Summary
En este trabajo, se optimizó un protocolo de descelularización para obtener matrices descelularizadas del músculo esquelético fetal del ratón. Los mioblastos C2C12 pueden colonizar estas matrices, proliferar y diferenciarse. Este modelo in vitro se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular en el contexto de enfermedades del músculo esquelético, como las distrofias musculares.
Abstract
La matriz extracelular (ECM) juega un papel crucial en proporcionar soporte estructural para las células y transmitir señales que son importantes para diversos procesos celulares. Los modelos de cultivo celular bidimensionales (2D) simplifican en exceso las complejas interacciones entre las células y la ECM, ya que la falta de un soporte tridimensional completo (3D) puede alterar el comportamiento celular, haciéndolos inadecuados para comprender los procesos in vivo . Las deficiencias en la composición de la ECM y las interacciones célula-ECM son contribuyentes importantes a una variedad de enfermedades diferentes.
Un ejemplo es la distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD), donde la ausencia o reducción de laminina funcional 211 y 221 puede conducir a hipotonía severa, detectable en o poco después del nacimiento. Trabajos previos utilizando un modelo de ratón de la enfermedad sugieren que su inicio ocurre durante la miogénesis fetal. El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo 3D in vitro que permitiera el estudio de las interacciones entre las células musculares y la ECM del músculo fetal, imitando el microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos de la espalda diseccionados de fetos de ratón E18.5, tratados con un tampón hipotónico, un detergente aniónico y DNasa. Las matrices descelularizadas resultantes (dECM) retuvieron todas las proteínas ECM probadas (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV) en comparación con el tejido nativo.
Cuando los mioblastos C2C12 se sembraron sobre estos dECM, penetraron y colonizaron los dECM, lo que apoyó su proliferación y diferenciación. Además, las células C2C12 produjeron proteínas ECM, contribuyendo a la remodelación de su nicho dentro de las dECM. El establecimiento de esta plataforma in vitro proporciona un nuevo enfoque prometedor para desentrañar los procesos involucrados en la aparición de LAMA2-CMD, y tiene el potencial de adaptarse a otras enfermedades del músculo esquelético donde las deficiencias en la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético contribuyen a la progresión de la enfermedad.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) es un componente importante de los tejidos, que representa su componente no celular. Esta estructura tridimensional (3D) no solo proporciona soporte físico a las células, sino que también desempeña un papel crucial en los procesos bioquímicos involucrados en el desarrollo de los organismos1. La formación de una ECM específica del tejido ocurre durante el desarrollo, como resultado de las complejas interacciones entre las células y sus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra y extracelulares. La ECM es una estructura altamente dinámica que sufre reordenamientos químicos y mecánicos de manera temporal-espacial e impacta directamente en el destino celular2. Una de las características más notables de la ECM es su diversidad funcional, ya que cada ECM tisular muestra una combinación única de moléculas que proporcionan diferentes topologías y propiedades que se adaptan a las células que contiene1.
La señalización y el apoyo de la ECM son cruciales para el desarrollo y la homeostasis, y cuando se interrumpen pueden conducir a múltiples condiciones patológicas 3,4. Un ejemplo es la distrofia congénita deficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), que es la forma más común de distrofia muscular congénita. El gen LAMA2 codifica para la cadena α2 de laminina, que está presente en la laminina 211 y la laminina 221, y cuando está mutada puede conducir a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 es la principal isoforma que se encuentra en la membrana basal que rodea las fibras del músculo esquelético. Cuando la laminina 211 es anormal o está ausente, el vínculo entre la membrana basal y las células musculares se interrumpe, lo que lleva a la aparición de la enfermedad6. Los pacientes con LAMA2-CMD muestran un fenotipo de leve a grave dependiendo del tipo de mutación en el gen LAMA2.
