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Developmental Biology

सेल कल्चर के लिए भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी से 3 डी डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस की तैयारी

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65069
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

Summary

इस काम में, भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी के डीसेलुलराइज्ड मैट्रिसेस प्राप्त करने के लिए एक डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट ्स इन मैट्रिक्स को उपनिवेशित कर सकते हैं, प्रसार कर सकते हैं और अंतर कर सकते हैं। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों जैसे मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी के संदर्भ में सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोशिकाओं के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने और संकेतों को व्यक्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। दो-आयामी (2 डी) सेल कल्चर मॉडल कोशिकाओं और ईसीएम के बीच जटिल बातचीत को अधिक सरल बनाते हैं, क्योंकि पूर्ण त्रि-आयामी (3 डी) समर्थन की कमी सेल व्यवहार को बदल सकती है, जिससे उन्हें विवो प्रक्रियाओं में समझने के लिए अपर्याप्त बना दिया जाता है। ईसीएम संरचना और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन में कमी विभिन्न बीमारियों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता हैं।

एक उदाहरण एलएएमए 2-जन्मजात मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी (एलएएमए 2-सीएमडी) है, जहां कार्यात्मक लैमिनिन 211 और 221 की अनुपस्थिति या कमी से गंभीर हाइपोटनी हो सकती है, जो जन्म के समय या उसके तुरंत बाद पता लगाया जा सकता है। रोग के माउस मॉडल का उपयोग करके पिछले काम से पता चलता है कि इसकी शुरुआत भ्रूण मायोजेनेसिस के दौरान होती है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक 3 डी इन विट्रो मॉडल विकसित करना है जो मांसपेशियों की कोशिकाओं और भ्रूण की मांसपेशी ईसीएम के बीच बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है, जो देशी माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करता है। यह प्रोटोकॉल ई 18.5 माउस भ्रूण से विच्छेदित गहरी पीठ की मांसपेशियों का उपयोग करता है, एक हाइपोटोनिक बफर, एक आयनिक डिटर्जेंट और डीनेस के साथ इलाज किया जाता है। परिणामी डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस (डीईसीएम) ने देशी ऊतक की तुलना में परीक्षण किए गए सभी ईसीएम प्रोटीन (लैमिनिन ए 2, कुल लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन I और कोलेजन IV) को बरकरार रखा।

जब सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स को इन डीईसीएम के शीर्ष पर बीज दिया गया था, तो उन्होंने डीईसीएम में प्रवेश किया और उपनिवेश किया, जिसने उनके प्रसार और भेदभाव का समर्थन किया। इसके अलावा, सी 2 सी 12 कोशिकाओं ने ईसीएम प्रोटीन का उत्पादन किया, जो डीईसीएम के भीतर उनके आला के रीमॉडेलिंग में योगदान देता है। इस इन विट्रो प्लेटफॉर्म की स्थापना एलएएमए 2-सीएमडी की शुरुआत में शामिल प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए एक नया आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करती है, और इसमें अन्य कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों के लिए अनुकूलित होने की क्षमता है जहां ईसीएम और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के बीच संचार में कमी रोग की प्रगति में योगदान करती है।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतकों का एक प्रमुख घटक है, जो उनके गैर-सेलुलर घटक का प्रतिनिधित्व करता है। यह त्रि-आयामी (3 डी) संरचना न केवल कोशिकाओं के लिए भौतिक समर्थन प्रदान करती है, बल्कि जीवों के विकास में शामिल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती है। ऊतक-विशिष्ट ईसीएम का गठन विकास के दौरान होता है, जो कोशिकाओं और उनके niches के बीच जटिल बातचीत के परिणामस्वरूप होता है, जो विभिन्न इंट्रा- और बाह्य उत्तेजनाओं से प्रभावित होता है। ईसीएम एक अत्यधिक गतिशील संरचना है जो अस्थायी-स्थानिक तरीके से रासायनिक और यांत्रिक पुनर्व्यवस्था से गुजरती है और सीधे सेल भाग्य2 को प्रभावित करती है। ईसीएम की सबसे उल्लेखनीय विशेषताओं में से एक इसकी कार्यात्मक विविधता है, क्योंकि प्रत्येक ऊतक ईसीएम अणुओं का एक अनूठा संयोजन प्रदर्शित करता है जो विभिन्न टोपोलॉजी और गुण प्रदान करते हैं जोइसमें मौजूद कोशिकाओं के अनुरूप होते हैं।

ईसीएम सिग्नलिंग और समर्थन विकास और होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं, और जब बाधित होता है तो कई रोग संबंधी स्थितियां हो सकती हैं 3,4. एक उदाहरण एलएएमए 2-कमी जन्मजात डिस्ट्रॉफी (एलएएमए 2-सीएमडी) है, जो जन्मजात मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी का सबसे आम रूप है। एलएएमए 2 जीन लैमिनिन ए 2 श्रृंखला के लिए एन्कोड करता है, जो लैमिनिन 211 और लैमिनिन 221 में मौजूद है, और जब उत्परिवर्तित होता है तो एलएएमए 2-सीएमडी 5 हो सकता है। लैमिनिन 211 कंकाल की मांसपेशी फाइबर के आसपास तहखाने की झिल्ली में पाया जाने वाला मुख्य आइसोफॉर्म है। जब लैमिनिन 211 असामान्य या अनुपस्थित होता है, तो तहखाने की झिल्ली और मांसपेशियों की कोशिकाओं के बीच की कड़ी बाधित हो जाती है, जिससे रोगकी शुरुआत होती है। एलएएमए 2-सीएमडी वाले रोगी एलएएमए 2 जीन में उत्परिवर्तन के प्रकार के आधार पर हल्के से गंभीर फेनोटाइप दिखाते हैं।

जब लेमिनिन ए 2 प्रोटीन का कार्य प्रभावित होता है, तो रोगी जन्म के समय गंभीर मांसपेशी हाइपोटोनिया का अनुभव कर सकते हैं और पुरानी सूजन, फाइब्रोसिस और मांसपेशी शोष विकसित कर सकते हैं, जिससे जीवन प्रत्याशा कम हो जाती है। आज तक, कोई लक्षित उपचार विकसित नहीं किया गया है और चिकित्सीयदृष्टिकोण रोग के लक्षणों को कम करने तक सीमित हैं। इसलिए, इस बीमारी की शुरुआत में शामिल अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना उचितचिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एलएएमए 2-सीएमडी के लिए एक मॉडल डीवाईडब्ल्यू माउस9 का उपयोग करने वाले पिछले काम से पता चलता है कि बीमारी की शुरुआत गर्भाशय में शुरू होती है, विशेष रूप से भ्रूण मायोजेनेसिस10 के दौरान। भ्रूण मायोजेनेसिस दोष कैसे उभरता है, इसकी बेहतर समझ एलएएमए 2-सीएमडी के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण पैदा करने में एक गेम चेंजर होगी।

इन विट्रो सिस्टम सेल-सेल और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करते हैं, लेकिन 2 डी कल्चर मॉडल में देशी ऊतकों की जटिलता की कमी होती है। ऊतकों का विकोशिकीयकरण ऊतक- और विकासात्मक चरण-विशिष्ट एककोशिकीय ईसीएम मचानों का उत्पादन करता है जो 2 डी मॉडल और इंजीनियर / सिंथेटिक मचानों की तुलना में प्राकृतिक सेल माइक्रोएन्वायरमेंट की अधिक सटीक नकल करते हैं। डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस (डीईसीएम) में मेजबान ऊतक के आणविक और यांत्रिक संकेतों को संरक्षित करने की क्षमता होती है, जिससे उन्हें विवो प्रक्रियाओं में समझने के लिए बेहतर वैकल्पिक मॉडल मिलते हैं।

