Summary
In dieser Arbeit wurde ein Dezellularisierungsprotokoll optimiert, um dezellularisierte Matrices des fetalen Mausskelettmuskels zu erhalten. C2C12-Myoblasten können diese Matrices besiedeln, sich vermehren und differenzieren. Mit diesem In-vitro-Modell kann das Zellverhalten im Kontext von Skelettmuskelerkrankungen wie Muskeldystrophien untersucht werden.
Abstract
Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung von Zellen und der Übertragung von Signalen, die für verschiedene zelluläre Prozesse wichtig sind. Zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle vereinfachen die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der EZM zu sehr, da das Fehlen eines vollständigen dreidimensionalen (3D) Trägers das Zellverhalten verändern kann, so dass sie für das Verständnis von In-vivo-Prozessen nicht ausreichen. Defizite in der EZM-Zusammensetzung und Zell-EZM-Interaktionen tragen wesentlich zu einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen bei.
Ein Beispiel ist die LAMA2-kongenitale Muskeldystrophie (LAMA2-CMD), bei der das Fehlen oder die Verringerung der funktionellen Laminine 211 und 221 zu einer schweren Hypotonie führen kann, die bei oder kurz nach der Geburt nachweisbar ist. Frühere Arbeiten mit einem Mausmodell der Krankheit deuten darauf hin, dass sie während der fetalen Myogenese ausbricht. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein 3D-In-vitro-Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Muskelzellen und der fetalen Muskel-EZM zu untersuchen und die native Mikroumgebung nachzuahmen. Bei diesem Protokoll werden tiefe Rückenmuskeln verwendet, die von E18.5-Mausföten präpariert und mit einem hypotonen Puffer, einem anionischen Detergens und DNase behandelt wurden. Die resultierenden dezellularisierten Matrices (dECMs) behielten alle getesteten EZM-Proteine (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) im Vergleich zum nativen Gewebe bei.
Wenn C2C12-Myoblasten auf diese dEZMs gesät wurden, drangen sie in die dEZMs ein und besiedelten sie, was ihre Proliferation und Differenzierung unterstützte. Darüber hinaus produzierten die C2C12-Zellen ECM-Proteine, die zum Umbau ihrer Nische innerhalb der dECMs beitrugen. Die Etablierung dieser In-vitro-Plattform bietet einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Entschlüsselung der Prozesse, die an der Entstehung von LAMA2-CMD beteiligt sind, und hat das Potenzial, an andere Skelettmuskelerkrankungen angepasst zu werden, bei denen Defizite in der Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind1. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelagert wird und sich direkt auf das Zellschicksalauswirkt 2. Eines der bemerkenswertesten Merkmale der EZM ist ihre funktionelle Vielfalt, da jede Gewebe-EZM eine einzigartige Kombination von Molekülen aufweist, die unterschiedliche Topologien und Eigenschaften bieten, die auf die darin enthaltenen Zellen zugeschnitten sind1.
Die Signalübertragung und Unterstützung der EZM ist entscheidend für die Entwicklung und Homöostase und kann, wenn sie gestört ist, zu multiplen pathologischen Zuständen führen 3,4. Ein Beispiel ist die LAMA2-defiziente kongenitale Dystrophie (LAMA2-CMD), die häufigste Form der angeborenen Muskeldystrophie. Das LAMA2-Gen kodiert für die Laminin-α2-Kette, die in Laminin 211 und Laminin 221 vorkommt und bei Mutation zu LAMA2-CMD 5 führen kann. Laminin 211 ist die Hauptisoform, die in der Basalmembran vorkommt, die die Skelettmuskelfasern umgibt. Wenn Laminin 211 abnormal ist oder fehlt, ist die Verbindung zwischen der Basalmembran und den Muskelzellen gestört, was zum Ausbruch der Krankheit führt6. Patienten mit LAMA2-CMD zeigen einen leichten bis schweren Phänotyp, abhängig von der Art der Mutation im LAMA2-Gen.
Wenn die Funktion des Laminin-α2-Proteins beeinträchtigt ist, kann es bei der Geburt zu einer schweren Muskelhypotonie kommen und chronische Entzündungen, Fibrose und Muskelatrophie entwickeln, was zu einer verkürzten Lebenserwartung führt. Bisher wurden keine zielgerichteten Therapien entwickelt und die therapeutischen Ansätze beschränken sich auf die Linderung der Krankheitssymptome7. Daher ist das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die an der Entstehung dieser Krankheit beteiligt sind, von entscheidender Bedeutung, um geeignete therapeutische Strategien zu entwickeln 6,8. Frühere Arbeiten mit der dy-W-Maus9, einem Modell für LAMA2-CMD, deuten darauf hin, dass der Ausbruch der Krankheit in utero beginnt, insbesondere während der fetalen Myogenese10. Ein besseres Verständnis der Entstehung des fetalen Myogenesedefekts wäre ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für LAMA2-CMD.
In-vitro-Systeme bieten eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen, aber 2D-Kulturmodellen fehlt die Komplexität nativer Gewebe. Die Dezellularisierung von Geweben erzeugt gewebe- und entwicklungsstadienspezifische azelluläre ECM-Gerüste, die im Vergleich zu 2D-Modellen und technischen/synthetischen Gerüsten die natürliche Mikroumgebung der Zellen genauer nachahmen. Dezellularisierte Matrices (dEZMs) haben das Potenzial, die molekularen und mechanischen Signale des Wirtsgewebes zu erhalten, was sie zu besseren alternativen Modellen für das Verständnis von In-vivo-Prozessen macht11.
Es gibt verschiedene Techniken, Reagenzien und Bedingungen, die für die Dezellularisierung verwendet werden können12,13. In dieser Studie wurde ein Dezellularisierungsprotokoll für das fetale Mausherz, das von Silva et al.14,15 beschrieben wurde, an die fetale Mausskelettmuskulatur angepasst und es wurde festgestellt, dass alle getesteten EZM-Komponenten (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) erhalten bleiben. Das Protokoll umfasst drei Schritte: Zelllyse durch osmotischen Schock (hypotoner Puffer), Auflösung der Plasmamembran und Proteindissoziation (0,05 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) und enzymatische Zerstörung der DNA (DNase-Behandlung). Unseres Wissens ist dies das erste etablierte Protokoll zur Dezellularisierung des fetalen Skelettmuskels der Maus.