Cuando la función de la proteína laminina α2 se ve afectada, los pacientes pueden experimentar hipotonía muscular severa al nacer y desarrollar inflamación crónica, fibrosis y atrofia muscular, lo que lleva a una esperanza de vida reducida. Hasta la fecha, no se han desarrollado tratamientos dirigidos y los enfoques terapéuticos se limitan a aliviar los síntomas de la enfermedad7. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes involucrados en la aparición de esta enfermedad es crucial para el desarrollo de estrategias terapéuticas apropiadas 6,8. Trabajos previos con el ratón dyW 9, un modelo para LAMA2-CMD, sugieren que el inicio de la enfermedad comienza en el útero, específicamente durante la miogénesis fetal10. Una mejor comprensión de cómo surge el defecto de miogénesis fetal sería un cambio de juego en la generación de nuevos enfoques terapéuticos para LAMA2-CMD.
Los sistemas in vitro proporcionan un entorno controlado para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM, pero los modelos de cultivo 2D carecen de la complejidad de los tejidos nativos. La descelularización de los tejidos produce andamios de ECM acelulares específicos para el tejido y la etapa de desarrollo que imitan con mayor precisión el microambiente celular natural en comparación con los modelos 2D y los andamios diseñados / sintéticos. Las matrices descelularizadas (dECMs) tienen el potencial de preservar las señales moleculares y mecánicas del tejido huésped, convirtiéndolas en mejores modelos alternativos para la comprensión de los procesos in vivo 11.
Existen diversas técnicas, reactivos y condiciones que pueden ser utilizadas para la descelularización12,13. En este estudio, un protocolo de descelularización para el corazón fetal del ratón, descrito por Silva et al.14,15, se adapta al músculo esquelético fetal del ratón y se encuentra que retiene todos los componentes de la ECM probados (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV). El protocolo incluye tres pasos: lisis celular por choque osmótico (tampón hipotónico), disolución de la membrana plasmática y disociación de proteínas (dodecil sulfato de sodio al 0,05% [SDS]) y destrucción enzimática del ADN (tratamiento con DNasa). Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo establecido para descelularizar el músculo esquelético fetal del ratón.
Para utilizar este sistema 3D in vitro para estudiar LAMA2-CMD, es crucial mantener la cadena α2 de laminina después de la descelularización. Por lo tanto, se implementó un protocolo de optimización donde se probaron diferentes detergentes (SDS y Triton X-100) y concentraciones (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% y 0.5%) (datos no mostrados). Se encontró que la opción óptima para la eliminación celular y la preservación de la proteína laminina α2 era 0.05% SDS. Se utilizaron células C2C12, una línea celular de mioblastos bien establecida16,17, para sembrar los dECM. Estas células invaden la dECM, proliferan y se diferencian dentro de estos andamios, sintetizando nuevas proteínas ECM. La producción exitosa de este modelo 3D in vitro ofrece un nuevo enfoque para comprender los procesos moleculares y celulares involucrados en la miogénesis fetal, el inicio de LAMA2-CMD, y puede extenderse a otras enfermedades musculares donde se interrumpe la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético.
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Protocol
Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el Comité de Bienestar Animal (ORBEA) de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Lisboa y la Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), y están de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE.
1. Preparación de tampones y reactivos de descelularización
NOTA: Todas las soluciones utilizadas durante el protocolo de descelularización deben esterilizarse en autoclave y almacenarse hasta 3 meses, a menos que se indique lo contrario.
- Prepare solución salina tamponada con fosfato 10x (10x PBS) agregando cloruro de sodio (NaCl) a 137 mM, cloruro de potasio (KCl) a 2.68 mM, fosfato de potasio-dihidrógeno (KH 2 PO 4) a 8.1 mM y dihidrato de disodio-hidrógeno-fosfato (Na 2 HPO4) a 1.47 mM al agua desmineralizada (dH2O) y ajuste el pH a 6.8. Agregue 100 mL de 10x PBS a 900 mL deH2Odesmineralizado para generar 1x PBS. Autoclave y conservar a temperatura ambiente (RT). Agregue una solución madre estéril de penicilina/estreptomicina (10,000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina [pluma/estreptococo]) a una concentración final de 1% antes de usar.