विभिन्न तकनीकें, अभिकर्मक और स्थितियां हैं जिनका उपयोग विकोशिकीयकरण12,13 के लिए किया जा सकता है। इस अध्ययन में, सिल्वा एट अल .14,15 द्वारा वर्णित भ्रूण माउस दिल के लिए एक डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल, भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया जाता है और सभी परीक्षण किए गए ईसीएम घटकों (लैमिनिन ए 2, कुल लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन I और कोलेजन IV) को बनाए रखने के लिए पाया जाता है। प्रोटोकॉल में तीन चरण शामिल हैं: आसमाटिक शॉक (हाइपोटोनिक बफर), प्लाज्मा झिल्ली विघटन और प्रोटीन पृथक्करण (0.05% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [एसडीएस]), और डीएनए के एंजाइमेटिक विनाश (डीनेस उपचार)। हमारे ज्ञान के लिए, यह माउस भ्रूण कंकाल की मांसपेशियों को डीसेल्युलर करने के लिए पहला स्थापित प्रोटोकॉल है।

एलएएमए 2-सीएमडी का अध्ययन करने के लिए इस 3 डी इन विट्रो सिस्टम का उपयोग करने के लिए, डीसेलुलराइजेशन के बाद लैमिनिन ए 2 श्रृंखला को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक अनुकूलन प्रोटोकॉल लागू किया गया था जहां विभिन्न डिटर्जेंट (एसडीएस और ट्राइटन एक्स -100) और सांद्रता (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, और 0.5%) का परीक्षण किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)। लेमिनिन ए 2 प्रोटीन के सेल हटाने और संरक्षण के लिए इष्टतम विकल्प 0.05% एसडीएस पाया गया था। सी 2 सी 12 कोशिकाएं, एक अच्छी तरह से स्थापित मायोब्लास्ट सेल लाइन16,17, का उपयोग डीईसीएम को बीज देने के लिए किया गया था। ये कोशिकाएं डीईसीएम पर आक्रमण करती हैं, प्रसार करती हैं, और इन मचानों के अंदर अंतर करती हैं, नए ईसीएम प्रोटीन को संश्लेषित करती हैं। इस 3 डी इन विट्रो मॉडल का सफल उत्पादन भ्रूण के मायोजेनेसिस में शामिल आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, एलएएमए 2-सीएमडी की शुरुआत, और इसे अन्य मांसपेशियों की बीमारियों तक बढ़ाया जा सकता है जहां ईसीएम और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के बीच संचार बाधित होता है।

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Protocol

वर्णित सभी पद्धतियों को विज्ञान संकाय, लिस्बन विश्वविद्यालय की पशु कल्याण समिति (ओआरबीईए) और डीरेको गेराल डी वेटेरिनेरिया (डीजीएवी; रेफरी 0421/000/000/2022) द्वारा अनुमोदित किया गया था, और यूरोपीय निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार हैं।

1. डीसेल्युलराइजेशन बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों को ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए और 3 महीने तक संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा न कहा जाए।

  1. 137 एमएम पर सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 2.68 एमएम पर पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 8.1 एमएम पर पोटेशियम-डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (केएच 2 पीओ 4) और 1.47 एमएम पर डिसोडियम-हाइड्रोजन-फॉस्फेट डाइहाइड्रेट (एनए2एचपीओ4) जोड़कर10एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (10 x पीबीएस) तैयार करें और पीएच को 6.8 पर समायोजित करें। 1x PBS उत्पन्न करने के लिए 10x PBS के 100 mL को 900 mL डिमिनरलाइज्डH2Oमें जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर आटोक्लेव और स्टोर। स्ट्रेप्टोमाइसिन स्टॉक समाधान (10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन और 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन [पेन / स्ट्रेप]) को उपयोग से पहले 1% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  2. 1.21 ग्राम ट्राइस (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन (ट्रिस बेस) और 1 ग्राम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) को डीएच2ओ (10 एमएम ट्रिस बेस 0.1% ईडीटीए) के 1 एल में घोलकर हाइपोटोनिक बफर तैयार करें। घुलने तक चुंबकीय हलचल का उपयोग करें और NaOH / HCl के साथ pH को 7.8 तक समायोजित करें। ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें और RT पर स्टोर करें। उपयोग से पहले 1% की अंतिम एकाग्रता में पेन / स्ट्रेप जोड़ें।
  3. 1 लीटर डीएच2ओ (10 एमएम ट्रिस बेस) में 1.21 ग्राम ट्रिस बेस को घोलकर हाइपोटोनिक वॉश बफर तैयार करें। घुलने तक चुंबकीय हलचल का उपयोग करें और पीएच को NaOH / HCl. ऑटोक्लेव के साथ 7.8 तक समायोजित करें और RT पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले पेन / स्ट्रेप को 1% तक जोड़ें।
  4. 0.05% एसडीएस उपचार समाधान का उत्पादन करने के लिए 100 एमएल हाइपोटोनिक वॉश बफर में 0.05 ग्राम सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) जोड़कर आयनिक डिटर्जेंट उपचार तैयार करें। 0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 1 महीने तक आरटी पर स्टोर करें।
    नोट: एसडीएस समाधान को आटोक्लेव नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि एसडीएस ऑटोक्लेविंग पर अवक्षेपित और अवक्रमित होता है।
  5. डीएच2ओ के 0.5 एमएल में 1.21 ग्राम ट्रिस बेस को घोलकर डीनेस उपचार समाधान तैयार करें और 1 एमएल 1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2) जोड़ें। NH को NaOH/HCl. ऑटोक्लेव के साथ 7.8 पर समायोजित करें और RT पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले DNase I जोड़ें (50 U/mL)।

2. नमूना संग्रह

नोट: अध्ययन में जंगली प्रकार सी 57 / बीएल 6 चूहों का उपयोग किया गया था। सभी तकनीकों को बाँझ परिस्थितियों में एक लामिनर प्रवाह हुड में आयोजित किया गया था।

  1. गर्भावस्था के भ्रूण दिवस (ई) 18.5 पर वयस्क गर्भवती महिला चूहों को आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन का उपयोग करके इच्छामृत्यु करें, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था होती है। भ्रूण को निकालने के लिए चूहों को टर्मिनल विच्छेदन के अधीन करें।
    1. माउस के पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    2. सर्जिकल बल और कैंची का उपयोग करके, पेट के निचले हिस्से में त्वचा की एक तह उठाएं और पेट की गुहा को उजागर करने के लिए यू-आकार का चीरालगाएं।
    3. गर्भाशय के सींगों को इकट्ठा करें जिसमें ई 18.5 भ्रूण होते हैं, अंडाणुओं और गर्भाशय ग्रीवा को काटकर और तुरंत उन्हें 1% पेन / स्ट्रेप18 के साथ बर्फ-ठंडे 1 x पीबीएस के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    4. गर्भाशय और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक ऊतकों से भ्रूण को जल्दी से हटा दें और कैंची18 का उपयोग करके उन्हें डिकैपिटेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें।
  2. एक समय में एक भ्रूण को बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, त्वचा को हटा दें और अंगों को काट दें। उदर पक्ष से, रिबकेज के माध्यम से काटें और उरोस्थि और अंतर्निहित अंगों को हटा दें।
  3. भ्रूण के ट्रंक पृष्ठीय पक्ष को ऊपर की ओर पलटें। कशेरुक स्तंभ के ग्रीवा भाग, पृष्ठीय वसा जमा, और गहरी पीठ की मांसपेशियों के शीर्ष पर संयोजी ऊतक को हटा दें।
  4. रिबकेज को लंगर डालने के लिए सर्जिकल फोर्स का उपयोग करें और माइक्रो स्केलपेल10 का उपयोग करके आसपास के ऊतकों से गहरी पीठ की मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक खुरचें और अलग करें। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप प्रति भ्रूण (बाएं और दाएं) दो मांसपेशियों के टुकड़ों का अलगाव होता है, दोनों मुख्य रूप से लॉन्गिसिमस और इलियोकोस्टलिस मांसपेशियों से बने होते हैं, जिसमें कुछ ट्रांसवर्सोस्पाइनल और लेवेटर कोस्टरम मांसपेशियां शामिल होती हैं।
  5. मांसपेशियों के नमूनों को अल्पकालिक भंडारण (<1 सप्ताह) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% पेन / स्ट्रेप के साथ 1x पीबीएस में स्टोर करें, या लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा एकत्र किए गए नमूने का उपयोग करें। विस्तारित अवधि (>3 महीने) के लिए जमे हुए नमूने कम डीसेलुलराइजेशन दक्षता और अधिक प्रोटीन गिरावट दिखाते हैं। एपिक्सियल मांसपेशी द्रव्यमान का उपयोग विकोशिकीय प्रयोगों के लिए किया गया था, लेकिन अन्य मांसपेशियों (जैसे, अंग की मांसपेशियों) को एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीसेलुलराइजेशन के लिए संसाधित किया जा सकता है।