Um dieses 3D-In-vitro-System für die Untersuchung von LAMA2-CMD zu verwenden, ist es entscheidend, die Laminin-α2-Kette nach der Dezellularisierung beizubehalten. Daher wurde ein Optimierungsprotokoll implementiert, bei dem verschiedene Detergenzien (SDS und Triton X-100) und Konzentrationen (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % und 0,5 %) getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Die optimale Wahl für die Zellentfernung und Konservierung des Laminin-α2-Proteins war 0,05 % SDS. C2C12-Zellen, eine gut etablierte Myoblasten-Zelllinie16,17, wurden verwendet, um die dEZMs zu besiedeln. Diese Zellen dringen in das dEZM ein, vermehren sich und differenzieren sich innerhalb dieser Gerüste, wobei sie neue EZM-Proteine synthetisieren. Die erfolgreiche Herstellung dieses 3D-In-vitro-Modells bietet einen neuen Ansatz zum Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die an der fetalen Myogenese und dem Auftreten von LAMA2-CMD beteiligt sind, und kann auf andere Muskelerkrankungen ausgeweitet werden, bei denen die Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen gestört ist.
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Protocol
Alle beschriebenen Methoden wurden vom Tierschutzausschuss (ORBEA) der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Lissabon und der Direção Geral de Veterinária (DGAV; Ref. 0421/000/000/2022) genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU.
1. Herstellung von Dezellularisierungspuffern und Reagenzien
Anmerkungen: Alle Lösungen, die während des Dezellularisierungsprotokolls verwendet werden, sollten durch Autoklavieren sterilisiert und bis zu 3 Monate gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.
- Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) durch Zugabe von Natriumchlorid (NaCl) bei 137 mM, Kaliumchlorid (KCl) bei 2,68 mM, Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4) bei 8,1 mM und Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat (Na 2 HPO4) bei 1,47 mM zu demineralisiertem Wasser (dH2O) her und stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein. Fügen Sie 100 ml 10x PBS zu 900 mL demineralisiertemH2Ohinzu, um 1x PBS zu erzeugen. Autoklavieren und bei Raumtemperatur (RT) lagern. Fügen Sie sterile Penicillin/Streptomycin-Stammlösung (10.000 E/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin [Pen/Streptokokken]) vor der Anwendung zu einer Endkonzentration von 1 % hinzu.
- Bereiten Sie den hypotonen Puffer vor, indem Sie 1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-Base) und 1 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 1 ldH2O(10 mM Tris-Base 0,1 % EDTA) auflösen. Verwenden Sie einen Magnetrührer, bis er sich aufgelöst hat, und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Sterilisieren Sie es durch Autoklavieren und lagern Sie es bei RT. Fügen Sie Pen/Streptokokken vor Gebrauch in einer Endkonzentration von 1% hinzu.
- Bereiten Sie den hypotonen Waschpuffer vor, indem Sie 1,21 g Trisbase in 1 LdH2O (10 mM Trisbase) auflösen. Verwenden Sie einen Magnetrührer, bis er sich aufgelöst hat, und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Autoklavieren und bei RT lagern. Fügen Sie Pen/Streptokokken vor Gebrauch zu 1% hinzu.
- Bereiten Sie die anionische Waschmittelbehandlung vor, indem Sie 0,05 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 100 ml hypotonem Waschpuffer hinzufügen, um eine 0,05%ige SDS-Behandlungslösung herzustellen. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Membranfilter. Bei RT bis zu 1 Monat lagern.
Anmerkungen: Die SDS-Lösung sollte nicht autoklaviert werden, da SDS beim Autoklavieren ausfällt und sich zersetzt. - Bereiten Sie die DNase-Behandlungslösung vor, indem Sie 1,21 g Trisbase in 0,5 ml dH2O auflösen und 1 ml 1 M Magnesiumchlorid (MgCl2) hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Autoklavieren und bei RT lagern. Fügen Sie vor Gebrauch DNase I hinzu (50 U/ml).
2. Probenentnahme
HINWEIS: In der Studie wurden Wildtyp-C57/BL6-Mäuse verwendet. Alle Techniken wurden in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Euthanasieren Sie erwachsene schwangere weibliche Mäuse am Embryonaltag (E) 18,5 der Schwangerschaft mittels Isofluran-Inhalation, gefolgt von einer Zervixluxation. Unterziehen Sie die Mäuse einer terminalen Dissektion, um die Föten zu extrahieren.
- Besprühen Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol.
- Heben Sie mit einer chirurgischen Zange und einer Schere eine Hautfalte im Unterbauch an und machen Sie einen U-förmigen Schnitt, um die Bauchhöhlefreizulegen 18.
- Sammeln Sie die Gebärmutterhörner mit den E18.5-Föten durch Durchtrennen der Eileiter und des Gebärmutterhalses und übertragen Sie sie sofort in eine Petrischale mit eiskaltem 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken18.
- Entfernen Sie die Föten schnell aus der Gebärmutter und dem extraembryonalen Gewebe und euthanasieren Sie sie durch Enthauptung mit einer Schere18.
- Übertragen Sie einen Fötus nach dem anderen in eine Petrischale mit eiskaltem 1x PBS. Entfernen Sie mit einem Stereomikroskop die Haut und schneiden Sie die Gliedmaßen ab. Schneiden Sie von der ventralen Seite den Brustkorb durch und entfernen Sie das Brustbein und die darunter liegenden Organe.
- Drehen Sie den fetalen Rumpf mit der dorsalen Seite nach oben. Entfernen Sie den zervikalen Teil der Wirbelsäule, die dorsalen Fettdepots und das Bindegewebe über der tiefen Rückenmuskulatur.
- Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um den Brustkorb zu verankern, und kratzen und lösen Sie die tiefe Rückenmuskulatur vorsichtig mit einem Mikroskalpell10 vom umgebenden Gewebe. Dieses Verfahren führt zur Isolierung von zwei Muskelstücken pro Fötus (links und rechts), die beide hauptsächlich aus dem Musculus longissimus und dem Musculus iliocostalis bestehen, wobei einige der Musculus transversospinalis und des Musculus levator costarum eingeschlossen sind.
- Lagern Sie die Muskelproben in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken bei 4 °C zur kurzfristigen Lagerung (<1 Woche) oder bei -80 °C für längere Zeiträume.
HINWEIS: Verwenden Sie frisch entnommene Proben, um beste Ergebnisse zu erzielen. Proben, die über einen längeren Zeitraum (>3 Monate) eingefroren wurden, zeigen eine geringere Dezellularisierungseffizienz und einen stärkeren Proteinabbau. Für die Dezellularisierungsexperimente wurden epaxiale Muskelmassen verwendet, aber auch andere Muskeln (z. B. Extremitätenmuskeln) können mit dem gleichen Protokoll für die Dezellularisierung verarbeitet werden.
