Summary
I detta arbete optimerades ett decellulariseringsprotokoll för att erhålla decellulariserade matriser av fostrets musskelettmuskulatur. C2C12-myoblaster kan kolonisera dessa matriser, föröka sig och differentiera. Denna in vitro-modell kan användas för att studera cellbeteende i samband med skelettmuskelsjukdomar som muskeldystrofier.
Abstract
Den extracellulära matrisen (ECM) spelar en avgörande roll för att ge strukturellt stöd för celler och förmedla signaler som är viktiga för olika cellulära processer. Tvådimensionella (2D) cellodlingsmodeller förenklar de komplexa interaktionerna mellan celler och ECM, eftersom bristen på ett komplett tredimensionellt (3D) stöd kan förändra cellbeteendet, vilket gör dem otillräckliga för att förstå in vivo-processer . Brister i ECM-sammansättning och cell-ECM-interaktioner är viktiga bidragsgivare till en mängd olika sjukdomar.
Ett exempel är LAMA2-kongenital muskeldystrofi (LAMA2-CMD), där frånvaro eller reduktion av funktionellt laminin 211 och 221 kan leda till svår hypotoni, detekterbar vid eller strax efter födseln. Tidigare arbete med en musmodell av sjukdomen tyder på att dess uppkomst sker under fostermyogenesen. Den aktuella studien syftade till att utveckla en 3D in vitro-modell som möjliggör studier av interaktionerna mellan muskelceller och fostermuskelns ECM, efterlikna den ursprungliga mikromiljön. Detta protokoll använder djupa ryggmuskler dissekerade från E18.5-musfoster, behandlade med en hypotonisk buffert, ett anjoniskt tvättmedel och DNase. De resulterande decellulariserade matriserna (dECM) behöll alla testade ECM-proteiner (laminin α2, totala lamininer, fibronektin, kollagen I och kollagen IV) jämfört med den ursprungliga vävnaden.
När C2C12-myoblaster såddes ovanpå dessa dECM penetrerade de och koloniserade dECM, vilket stödde deras spridning och differentiering. Dessutom producerade C2C12-cellerna ECM-proteiner, vilket bidrog till ombyggnaden av deras nisch inom dECM. Etableringen av denna in vitro-plattform ger ett nytt lovande tillvägagångssätt för att avslöja de processer som är involverade i uppkomsten av LAMA2-CMD, och har potential att anpassas till andra skelettmuskelsjukdomar där brister i kommunikationen mellan ECM och skelettmuskelceller bidrar till sjukdomsprogression.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) är en viktig beståndsdel i vävnader, som representerar deras icke-cellulära komponent. Denna tredimensionella (3D) struktur ger inte bara fysiskt stöd för celler utan spelar också en avgörande roll i de biokemiska processer som är involverade i utvecklingen av organismer1. Bildandet av en vävnadsspecifik ECM sker under utveckling, som ett resultat av de komplexa interaktionerna mellan celler och deras nischer, påverkade av olika intra- och extracellulära stimuli. ECM är en mycket dynamisk struktur som genomgår kemiska och mekaniska omarrangemang på ett tidsmässigt-rumsligt sätt och direkt påverkar cellens öde2. En av de mest anmärkningsvärda egenskaperna hos ECM är dess funktionella mångfald, eftersom varje vävnads ECM visar en unik kombination av molekyler som ger olika topologier och egenskaper som är skräddarsydda för cellerna den innehåller1.
ECM-signalering och stöd är avgörande för utveckling och homeostas, och när det störs kan det leda till flera patologiska tillstånd 3,4. Ett exempel är LAMA2-bristfällig medfödd dystrofi (LAMA2-CMD), som är den vanligaste formen av medfödd muskeldystrofi. LAMA2-genen kodar för laminin α2-kedjan, som finns i laminin 211 och laminin 221, och när den muteras kan den leda till LAMA2-CMD5. Laminin 211 är den huvudsakliga isoformen som finns i basalmembranet som omger skelettmuskelfibrer. När laminin 211 är onormalt eller frånvarande störs länken mellan basalmembranet och muskelcellerna, vilket leder till sjukdomsuppkomsten6. Patienter med LAMA2-CMD uppvisar en mild till svår fenotyp beroende på typen av mutation i LAMA2-genen.
När funktionen hos laminin α2-proteinet påverkas kan patienter uppleva svår muskelhypotoni vid födseln och utveckla kronisk inflammation, fibros och muskelatrofi, vilket leder till minskad livslängd. Hittills har inga riktade behandlingar utvecklats och terapeutiska metoder är begränsade till att lindra symtomen på sjukdomen7. Därför är det avgörande att förstå de underliggande molekylära mekanismerna som är involverade i uppkomsten av denna sjukdom för att utveckla lämpliga terapeutiska strategier 6,8. Tidigare arbete med dyW-musen 9, en modell för LAMA2-CMD, tyder på att sjukdomsuppkomsten börjar i livmodern, särskilt under fostermyogenes10. En bättre förståelse för hur fostrets myogenesdefekt uppstår skulle vara en spelväxlare för att generera nya terapeutiska metoder för LAMA2-CMD.
In vitro-system ger en kontrollerad miljö för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner, men 2D-odlingsmodeller saknar komplexiteten hos inhemska vävnader. Decellularisering av vävnader producerar vävnads- och utvecklingsstadiespecifika acellulära ECM-byggnadsställningar som mer exakt efterliknar den naturliga cellmikromiljön jämfört med 2D-modeller och konstruerade / syntetiska byggnadsställningar. Decellulariserade matriser (dECM) har potential att bevara värdvävnadens molekylära och mekaniska signaler, vilket gör dem till bättre alternativa modeller för att förstå in vivo-processer 11.