3. भ्रूण कंकाल की मांसपेशी विकोशिकीयकरण।

नोट: सभी तकनीकों को बाँझ परिस्थितियों में एक लामिनर प्रवाह हुड में आयोजित किया गया था। एक विस्तृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए, चित्रा 1 ए देखें। सभी चरणों को 25 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिमी (165 आरपीएम) के व्यास के साथ एक कक्षीय शेकर में आंदोलन के साथ किया गया था जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो। उपयोग करने से पहले समाधान में 1% पेन / स्ट्रेप जोड़ें। समाधान ों को हटाते समय, पिपेट में नमूना फंसाने से बचने के लिए सावधानी पूर्वक एस्पिरेट करें।

  1. दिन 1 - एपिक्सियल मांसपेशी द्रव्यमान से लगभग 2 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी (~ 3.5 मिलीग्राम) ऊतक टुकड़े तैयार करें। 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1% पेन / स्ट्रेप के साथ 3 मिलीलीटर हाइपोटोनिक बफर जोड़ें और प्रति अच्छी तरह से एक पूरे मांसपेशी ऊतक का टुकड़ा जोड़ें।
    1. ऊतक के टुकड़ों को हाइपोटोनिक बफर में 18 घंटे (रात भर) (ओ / एन) के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 2 - एक फाइन-टिप पिपेट का उपयोग करके हाइपोटोनिक बफर को एस्पिरेट करें और हर बार आंदोलन के साथ 3 x 1 लीटर 1 x पीबीएस के साथ 3 x 1 घंटे के नमूने धोएं।
    1. आंदोलन के साथ 0.05% एसडीएस डिटर्जेंट समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ 24 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
      नोट: (चेक पॉइंट) एसडीएस इनक्यूबेशन के बाद, नमूने दिखने में पारदर्शी होना चाहिए। नमूने जिलेटिन जैसी स्थिरता प्रदर्शित करते हैं और इसलिए, तरल पदार्थ को हटाते समय पिपेट का पालन करने के लिए अधिक प्रवण होते हैं।
  3. दिन 3 - एक ठीक-टिप पिपेट का उपयोग करके एसडीएस डिटर्जेंट समाधान को हटा दें और आंदोलन के साथ हर बार हाइपोटोनिक वॉश बफर के 3 एमएल के साथ ऊतक के टुकड़े 3 x 20 मिनट धो लें।
    नोट: (विराम बिंदु) नमूने को 18 घंटे (ओ / एन) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइपोटोनिक वॉश बफर में बनाए रखा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि धोने के चरणों के दौरान एसडीएस को अच्छी तरह से हटा दिया जाता है, क्योंकि अवशिष्ट एसडीएस साइटोटोक्सिक हो सकता है।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ 2 मिलीलीटर डीनेस समाधान के साथ 3 घंटे के लिए ऊतक के टुकड़ों को इनक्यूबेट करें।
    2. एक फाइन-टिप पिपेट का उपयोग करके DNase समाधान को निकालें और आंदोलन के साथ हर बार 1x PBS के 3 mL के साथ 3 x 20 मिनट ऊतक के टुकड़े धोएं। अंत में, आंदोलन (60 आरपीएम) के साथ ओ / एन धो लें।
      नोट: DNase उपचार के बाद, डीएनए अवशेषों की उपस्थिति के कारण DECM चिपचिपा हो जाता है। इसलिए, सावधानीपूर्वक धोना आवश्यक है।
    3. डीईसीएम को 1x पीबीएस में 1% पेन / स्ट्रेप के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्कोशिकीयकरण (<1 सप्ताह) तक स्टोर करें। अन्य उपयोगों के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. डीसेल्युलराइजेशन गुणवत्ता मूल्यांकन

नोट: डीसेलुलराइजेशन के बाद अवशिष्ट सेल सामग्री की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए डीएनए परिमाणीकरण, डीएपीआई / मिथाइल ग्रीन स्टेनिंग, और फैलोइडिन स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण डीसेलुलराइजेशन के बाद प्रमुख ईसीएम प्रोटीन के प्रतिधारण का आकलन करने के लिए आयोजित किए गए थे।