3. Dezellularisierung der fetalen Skelettmuskulatur
HINWEIS: Alle Techniken wurden in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Eine detaillierte schematische Darstellung finden Sie in Abbildung 1A. Alle Schritte wurden, sofern nicht anders angegeben, mit Rühren in einem Orbitalschüttler mit einem Durchmesser von 120 mm (165 U/min) bei 25 °C durchgeführt. Fügen Sie den Lösungen vor der Anwendung 1% Pen/Streptokokken hinzu. Wenn Sie die Lösungen entfernen, saugen Sie vorsichtig ab, um ein Einfangen der Probe in der Pipette zu vermeiden.
- Tag 1 - Präparation von ca. 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) Gewebefragmenten aus den epaxialen Muskelmassen. Geben Sie 3 ml hypotonen Puffer mit 1 % Pen/Streptokokken in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und fügen Sie ein ganzes Muskelgewebefragment pro Well hinzu.
- Inkubieren Sie die Gewebefragmente in hypotonem Puffer unter Rühren für 18 h (über Nacht) (O/N).
- Tag 2 - Saugen Sie den hypotonen Puffer mit einer Feinpipette ab und waschen Sie die Proben 3 x 1 h mit jeweils 3 ml 1x PBS unter Rühren.
- Die Proben werden 24 h lang mit 3 ml 0,05%iger SDS-Reinigungslösung unter Rühren inkubiert.
HINWEIS: (PRÜFPUNKT) Nach der SDS-Inkubation sollten die Proben transparent aussehen. Die Proben weisen eine gelatineartige Konsistenz auf und neigen daher beim Entfernen der Flüssigkeiten eher dazu, an der Pipette zu haften.
- Die Proben werden 24 h lang mit 3 ml 0,05%iger SDS-Reinigungslösung unter Rühren inkubiert.
- Tag 3 - Entfernen Sie die SDS-Reinigungslösung mit einer Feinpipette und waschen Sie die Gewebefragmente 3 x 20 min mit jeweils 3 ml hypotonem Waschpuffer unter Rühren.
ANMERKUNG: (PAUSENPUNKT) Die Proben können 18 h (O/N) in hypotonem Waschpuffer bei 4 °C aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, dass SDS während der Waschschritte gut entfernt wird, da SDS-Reste zytotoxisch sein können.- Inkubieren Sie die Gewebefragmente 3 h lang mit 2 mL DNase-Lösung unter Rühren bei 37 °C.
- Entfernen Sie die DNase-Lösung mit einer Feinpipette und waschen Sie die Gewebefragmente 3 x 20 min mit jeweils 3 mL 1x PBS unter Rühren. Zum Schluss O/N mit Rühren (60 U/min) waschen.
HINWEIS: Nach der DNase-Behandlung werden die dECMs aufgrund des Vorhandenseins von DNA-Resten klebrig. Daher ist sorgfältiges Waschen notwendig. - Lagern Sie die dEZMs in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken bei 4 °C bis zur Rezellularisierung (<1 Woche). Für andere Zwecke bei -80 °C lagern.
4. Qualitätsbewertung der Dezellularisierung
HINWEIS: DNA-Quantifizierung, DAPI/Methylgrün-Färbung und Phalloidin-Färbung wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Restzellinhalten nach der Dezellularisierung zu bewerten. Immunhistochemie und Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um den Verbleib von Schlüsselproteinen der EZM nach der Dezellularisierung zu beurteilen.
- Quantifizierung der im dECM vorhandenen DNA
HINWEIS: Die dEZMs sollten mit dem nativen Gewebe verglichen werden, um das Vorhandensein von DNA nachzuweisen.- Vor der Dezellularisierung wird ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einer hochpräzisen Digitalwaage gewogen. Bevor Sie die Muskelprobe in das Röhrchen übertragen, entfernen Sie alle verbleibenden 1x PBS mit einem Papiertuch. Wiegen Sie das Röhrchen mit der Probe. Berechnen Sie das Nassgewicht der Proben mit Gleichung (1):
Nassgewicht der Probe =Gewichtsröhrchen mit Proben - Gewichtleeres Röhrchen (1) - Dezellularisieren Sie die Proben gemäß dem in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll.
- Legen Sie die Proben in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Die Proben können bis zur DNA-Extraktion und -Quantifizierung bei -20 °C aufbewahrt werden. - Führen Sie die DNA-Extraktion der dECMs und nativer Gewebeproben mit einem Spinsäulen-basierten Kit durch. Fügen Sie den Aufschlusspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.
- Homogenisieren Sie die Proben in einer Perlmühle zweimal für jeweils 2,5 Minuten (Umdrehen der Halterungen) mit einer Wolframkarbidperle pro Röhrchen (verwenden Sie gekühlte Röhrchenhalterungen).
- Proteinase K zugeben und O/N unter langsamem Rühren bei 56 °C inkubieren.
- Fahren Sie mit dem Protokoll fort, wie es in der Anleitung des Herstellers beschrieben ist.
- Mit dem vom Hersteller bereitgestellten Puffer eluieren und 2 x 1 min bei ≥6.000 x g zentrifugieren, jeweils bei 4 °C, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen.
HINWEIS: Die DNA kann bis zur Quantifizierung bei -20 °C gelagert werden. - Quantifizieren Sie die in den Proben vorhandene DNA mit einem fluoreszierenden dsDNA-Detektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Normalisieren Sie den DNA-Gehalt als Nanogramm DNA pro Milligramm des ursprünglichen Nassgewichts der Probe.
- Analysieren Sie die Daten mit einem zweiseitigen Student-t-Test und drücken Sie als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus.
- Vor der Dezellularisierung wird ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einer hochpräzisen Digitalwaage gewogen. Bevor Sie die Muskelprobe in das Röhrchen übertragen, entfernen Sie alle verbleibenden 1x PBS mit einem Papiertuch. Wiegen Sie das Röhrchen mit der Probe. Berechnen Sie das Nassgewicht der Proben mit Gleichung (1):
- Immunhistochemie
Anmerkungen: Die Lösungen 1, 2 und 3 sowie die Fixierlösung sollten vor Gebrauch zubereitet werden und können bis zu 6 Monate eingefroren aufbewahrt werden. Alle verwendeten Antikörper und Farbstoffe sowie die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1.- Aufbereitung von Lösungen
- Stellen Sie eine Fixierlösung her, indem Sie 2 g Paraformaldehyd (PFA), 8 g Saccharose und 24 μl 1 M CaCl 2 auf 77 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 und 23 ml0,2M NaH2 PO 4 zu einem Endvolumen von 200 mL durch Zugabe vondH2Ozugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf7,4 ein.