Det finns olika tekniker, reagens och förhållanden som kan användas för decellularisering12,13. I denna studie är ett decellulariseringsprotokoll för fostrets mushjärta, beskrivet av Silva et al.14,15, anpassat till fostrets musskelettmuskulatur och visat sig behålla alla testade ECM-komponenter (laminin α2, totala lamininer, fibronektin, kollagen I och kollagen IV). Protokollet innehåller tre steg: celllys genom osmotisk chock (hypotonisk buffert), plasmamembranupplösning och proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) och enzymatisk förstörelse av DNA (DNase-behandling). Såvitt vi vet är detta det första etablerade protokollet för decellularisering av musfosters skelettmuskulatur.
För att använda detta 3D-in vitro-system för att studera LAMA2-CMD är det avgörande att bibehålla laminin α2-kedjan efter decellularisering. Därför implementerades ett optimeringsprotokoll där olika tvättmedel (SDS och Triton X-100) och koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% och 0,5%) testades (data visas inte). Det optimala valet för cellavlägsnande och bevarande av laminin α2-proteinet visade sig vara 0,05% SDS. C2C12-celler, en väletablerad myoblastcellinje16,17, användes för att fröa dECM. Dessa celler invaderar dECM, prolifererar och differentierar inuti dessa byggnadsställningar och syntetiserar nya ECM-proteiner. Den framgångsrika produktionen av denna 3D in vitro-modell erbjuder ett nytt tillvägagångssätt för att förstå de molekylära och cellulära processerna som är involverade i fostermyogenes, uppkomsten av LAMA2-CMD, och kan utvidgas till andra muskelsjukdomar där kommunikationen mellan ECM och skelettmuskelceller störs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna metoder har godkänts av djurskyddskommittén (ORBEA) vid naturvetenskapliga fakulteten, Lissabons universitet, och Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) och överensstämmer med det europeiska direktivet 2010/63/EU.
1. Beredning av decellulariseringsbuffertar och reagens
OBS: Alla lösningar som används under decellulariseringsprotokollet ska steriliseras genom autoklavering och lagras i upp till 3 månader om inte annat anges.
- Förbered 10x fosfatbuffrad saltlösning (10x PBS) genom att tillsätta natriumklorid (NaCl) vid 137 mM, kaliumklorid (KCl) vid 2,68 mM, kaliumdivätefosfat (KH 2 PO4) vid 8,1 mM och disodium-vätefosfatdihydrat (Na2HPO4) vid 1,47 mM till demineraliserat vatten (dH 2O) och justera pH till 6,8. Tillsätt 100 ml 10x PBS till 900 ml demineraliseradH2Oför att generera 1x PBS. Autoklav och förvara vid rumstemperatur (RT). Tillsätt steril penicillin/streptomycinstamlösning (10 000 E/ml penicillin och 10 mg/ml streptomycin [penna/strep]) till en slutlig koncentration på 1 % före användning.
- Bered den hypotona bufferten genom att lösa 1,21 g Tris (hydroximetyl) aminometan (Tris bas) och 1 g etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 1 liter dH2O (10 mM Tris bas 0,1% EDTA). Använd en magnetomrörare tills den är upplöst och justera pH-värdet till 7,8 med NaOH/HCl. Sterilisera i autoklav och förvara vid rumstemperatur. Tillsätt penna/strep till en slutlig koncentration på 1 % före användning.
- Bered den hypotona tvättbufferten genom att lösa upp 1,21 g Tris-bas i 1 literdH2O(10 mM Tris-bas). Använd en magnetomrörare tills den är upplöst och justera pH till 7,8 med NaOH/HCl. Autoklav och förvara vid rumstemperatur. Tillsätt penna/strep till 1 % före användning.
- Förbered behandlingen med anjoniskt tvättmedel genom att tillsätta 0,05 g natriumdodecylsulfat (SDS) till 100 ml hypoton tvättbuffert för att producera en 0,05% SDS-behandlingslösning. Filtrera genom ett 0,22 μm membranfilter. Förvara på RT i upp till 1 månad.
SDS-lösningen bör inte autoklaveras, eftersom SDS fälls ut och försämras vid autoklavering. - Bered DNase-behandlingslösningen genom att lösa 1,21 g Tris-bas i 0,5 ml dH2O och tillsätt 1ml 1 M magnesiumklorid (MgCl2). Justera pH-värdet till 7,8 med NaOH/HCl. Autoklav och förvara vid rumstemperatur. Tillsätt DNas I före användning (50 E/ml).
2. Insamling av prover
OBS: Vildtyp C57 / BL6 möss användes i studien. Alla tekniker utfördes i en laminär flödeshuv under sterila förhållanden.
- Avliva vuxna dräktiga honmöss på embryonal dag (E) 18,5 av graviditeten med isofluran inhalation följt av cervikal dislokation. Utsätt mössen för terminal dissektion för att extrahera foster.
- Spraya musens buk med 70% etanol.
- Använd kirurgiska pincett och sax, lyft ett hudveck i underlivet och gör ett U-format snitt för att exponera bukhålan18.
- Samla livmoderhornen som innehåller E18.5-fostren genom att skära äggledarna och livmoderhalsen och överför dem omedelbart till en petriskål med iskall 1x PBS med 1% penna / strep18.
- Ta snabbt bort fostren från livmodern och extraembryonala vävnader och avliva dem genom halshuggning med sax18.
- Överför ett foster i taget till en petriskål med iskall 1x PBS. Använd ett stereomikroskop, ta bort huden och skär av lemmarna. Från den ventrala sidan, skär genom bröstkorgen och ta bort bröstbenet och de underliggande organen.