  1. डीईसीएम में मौजूद डीएनए का परिमाणीकरण।
    नोट: डीएनए की उपस्थिति का पता लगाने के लिए डीईसीएम की तुलना देशी ऊतक से की जानी चाहिए।
    1. डीसेल्युलराइजेशन से पहले, उच्च परिशुद्धता डिजिटल पैमाने पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब का वजन करें। मांसपेशियों के नमूने को ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले, पेपर तौलिया का उपयोग करके शेष सभी 1x पीबीएस को हटा दें। नमूने के साथ ट्यूब का वजन करें। समीकरण (1) का उपयोग करके नमूने के गीले वजन की गणना करें:
      नमूनागीला वजन =नमूने के साथ वजन ट्यूब- वजनखाली ट्यूब (1)
    2. अनुभाग 3 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए नमूनों को विकोशिकीय करें।
    3. नमूने को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें।
      नोट: डीएनए निष्कर्षण और परिमाणीकरण तक नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर रखे जा सकते हैं।
    4. स्पिन कॉलम-आधारित किट का उपयोग करके डीईसीएम और देशी ऊतक के नमूनों का डीएनए निष्कर्षण करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पाचन बफर जोड़ें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में एक टंगस्टन कार्बाइड मोती (ठंडा ट्यूब माउंट का उपयोग करके) का उपयोग करके 2.5 मिनट के लिए दो बार मोती मिल में नमूनों को समरूप करें (माउंट को फ्लिप करें)।
    6. प्रोटीन के जोड़ें और 56 डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से आंदोलन के साथ ओ / एन को इनक्यूबेट करें।
    7. निर्माता के निर्देशों में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    8. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए बफर के साथ इल्यूट और डीएनए उपज बढ़ाने के लिए हर बार 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज 2 x 1 मिनट।
      नोट: डीएनए को परिमाणीकरण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    9. निर्माता के निर्देशों के बाद फ्लोरोसेंट डीएसडीएनए डिटेक्शन किट का उपयोग करके नमूनों में मौजूद डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    10. नमूने के मूल गीले वजन के प्रति मिलीग्राम डीएनए के नैनोग्राम के रूप में डीएनए सामग्री को सामान्य करें।
    11. दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें और माध्य (एसईएम) के औसत ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त करें।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
    नोट: समाधान 1, 2, और 3 और फिक्सेटिव समाधान उपयोग से पहले तैयार किया जाना चाहिए और 6 महीने तक जमे हुए रखा जा सकता है। उपयोग किए गए सभी एंटीबॉडी और रंजक और संबंधित कमजोर पड़ने को सूचीबद्ध किया गया है: तालिका 1.
    1. समाधान की तैयारी
      1. 2 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए), 8 ग्राम सुक्रोज, और 1 एम सीएसीएल 2 के 24 μL 0.2 M Na 2 HPO 4 के 77 mL और 0.2 M NaH 2 PO 4 के 23 mL को dH2O जोड़कर 200 mL की अंतिम मात्रा में फिक्सेटिव घोलतैयार करें। pHको7.4 तक समायोजित करें।
      2. 13.5 ग्राम Na 2 HPO 4 और 3.2 g NaH 2 PO4 से 1 L dH2O जोड़कर 0.12 M फॉस्फेट बफर तैयार करें।
      3. 0.12 एम फॉस्फेट बफर के 100 एमएल में 4 ग्राम सुक्रोज जोड़कर समाधान 1 तैयार करें।
      4. 0.12 एम फॉस्फेट बफर के 100 एमएल में 15 ग्राम सुक्रोज जोड़कर समाधान 2 तैयार करें।
      5. 0.12 एम फॉस्फेट बफर के 100 एमएल में 15 ग्राम सुक्रोज और 7.5 ग्राम जिलेटिन जोड़कर समाधान 3 तैयार करें। जिलेटिन घुलने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
      6. मिथाइल ग्रीन स्टॉक समाधान तैयार करें (डीएच 2 ओ में घुलने वाला2% मिथाइल ग्रीन पाउडर)19।
    2. इम्यूनोडिटेक्शन
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए फिक्सेटिव समाधान का उपयोग करके नमूने ठीक करें।
      2. 1x PBS के साथ 10 मिनट के लिए नमूने 2x धोएं।
      3. O/N, या 1 दिन से अधिक, घोल 1 में 4 °C पर रखें।
      4. O/N या 1 दिन से अधिक समय तक घोल 2 में 4 डिग्री सेल्सियस पर धोकर रखें। नमूने को आरटी के लिए गर्म होने दें।
      5. 37 डिग्री सेल्सियस पर घोल 3 में 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में उपयोग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त समाधान 3 रखें।
      6. एल्यूमीनियम पन्नी में छोटे (2 सेमी x 1 सेमी x 1 सेमी) कंटेनर मोल्ड। मोल्ड कंटेनर में घोल 3 की एक पतली परत रखें और इसे सेट होने दें। नमूने को ठोस समाधान 3 पर रखें और गर्म समाधान 3 के साथ कवर करें। नमूनों को उन्मुख करें और उन्हें ठोस होने दें। एक रंगीन पेन के साथ ठोस समाधान 3 पर स्थान चिह्नित करें।
      7. कंटेनरों को सूखी बर्फ-ठंडा या तरल नाइट्रोजन-ठंडा आइसोपेंटेन की सतह पर रखकर फ्रीज करें।
      8. इष्टतम काटने के तापमान (ओ.सी.टी.) यौगिक का उपयोग करके, नमूने युक्त जमे हुए जिलेटिन क्यूब्स को क्रायोस्टैट माउंट पर ठीक करें।
      9. जमे हुए जिलेटिन क्यूब्स को सेक्शन करें और ऊतक वर्गों को स्लाइड्स में स्थानांतरित करें। उन्हें 60 मिनट के लिए सूखने दें।
      10. अनुभागों के चारों ओर एक रेखा का पता लगाने के लिए एक हाइड्रोफोबिक मार्कर का उपयोग करें।
      11. स्लाइड्स को 1x PBS में 3 x 10 मिनट धो लें।
      12. 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), 1% बकरी सीरम और 0.05% ट्राइटन एक्स -100 के साथ 30 मिनट (ब्लॉकिंग स्टेप) के लिए 1x पीबीएस (ब्लॉकिंग समाधान) में पतला वर्गों को कवर करें।
      13. ब्लॉकिंग समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और वर्गों को कवर करें। अनुभागों को सूखने से रोकने के लिए, नम कागज के साथ एक बंद बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन को इनक्यूबेट करें।
      14. स्लाइड्स को 1x PBS के साथ 3 x 10 मिनट धो लें।
      15. ब्लॉकिंग समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें और वर्गों को कवर करें। अंधेरे में आरटी पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: फ्लोरोफोरे क्षरण को रोकने के लिए प्रकाश जोखिम से बचें।
      16. स्लाइड्स को 4x PBS के साथ 3 x 10 मिनट धो लें।
        नोट: पीबीएस की उच्च एकाग्रता का उपयोग तब किया जा सकता है जब एक मजबूत पृष्ठभूमि मौजूद हो।
      17. प्रत्येक 30 सेकंड के लिए DAPI समाधान (5 μg/mL 1,4-diazabicyclo-2,2,2-ऑक्टेन में 0.1% ट्राइटन X-100/1x PBS) में स्लाइड ्स को डुबोएं।
      18. 1x PBS में धो लें।
      19. खंडों को एंटी-लुप्त माध्यम (1x PBS में 50 mg / mL n-propyl-गैलेट में माउंट करें: ग्लिसरॉल [1: 9]) और कवरस्लिप के साथ सील करें। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप20 में अवलोकन और छवि अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: इनटोटो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के लिए, एक ही प्रोटोकॉल (चरण 4.2.2.12-4.2.2.18 देखें) का उपयोग किया गया था, सिवाय इसके कि नमूने पहले आरटी पर 3 घंटे के लिए 1x पीबीएस में पतला 4% पीएफए में तय किए गए थे। उपयोग किए गए सभी एंटीबॉडी और रंजक, और उनके संबंधित कमजोर पड़ने, तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। नमूनों को तब स्टील के छल्ले द्वारा अलग किए गए दो कवरलिप्स के बीच एंटी-लुप्त माध्यम में रखा गया था, मधुमक्खियों के साथ एक साथ चिपकाया गया था, और 100 μm छवि स्टैक को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप21 का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।
  3. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
    नोट: उपयोग किए गए सभी एंटीबॉडी और संबंधित कमजोर पड़ने में सूचीबद्ध हैं तालिका 1.
    1. समाधान की तैयारी
      1. 2x SDS-PAGE लोडिंग बफर को 20 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 4 ग्राम SDS, और 0.2 mL ब्रोमोफेनॉल ब्लू को 100 mM Tris बेस समाधान के 80 mL में जोड़कर तैयार करें। पीएच को 6.8 पर समायोजित करें। उपयोग करने से पहले ताजा डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) जोड़ें।
      2. 2.4 ग्राम ट्रिस बेस, 8.8 ग्राम एनएसीएल, और 1 एमएल ट्वीन-20 से डीएच2ओ को 1 एल की अंतिम मात्रा में जोड़कर ट्वीन 20 (टीबीएसटी) समाधान के साथ ट्रिस बफर्ड सलाइन वॉश बफर तैयार करें।
      3. 30.2 ग्राम ट्रिस बेस, 144.2 ग्राम ग्लाइसिन और 10 ग्राम एसडीएस को डीएच2ओ के 1 एल में जोड़कर 10एक्स रनिंग बफर (आरबी) तैयार करें। उपयोग करने से पहले, 1x RB (कार्यशील समाधान) तैयार करने के लिए 10x RB के 100 mL से 900 mL dH2O जोड़ें।
        नोट: जबकि 10x RB को कई महीनों तक RT में संग्रहीत किया जा सकता है, 1x RB को विभिन्न रन पर पुन: उपयोग किया जा सकता है।
      4. 5.82 ग्राम ट्रिस बेस, 2.93 ग्राम ग्लाइसिन और 0.5 ग्राम एसडीएस को डीएच2ओ के 800 एमएल में जोड़कर ट्रांसफर बफर (टीबी) तैयार करें। घटकों को भंग करने के बाद, मेथनॉल के 200 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
        नोट: टीबी को हर उपयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
    2. प्रोटीन निष्कर्षण
      1. E18.5 चूहों से एपिक्सियल मांसपेशियों को इकट्ठा करें और तुरंत उन्हें एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (2 एमएल) में रखें जिसमें ताजा जोड़े गए डीटीटी (100 एमएम डीटीटी) के साथ 2x SDS-PAGE लोडिंग बफर हो। E18.5 decm को उसी तरह से संसाधित करें।
      2. प्रति ट्यूब एक टंगस्टन कार्बाइड मोती जोड़ें। हर बार 2.5 मिनट के लिए एक मोती मिल में 2x को समरूप करें (माउंट को फ्लिप करें)।
      3. एक अल्ट्रासाउंड स्नान में 5 मिनट के लिए नमूने को सोनिकेट करें।
      4. नमूने को 50 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्म करें।
      5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
      6. सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      7. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
      8. आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन
      1. प्रीकास्ट एक्रिलामाइड ग्रेडिएंट जेल (4% -20%) का उपयोग करें
      2. वैद्युतकणसंचलन टैंक में जेल माउंट करें। कंघी को सावधानी से निकालें। वैद्युतकणसंचलन टैंक में प्रदर्शित लाइन तक 1x आरबी जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कुएं आरबी से भरे हुए हैं।
      3. कुओं में प्रति नमूना 100 μg प्रोटीन लोड करें। उच्च आणविक भार प्रोटीन मानक के 12 μL लोड करें।
      4. निरंतर वोल्टेज के साथ कुल 100 मिनट के लिए दौड़ें (150 वी पर 10 मिनट और 185 वी पर 90 मिनट)।
    4. तबादला
      1. जब जेल चल रहा हो तो फ़िल्टर पैड और स्पंज को ठंडा टीबी (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ भिगोदें।
      2. पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड झिल्ली को जेल के आकार में काटें। उन्हें मेथनॉल के साथ सक्रिय करें और डीएच2ओ से धो लें।
      3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पंज, फिल्टर पैड, जैल और सक्रिय झिल्ली के साथ स्थानांतरण कैसेट माउंट करें।
      4. कैसेट को वैद्युतकणसंचलन टैंक में रखें जिसमें ठंडा टीबी (बर्फ के बिस्तर पर) होता है। शीतलन इकाई जोड़ें। 100 वोल्ट पर 90 मिनट के लिए दौड़ें।
      5. स्थानांतरण के बाद, स्थानांतरण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कूमासी नीले रंग के विकल्प के साथ दाग लगाएं।
    5. इम्यूनोडिटेक्शन
      1. ब्लॉकिंग समाधान (5% कम वसा वाले दूध के साथ टीबीएसटी) तैयार करें। आरटी में 1 घंटे के लिए आंदोलन के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
      2. टीबीएसटी के साथ 3 x 5 सेकंड कुल्ला करें।
      3. टीबीएसटी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली ओ /एन को 2% बीएसए और 0.02% सोडियम एजाइड (3 एमएल प्रति झिल्ली) के साथ एक ठंडे कक्ष (4 डिग्री सेल्सियस) में आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
      4. अगले दिन, टीबीएसटी के साथ 3 x 5 मिनट धो लें।
      5. आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% कम वसा वाले दूध (प्रत्येक झिल्ली के लिए 5 एमएल) के साथ टीबीएसटी में पतला होने वाले हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
      6. टीबीएसटी 3 x 5 मिनट के साथ झिल्ली धो लें। पता लगाने के चरण तक टीबीएसटी में रखें।
      7. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकासशील किट का उपयोग करके प्रोटीन की कल्पना करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पहचान अभिकर्मकों को जोड़ें। बैंड की छवियां प्राप्त करें।
      8. प्रति झिल्ली एक से अधिक एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए, पता लगाने के चरण के बाद, टीबीएसटी का उपयोग करके पूर्व एंटीबॉडी को तीन वॉश (प्रत्येक 5 मिनट) के साथ स्ट्रिप करें और चरण 4.3.5.2-4.3.5.7 दोहराएं।