- Bereiten Sie 0,12 M Phosphatpuffer vor, indem Sie 13,5 g Na2 HPO4 und 3,2 gNaH2PO4 auf 1 LdH2Ozugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf7,4 ein.
- Bereiten Sie Lösung 1 zu, indem Sie 4 g Saccharose zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hinzufügen.
- Lösung 2 wird durch Zugabe von 15 g Saccharose zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hergestellt.
- Lösung 3 wird durch Zugabe von 15 g Saccharose und 7,5 g Gelatine zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hergestellt. Bei 37 °C erhitzen, bis sich die Gelatine aufgelöst hat.
- Methylgrüne Stammlösung (2%iges Methylgrünpulver, gelöst indH2O)19 herstellen.
- Immundetektion
- Fixieren Sie die Proben mit der Fixierlösung für mindestens 4 h bei 4 °C.
- Waschen Sie die Proben 2x für 10 min mit 1x PBS.
- Bewahren Sie O/N oder länger als 1 Tag in Lösung 1 bei 4 °C auf.
- Waschen und O/N oder länger als 1 Tag in Lösung 2 bei 4 °C aufbewahren. Lassen Sie die Proben auf RT erwärmen.
- 3 h in Lösung 3 bei 37 °C inkubieren. Bewahren Sie die zusätzliche Lösung 3 bei 37 °C auf, um sie später verwenden zu können.
- Kleine (2 cm x 1 cm x 1 cm) Behälter aus Alufolie formen. Geben Sie eine dünne Schicht Lösung 3 in den geformten Behälter und lassen Sie sie aushärten. Die Proben werden auf die erstarrte Lösung 3 gelegt und mit warmer Lösung 3 bedeckt. Richten Sie die Proben aus und lassen Sie sie erstarren. Markieren Sie die Stelle auf der erstarrten Lösung 3 mit einem Farbstift.
- Frieren Sie die Behälter ein, indem Sie sie auf die Oberfläche von trockeneisgekühltem oder mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan stellen.
- Fixieren Sie die gefrorenen Gelatinewürfel mit den Proben unter Verwendung der optimalen Schneidtemperatur (O.C.T.) auf der Kryostathalterung.
- Schneiden Sie die gefrorenen Gelatinewürfel und übertragen Sie die Gewebeschnitte auf die Objektträger. 60 Minuten trocknen lassen.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um eine Linie um die Abschnitte zu ziehen.
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min in 1x PBS.
- Bedecken Sie die Abschnitte mit 1 % Kälberserumalbumin (BSA), 1 % Ziegenserum und 0,05 % Triton X-100, verdünnt in 1x PBS (Blockierungslösung) für 30 min (Blockierungsschritt).
- Verdünnen Sie die primären Antikörper in Blockierlösung und decken Sie die Abschnitte ab. Inkubieren Sie O/N bei 4 °C in einer geschlossenen Box mit feuchtem Papier, um ein Austrocknen der Abschnitte zu verhindern.
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min mit 1x PBS.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Blockierlösung und decken Sie die Abschnitte ab. 1,5 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
Anmerkungen: Vermeiden Sie Lichteinstrahlung, um den Abbau von Fluorophoren zu verhindern. - Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min mit 4x PBS.
HINWEIS: Eine höhere PBS-Konzentration kann verwendet werden, wenn ein starker Hintergrund vorhanden ist. - Tauchen Sie die Objektträger für jeweils 30 s in DAPI-Lösung (5 μg/ml 1,4-Diazabicyclo-2,2,2-Oktan in 0,1 % Triton X-100/1x PBS).
- In 1x PBS ausspülen.
- Montieren Sie die Abschnitte in einem lichtbeständigen Medium (50 mg/ml n-Propylgallat in 1x PBS:Glycerin [1:9]) und verschließen Sie sie mit einem Deckglas. Bei 4 °C bis zur Betrachtung und Bildaufnahme in einem Fluoreszenzmikroskop20 lagern.
ANMERKUNG: Für die immunhistochemischen In-toto-Experimente wurde das gleiche Protokoll (siehe Schritte 4.2.2.12-4.2.2.18) verwendet, mit der Ausnahme, dass die Proben zuvor in 4% PFA, verdünnt in 1x PBS, für 3 h bei RT fixiert wurden. Die DNA-Färbung wurde durch Zugabe von Methylgrün zur sekundären Antikörperlösung durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper und Farbstoffe sowie ihre jeweiligen Verdünnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Proben wurden dann in einem lichtbeständigen Medium zwischen zwei Deckgläsern montiert, die durch Stahlringe getrennt waren, mit Bienenwachs zusammengeklebt, und es wurden 100 μm-Bildstapel mit einem konfokalen Mikroskop21 aufgenommen.
- Aufbereitung von Lösungen
- Western-Blot-Analyse
HINWEIS: Alle verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1.- Aufbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie den 2x SDS-PAGE-Ladepuffer vor, indem Sie 20 ml Glycerin, 4 g SDS und 0,2 ml Bromphenolblau zu 80 ml 100 mM Tris-Basenlösung hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein. Fügen Sie vor Gebrauch frisches Dithiothreitol (DTT) hinzu.
- Bereiten Sie den Tris-gepufferten Kochsalzlösung-Waschpuffer mit Tween-20-Lösung (TBST) vor, indem Sie 2,4 g Tris-Base, 8,8 g NaCl und 1 ml Tween-20 zu dH2O zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4-7,6 ein.
- Bereiten Sie den 10-fachen Laufpuffer (RB) vor, indem Sie 30,2 g Tris-Base, 144,2 g Glycin und 10 g SDS zu 1 l dH2O hinzufügen. Vor Gebrauch 100 ml 10x RB zu 900 ml dH2O hinzufügen, um 1x RB (Arbeitslösung) herzustellen.
HINWEIS: Während 10x RB mehrere Monate bei RT gelagert werden kann, kann 1x RB für verschiedene Läufe wiederverwendet werden. - Bereiten Sie den Transferpuffer (TB) vor, indem Sie 5,82 g Trisbase, 2,93 g Glycin und 0,5 g SDS zu 800 mldH2Ohinzufügen. Nachdem die Komponenten aufgelöst sind, fügen Sie 200 ml Methanol hinzu. Bei 4 °C kalt stellen.