- Vänd fosterstammen dorsala sidan uppåt. Ta bort livmoderhalsdelen av ryggraden, dorsala fettavlagringar och bindväven ovanpå de djupa ryggmusklerna.
- Använd kirurgiska pincett för att förankra bröstkorgen och skrapa försiktigt och lossa de djupa ryggmusklerna från de omgivande vävnaderna med hjälp av en mikroskalpell10. Denna procedur resulterar i isolering av två muskelstycken per foster (vänster och höger), båda huvudsakligen bestående av longissimus och iliocostalis muskler, med några av transversospinalis och levator costarum muskler ingår.
- Förvara muskelproverna i 1x PBS med 1% penna/strep vid 4 °C för kortvarig lagring (<1 vecka), eller vid -80 °C under längre perioder.
OBS: Använd nyinsamlade prover för bästa resultat. Prover frysta under längre perioder (>3 månader) visar lägre decellulariseringseffektivitet och mer proteinnedbrytning. Epaxiala muskelmassor användes för decellulariseringsexperimenten, men andra muskler (t.ex. lemmuskler) kan bearbetas för decellularisering med samma protokoll.
3. Decellularisering av fostermuskulaturen
OBS: Alla tekniker utfördes i en laminär flödeshuv under sterila förhållanden. För en detaljerad schematisk representation, se figur 1A. Alla steg utfördes med omrörning i en orbitalskakapparat med en diameter på 120 mm (165 rpm) vid 25 °C om inget annat anges. Tillsätt 1% penna/strep till lösningar före användning. När du tar bort lösningarna, aspirera försiktigt för att undvika provinfångning i pipetten.
- Dag 1 - Förbered cirka 2 mm x 1 mm x 1 mm (~ 3,5 mg) vävnadsfragment från de epaxiella muskelmassorna. Tillsätt 3 ml hypotonisk buffert med 1% penna / strep till varje brunn på en 12-brunnsplatta och tillsätt ett helt muskelvävnadsfragment per brunn.
- Inkubera vävnadsfragmenten i hypotonisk buffert under omrörning i 18 timmar (över natten) (O/N).
- Dag 2 - Aspirera den hypotoniska bufferten med en finpipett och tvätta proverna 3 x 1 h med 3 ml 1x PBS varje gång med omrörning.
- Inkubera proverna i 24 timmar med 3 ml 0,05 % SDS tvättmedelslösning under omrörning.
ANMÄRKNING: (KONTROLLPUNKT) Efter SDS-inkubation ska proverna vara transparenta i utseende. Proverna visar en gelatinliknande konsistens och är därför mer benägna att fästa vid pipetten när vätskorna avlägsnas.
- Inkubera proverna i 24 timmar med 3 ml 0,05 % SDS tvättmedelslösning under omrörning.
- Dag 3 - Ta bort SDS-tvättmedelslösningen med en finpipett och tvätta vävnadsfragmenten 3 x 20 min med 3 ml hypoton tvättbuffert varje gång under omrörning.
ANMÄRKNING: (PAUSPUNKT) Proverna kan förvaras i hypoton tvättbuffert vid 4 °C i 18 timmar (O/N). Se till att SDS avlägsnas väl under tvättstegen, eftersom kvarvarande SDS kan vara cytotoxiskt.- Inkubera vävnadsfragmenten i 3 timmar med 2 ml DNas-lösning under omrörning vid 37 °C.
- Ta bort DNase-lösningen med en finpipett och tvätta vävnadsfragmenten 3 x 20 min med 3 ml 1x PBS varje gång under omrörning. Tvätta slutligen O/N med omrörning (60 rpm).
OBS: Efter DNase-behandlingen blir dECM klibbiga på grund av närvaron av DNA-rester. Därför är noggrann tvättning nödvändig. - Förvara dECM i 1x PBS med 1% penna/strep vid 4 °C tills recellularisering (<1 vecka). För annan användning, förvara vid -80 °C.
4. Kvalitetsbedömning av decellularisering
OBS: DNA-kvantifiering, DAPI / metylgrön färgning och falloidinfärgning utfördes för att utvärdera närvaron av kvarvarande cellinnehåll efter decellularisering. Immunohistokemi och western blot-analyser utfördes för att bedöma retentionen av viktiga ECM-proteiner efter decellularisering.
- Kvantifiering av DNA i dECM
OBS: dECM bör jämföras med den ursprungliga vävnaden för att detektera närvaron av DNA.- Före decellularisering, väg ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på en digital våg med hög precision. Innan du överför muskelprovet till röret, ta bort alla återstående 1x PBS med en pappershandduk. Väg röret med provet. Beräkna provernas våtvikt med hjälp av ekvation (1):
Provvåtvikt =viktrör med prover- vikttomt rör (1) - Decellularisera proverna enligt det protokoll som beskrivs i avsnitt 3.
- Placera proverna i 2 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Proverna kan förvaras vid -20 °C fram till DNA-extraktion och kvantifiering. - Utför DNA-extraktion av dECM och inhemska vävnadsprover med hjälp av ett spinnkolonnbaserat kit. Tillsätt digestionsbufferten enligt tillverkarens anvisningar.
- Homogenisera proverna i en pärlkvarn två gånger i 2,5 minuter varje gång (vänd fästena) med en volframkarbidsträng per rör (använd kylda rörfästen).
- Tillsätt proteinas K och inkubera O/N under långsam omrörning vid 56 °C.
- Fortsätt med protokollet enligt beskrivningen i tillverkarens instruktioner.
- Eluera med den buffert som tillverkaren tillhandahåller och centrifugera 2 x 1 min vid ≥6 000 x g, varje gång vid 4 °C för att öka DNA-utbytet.