तालिका 1: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और संबंधित कमजोर पड़ने में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और रंजक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।10,22

5. विकोशिकीय मैट्रिक्स में सेल कल्चर

नोट: सभी तकनीकों को एक लामिनर प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों में किया गया था। सभी ऊष्मायन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के साथ किए गए थे।

  1. सेल कल्चर माध्यम, उच्च ग्लूकोज डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम को स्थिर ग्लूटामाइन और सोडियम पाइरूवेट (डीएमईएम) के साथ तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेन / स्ट्रेप (पूर्ण संस्कृति माध्यम) के साथ पूरक है।
  2. डीईसीएम को 1x पीबीएस में एक पेट्री डिश में 1% पेन / स्ट्रेप के साथ एक लामिनर फ्लो हुड में रखें और उन्हें माइक्रो स्केलपेल और चिमटी का उपयोग करके लगभग 500 μm x 500 μm x 250 μm के टुकड़ों में अलग करें।
    नोट: डीईसीएम में एक नरम बनावट होती है, और इसलिए माइक्रो स्केलपेल के साथ काटने के बजाय उन्हें लगभग समान आकार के टुकड़ों में अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करना अक्सर आसान होता है।
  3. टुकड़ों को 200 μL पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ 96-वेल प्लेट (तीन या चार टुकड़े प्रति कुआं) में स्थानांतरित करें, जिसे पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया था। इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. उप-कंफ्लुएंट (~ 70%) सी 2 सी 12 कोशिकाओं के साथ बीज ति टी 25 फ्लास्क में ट्रिप्सिन के 500 μL जोड़ें। पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें।
  5. 10 μL ट्राइपैन ब्लू डाई में 10 μL रीसस्पेंशन जोड़ें और एक हेमोसाइटोमीटर में लोड करें। सेल संख्या की गणना और गणना करें और सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करें।
  6. डीईसीएम युक्त 96-वेल प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें और 50,000 व्यवहार्य सी 2 सी 12 कोशिकाओं वाले पूर्ण कल्चर माध्यम के 200 μL जोड़ें।
  7. 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें और फिर, चिमटी का उपयोग करके, डीईसीएम (कोशिकाओं के साथ) को 400 μL पूर्ण कल्चर माध्यम के साथ 48-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। हर 2 दिनों में, डीईसीएम को कुएं के तल से अलग होने से रोकने के लिए एक माइक्रोपिपेट के साथ माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और 8 वें दिन तक ताजा माध्यम जोड़ें।
    नोट: सीईसीएम में सी 2 सी 12 सेल आसंजन को बढ़ावा देने के लिए मैट्रिसेस को 96-वेल प्लेटों में 2 दिनों के लिए रखा जाता है, और फिर पोषक तत्वों के साथ माध्यम की एक बड़ी मात्रा तक पहुंच की अनुमति देने के लिए 48-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है। डीईसीएम को कुओं के तल का पालन करना चाहिए।
  8. विभेदन प्रयोग के लिए, 8 वें दिन पूर्ण संस्कृति माध्यम को विभेदन माध्यम (डीएमईएम 2% घोड़े के सीरम और 1% पेन / स्ट्रेप के साथ पूरक) के साथ प्रतिस्थापित करें, इसके बाद 12 वें दिन तक 4 दिनों के लिए विभेदन माध्यम में इनक्यूबेशन करें।