HINWEIS: Der TB sollte vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden.
- Protein-Extraktion
- Sammeln Sie epaxiale Muskeln von E18.5-Mäusen und legen Sie sie sofort in ein Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml), das 2x SDS-PAGE-Ladepuffer mit frisch zugegebenem DTT (100 mM DTT) enthält. Verarbeiten Sie E18.5 dECM auf die gleiche Weise.
- Fügen Sie eine Wolframkarbidperle pro Rohr hinzu. 2x in einer Perlmühle jeweils 2,5 min homogenisieren (Halterungen umdrehen).
- Beschallen Sie die Proben 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad.
- Die Proben werden 10 min bei 50 °C erhitzt.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Quantifizieren Sie das Protein mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer.
- Bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
- Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- Verwenden Sie vorgefertigtes Acrylamid-Gradientengel (4%-20%)
- Montieren Sie das Gel im Elektrophoresetank. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig. Fügen Sie 1x RB hinzu, bis die Linie im Elektrophoresebehälter angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen mit RB gefüllt sind.
- Laden Sie 100 μg Protein pro Probe in die Vertiefungen. Laden Sie 12 μl hochmolekularen Proteinstandard.
- Insgesamt 100 min mit konstanter Spannung laufen lassen (10 min bei 150 V und 90 min bei 185 V).
- Übertragung
- Tränken Sie die Filtermatten und Schwämme mit gekühltem TB (4 °C), während das Gel läuft.
- Schneiden Sie die Polyvinyliden-Difluorid-Membranen auf die Größe des Gels zu. Aktivieren Sie sie mit Methanol und waschen Sie sie mit dH2O. In TB einweichen.
- Montieren Sie die Transferkassette mit den Schwämmen, Filtermatten, Gelen und aktivierten Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Legen Sie die Kassette in den Elektrophoresebehälter mit dem gekühlten TB (auf ein Eisbett). Fügen Sie die Kühleinheit hinzu. 90 Minuten bei 100 V laufen lassen.
- Nach dem Transfer mit einem Coomassie-Blau-Ersatz färben, um die Transferqualität zu beurteilen.
- Immundetektion
- Bereiten Sie die Blockierlösung vor (TBST mit 5% fettarmer Milch). Inkubieren Sie die Membranen unter Rühren für 1 h bei RT.
- 3 x 5 s mit TBST ausspülen.
- Inkubieren Sie die Membranen O/N mit den in TBST verdünnten Primärantikörpern mit 2 % BSA und 0,02 % Natriumazid (3 ml pro Membran) in einer Kältekammer (4 °C) unter Rühren.
- Am nächsten Tag 3 x 5 min mit TBST waschen.
- Die Membranen werden mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern, die in TBST mit 5%iger fettarmer Milch (5 ml für jede Membran) verdünnt wurden, für 1 h bei RT inkubiert.
- Waschen Sie die Membranen mit TBST 3 x 5 min. Bleiben Sie bis zum Erkennungsschritt in TBST.
- Visualisieren Sie das Protein mit einem handelsüblichen Entwicklungskit. Fügen Sie Nachweisreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Erfassen Sie Bilder der Bands.
- Um mehr als einen Antikörper pro Membran zu testen, werden die ehemaligen Antikörper nach dem Nachweisschritt mit drei Waschgängen (je 5 Minuten) mit TBST abgestreift und die Schritte 4.3.5.2 bis 4.3.5.7 wiederholt.
- Aufbereitung von Lösungen
Tabelle 1: Antikörper und Farbstoffe, die in der Immunhistochemie und Western-Blot-Analyse verwendet werden, und die entsprechenden Verdünnungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.10,22
5. Zellkultur in dezellularisierten Matrices
HINWEIS: Alle Techniken wurden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Alle Inkubationen wurden bei 37 °C und 5% CO2 durchgeführt.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium mit hohem Glukosegehalt mit stabilem Glutamin und Natriumpyruvat (DMEM) vor, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Pen/Streptokokken (komplettes Nährmedium).
- Legen Sie die dECMs in eine Petrischale in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken in eine Laminar-Flow-Haube und trennen Sie sie mit einem Mikroskalpell und einer Pinzette in Stücke von ca. 500 μm x 500 μm x 250 μm.
HINWEIS: dECMs haben eine weiche Textur und daher ist es oft einfacher, sie mit einer Pinzette in ungefähr gleich große Stücke zu trennen, anstatt sie mit dem Mikroskalpell zu schneiden. - Die Fragmente werden in eine 96-Well-Platte (drei oder vier Stück pro Well) mit 200 μl vollständigem Nährmedium überführt, das zuvor auf 37 °C erwärmt wurde. 2 h im Inkubator inkubieren.
- Geben Sie 500 μl Trypsin in einen T25-Kolben, der mit subkonfluenten (~70%) C2C12-Zellen besiedelt ist. Resuspendieren in 1 ml des vollständigen Mediums.
- Geben Sie 10 μl der Resuspension zu 10 μl Trypanblau-Farbstoff und laden Sie sie in ein Hämozytometer. Zählen und berechnen Sie die Zellzahl und bestätigen Sie die Zelllebensfähigkeit.
- Saugen Sie das Medium von der 96-Well-Platte mit den dEZMs ab und fügen Sie 200 μl vollständiges Nährmedium hinzu, das 50.000 lebensfähige C2C12-Zellen enthält.
- Inkubieren Sie 2 Tage lang und übertragen Sie dann die dECMs (mit den Zellen) mit einer Pinzette auf eine 48-Well-Platte mit 400 μl vollständigem Nährmedium. Saugen Sie das Medium alle 2 Tage vorsichtig mit einer Mikropipette ab, um zu verhindern, dass sich die dECMs vom Boden der Vertiefung lösen, und fügen Sie bis zum 8. Tag frisches Medium hinzu.
HINWEIS: Die Matrizen werden 2 Tage lang in 96-Well-Platten aufbewahrt, um die C2C12-Zelladhäsion an den dEZMs zu fördern, und dann auf eine 48-Well-Platte übertragen, um den Zugang zu einem größeren Volumen des Mediums mit Nährstoffen zu ermöglichen. dECMs sollten am Boden der Vertiefungen haften. - Für das Differenzierungsexperiment wird das komplette Nährmedium am 8. Tag durch Differenzierungsmedium (DMEM ergänzt mit 2 % Pferdeserum und 1 % Pen/Streptokokken) ersetzt, gefolgt von einer Inkubation im Differenzierungsmedium für 4 Tage bis zum 12. Tag.