- Preparar el tampón hipotónico disolviendo 1,21 g de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris base) y 1 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en 1 L dedH2O(10 mM Tris base 0,1% EDTA). Use un agitador magnético hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.8 con NaOH / HCl. Esterilizar en autoclave y almacenar en RT. Agregue la pluma/estreptococo a una concentración final del 1% antes de usar.
- Preparar el tampón de lavado hipotónico disolviendo 1,21 g de Tris base en 1 L dedH2O(10 mM de base Tris). Use un agitador magnético hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.8 con NaOH / HCl. Autoclave y guárdelo en RT. Agregue la pluma / estreptococo al 1% antes de usar.
- Prepare el tratamiento con detergente aniónico agregando 0,05 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) a 100 ml de tampón de lavado hipotónico para producir una solución de tratamiento SDS al 0,05%. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Almacenar en RT por hasta 1 mes.
NOTA: La solución SDS no debe esterilizarse en autoclave, ya que SDS precipita y se degrada al esterilizarse en autoclave. - Preparar la solución de tratamiento con DNasa disolviendo 1,21 g de Tris base en 0,5 mL dedH2Oy añadir 1 mL de cloruro de magnesio 1 M (MgCl2). Ajuste el pH a 7.8 con NaOH/HCl. Autoclave y almacenar en RT. Agregue DNasa I antes de usar (50 U/mL).
2. Recogida de muestras
NOTA: En el estudio se utilizaron ratones C57/BL6 de tipo salvaje. Todas las técnicas se realizaron en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Eutanasia de ratones hembra hembra embarazadas adultos en el día embrionario (E) 18.5 del embarazo utilizando la inhalación de isoflurano seguida de luxación cervical. Someter a los ratones a una disección terminal para extraer los fetos.
- Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%.
- Usando fórceps quirúrgicos y tijeras, levante un pliegue de piel en la parte inferior del abdomen y haga una incisión en forma de U para exponer la cavidad abdominal18.
- Recoja los cuernos uterinos que contienen los fetos E18.5 cortando los oviductos y el cuello uterino y transfiéralos inmediatamente a una placa de Petri con PBS 1x helado con 1% de pluma/estreptococo18.
- Extraer rápidamente los fetos del útero y de los tejidos extraembrionarios y sacrificarlos por decapitación con tijeras18.
- Transfiera un feto a la vez a una placa de Petri con 1x PBS helado. Con un microscopio estereoscópico, retire la piel y corte las extremidades. Desde el lado ventral, corte a través de la caja torácica y retire el esternón y los órganos subyacentes.
- Voltea el lado dorsal del tronco fetal hacia arriba. Retire la porción cervical de la columna vertebral, los depósitos de grasa dorsal y el tejido conectivo en la parte superior de los músculos profundos de la espalda.
- Use fórceps quirúrgicos para anclar la caja torácica y raspe y separe cuidadosamente los músculos profundos de la espalda de los tejidos circundantes con un micro bisturí10. Este procedimiento da como resultado el aislamiento de dos piezas musculares por feto (izquierda y derecha), ambas compuestas principalmente por músculos longissimus e iliocostalis , con algunos de los músculos transversoespinal y elevador costarum incluidos.
- Almacene las muestras musculares en 1x PBS con pluma/estreptococo al 1% a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (<1 semana), o a -80 °C durante períodos más largos.
NOTA: Utilice muestras recién recolectadas para obtener mejores resultados. Las muestras congeladas durante períodos prolongados (>3 meses) muestran una menor eficiencia de descelularización y una mayor degradación de proteínas. Se utilizaron masas musculares epaxiales para los experimentos de descelularización, pero otros músculos (por ejemplo, los músculos de las extremidades) pueden procesarse para la descelularización utilizando el mismo protocolo.
3. Descelularización del músculo esquelético fetal
NOTA: Todas las técnicas se realizaron en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Para obtener una representación esquemática detallada, consulte la figura 1A. Todos los pasos se realizaron con agitación en un agitador orbital con un diámetro de 120 mm (165 rpm) a 25 °C a menos que se indique lo contrario. Agregue un 1% de pluma/estreptococo a las soluciones antes de usarlas. Al extraer las soluciones, aspirar cuidadosamente para evitar que la muestra quede atrapada en la pipeta.