OBS: DNA kan förvaras vid -20 °C fram till kvantifiering. - Kvantifiera DNA som finns i proverna med hjälp av en fluorescerande dsDNA-detektionssats enligt tillverkarens instruktioner.
- Normalisera DNA-innehållet som nanogram DNA per milligram ursprunglig våtvikt av provet.
- Analysera data med hjälp av en tvåsidig Students t-test och uttrycka som medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM).
- Före decellularisering, väg ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på en digital våg med hög precision. Innan du överför muskelprovet till röret, ta bort alla återstående 1x PBS med en pappershandduk. Väg röret med provet. Beräkna provernas våtvikt med hjälp av ekvation (1):
- Immunhistokemi
OBS: Lösningarna 1, 2 och 3 och fixeringslösningen ska beredas före användning och kan hållas frysta i upp till 6 månader. Alla antikroppar och färgämnen som används och respektive spädningar anges i Tabell 1.- Beredning av lösningar
- Bered fixeringslösning genom att tillsätta 2 g paraformaldehyd (PFA), 8 g sackaros och 24 μl 1 MCaCl2 till 77 ml 0,2 MNa2HPO4 och 23 ml 0,2 M NaH2PO4 till en slutlig volym på 200 ml genom tillsats av dH2O. Justera pH till7,4.
- Bered 0,12 M fosfatbuffert genom att tillsätta 13,5 gNa2HPO4 och 3,2 g NaH2PO4-1 L-PH2O. Justera pH-värdet till 7,4.
- Bered lösning 1 genom att tillsätta 4 g sackaros till 100 ml 0,12 M fosfatbuffert.
- Förbered lösning 2 genom att tillsätta 15 g sackaros till 100 ml 0,12 M fosfatbuffert.
- Förbered lösning 3 genom att tillsätta 15 g sackaros och 7,5 g gelatin till 100 ml 0,12 M fosfatbuffert. Värm vid 37 °C tills gelatinet har lösts upp.
- Bered metylgrön stamlösning (2 % metylgrönt pulver upplöst idH2O)19.
- Immundetektion
- Fixera proverna med fixeringslösningen i minst 4 timmar vid 4 °C.
- Tvätta proverna 2x i 10 min med 1x PBS.
- Förvara O/N, eller under 1 dag, i lösning 1 vid 4 °C.
- Tvätta och förvara O/N eller mer än 1 dag i lösning 2 vid 4 °C. Låt proverna värmas till RT.
- Inkubera i 3 timmar i lösning 3 vid 37 °C. Förvara extra lösning 3 vid 37 °C för senare användning.
- Forma små (2 cm x 1 cm x 1 cm) behållare i aluminiumfolie. Lägg ett tunt lager av lösning 3 i den gjutna behållaren och låt den stelna. Placera proverna på den stelnade lösningen 3 och täck med varm lösning 3. Orientera proverna och låt dem stelna. Markera platsen på den stelnade lösningen 3 med en färgpenna.
- Frys genom att placera behållarna på ytan av torriskyld eller flytande kvävekyld isopentan.
- Använd optimal skärtemperatur (O.C.T.) och fäst de frysta gelatinkuberna som innehåller proverna på kryostatfästet.
- Dela de frysta gelatinkuberna och överför vävnadssektionerna till objektglasen. Låt dem torka i 60 min.
- Använd en hydrofob markör för att spåra en linje runt sektionerna.
- Tvätta bilderna 3 x 10 min i 1x PBS.
- Täck sektionerna med 1% bovint serumalbumin (BSA), 1% getserum och 0,05% Triton X-100 utspätt i 1x PBS (blockerande lösning) i 30 minuter (blockeringssteg).
- Späd de primära antikropparna i blockerande lösning och täck sektionerna. Inkubera O/N vid 4 °C i en sluten kartong med fuktigt papper för att förhindra att sektionerna torkar.
- Tvätta bilderna 3 x 10 min med 1x PBS.
- Späd de sekundära antikropparna i blockerande lösning och täck sektionerna. Inkubera i 1,5 h vid rumstemperatur i mörker.
OBS: Undvik ljusexponering för att förhindra nedbrytning av fluoroforer. - Tvätta bilderna 3 x 10 min med 4x PBS.
OBS: Högre koncentration av PBS kan användas när en stark bakgrund är närvarande. - Sänk ner objektglasen i DAPI-lösning (5 μg/ml 1,4-diazabicyklo-2,2,2-oktan i 0,1% Triton X-100/1x PBS) i 30 s vardera.
- Skölj i 1x PBS.
- Montera sektionerna i antiblekningsmedium (50 mg / ml n-propylgallat i 1x PBS: glycerol [1: 9]) och försegla med ett täckglas. Förvaras vid 4 °C tills observation och bildtagning förvaras i fluorescensmikroskop20.
OBS: För in toto-immunhistokemiexperimenten användes samma protokoll (se steg 4.2.2.12-4.2.2.18), förutom att proverna tidigare fixerades i 4% PFA utspädd i 1x PBS i 3 timmar vid RT. DNA-färgning utfördes genom tillsats av metylgrönt till den sekundära antikroppslösningen. Alla antikroppar och färgämnen som används och deras respektive spädningar förtecknas i tabell 1. Proverna monterades sedan i antiblekningsmedium mellan två täckglas åtskilda av stålringar, limmade ihop med bivax, och 100 μm bildstaplar förvärvades med hjälp av ett konfokalmikroskop21.