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Representative Results
Das Ziel des Dezellularisierungsprotokolls ist es, dEZMs herzustellen, die der Zusammensetzung von nativem Gewebe sehr ähnlich sind. Um die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses zu bestimmen, wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter die Untersuchung der Gewebemorphologie, die Messung des DNA-Spiegels, die Färbung auf F-Aktin und die Analyse von Schlüsselkomponenten der EZM mittels Immunhistochemie und Western-Blotting-Techniken. Konkret wurden fünf Hauptkomponenten der EZM des Skelettmuskelgewebes analysiert.
Während des gesamten Protokolls verändern sich die Proben im Aussehen (Abbildung 1B 1-4). Nach der Isolierung erscheint das Muskelgewebe aufgrund des Vorhandenseins von Myoglobin rötlich (Abbildung 1B1). Nach der Inkubation im hypotonen Puffer, der die Zellen lysiert und die meisten zytoplasmatischen Proteine entfernt, färben sich die Proben weiß (Abbildung 1B2). SDS, ein anionisches Detergens, das häufig bei der Dezellularisierung von Geweben verwendetwird 12, entfernt effektiv zytoplasmatisches und nukleäres Material sowie Membranen. Dadurch werden die Proben nach der SDS-Behandlung transparenter (Abbildung 1B3). Hohe Konzentrationen oder eine längere Exposition gegenüber diesem Reinigungsmittel können jedoch zu einer Denaturierung von Proteinen, zum Verlust von Glykosaminoglykanen und zur Zerstörung von Kollagenfasern führen12. Das optimale Gleichgewicht zwischen Zellentnahme und Konservierung der EZM wird mit 0,05 % SDS für 24 h erreicht, wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. Schließlich wird die DNA durch eine DNase-Behandlung entfernt, was zu transparenten dEZM-Gerüsten führt, die etwas kleiner sind als nach der SDS-Behandlung (Abbildung 1B4).
Der Erfolg des Dezellularisierungsprotokolls wird durch die Menge an Rest-DNA angezeigt, die nach dem Prozess in den Matrices vorhanden ist. Die DNA-Quantifizierung zeigt eine fast 100%ige Abnahme der dEZMs im Vergleich zum nativen Gewebe (Abbildung 1C). Die DAPI-Färbung bestätigt auch das Fehlen von DNA in den dECMs (Abbildung 2B,D,F,H,J).
Das Vorhandensein von fünf wichtigen EZM-Proteinen wurde immunhistochemisch und mittels Western Blot nach Dezellularisierung bewertet und mit dem nativen Gewebe verglichen. Die Immunfärbung der Laminin-α2-Untereinheit (Abbildung 2A,B) und der Gesamtlaminine (Abbildung 2C,D) zeigt, dass die dEZMs eine röhrenförmige Färbung für diese Proteine aufweisen (Pfeile in Abbildung 2B,D), ähnlich der Lamininmatrix, die Myotuben im nativen Gewebe umgibt (Pfeile in Abbildung 2A,C). Die Western-Blot-Analyse für die Laminin-α2-Untereinheit zeigt das Vorhandensein von zwei Banden im nativen Gewebe (Abbildung 2A'), während drei Banden mit einem kleineren Molekulargewicht als erwartet in der dECM nachgewiesen werden können (Abbildung 2B'). Dies kann das Ergebnis des Abbaus oder der Entfernung von Proteinen während des Dezellularisierungsprozesses sein. Die Western-Blot-Analyse für Gesamtlaminine zeigt eine gewisse Fragmentierung dieser Proteine in der dECM im Vergleich zu Proben aus dem nativen Gewebe (Abbildung 2C',D').
Abbildung 1: Verfahren zur Dezellularisierung der fetalen Skelettmuskulatur und Bewertung der Gewebemorphologie und des DNA-Gehalts. (A) Schematische Darstellung des Dezellularisierungsprotokolls. (B) Gewebemorphologie während des gesamten Protokolls, von frisch entnommenem bis hin zu dezellularisiertem Gewebe. Maßstabsbalken = 1 mm. (C) Quantifizierung der in den dEZMs vorhandenen DNA im Vergleich zum nativen Gewebe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. t-Test des Schülers, zweiseitig **p < 0,01. Das Dezellularisierungsprotokoll entfernt effizient nukleäre Inhalte, die azelluläre dECMs produzieren. Abkürzungen: dECMs = dezellularisierte Matrizen; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; SDS = Natriumdodecylsulfat; NT = natives Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Immunfärbung von Fibronektin (Abbildung 2E,F) und Kollagen I (Abbildung 2G,H) zeigt das Vorhandensein dieser Proteine im interstitiellen Raum zwischen den Zellen im nativen Gewebe (Pfeile in Abbildung 2E,G) und eine ähnliche Färbung in den dECMs (Pfeile Abbildung 2F,H). Die Western-Blot-Analyse zeigt ähnliche Banden für Fibronektin unter beiden Bedingungen (Abbildung 2E',F'), was darauf hindeutet, dass dieses Protein nicht besonders vom Dezellularisierungsprozess betroffen ist. Im Fall von Kollagen I (Abbildung 2G',H') gibt es jedoch weniger Banden in den dEZMs, was auf einen gewissen Grad des Abbaus hinweist. Die Immunfärbung für Kollagen IV zeigt ein röhrenförmiges Färbemuster im nativen Gewebe (Pfeil in Abbildung 2I) und eine ähnliche Färbung in der dEZM, obwohl die röhrenförmigen Strukturen schmaler sind (Pfeil in Abbildung 2J). Die Western-Blot-Analyse für Kollagen IV zeigt das Vorhandensein von drei Banden im nativen Gewebe (Abbildung 2I'). Während die gleichen drei Banden in den dEZMs beobachtet werden (Abbildung 2J'), ist das Molekulargewicht dieser Gruppen niedriger als erwartet. Ähnlich wie bei Laminin α2 kann dies das Ergebnis des Proteinabbaus oder der Entfernung während der Dezellularisierung sein.