- Día 1 - Prepare aproximadamente fragmentos de tejido de 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3.5 mg) de las masas musculares epaxiales. Agregue 3 ml de tampón hipotónico con pluma/estreptococo al 1% a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y agregue un fragmento de tejido muscular completo por pocillo.
- Incubar los fragmentos de tejido en tampón hipotónico con agitación durante 18 h (durante la noche) (O/N).
- Día 2 - Aspirar el tampón hipotónico con una pipeta de punta fina y lavar las muestras 3 x 1 h con 3 mL de 1x PBS cada vez con agitación.
- Incubar las muestras durante 24 h con 3 mL de solución detergente SDS al 0,05% con agitación.
NOTA: (PUNTO DE VERIFICACIÓN) Después de la incubación de SDS, las muestras deben ser transparentes en apariencia. Las muestras muestran una consistencia similar a la gelatina y, por lo tanto, son más propensas a adherirse a la pipeta al eliminar los líquidos.
- Incubar las muestras durante 24 h con 3 mL de solución detergente SDS al 0,05% con agitación.
- Día 3 - Retire la solución detergente SDS con una pipeta de punta fina y lave los fragmentos de tejido 3 x 20 min con 3 ml de tampón de lavado hipotónico cada vez con agitación.
NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Las muestras pueden mantenerse en tampón de lavado hipotónico a 4 °C durante 18 h (O/N). Asegúrese de que el SDS se elimine bien durante los pasos de lavado, ya que el SDS residual puede ser citotóxico.- Incubar los fragmentos de tejido durante 3 h con 2 ml de solución de DNasa con agitación a 37 °C.
- Retire la solución de DNasa con una pipeta de punta fina y lave los fragmentos de tejido 3 x 20 min con 3 ml de 1x PBS cada vez con agitación. Finalmente, lavar O/N con agitación (60 rpm).
NOTA: Después del tratamiento con DNasa, los dECM se vuelven pegajosos debido a la presencia de residuos de ADN. Por lo tanto, es necesario un lavado cuidadoso. - Almacenar los dECM en 1x PBS con 1% de pluma/estreptococo a 4 °C hasta la recelularización (<1 semana). Para otros usos, conservar a -80 °C.
4. Evaluación de la calidad de la descelularización
NOTA: Se realizó cuantificación de ADN, tinción DAPI/verde de metilo y tinción de faloidina para evaluar la presencia de contenido celular residual después de la descelularización. Se realizaron análisis inmunohistoquímicos y Western blot para evaluar la retención de proteínas clave de la ECM después de la descelularización.
- Cuantificación del ADN presente en el dECM
NOTA: Los dECM deben compararse con el tejido nativo para detectar la presencia de ADN.- Antes de la descelularización, pese un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en una báscula digital de alta precisión. Antes de transferir la muestra de músculo al tubo, retire todo el PBS 1x restante con una toalla de papel. Pese el tubo con la muestra. Calcule el peso húmedo de las muestras usando la ecuación (1):
Peso húmedo de la muestra =peso tubo con muestras- pesotubo vacío (1) - Descelularizar las muestras siguiendo el protocolo descrito en la sección 3.
- Coloque las muestras en tubos de microcentrífuga de 2 ml.
NOTA: Las muestras pueden mantenerse a -20 °C hasta la extracción y cuantificación del ADN. - Realice la extracción de ADN de los dECM y muestras de tejido nativo utilizando un kit basado en columnas de centrifugado. Agregue el tampón de digestión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Homogeneice las muestras en un molino de perlas dos veces durante 2,5 minutos cada vez (volteando los soportes) usando una perla de carburo de tungsteno por tubo (use soportes de tubo refrigerados).
- Añadir proteinasa K e incubar O/N con agitación lenta a 56 °C.
- Proceda con el protocolo como se describe en las instrucciones del fabricante.