- Beredning av lösningar
- Western blot analys
OBS: Alla antikroppar som används och respektive spädningar anges i Tabell 1.- Beredning av lösningar
- Förbered 2x SDS-PAGE laddningsbuffert genom att tillsätta 20 ml glycerol, 4 g SDS och 0,2 ml bromfenolblått till 80 ml 100 mM Tris baslösning. Justera pH-värdet till 6,8. Tillsätt färsk ditiotreitol (DTT) före användning.
- Bered Tris-buffrad saltlösningstvättbuffert med Tween 20 (TBST) lösning genom att tillsätta 2,4 g Tris-bas, 8,8 g NaCl och 1 ml Tween-20 tilldH2Otill en slutlig volym på 1 liter. Justera pH till 7,4-7,6 med HCl.
- Förbered 10x löpbufferten (RB) genom att tillsätta 30,2 g Tris-bas, 144,2 g glycin och 10 g SDS till 1 ldH2O. Före användning, tillsätt 100 ml 10x RB till 900 ml dH2O för att förbereda 1x RB (arbetslösning).
OBS: Medan 10x RB kan lagras på RT i flera månader, kan 1x RB återanvändas på olika körningar. - Bered överföringsbufferten (TB) genom att tillsätta 5,82 g Tris-bas, 2,93 g glycin och 0,5 g SDS till 800 mldH2O. Efter att komponenterna är upplösta, tillsätt 200 ml metanol. Kyl vid 4 °C.
OBS: TB bör beredas nyligen före varje användning.
- Proteinutvinning
- Samla epaxiala muskler från E18.5-möss och placera dem omedelbart i ett mikrocentrifugrör (2 ml) innehållande 2x SDS-PAGE laddningsbuffert med nyligen tillsatt DTT (100 mM DTT). Bearbeta E18.5 dECM på samma sätt.
- Tillsätt en volframkarbidpärla per rör. Homogenisera 2x i en pärlkvarn i 2,5 minuter varje gång (vänd fästena).
- Sonicate proverna för 5 min i ett ultraljudsbad.
- Värm proverna i 10 minuter vid 50 °C.
- Centrifugera proverna vid 12 000 × g i 15 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Kvantifiera proteinet med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer.
- Förvaras vid -20 °C tills vidare användning.
- Polyakrylamidgelelektrofores
- Använd prefabricerad akrylamidgradientgel (4%-20%)
- Montera gelén i elektroforestanken. Ta bort kammen försiktigt. Tillsätt 1x RB tills linjen visas i elektroforestanken. Se till att brunnarna är fyllda med RB.
- Fyll 100 μg protein per prov i brunnarna. Ladda 12 μL proteinstandard med hög molekylvikt.
- Kör totalt 100 min med konstant spänning (10 min vid 150 V och 90 min vid 185 V).
- Överföra
- Blötlägg filterdynorna och svamparna med kyld TB (4 °C) medan gelen är igång.
- Skär polyvinylidendifluoridmembranen till gelens storlek. Aktivera dem med metanol och tvätta med dH2O. Blötlägg i TB.
- Montera överföringskassetten med svampar, filterdynor, geler och aktiverade membran enligt tillverkarens instruktioner.
- Placera kassetten i elektroforestanken som innehåller den kylda TB (på en isbädd). Lägg till kylenheten. Kör i 90 min vid 100 V.
- Efter överföringen, fläcka med en Coomassie blå ersättare för att bedöma överföringskvaliteten.
- Immundetektion
- Förbered blockeringslösningen (TBST med 5% mager mjölk). Inkubera membranen under omrörning i 1 timme vid rumstemperatur.
- Skölj 3 x 5 s med TBST.
- Inkubera membranen O/N med de primära antikropparna utspädda i TBST med 2 % BSA och 0,02 % natriumazid (3 ml per membran) i en kall kammare (4 °C) under omrörning.
- Nästa dag, tvätta 3 x 5 min med TBST.
- Inkubera membranen med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerade sekundära antikroppar utspädda i TBST med 5% mager mjölk (5 ml för varje membran) i 1 timme vid RT.
- Tvätta membranen med TBST 3 x 5 min. Behåll TBST tills identifieringssteget.
- Visualisera proteinet med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt utvecklingskit. Lägg till detektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. Skaffa bilder av banden.
- För att testa mer än en antikropp per membran, efter detektionssteget, strippa de tidigare antikropparna med tre tvättar (5 min vardera) med TBST och upprepa steg 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Beredning av lösningar
Tabell 1: Antikroppar och färgämnen som används vid immunohistokemi och western blot-analys samt respektive utspädningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.10,22
5. Cellodling i decellulariserade matriser
OBS: Alla tekniker utfördes under sterila förhållanden i en laminär flödeshuv. Alla inkubationer utfördes vid 37 °C och med 5 %CO2.
- Förbered cellodlingsmediet, Dulbeccos modifierade örnmedium med hög glukos med stabil glutamin och med natriumpyruvat (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penna / strep (komplett odlingsmedium).
- Placera dECM:erna i en petriskål i 1x PBS med 1% penna/strep i en laminär flödeshuv och separera dem i bitar på ca 500 μm x 500 μm x 250 μm med hjälp av en mikroskalpell och pincett.
OBS: dECM har en mjuk konsistens, och därför är det ofta lättare att använda pincett för att separera dem i ungefär samma storlek istället för att skära dem med mikroskalpellen. - Överför fragmenten till en platta med 96 brunnar (tre eller fyra stycken per brunn) med 200 μl komplett odlingsmedium, som tidigare värmts till 37 °C. Inkubera i 2 timmar i inkubatorn.
- Tillsätt 500 μL trypsin till en T25-kolv sådd med subkonfluenta (~70%) C2C12-celler. Resuspendera i 1 ml komplett medium.
- Tillsätt 10 μL av resuspensionen till 10 μL trypanblått färgämne och fyll på i en hemocytometer. Räkna och beräkna cellnumret och bekräfta cellens livskraft.