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Representative Results

डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल का लक्ष्य डीईसीएम का उत्पादन करना है जो देशी ऊतक की संरचना से निकटता से मिलते जुलते हैं। डीसेल्युलराइजेशन प्रक्रिया की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए, विभिन्न तरीकों को नियोजित किया गया था, जिसमें ऊतक आकृति विज्ञान की परीक्षा, डीएनए के स्तर का माप, एफ-एक्टिन के लिए धुंधलापन, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी ब्लोटिंग तकनीकों का उपयोग करके प्रमुख ईसीएम घटकों का विश्लेषण शामिल था। विशेष रूप से, कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के पांच प्रमुख ईसीएम घटकों का विश्लेषण किया गया था।

प्रोटोकॉल के दौरान, नमूने उपस्थिति में बदलते हैं (चित्रा 1 बी 1-4)। अलगाव के बाद, मायोग्लोबिन की उपस्थिति के कारण मांसपेशियों के ऊतक लाल दिखाई देते हैं (चित्रा 1 बी 1)। हाइपोटोनिक बफर में इनक्यूबेशन के बाद, जो कोशिकाओं को लाइज करता है और अधिकांश साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को हटा देता है, नमूने सफेद हो जाते हैं (चित्रा 1 बी2)। एसडीएस, एक आयनिक डिटर्जेंट जो आमतौर पर ऊतक विकोशिकीयकरण12 में उपयोग किया जाता है, प्रभावी रूप से साइटोप्लाज्मिक और परमाणु सामग्री, साथ ही झिल्ली को हटा देता है। नतीजतन, एसडीएस उपचार के बाद नमूने अधिक पारदर्शी हो जाते हैं (चित्रा 1 बी3)। हालांकि, इस डिटर्जेंट के लिए उच्च सांद्रता या लंबे समय तक संपर्क प्रोटीन विकृतीकरण, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स के नुकसान और कोलेजन फाइबर12 के विघटन का कारण बन सकता है। सेल हटाने और ईसीएम के संरक्षण के बीच इष्टतम संतुलन 24 घंटे के लिए 0.05% एसडीएस का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जैसा कि चित्र 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है। अंत में, डीएनए को DNase उपचार के माध्यम से हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पारदर्शी डीईसीएम मचान होते हैं जो एसडीएस उपचार के बाद की तुलना में थोड़े छोटे होते हैं (चित्रा 1 बी4)।

डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल की सफलता प्रक्रिया के बाद मैट्रिसेस में मौजूद अवशिष्ट डीएनए की मात्रा से इंगित की जाती है। डीएनए परिमाणीकरण से देशी ऊतक की तुलना में डीईसीएम में लगभग 100% की कमी का पता चलता है (चित्रा 1 सी)। DAPI धुंधला होना भी DECM में डीएनए की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है (चित्रा 2B, D, F, H, J)।

पांच प्रमुख ईसीएम प्रोटीन की उपस्थिति का मूल्यांकन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा और पश्चिमी धब्बा द्वारा डीसेलुलराइजेशन के बाद और देशी ऊतक की तुलना में किया गया था। लैमिनिन ए 2 सबयूनिट (चित्रा 2 ए, बी) और कुल लैमिनिन (चित्रा 2 सी, डी) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है कि डीईसीएम इन प्रोटीनों (चित्रा 2 बी, डी में तीर) के लिए एक ट्यूबलर धुंधलापन प्रदर्शित करते हैं, जो मूल ऊतक में मायोट्यूब के आसपास लैमिनिन मैट्रिक्स के समान है (चित्रा 2 ए, सी में तीर)। लैमिनिन ए 2 सबयूनिट के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण देशी ऊतक (चित्रा 2 ए') में दो बैंड की उपस्थिति का खुलासा करता है, जबकि तीन बैंड, अपेक्षा से कम आणविक भार के साथ, डीईसीएम (चित्रा 2 बी') में पाए जा सकते हैं। यह डीसेल्युलराइजेशन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन क्षरण या हटाने का परिणाम हो सकता है। कुल लैमिनिन के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण देशी ऊतक (चित्रा 2 सी', डी') के नमूनों की तुलना में डीईसीएम में इन प्रोटीनों के कुछ विखंडन को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण कंकाल की मांसपेशी विकोशिकीय प्रक्रिया और ऊतक आकृति विज्ञान और डीएनए सामग्री का मूल्यांकन। (ए) डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) पूरे प्रोटोकॉल में ऊतक आकृति विज्ञान, ताजा एकत्र किए गए से डीसेल्युलर ऊतक तक। स्केल बार = 1 मिमी (सी) देशी ऊतक की तुलना में डीईसीएम में मौजूद डीएनए का परिमाणीकरण। डेटा को एसईएम ± छात्र के टी-टेस्ट, दो पूंछ वाले ** पी < 0.01 के रूप में व्यक्त किया गया है। डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक एककोशिकीय डीईसीएम का उत्पादन करने वाली परमाणु सामग्री को हटा देता है। संक्षेप: डीईसीएम = डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिक्स; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एसडीएस = सोडियम डोडेसिल सल्फेट; एनटी = देशी ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 2 ई, एफ) और कोलेजन आई (चित्रा 2 जी, एच) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग मूल ऊतक (चित्रा 2 ई, जी में तीर) में कोशिकाओं के बीच अंतरालीय स्थान में इन प्रोटीनों की उपस्थिति को दर्शाता है और डीईसीएम (तीर चित्रा 2 एफ, एच) में एक समान धुंधलापन दिखाता है। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दोनों स्थितियों में फाइब्रोनेक्टिन के लिए समान बैंड दिखाता है (चित्रा 2 ई', एफ'), यह दर्शाता है कि यह प्रोटीन विशेष रूप से डीसेलुलराइजेशन प्रक्रिया से प्रभावित नहीं है। हालांकि, कोलेजन I (चित्रा 2 जी', एच') के मामले में डीईसीएम में कम बैंड हैं, जो कुछ हद तक गिरावट का संकेत देते हैं। कोलेजन IV के लिए इम्यूनोस्टेनिंग मूल ऊतक में एक ट्यूबलर धुंधला पैटर्न दिखाता है (चित्रा 2 I में तीर) और डीईसीएम में एक समान धुंधलापन, हालांकि ट्यूबलर संरचनाएं संकरी हैं (चित्रा 2 जे में तीर)। कोलेजन IV के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण देशी ऊतक में तीन बैंड की उपस्थिति का खुलासा करता है (चित्रा 2I')। जबकि वही तीन बैंड डीईसीएम (चित्रा 2 जे') में देखे जाते हैं, इनका आणविक भार अपेक्षा से कम है। लैमिनिन ए 2 के समान, यह डीसेलुलराइजेशन के दौरान प्रोटीन क्षरण या हटाने का परिणाम हो सकता है।