- Eluya con el tampón proporcionado por el fabricante y centrifugar 2 x 1 min a ≥6,000 x g, cada vez a 4 °C para aumentar el rendimiento de ADN.
NOTA: El ADN se puede almacenar a -20 °C hasta la cuantificación. - Cuantificar el ADN presente en las muestras utilizando un kit de detección de dsDNA fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Normalice el contenido de ADN como nanogramos de ADN por miligramo de peso húmedo original de la muestra.
- Analice los datos utilizando una prueba t de Student de dos colas y exprese como la media ± error estándar de la media (SEM).
- Antes de la descelularización, pese un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en una báscula digital de alta precisión. Antes de transferir la muestra de músculo al tubo, retire todo el PBS 1x restante con una toalla de papel. Pese el tubo con la muestra. Calcule el peso húmedo de las muestras usando la ecuación (1):
- Inmunohistoquímica
NOTA: Las soluciones 1, 2 y 3 y la solución fijadora deben prepararse antes de su uso y pueden mantenerse congeladas hasta por 6 meses. Todos los anticuerpos y colorantes utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en Cuadro 1.- Preparación de soluciones
- Preparar la solución fijadora añadiendo 2 g de paraformaldehído (PFA), 8 g de sacarosa y 24 μL de 1 M CaCl 2 a 77 mL de 0,2 M Na2 HPO 4 y 23 mL de 0,2 MNaH2PO 4, a un volumen final de 200 mL añadiendodH2O. Ajustar el pH a 7,4.
- Preparar tampón fosfato 0,12 M añadiendo 13,5 g deNa2HPO 4 y 3,2 g deNaH2PO 4 a 1 L dedH2O. Ajustar el pH a7,4.
- Preparar la solución 1 añadiendo 4 g de sacarosa a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M.
- Preparar la solución 2 añadiendo 15 g de sacarosa a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M.
- Preparar la solución 3 añadiendo 15 g de sacarosa y 7,5 g de gelatina a 100 ml de tampón fosfato 0,12 M. Calentar a 37 °C hasta que la gelatina se disuelva.
- Preparar la solución madre de verde de metilo (polvo verde de metilo al 2% disuelto endH2O)19.
- Inmunodetección
- Fijar las muestras con la solución fijadora durante al menos 4 h a 4 °C.
- Lave las muestras 2 veces durante 10 minutos con 1 PBS.
- Conservar O/N, o durante 1 día, en solución 1 a 4 °C.
- Lavar y conservar O/N o durante 1 día en solución 2 a 4 °C. Deje que las muestras se calienten a RT.
- Incubar durante 3 h en solución 3 a 37 °C. Conservar la solución extra 3 a 37 °C para utilizarla más tarde.
- Moldee recipientes pequeños (2 cm x 1 cm x 1 cm) en papel de aluminio. Coloque una capa delgada de solución 3 en el recipiente moldeado y déjelo reposar. Coloque las muestras sobre la solución solidificada 3 y cubra con la solución tibia 3. Orientar las muestras y dejar que se solidifiquen. Marque la ubicación en la solución solidificada 3 con un bolígrafo de color.
- Congele colocando los recipientes sobre la superficie del isopentano seco refrigerado con hielo o nitrógeno líquido.
- Utilizando el compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.), fije los cubos de gelatina congelados que contienen las muestras al soporte de criostato.
- Secciona los cubos de gelatina congelada y transfiere las secciones de tejido a los portaobjetos. Dejar secar durante 60 min.
- Use un marcador hidrofóbico para trazar una línea alrededor de las secciones.
- Lave las diapositivas 3 x 10 min en 1x PBS.
- Cubra las secciones con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, suero de cabra al 1% y Triton X-100 al 0,05% diluido en 1x PBS (solución de bloqueo) durante 30 minutos (paso de bloqueo).
- Diluir los anticuerpos primarios en solución de bloqueo y cubrir las secciones. Incubar O/N a 4 °C en una caja cerrada, con papel húmedo, para evitar que las secciones se sequen.