dECMs werden dann mit C2C12-Myoblasten besiedelt und 8 Tage lang in einem vollständigen Nährmedium kultiviert. C2C12-Zellen besiedeln die dEZMs und proliferieren, wie die Phospho-Histon-3-Kernfärbung zeigt (Pfeile in Abbildung 3A). Nach weiteren 4 Tagen Kultur in Differenzierungsmedium differenzieren sich C2C12-Zellen und fusionieren zu mehrkernigen (blaue Pfeile in Abbildung 3B) Myotuben, die eine schwere Myosinkette exprimieren (gestrichelte Linie in Abbildung 3B). Interessanterweise können intrazelluläre und/oder perizelluläre Färbungen für die Laminin-α2-Kette (gelbe Pfeile in Abbildung 3C,D), die Gesamtlaminine (magentafarbener Pfeil in Abbildung 3C) und das Fibronektin (magentafarbener Pfeil in Abbildung 3D) in C2C12-Zellen nachgewiesen werden, die in einem vollständigen Nährmedium kultiviert wurden, was darauf hindeutet, dass diese Zellen in der Lage sind, diese ECM-Proteine de novo zu synthetisieren und tragen so zur Bildung ihrer Nische bei. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Dezellularisierungsprotokoll eine dECM-Mikroumgebung erzeugt, in der C2C12-Myoblasten proliferieren, differenzieren und mehrkernige Myotuben bilden können.
Abbildung 2: Untersuchung von fünf ECM-Proteinen in nativem versus dezellularisiertem E18.5 fetalem Muskelgewebe. Immunhistochemie an Schnitten nativen Gewebes (A,C,E,G,I) und Färbung von dECMs (B,D,F,H,J) mit DAPI, einem DNA-Marker, Phalloidin-Nachweis von F-Aktin und für ECM-Proteine. Maßstabsbalken = 15 μm. Im nativen Gewebe ist eine Immunfärbung für Laminine und Kollagen IV um die Myofasern herum vorhanden (A,C,I; gelbe Pfeile) und eine Färbung für Fibronektin und Kollagen I wird im interstitiellen Raum zwischen den Myofasern nachgewiesen (E,G; gelbe Pfeile). In den dEZMs zeigt die Färbung von Lamininen und Kollagen IV (B,D,J; GELBE Pfeile) ein röhrenförmiges Muster, das die von den Myofasern nach der Dezellularisierung hinterlassenen Räume umgibt. Die Immunfärbung von Fibronektin und Kollagen I von dEZMs stimmt mit ihrer Anwesenheit im interstitiellen Raum überein (F,H; gelbe Pfeile). (A'-J') Western-Blot-Analyse für fünf ECM-Proteine in nativem Gewebe (A',C',E',G',I') und in dECM-Proben (B',D',F',H',J'). Beide Ansätze zeigen eine Proteinkonservierung nach Dezellularisierung. Die verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Abkürzungen: LNα2 = Laminin-α2-Kette; LNp = pan-muskuläre Laminine; FN = Fibronektin; Kol I = Kollagen I; Spalte IV = Kollagen IV; MHC = Myosin-Schwerkette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: dEZM-Rezellularisierung mit einer Myoblastenzelllinie (C2C12-Myoblasten). (A) Projektion mit maximaler Intensität eines konfokalen Bildes eines 100 μm großen Stapels rezellularisierter Matrix, kolonisiert mit C2C12-Zellen, die mit Methylgrün-Färbe-DNA, Phalloidin-Nachweis von F-Aktin und Anti-pH3-Antikörpern, einem Proliferationsmarker (magentafarbene Pfeile), markiert sind. Maßstabsbalken = 35 μm. (B) Projektion maximaler Intensität eines konfokalen Bildes eines 100 μm großen Stapels, das ein mehrkerniges (blaue Pfeile zeigen die Kerne) Myosin-Schwerketten-positives Myotubus (gestrichelte Linie) zeigt, das während der Kultur gebildet wurde. Maßstabsbalken = 35 μm. (C,D) Immunhistochemisches konfokales Bild mit intra- oder perizellulärer Färbung der Laminin-α2-Kette (gelbe Pfeile), Gesamtlaminine (magentafarbene Pfeile in C) und Fibronektin (magentafarbene Pfeile in D) in Myoblasten, was auf eine de novo Proteinsynthese hindeutet. Maßstabsleiste = 10 μm. Die verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Abkürzungen: pH3 = Phospho-Histon 3; LNα2 = Laminin-α2-Kette; LNp = pan-muskuläre Laminine; FN = Fibronektin; MHC = Myosin-Schwerkette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die EZM ist ein komplexes Netzwerk von Makromolekülen, das in allen Geweben vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellfunktion spielt2. Die EZM fungiert als physikalisches Gerüst für Zellen, an das sie sich anheften können, und liefert Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Motilität, Differenzierung und Apoptose aktiv modulieren. Daher ist die ordnungsgemäße Bildung und Aufrechterhaltung der EZM sowohl für die Entwicklung als auch für die Homöostase unerlässlich1.
Während 2D-Zellkulturmodelle weit verbreitet sind, werden sie zunehmend durch fortschrittlichere 3D-Plattformen ersetzt. Dies liegt daran, dass 2D-Kulturen die chemischen und physikalischen Hinweise fehlen, die das Zellverhalten beeinflussen, während 3D-Kulturen als realistischere Alternative für die Untersuchung der molekularen und zellulären Dynamik in nativen Geweben angesehen werden11. Die Dezellularisierung von Geweben führt zur Herstellung von Gerüsten, die die Mikroumgebungen biologischer Gewebe besser nachahmen, wie in einer Reihe von Studien über verschiedene Gewebe- oder Organsysteme hinweg gezeigt wurde 14,15,23,24,25. Die Fähigkeit von dECMs, die Mikroumgebung von nativem Gewebe zu replizieren, birgt ein großes Potenzial für die Erforschung der normalen Entwicklung, verschiedener Krankheitszustände und der Wirkung von Medikamenten oder Toxinen auf Gewebe11.