डीईसीएम को तब सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स के साथ बीज दिया जाता है और पूर्ण संस्कृति माध्यम में 8 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। सी 2 सी 12 कोशिकाएं डीईसीएम को उपनिवेशित करती हैं और प्रसार करती हैं, जैसा कि फॉस्फो-हिस्टोन 3 परमाणु धुंधला (चित्रा 3 ए में तीर) द्वारा दिखाया गया है। विभेदन माध्यम में अतिरिक्त 4 दिनों की संस्कृति के बाद, सी 2 सी 12 कोशिकाएं मायोसिन भारी श्रृंखला (चित्रा 3 बी में डैश लाइन) को व्यक्त करने वाले मल्टीन्यूक्लिएटेड (चित्रा 3 बी में नीले तीर) मायोट्यूब में अंतर और फ्यूज होती हैं। दिलचस्प बात यह है कि लैमिनिन ए 2 श्रृंखला (चित्रा 3 सी, डी में पीले तीर), कुल लैमिनिन (चित्रा 3 सी में मैजेंटा तीर), और फाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 3 डी में मैजेंटा तीर) के लिए इंट्रासेल्युलर और / या पेरिसेलुलर धुंधलापन सी 2 सी 12 कोशिकाओं में पाया जा सकता है, जो सुझाव देता है कि ये कोशिकाएं इन ईसीएम प्रोटीन को नए सिरे से संश्लेषित करने में सक्षम हैं।, इसलिए उनके आला के गठन में योगदान देता है। इन परिणामों से पता चलता है कि डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल एक डीईसीएम माइक्रोएन्वायरमेंट उत्पन्न करता है जहां सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट ्स प्रसार, अंतर और बहुराष्ट्रीय मायोट्यूब बना सकते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: देशी बनाम डीसेल्युलराइज्ड ई 18.5 भ्रूण की मांसपेशियों के ऊतकों में पांच ईसीएम प्रोटीन का आकलन। देशी ऊतक (ए, सी, ई, जी, आई) के वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डीएपीआई, एक डीएनए मार्कर, एफ-एक्टिन का पता लगाने वाले फैलोइडिन और ईसीएम प्रोटीन के साथ डीईसीएम (बी, डी, एफ, एच, जे) का धुंधला होना। स्केल बार = 15 μm। मूल ऊतक में, लेमिनिन और कोलेजन IV के लिए इम्यूनोस्टेनिंग मायोफाइबर (ए, सी, आई; पीले तीर) के आसपास मौजूद होता है और फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन I के लिए धुंधलापन मायोफाइबर (ई, जी; पीले तीर) के बीच अंतरालीय स्थान में पाया जाता है। डीईसीएम में, लैमिनिन और कोलेजन IV (बी, डी, जे; पीले तीर) के लिए धुंधलापन एक ट्यूबलर पैटर्न दिखाता है, जो डीसेलुलराइजेशन के बाद मायोफाइबर द्वारा छोड़े गए रिक्त स्थान को घेरता है। फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन आई डीईसीएम का इम्यूनोस्टेनिंग अंतरालीय स्थान (एफ, एच; पीले तीर) में उनकी उपस्थिति के अनुरूप है। (ए'-जे') देशी ऊतक (ए', सी', ई', जी', आई') और डीईसीएम नमूनों (बी', डी', एफ', एच', जे') में पांच ईसीएम प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। दोनों दृष्टिकोण डीसेलुलराइजेशन के बाद प्रोटीन संरक्षण दिखाते हैं। उपयोग किए गए एंटीबॉडी और संबंधित कमजोर पड़ने को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है। संक्षेप: LN2 = लैमिनिन 2 श्रृंखला; एलएनपी = पैन-मांसपेशी लैमिनिन; एफएन = फाइब्रोनेक्टिन; कोल I = कोलेजन I; कोल IV = कोलेजन IV; एमएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मायोब्लास्ट सेल लाइन (सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स) के साथ डीईसीएम पुनर्कोशिकीयकरण। (ए) मिथाइल ग्रीन स्टेनिंग डीएनए के साथ लेबल किए गए सी 2 सी 12 कोशिकाओं के साथ उपनिवेशित पुनर्कोशिकीय मैट्रिक्स के 100 μm स्टैक की एक कॉन्फोकल छवि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण, एफ-एक्टिन का पता लगाने वाले फैलोइडिन, और एंटी-पीएच 3 एंटीबॉडी, एक प्रसार मार्कर (मैजेंटा तीर)। स्केल बार = 35 μm. (B) 100 μm स्टैक की एक कॉन्फोकल छवि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण जो संस्कृति के दौरान गठित एक बहुउद्देशीय (नीले तीर नाभिक को इंगित करता है) मायोसिन भारी श्रृंखला-पॉजिटिव मायोट्यूब (डैश्ड लाइन) दिखाता है। स्केल बार = 35 μm. (C, D) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री कॉन्फोकल छवि मायोब्लास्ट्स में लैमिनिन ए 2 श्रृंखला (पीले तीर), कुल लैमिनिन (सी में मैजेंटा तीर), और फाइब्रोनेक्टिन (डी में मैजेंटा तीर) के लिए इंट्रा- या पेरी-सेलुलर धुंधलापन दिखाती है, जो नए प्रोटीन संश्लेषण का सुझाव देती है। स्केल बार = 10 μm। उपयोग किए गए एंटीबॉडी और संबंधित कमजोर पड़ने को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है। संक्षेप: पीएच 3 = फॉस्फो-हिस्टोन 3; LNn2 = लैमिनिन α2 श्रृंखला; एलएनपी = पैन-मांसपेशी लैमिनिन; एफएन = फाइब्रोनेक्टिन; एमएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ईसीएम मैक्रोमोलेक्यूल्स का एक जटिल नेटवर्क है जो सभी ऊतकों में मौजूद है और सेल व्यवहार और फ़ंक्शन2 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ईसीएम कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए एक भौतिक मचान के रूप में कार्य करता है और संकेत प्रदान करता है जो सक्रिय रूप से सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे प्रसार, गतिशीलता, भेदभाव और एपोप्टोसिस को संशोधित करता है। इस प्रकार, ईसीएम का उचित गठन और रखरखाव विकास और होमियोस्टैसिस दोनों के लिएआवश्यक है।

जबकि 2 डी सेल कल्चर मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, उन्हें तेजी से अधिक उन्नत 3 डी प्लेटफार्मों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है। ऐसा इसलिए है क्योंकि 2 डी संस्कृतियों में रासायनिक और भौतिक संकेतों की कमी होती है जो सेल व्यवहार को प्रभावित करते हैं, जबकि 3 डी संस्कृतियों को देशी ऊतकों में आणविक और सेलुलर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अधिक यथार्थवादी विकल्प माना जाताहै। ऊतकों के विकोशिकीयकरण के परिणामस्वरूप मचानों का उत्पादन होता है जो जैविक ऊतकों के माइक्रोएन्वायरमेंट की अधिक बारीकी से नकल करते हैं, जैसा कि विभिन्न ऊतक या अंग प्रणालियों 14,15,23,24,25 में कई अध्ययनों में दिखाया गया है। देशी ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को दोहराने के लिए डीईसीएम की क्षमता सामान्य विकास, विभिन्न रोग राज्यों और ऊतकों पर दवाओं या विषाक्त पदार्थों के प्रभाव पर अनुसंधान के लिए बड़ी क्षमतारखती है।

इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला प्रोटोकॉल सिल्वा एट अल द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है, जो भ्रूण के हृदय ऊतक14 को एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में डीसेल्यूलराइज्ड करता है। इसमें एक हाइपोटोनिक बफर का संयोजन, एक आयनिक डिटर्जेंट (एसडीएस) के साथ उपचार और एक डीनेस उपचार शामिल है। डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल में मुख्य चुनौतियों में से एक कोशिकाओं को हटाने और ईसीएम प्रोटीन संरचना को संरक्षित करने के बीच संतुलन खोजना है। एलएएमए 2-सीएमडी के शुरुआती चरणों का अध्ययन करने के लिए इस 3 डी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करने पर हमारे ध्यान को देखते हुए, डीसेलुलराइजेशन के दौरान लैमिनिन 211 को संरक्षित करने पर विशेष ध्यान दिया गया था। सिल्वा एट अल .14 के प्रोटोकॉल ने डीसेल्युलराइज्ड भ्रूण की मांसपेशियों में लैमिनिन ए 2 श्रृंखला की कमी का कारण बना; यह उपयोग किए गए एसडीएस की एकाग्रता के कारण हो सकता है। इसलिए, 0.2% एसडीएस डिटर्जेंट समाधान चरण के विकल्पों का परीक्षण किया गया, जैसे कि एसडीएस की कम सांद्रता (0.1%, 0.05%, और 0.02%) और ट्राइटन एक्स -100 (0.5% और 0.2%) की विभिन्न सांद्रता के साथ एसडीएस का प्रतिस्थापन। 24 घंटे के लिए 0.05% एसडीएस डिटर्जेंट उपचार का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए गए थे। इस एकाग्रता ने डीसेलुलराइजेशन के बाद लैमिनिन ए 2 श्रृंखला विकृति को संरक्षित करते हुए सेल सामग्री को प्रभावी ढंग से हटा दिया। यह प्रोटोकॉल पुन: प्रत्यावर्ती रूप से एककोशिकीय डीईसीएम का उत्पादन करता है जो डीएनए सहित सेलुलर अवशेषों से मुक्त होते हैं।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल अंतरालीय मैट्रिक्स प्रोटीन (फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन I) और तहखाने झिल्ली प्रोटीन (लैमिनिन और कोलेजन IV) दोनों को संरक्षित करते हैं। भविष्य के अध्ययनों का आकलन करना चाहिए कि क्या कोलेजन वीआई भी संरक्षित है, क्योंकि यह मांसपेशियों के डिस्ट्रोफी26 में भी एक खिलाड़ी है। यह ज्ञात है कि एसडीएस प्रोटीन अल्ट्रास्ट्रक्चर को बाधित कर सकता है और कोलेजन12 को नुकसान पहुंचा सकता है; भ्रूण कंकाल की मांसपेशियों के लिए, लैमिनिन ए 2 विकृति को बनाए रखने के लिए एसडीएस (0.05%) की कम सांद्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण था। हालांकि, पश्चिमी धब्बा परिणाम बताते हैं कि देशी ऊतक की तुलना में लैमिनिन और कोलेजन के इम्यूनोडिटेक्शन के बाद डीसेल्यूलराइज्ड नमूने अधिक बैंड प्रदर्शित करते हैं, यह दर्शाता है कि डीसेलुलराइजेशन प्रक्रियाके परिणामस्वरूप कुछ प्रोटीन गिरावट हुई है।

महत्वपूर्ण रूप से, पुनर्कोशिकीय प्रयोगों से पता चलता है कि ये मैट्रिक्स विश्वसनीय मचान हैं जो लगातार सेल आसंजन, प्रसार और भेदभाव का समर्थन करते हैं। एसडीएस को साइटोटोक्सिक28 बताया गया है, और इसलिए प्रोटोकॉल में शामिल धोने के चरण महत्वपूर्ण हैं यदि मैट्रिक्स का उपयोग पुनर्कोशिकीयकरण के लिए किया जाना है। इन मचानों को सी 2 सी 12 कोशिकाओं द्वारा प्रभावी ढंग से उपनिवेशित किया गया था, जो कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में उनकी उपयुक्तता का संकेत देता है। सी 2 सी 12 कोशिकाओं के आसपास ईसीएम प्रोटीन के लिए इंट्रासेल्युलर और पेरिसेलुलर धुंधलापन का अवलोकन आगे बताता है कि कोशिकाएं डीईसीएम के भीतर अपने माइक्रोएन्वायरमेंट में सक्रिय रूप से योगदान दे रही हैं। इसके अतिरिक्त, जब विभेदन माध्यम में रखा जाता है, तो सी 2 सी 12 कोशिकाओं ने डीईसीएम के भीतर विभेदित, फ्यूज और मायोट्यूब का गठन किया।

इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण चुनौती पूरे प्रोटोकॉल में नमूनों का हेरफेर है। नमूने बहुत छोटे और नरम होते हैं, जिन्हें फाइन-टिप पिपेट में फंसाने और नमूनों के नुकसान को रोकने के लिए देखभाल और कौशल की आवश्यकता होती है। ताजा ऊतक के साथ प्रोटोकॉल शुरू करते समय सबसे अच्छे परिणाम प्राप्त होते हैं। जमे हुए, संग्रहीत नमूनों का उपयोग सेलुलर सामग्री हटाने में बाधा डाल सकता है और प्रोटीन क्षरण में वृद्धि कर सकता है, प्रोटीन का पता लगाने में बाधा डाल सकता है और डीसेलुलराइजेशन दक्षता को कम कर सकता है।

केवल कुछ अध्ययनों ने भ्रूण के ऊतकों 15,29,30,31 के विकोशिकीयकरण की सूचना दी है। विशेष रूप से, भ्रूण कंकाल की मांसपेशियों के विकोशिकीयकरण के बारे में, केवल एक पिछले अध्ययन ने डर्मिस, चमड़े के नीचे के ऊतक, और पैनिकुलस कार्नोसस31 के समग्र नमूनों के विकोशिकीयकरण पर रिपोर्ट की है। लेखकों के सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह पहली बार है कि पृथक भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी के लिए एक डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है। यह प्रोटोकॉल अन्य प्रजातियों के भ्रूण की मांसपेशियों के ऊतकों के लिए समान प्रोटोकॉल के निर्माण के लिए एक नींव के रूप में काम कर सकता है, जैसे कि सूअर और मनुष्य13।

ई 18.5 माउस कंकाल की मांसपेशी को डीसेल्युलर करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल सिल्वा एट अल .14 की प्रक्रिया के समान है, जिन्होंने इसे ई 18 माउस दिल पर लागू किया था। एकमात्र अंतर एसडीएस की एकाग्रता का उपयोग किया जाता है, जो भ्रूण के दिल (0.05% बनाम 0.2%) के लिए उपयोग किए जाने वाले की तुलना में काफी कम है, संभवतः इन दो भ्रूण के ऊतकों के विभिन्न भौतिक गुणों के कारण।

इस इन विट्रो मॉडल का विकास न केवल सामान्य भ्रूण की मांसपेशियों के विकास में शामिल प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है, बल्कि शुरुआती शुरुआती मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी और मायोपैथियों की समानांतर जांच को भी सक्षम बनाता है, जैसे कि एलएएमए 2-सीएमडी, जो डीवाईडब्ल्यू माउस मॉडल10 में ई 18.5 पर मायोजेनेसिस दोष के रूप में प्रकट होता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह प्रणाली सीमित है कि इसमें केवल ईसीएम और मांसपेशियों की कोशिकाएं शामिल हैं और इसमें न्यूरॉन्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट जैसे अन्य सेल प्रकार शामिल नहीं हैं। इन अतिरिक्त सेल प्रकारों की प्रासंगिकता बीमारी के आधार पर भिन्न हो सकती है, और उन्हें शामिल करने के लिए संस्कृति प्रणाली में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। कुल मिलाकर, इस अध्ययन में वर्णित डीईसीएम का उपयोग विभिन्न शुरुआती मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी और मायोपैथियों के अध्ययन में लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एसोसिएशन फ्रैंकाइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस (एएफएम-टेलेथॉन; अनुबंध संख्या 23049), मैट्रिहेल्थ प्रोजेक्ट और सीई 3 सी यूनिट फंडिंग यूआईडीबी / 00329/2020 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम अपने दाता हेनरिक मीरेल्स को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने मैट्रिहेल्थ प्रोजेक्ट का समर्थन करना चुना। इस काम को विज्ञान माइक्रोस्कोपी सुविधा के संकाय के बुनियादी ढांचे से लाभ हुआ, जो बायोइमेजिंग के पुर्तगाली प्लेटफॉर्म (संदर्भ पीपीबीआई-पीओसीआई-01-0145-फेडर-022122) का एक नोड है, और हम छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के साथ उनकी सहायता के लिए लुइस मार्कस को धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम तकनीकी सहायता के लिए मार्टा पाल्मा और उनके उदार योगदान के लिए हमारी शोध टीम को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

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References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

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सेल कल्चर के लिए भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी से 3 डी डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस की तैयारी
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Gameiro dos Santos, P., Soares, A.… More

Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

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