- Lave las diapositivas 3 x 10 min con 1x PBS.
- Diluir los anticuerpos secundarios en solución de bloqueo y cubrir las secciones. Incubar durante 1,5 h a RT en la oscuridad.
NOTA: Evite la exposición a la luz para evitar la degradación del fluoróforo. - Lave las diapositivas 3 x 10 min con 4x PBS.
NOTA: Se puede usar una mayor concentración de PBS cuando hay un fondo fuerte. - Sumergir los portaobjetos en solución DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-octano en Triton X-100/1x PBS al 0,1%) durante 30 s cada uno.
- Enjuague en 1x PBS.
- Monte las secciones en medio antidecolorante (50 mg/ml de n-propil-galato en 1x PBS:glicerol [1:9]) y selle con un cubreobjetos. Conservar a 4 °C hasta la observación y adquisición de imágenes en un microscopio de fluorescencia20.
NOTA: Para los experimentos de inmunohistoquímica in toto , se utilizó el mismo protocolo (ver pasos 4.2.2.12-4.2.2.18), excepto que las muestras se fijaron previamente en PFA al 4% diluido en 1x PBS durante 3 h en RT. La tinción de ADN se realizó agregando verde de metilo a la solución secundaria de anticuerpos. Todos los anticuerpos y colorantes utilizados, y sus respectivas diluciones, se enumeran en la Tabla 1. Luego, las muestras se montaron en medio antidecolorante entre dos cubreobjetos separados por anillos de acero, pegados con cera de abejas, y se adquirieron pilas de imágenes de 100 μm utilizando un microscopio confocal21.
- Preparación de soluciones
- Análisis de Western blot
NOTA: Todos los anticuerpos utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en Cuadro 1.- Preparación de soluciones
- Prepare el tampón de carga 2x SDS-PAGE agregando 20 ml de glicerol, 4 g de SDS y 0,2 ml de azul de bromofenol a 80 ml de solución base de Tris de 100 mM. Ajuste el pH a 6.8. Agregue ditiothreitol fresco (DTT) antes de usar.
- Prepare el tampón de lavado salino tamponado Tris con solución Tween 20 (TBST) agregando 2.4 g de base de Tris, 8.8 g de NaCl y 1 ml de Tween-20 adH2Oa un volumen final de 1 L. Ajuste el pH a 7.4-7.6 usando HCl.
- Prepare el tampón de funcionamiento 10x (RB) agregando 30.2 g de base de Tris, 144.2 g de glicina y 10 g de SDS a 1 L de dH2O. Antes de usar, agregue 100 ml de 10x RB a 900 ml dedH2Opara preparar 1x RB (solución de trabajo).
NOTA: Mientras que 10x RB se puede almacenar en RT durante varios meses, 1x RB se puede reutilizar en diferentes ejecuciones. - Prepare el tampón de transferencia (TB) agregando 5.82 g de Tris base, 2.93 g de glicina y 0.5 g de SDS a 800 mL dedH2O. Después de disolver los componentes, agregue 200 ml de metanol. Enfriar a 4 °C.
NOTA: La TB debe prepararse recién antes de cada uso.
- Extracción de proteínas
- Recoja los músculos epaxiales de ratones E18.5 y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (2 ml) que contenga 2 tampones de carga SDS-PAGE con TDT recién agregado (100 mM DTT). Procese E18.5 dECM de la misma manera.
- Agregue una perla de carburo de tungsteno por tubo. Homogeneice 2x en un molino de perlas durante 2,5 minutos cada vez (voltee los soportes).
- Sonicar las muestras durante 5 minutos en un baño de ultrasonido.
- Calentar las muestras durante 10 min a 50 °C.
- Centrifugar las muestras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
- Cuantificar la proteína usando un espectrofotómetro de microvolumen.
- Conservar a -20 °C hasta su uso posterior.