Das in dieser Studie verwendete Protokoll baut auf dem von Silva et al. entwickelten Protokoll zur Dezellularisierung von fetalem Herzgewebe14 als Ausgangspunkt auf. Es handelt sich um eine Kombination aus einem hypotonen Puffer, einer Behandlung mit einem anionischen Detergens (SDS) und einer DNase-Behandlung. Eine der größten Herausforderungen bei Dezellularisierungsprotokollen besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen der Entfernung von Zellen und der Erhaltung der EZM-Proteinzusammensetzung zu finden. Da wir uns darauf konzentrieren, dieses 3D-Zellkultursystem zur Untersuchung der frühen Stadien von LAMA2-CMD zu verwenden, wurde besonderes Augenmerk auf die Konservierung von Laminin 211 während der Dezellularisierung gelegt. Das Protokoll von Silva et al.14 führte zum Verlust der Immunreaktivität der Laminin-α2-Kette in den dezellularisierten fetalen Muskeln; Dies könnte auf die Konzentration des verwendeten SDS zurückzuführen sein. Daher wurden Alternativen zum 0,2%igen SDS-Detergenzienlösungsschritt getestet, wie z. B. niedrigere Konzentrationen von SDS (0,1 %, 0,05 % und 0,02 %) und die Substitution von SDS durch unterschiedliche Konzentrationen von Triton X-100 (0,5 % und 0,2 %). Die besten Ergebnisse wurden mit einer 0,05%igen SDS-Waschmittelbehandlung für 24 Stunden erzielt. Durch diese Konzentration wurde der Zellinhalt effektiv entfernt, während die Immunreaktivität der Laminin-α2-Kette nach der Dezellularisierung erhalten blieb. Dieses Protokoll erzeugt reproduzierbar azelluläre dEZMs, die frei von zellulären Resten, einschließlich DNA, sind.
Das in dieser Studie verwendete Protokoll bewahrt sowohl die interstitiellen Matrixproteine (Fibronektin und Kollagen I) als auch die Basalmembranproteine (Laminine und Kollagen IV). Zukünftige Studien sollten untersuchen, ob Kollagen VI auch erhalten bleibt, da es auch bei Muskeldystrophien eine Rolle spielt26. Es ist bekannt, dass SDS die Ultrastruktur von Proteinen stören und Kollagene schädigenkann 12; Für die fetale Skelettmuskulatur war es wichtig, eine niedrige Konzentration von SDS (0,05 %) zu verwenden, um die Immunreaktivität von Laminin α2 aufrechtzuerhalten. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigen jedoch, dass die dezellularisierten Proben nach dem Immunnachweis von Lamininen und Kollagenen im Vergleich zum nativen Gewebe mehr Banden aufweisen, was darauf hindeutet, dass ein gewisser Proteinabbau als Ergebnis des Dezellularisierungsprozesses aufgetretenist 27.
Wichtig ist, dass die Rezellularisierungsexperimente zeigen, dass diese Matrices zuverlässige Gerüste sind, die die Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung konsequent unterstützen. Es wurde berichtet, dass SDS zytotoxischist 28, und daher sind die im Protokoll enthaltenen Waschschritte entscheidend, wenn die Matrices für die Rezellularisierung verwendet werden sollen. Diese Gerüste wurden effektiv von C2C12-Zellen besiedelt, was auf ihre Eignung als Modellsystem für die 3D-Kultur von Zellen hinweist. Die Beobachtung der intrazellulären und perizellulären Färbung von EZM-Proteinen, die die C2C12-Zellen umgeben, deutet darauf hin, dass die Zellen aktiv zu ihrer Mikroumgebung innerhalb der dECMs beitragen. Darüber hinaus differenzierten sich die C2C12-Zellen, wenn sie in Differenzierungsmedium platziert wurden, und bildeten Myotuben innerhalb der dEZMs.
Eine große Herausforderung bei diesem Verfahren ist die Manipulation der Proben im gesamten Protokoll. Die Proben sind sehr klein und weich und erfordern Sorgfalt und Geschick in der Handhabung, um ein Einklemmen in der Feinpipette und den Verlust der Proben zu verhindern. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn das Protokoll mit frischem Gewebe begonnen wird. Die Verwendung von gefrorenen, gelagerten Proben kann die Entfernung zellulärer Inhalte behindern und zu einem erhöhten Proteinabbau führen, was den Proteinnachweis behindert und die Dezellularisierungseffizienz verringert.
Nur wenige Studien haben über die Dezellularisierung von fetalem Gewebe berichtet 15,29,30,31. Speziell in Bezug auf die Dezellularisierung fetaler Skelettmuskeln hat nur eine frühere Studie über die Dezellularisierung von Mischproben von Dermis, subkutanem Gewebe und Panniculus carnosus berichtet 31. Nach bestem Wissen der Autoren ist dies das erste Mal, dass ein Dezellularisierungsprotokoll für isolierte fetale Mausskelettmuskeln etabliert wurde. Dieses Protokoll kann als Grundlage für die Erstellung ähnlicher Protokolle für fötales Muskelgewebe anderer Spezies wie Schweine und Menschen dienen13.
Das vorliegende Protokoll zur Dezellularisierung des Skelettmuskels der E18.5-Maus ist dem Verfahren von Silva et al.14 sehr ähnlich, die es auf ein E18-Mausherz angewendet haben. Der einzige Unterschied besteht in der Konzentration des verwendeten SDS, die deutlich niedriger ist als die für das fetale Herz verwendete (0,05 % vs. 0,2 %), was möglicherweise auf unterschiedliche physikalische Eigenschaften dieser beiden fetalen Gewebe zurückzuführen ist.
Die Entwicklung dieses in vitro Modells ermöglicht nicht nur die Untersuchung der Prozesse, die an der normalen fetalen Muskelentwicklung beteiligt sind, sondern ermöglicht auch die parallele Untersuchung von früh einsetzenden Muskeldystrophien und Myopathien, wie z.B. LAMA2-CMD, die sich als Myogenesedefekt bei E18.5 im dy-W-Mausmodell 10 manifestiert. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dieses System insofern eingeschränkt ist, als es nur die EZM und Muskelzellen umfasst und keine anderen Zelltypen wie Neuronen, Endothelzellen und Fibroblasten enthält. Die Relevanz dieser zusätzlichen Zelltypen kann je nach Erkrankung variieren, und es können Modifikationen des Kultursystems erforderlich sein, um sie einzubeziehen. Insgesamt kann die in dieser Studie beschriebene Verwendung von dEZMs bei der Untersuchung verschiedener früh einsetzender Muskeldystrophien und Myopathien angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; Vertrags-Nr. 23049), dem MATRIHEALTH-Projekt und der cE3c-Unit-Finanzierung UIDB/00329/2020 finanziert. Wir möchten uns bei unserem Spender Henrique Meirelles bedanken, der sich entschieden hat, das MATRIHEALTH-Projekt zu unterstützen. Diese Arbeit profitierte von den Infrastrukturen der Mikroskopie-Einrichtung der Fakultät für Naturwissenschaften, einem Knotenpunkt der portugiesischen Plattform für BioBildgebung (Referenz PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), und wir danken Luís Marques für seine Unterstützung bei der Bildaufnahme und -verarbeitung. Abschließend danken wir Marta Palma für die technische Unterstützung und unserem Forschungsteam für die großzügigen Beiträge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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