sui tessuti11.
Il protocollo utilizzato in questo studio si basa sul protocollo sviluppato da Silva et al. per decellularizzare il tessuto cardiaco fetale14 come punto di partenza. Prevede una combinazione di un tampone ipotonico, un trattamento con un detergente anionico (SDS) e un trattamento con DNasi. Una delle principali sfide nei protocolli di decellularizzazione è trovare un equilibrio tra la rimozione delle cellule e la conservazione della composizione proteica della ECM. Data la nostra attenzione all'utilizzo di questo sistema di coltura cellulare 3D per studiare le prime fasi di LAMA2-CMD, è stata prestata particolare attenzione alla conservazione della laminina 211 durante la decellularizzazione. Il protocollo di Silva et al.14 ha portato alla perdita di immunoreattività della catena α2 della laminina nei muscoli fetali decellularizzati; ciò potrebbe essere dovuto alla concentrazione di SDS utilizzata. Pertanto, sono state testate alternative alla fase della soluzione detergente SDS allo 0,2%, come concentrazioni più basse di SDS (0,1%, 0,05% e 0,02%) e la sostituzione di SDS con diverse concentrazioni di Triton X-100 (0,5% e 0,2%). I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando il trattamento detergente SDS allo 0,05% per 24 ore. Questa concentrazione ha rimosso efficacemente il contenuto cellulare preservando l'immunoreattività della catena α2 della laminina dopo la decellularizzazione. Questo protocollo produce in modo riproducibile dECM acellulari privi di residui cellulari, incluso il DNA.
Il protocollo utilizzato in questo studio preserva sia le proteine della matrice interstiziale (fibronectina e collagene I) che le proteine della membrana basale (laminine e collagene IV). Studi futuri dovrebbero valutare se anche il collagene VI è conservato, poiché è anche un attore nelle distrofie muscolari26. È noto che la SDS può interrompere l'ultrastruttura proteica e danneggiare i collageni12; per il muscolo scheletrico fetale, era importante utilizzare una bassa concentrazione di SDS (0,05%) per mantenere l'immunoreattività della laminina α2. Tuttavia, i risultati del western blot mostrano che i campioni decellularizzati mostrano più bande dopo l'immunorilevazione di laminine e collageni rispetto al tessuto nativo, indicando che una certa degradazione proteica si è verificata come risultato del processo di decellularizzazione27.
È importante sottolineare che gli esperimenti di ricellularizzazione dimostrano che queste matrici sono scaffold affidabili che supportano costantemente l'adesione, la proliferazione e la differenziazione cellulare. La SDS è stata segnalata come citotossica28, e quindi le fasi di lavaggio incluse nel protocollo sono cruciali se le matrici devono essere utilizzate per la ricellularizzazione. Questi scaffold sono stati efficacemente colonizzati da cellule C2C12, indicando la loro idoneità come sistema modello per la coltura 3D delle cellule. L'osservazione della colorazione intracellulare e pericellulare per le proteine ECM che circondano le cellule C2C12 suggerisce inoltre che le cellule stanno contribuendo attivamente al loro microambiente all'interno dei dECM. Inoltre, quando collocate nel mezzo di differenziazione, le cellule C2C12 si differenziano, si fondono e formano miotubi all'interno dei dECM.
Una sfida significativa in questa procedura è la manipolazione dei campioni in tutto il protocollo. I campioni sono molto piccoli e morbidi, richiedono cura e abilità nella manipolazione per evitare l'intrappolamento nella pipetta a punta fine e la perdita dei campioni. I migliori risultati si ottengono quando si inizia il protocollo con tessuto fresco. L'uso di campioni congelati e conservati può impedire la rimozione del contenuto cellulare e portare ad una maggiore degradazione delle proteine, ostacolando il rilevamento delle proteine e riducendo l'efficienza di decellularizzazione.
Solo pochi studi hanno riportato la decellularizzazione dei tessuti fetali 15,29,30,31. In particolare, per quanto riguarda la decellularizzazione del muscolo scheletrico fetale, solo uno studio precedente ha riportato la decellularizzazione di campioni compositi di derma, tessuto sottocutaneo e pannicolo carnosus31. Per quanto a conoscenza degli autori, questa è la prima volta che è stato stabilito un protocollo di decellularizzazione per il muscolo scheletrico fetale isolato del topo. Questo protocollo può servire come base per la creazione di protocolli simili per i tessuti muscolari fetali di altre specie, come maiali e umani13.
L'attuale protocollo per la decellularizzazione del muscolo scheletrico del topo E18.5 è molto simile alla procedura di Silva et al.14, che lo ha applicato a un cuore di topo E18. L'unica differenza è la concentrazione di SDS utilizzata, che è notevolmente inferiore a quella utilizzata per il cuore fetale (0,05% vs 0,2%), probabilmente a causa delle diverse proprietà fisiche di questi due tessuti fetali.
Lo sviluppo di questo modello in vitro non solo consente lo studio dei processi coinvolti nel normale sviluppo muscolare fetale, ma consente anche lo studio parallelo di distrofie muscolari e miopatie ad esordio precoce, come LAMA2-CMD, che si manifesta come un difetto di miogenesi a E18.5 nel modello murino dyW 10. Tuttavia, va notato che questo sistema è limitato in quanto include solo la ECM e le cellule muscolari e non contiene altri tipi di cellule come neuroni, cellule endoteliali e fibroblasti. La rilevanza di questi ulteriori tipi di cellule può variare a seconda della malattia e possono essere necessarie modifiche al sistema di coltura per includerli. Nel complesso, l'uso di dECM come descritto in questo studio può essere applicato nello studio di varie distrofie muscolari e miopatie ad esordio precoce.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dall'Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contratto n. 23049), dal progetto MATRIHEALTH e dal finanziamento dell'unità cE3c UIDB/00329/2020. Vorremmo ringraziare il nostro donatore Henrique Meirelles che ha scelto di sostenere il progetto MATRIHEALTH. Questo lavoro ha beneficiato delle infrastrutture della Facoltà di Scienze Microscopy Facility, un nodo della piattaforma portoghese di BioImaging (riferimento PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e ringraziamo Luís Marques per la sua assistenza con l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini. Infine, ringraziamo Marta Palma per il supporto tecnico e il nostro team di ricerca per il loro generoso contributo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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