- Aspirera mediet från 96-brunnsplattan som innehåller dECM och tillsätt 200 μL komplett odlingsmedium innehållande 50 000 livskraftiga C2C12-celler.
- Inkubera i 2 dagar och överför sedan dECM (med cellerna) med pincett till en 48-brunnsplatta med 400 μL komplett odlingsmedium. Var 2: e dag, sug försiktigt mediet med en mikropipett för att förhindra att dECM lossnar från botten av brunnen och tillsätt nytt medium till dag 8.
OBS: Matriser hålls i 2 dagar i 96-brunnsplattor för att främja C2C12-celladhesion till dECM och överförs sedan till en 48-brunnsplatta för att ge tillgång till en större volym medium med näringsämnen. dECM bör fästa vid botten av brunnarna. - För differentieringsexperimentet, ersätt hela odlingsmediet med differentieringsmedium (DMEM kompletterat med 2% hästserum och 1% penna/strep) på dag 8, följt av inkubation i differentieringsmedium i 4 dagar fram till dag 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med decellulariseringsprotokollet är att producera dECM som liknar sammansättningen av naturlig vävnad. För att bestämma effektiviteten av decellulariseringsprocessen användes olika metoder, inklusive undersökning av vävnadsmorfologi, mätning av DNA-nivåer, färgning för F-aktin och analys av viktiga ECM-komponenter med hjälp av immunhistokemi och västerländska blottningstekniker. Specifikt analyserades fem huvudsakliga ECM-komponenter i skelettmuskelvävnader.
Under hela protokollet ändras proverna i utseende (figur 1B 1-4). Efter isolering verkar muskelvävnaden rödaktig på grund av närvaron av myoglobin (figur 1B1). Efter inkubation i den hypotona bufferten, som lyserar celler och avlägsnar de flesta cytoplasmatiska proteinerna, blir proverna vita (figur 1B2). SDS, ett anjoniskt tvättmedel som vanligtvis används vid vävnadsdecellularisering12, avlägsnar effektivt cytoplasmatiskt och kärnmaterial samt membran. Som ett resultat blir proverna mer transparenta efter SDS-behandling (figur 1B3). Höga koncentrationer eller långvarig exponering för detta tvättmedel kan dock orsaka proteindenaturering, förlust av glykosaminoglykaner och störning av kollagenfibrer12. Den optimala balansen mellan cellavlägsnande och bevarande av ECM uppnås med 0,05% SDS under 24 timmar, som visas i figur 2 och figur 3. Slutligen avlägsnas DNA genom DNase-behandling, vilket resulterar i transparenta dECM-ställningar som är något mindre än efter SDS-behandling (figur 1B4).
Framgången för decellulariseringsprotokollet indikeras av mängden kvarvarande DNA närvarande i matriserna efter processen. DNA-kvantifiering visar en nästan 100% minskning av dECM jämfört med den ursprungliga vävnaden (figur 1C). DAPI-färgning bekräftar också frånvaron av DNA i dECM (figur 2B, D, F, H, J).
Närvaron av fem huvudsakliga ECM-proteiner utvärderades med immunhistokemi och med western blot efter decellularisering och jämfördes med den ursprungliga vävnaden. Immunfärgning för laminin α2-underenheten (figur 2A,B) och totala lamininer (figur 2C,D) visar att dECM uppvisar en rörformig färgning för dessa proteiner (pilar i figur 2B,D), liknande lamininmatrisen som omger myorör i den ursprungliga vävnaden (pilar i figur 2A,C). Western blot-analys för laminin α2-subenhet avslöjar närvaron av två band i den ursprungliga vävnaden (figur 2A'), medan tre band, med en mindre molekylvikt än förväntat, kan detekteras i dECM (figur 2B'). Detta kan vara resultatet av proteinnedbrytning eller avlägsnande under decellulariseringsprocessen. Western blot-analys för totala lamininer visar viss fragmentering av dessa proteiner i dECM jämfört med prover från den ursprungliga vävnaden (figur 2C',D').
Figur 1: Decellulariseringsprocedur för fosterskelettmuskulatur och utvärdering av vävnadsmorfologi och DNA-innehåll. (A) Schematisk representation av decellulariseringsprotokollet. (B) Vävnadsmorfologi genom hela protokollet, från nyinsamlad till decellulär vävnad. Skalstapel = 1 mm. (C) Kvantifiering av DNA i dECM jämfört med den ursprungliga vävnaden. Data uttryckt som medelvärde ± SEM. Studentens t-test, tvåsidigt **p < 0,01. Decellulariseringsprotokollet avlägsnar effektivt kärninnehåll som producerar acellulära dECM. Förkortningar: dECM = decellulariserade matriser; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; SDS = natriumdodecylsulfat; NT = naturlig vävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Immunfärgning för fibronektin (figur 2E,F) och kollagen I (figur 2G,H) visar närvaron av dessa proteiner i det interstitiella utrymmet mellan celler i den ursprungliga vävnaden (pilar i figur 2E,G) och en liknande färgning i dECM (pilarna figur 2F,H). Western blot-analys visar liknande band för fibronektin under båda förhållandena (figur 2E',F'), vilket indikerar att detta protein inte påverkas särskilt av decellulariseringsprocessen. När det gäller kollagen I (figur 2G',H') finns det dock färre band i dECM, vilket indikerar en viss grad av nedbrytning. Immunfärgning för kollagen IV visar ett rörformigt färgningsmönster i den ursprungliga vävnaden (pil i figur 2I) och en liknande färgning i dECM, även om de rörformiga strukturerna är smalare (pil i figur 2J). Western blot-analys för kollagen IV avslöjar närvaron av tre band i den ursprungliga vävnaden (figur 2I '). Medan samma tre band observeras i dECM (figur 2J'), är molekylvikten för dessa lägre än förväntat. På samma sätt som laminin α2 kan detta vara resultatet av proteinnedbrytning eller avlägsnande under decellulariseringen.
dECM sås sedan med C2C12-myoblaster och odlas i 8 dagar i komplett odlingsmedium. C2C12-celler koloniserar dECM och sprider sig, vilket visas av fosfohiston 3-kärnfärgning (pilar i figur 3A). Efter ytterligare 4 dagars odling i differentieringsmedium differentieras C2C12-celler och smälter samman till flerkärniga (blå pilar i figur 3B) myorör som uttrycker en myosin tung kedja (streckad linje i figur 3B). Intressant nog kan intracellulär och / eller pericellulär färgning för laminin α2-kedjan (gula pilar i figur 3C, D), totala lamininer (magenta pil i figur 3C) och fibronektin (magenta pil i figur 3D) detekteras i C2C12-celler odlade i komplett odlingsmedium, vilket tyder på att dessa celler kan syntetisera dessa ECM-proteiner de novo , vilket bidrar till bildandet av deras nisch. Dessa resultat visar att decellulariseringsprotokollet genererar en dECM-mikromiljö där C2C12-myoblaster kan föröka sig, differentiera och bilda flerkärniga myorör.
Figur 2: Bedömning av fem ECM-proteiner i nativ kontra decellulariserad E18.5 fostermuskelvävnad. Immunhistokemi på sektioner av naturlig vävnad (A,C,E,G,I) och färgning av dECM (B,D,F,H,J) med DAPI, en DNA-markör, falloidin som detekterar F-aktin, och för ECM-proteiner. Skalstång = 15 μm. I den ursprungliga vävnaden finns immunfärgning för lamininer och kollagen IV närvarande som omger myofibrerna (A, C, I; gula pilar) och färgning för fibronektin och kollagen I detekteras i det interstitiella utrymmet mellan myofibrer (E, G; gula pilar). I dECM visar färgning för lamininer och kollagen IV (B, D, J; gula pilar) ett rörformigt mönster som omger de utrymmen som lämnas av myofibrerna efter decellularisering. Fibronectin och kollagen I immunfärgning av dECM överensstämmer med deras närvaro i det interstitiella utrymmet (F,H; gula pilar). (A'-J') Western blot-analys för fem ECM-proteiner i naturlig vävnad (A',C',E',G',I') och i dECM-prover (B',D',F',H',J'). Båda metoderna visar proteinbevarande efter decellularisering. Använda antikroppar och respektive spädningar anges i tabell 1. Förkortningar: LNα2 = laminin α2-kedja; LNp = pan-muskellamininer; FN = fibronektin; Kol I = kollagen I; Kol IV = kollagen IV; MHC = myosin tung kedja. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: dECM-recellularisering med en myoblastcellinje (C2C12-myoblaster). (A) Projektion med maximal intensitet av en konfokal bild av en 100 μm stapel av recellulariserad matris, koloniserad med C2C12-celler märkta med metylgrönt färgnings-DNA, falloidindetektering av F-aktin och anti-pH3-antikropp, en spridningsmarkör (magentapilar). Skalstapel = 35 μm. (B) Projektion med maximal intensitet av en konfokal bild av en 100 μm stack som visar en flerkärnig (blå pilar indikerar kärnorna) myosin tung kedjepositiv myorör (streckad linje) bildad under odling. Skalstapel = 35 μm. (C,D) Immunohistokemi konfokal bild som visar intra- eller pericellulär färgning för laminin α2-kedja (gula pilar), totala lamininer (magentapilar i C) och fibronektin (magentapilar i D) i myoblaster, vilket tyder på de novo-proteinsyntes. Skalstång = 10 μm. Använda antikroppar och respektive spädningar anges i tabell 1. Förkortningar: pH3 = fosfohiston 3; LNα2 = laminin α2-kedja; LNp = pan-muskellamininer; FN = fibronektin; MHC = myosin tung kedja. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM är ett komplext nätverk av makromolekyler som finns i alla vävnader och spelar en avgörande roll för att reglera cellbeteende och funktion2. ECM fungerar som en fysisk ställning för celler att fästa vid och ger ledtrådar som aktivt modulerar cellulära processer som proliferation, motilitet, differentiering och apoptos. Således är korrekt bildning och underhåll av ECM avgörande för både utveckling och homeostas1.
Medan 2D-cellodlingsmodeller har använts i stor utsträckning, ersätts de alltmer av mer avancerade 3D-plattformar. Detta beror på att 2D-kulturer saknar de kemiska och fysiska signaler som påverkar cellbeteende, medan 3D-kulturer anses vara ett mer realistiskt alternativ för att studera molekylär och cellulär dynamik i inhemska vävnader11. Decellularisering av vävnader resulterar i produktion av byggnadsställningar som närmare efterliknar mikromiljöerna i biologiska vävnader, vilket visats i ett antal studier över olika vävnads- eller organsystem 14,15,23,24,25. Förmågan hos dECM att replikera naturliga vävnadsmikromiljöer har stor potential för forskning om normal utveckling, olika sjukdomstillstånd och effekten av läkemedel eller toxiner på vävnader11.
Protokollet som används i denna studie bygger på det protokoll som utvecklats av Silva et al. för decellularisering av fostrets hjärtvävnad14 som utgångspunkt. Det innebär en kombination av en hypoton buffert, behandling med ett anjoniskt tvättmedel (SDS) och en DNase-behandling. En av de största utmaningarna i decellulariseringsprotokoll är att hitta en balans mellan att ta bort celler och bevara ECM-proteinkompositionen. Med tanke på vårt fokus på att använda detta 3D-cellodlingssystem för att studera de tidiga stadierna av LAMA2-CMD, ägnades särskild uppmärksamhet åt att bevara laminin 211 under decellularisering. Protokollet för Silva et al.14 ledde till förlust av laminin α2-kedjeimmunoreaktivitet i de decellulariserade fostermusklerna; Detta kan bero på koncentrationen av SDS som används. Därför testades alternativ till 0,2% SDS-tvättmedelslösningssteget, såsom lägre koncentrationer av SDS (0,1%, 0,05% och 0,02%) och substitution av SDS med olika koncentrationer av Triton X-100 (0,5% och 0,2%). De bästa resultaten uppnåddes genom att använda 0,05% SDS-tvättmedelsbehandling i 24 timmar. Denna koncentration avlägsnade effektivt cellinnehållet samtidigt som laminin α2-kedjans immunoreaktivitet bevarades efter decellularisering. Detta protokoll producerar reproducerbara acellulära dECM som är fria från cellulära rester, inklusive DNA.
Protokollet som används i denna studie bevarar både interstitiella matrisproteiner (fibronektin och kollagen I) och basalmembranproteiner (lamininer och kollagen IV). Framtida studier bör bedöma om kollagen VI också bevaras, eftersom det också är en aktör i muskeldystrofier26. Det är känt att SDS kan störa proteinets ultrastruktur och skada kollagener12; För fostrets skelettmuskulatur var det viktigt att använda en låg koncentration av SDS (0,05%) för att upprätthålla laminin α2-immunreaktivitet. Western blot-resultaten visar emellertid att de decellulariserade proverna visar fler band efter immundetektion av lamininer och kollagener jämfört med den ursprungliga vävnaden, vilket indikerar att viss proteinnedbrytning inträffade som ett resultat av decellulariseringsprocessen27.
Det är viktigt att recellulariseringsexperimenten visar att dessa matriser är tillförlitliga byggnadsställningar som konsekvent stöder celladhesion, proliferation och differentiering. SDS har rapporterats vara cytotoxiskt28, och därför är tvättstegen som ingår i protokollet avgörande om matriserna ska användas för recellularisering. Dessa byggnadsställningar koloniserades effektivt av C2C12-celler, vilket indikerar deras lämplighet som modellsystem för 3D-odling av celler. Observationen av intracellulär och pericellulär färgning för ECM-proteiner som omger C2C12-cellerna tyder vidare på att cellerna aktivt bidrar till sin mikromiljö inom dECM. Dessutom, när de placerades i differentieringsmedium, differentierade, smälte och bildade C2C12-cellerna myorör inom dECM.
En betydande utmaning i denna procedur är manipuleringen av proverna i hela protokollet. Proverna är mycket små och mjuka, vilket kräver omsorg och skicklighet i hanteringen för att förhindra att den fastnar i finspetspipetten och att proverna går förlorade. De bästa resultaten erhålls när protokollet startas med färsk vävnad. Användning av frysta, lagrade prover kan hindra borttagning av cellulärt innehåll och leda till ökad proteinnedbrytning, vilket hindrar proteindetektering och minskar decellulariseringseffektiviteten.
Endast ett fåtal studier har rapporterat decellularisering av fostervävnader 15,29,30,31. Specifikt, när det gäller decellularisering av fostrets skelettmuskulatur, har endast en tidigare studie rapporterat om decellularisering av kompositprover av dermis, subkutan vävnad och panniculus carnosus31. Så vitt författarna vet är detta första gången som ett decellulariseringsprotokoll för isolerad fostermuskulaturen har upprättats. Detta protokoll kan tjäna som grund för skapandet av liknande protokoll för fostermuskelvävnader av andra arter, såsom grisar och människor13.
Det nuvarande protokollet för decellularisering av E18.5 musskelettmuskulatur är mycket likt proceduren för Silva et al.14, som applicerade den på ett E18-mushjärta. Den enda skillnaden är koncentrationen av SDS som används, vilket är betydligt lägre än den som används för fostrets hjärta (0,05% mot 0,2%), möjligen på grund av olika fysikaliska egenskaper hos dessa två fostervävnader.
Utvecklingen av denna in vitro-modell möjliggör inte bara studier av de processer som är involverade i normal fostermuskelutveckling, utan möjliggör också parallell undersökning av tidigt debuterande muskeldystrofier och myopatier, såsom LAMA2-CMD, vilket manifesterar sig som en myogenesdefekt vid E18.5 i dy W-musmodell 10. Det bör dock noteras att detta system är begränsat genom att det endast inkluderar ECM och muskelceller och inte innehåller andra celltyper såsom neuroner, endotelceller och fibroblaster. Relevansen av dessa ytterligare celltyper kan variera beroende på sjukdomen, och modifieringar av odlingssystemet kan behövas för att inkludera dem. Sammantaget kan användningen av dECM som beskrivs i denna studie tillämpas i studien av olika tidiga muskeldystrofier och myopatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr 23049), MATRIHEALTH-projektet och cE3c-enheten som finansierar UIDB/00329/2020. Vi vill tacka vår donator Henrique Meirelles som valde att stödja MATRIHEALTH-projektet. Detta arbete gynnades av infrastrukturen vid naturvetenskapliga fakultetens mikroskopianläggning, en nod i den portugisiska plattformen för bioavbildning (referens PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), och vi tackar Luís Marques för hans hjälp med bildförvärv och bearbetning. Slutligen tackar vi Marta Palma för teknisk support och vår forskargrupp för deras generösa bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