- Electroforesis en gel de poliacrilamida
- Use gel de gradiente de acrilamida prefabricado (4% -20%)
- Monte el gel en el tanque de electroforesis. Retire el peine con cuidado. Agregue 1x RB hasta que la línea se muestre en el tanque de electroforesis. Asegúrese de que los pozos estén llenos de RB.
- Cargar 100 μg de proteína por muestra en los pocillos. Carga 12 μL de proteína estándar de alto peso molecular.
- Funcionamiento durante un total de 100 min con voltaje constante (10 min a 150 V y 90 min a 185 V).
- Transferencia
- Remoje las almohadillas filtrantes y las esponjas con TB refrigerada (4 °C) mientras el gel está funcionando.
- Corte las membranas de difluoruro de polivinilideno al tamaño del gel. Actívalos con metanol y lavar condH2O. Remojar en la TB.
- Monte el casete de transferencia con las esponjas, almohadillas filtrantes, geles y membranas activadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Coloque el casete en el tanque de electroforesis que contiene la TB refrigerada (sobre un lecho de hielo). Añada la unidad de refrigeración. Correr durante 90 minutos a 100 V.
- Después de la transferencia, tiñe con un sustituto azul Coomassie para evaluar la calidad de la transferencia.
- Inmunodetección
- Prepare la solución de bloqueo (TBST con leche baja en grasa al 5%). Incubar las membranas con agitación durante 1 h a RT.
- Enjuague 3 x 5 s con TBST.
- Incubar las membranas O/N con los anticuerpos primarios diluidos en TBST con BSA al 2% y azida sódica al 0,02% (3 mL por membrana) en cámara fría (4 °C) con agitación.
- Al día siguiente, lavar 3 x 5 min con TBST.
- Incubar las membranas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos en TBST con leche baja en grasa al 5% (5 ml para cada membrana) durante 1 h en RT.
- Lave las membranas con TBST 3 x 5 min. Mantener en TBST hasta el paso de detección.
- Visualice la proteína utilizando un kit de desarrollo disponible comercialmente. Agregue reactivos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Adquiere imágenes de las bandas.
- Para probar más de un anticuerpo por membrana, después de la etapa de detección, elimine los anticuerpos anteriores con tres lavados (5 minutos cada uno) usando TBST y repita los pasos 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Preparación de soluciones
Tabla 1: Anticuerpos y colorantes utilizados en inmunohistoquímica y análisis de Western blot y las diluciones respectivas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.10,22
5. Cultivo celular en matrices descelularizadas
NOTA: Todas las técnicas se realizaron en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C y con 5% deCO2.
- Preparar el medio de cultivo celular, medio de águila modificado de Dulbecco con glucosa alta con glutamina estable y con piruvato de sodio (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de pluma/estreptococo (medio de cultivo completo).
- Coloque los dECM en una placa de Petri en 1x PBS con 1% de pluma/estreptococo en una campana de flujo laminar y sepárelos en trozos de aproximadamente 500 μm x 500 μm x 250 μm, utilizando un micro bisturí y pinzas.
NOTA: Las dECM tienen una textura suave y, por lo tanto, a menudo es más fácil usar pinzas para separarlas en trozos aproximadamente del mismo tamaño en lugar de cortarlas con el micro bisturí. - Transfiera los fragmentos a una placa de 96 pocillos (tres o cuatro piezas por pocillo) con 200 μL de medio de cultivo completo, previamente calentado a 37 °C. Incubar durante 2 h en la incubadora.
- Añadir 500 μL de tripsina a un matraz T25 sembrado con células C2C12 subconfluentes (~70%). Resuspender en 1 mL de medio completo.
- Añadir 10 μL de la resuspensión a 10 μL de colorante azul de tripano y cargar en un hemocitómetro. Contar y calcular el número de células y confirmar la viabilidad celular.
- Aspirar el medio de la placa de 96 pocillos que contiene los dECM y añadir 200 μL de medio de cultivo completo que contenga 50.000 células C2C12 viables.
- Incubar durante 2 días y luego, usando pinzas, transferir las dECM (con las células) a una placa de 48 pocillos con 400 μL de medio de cultivo completo. Cada 2 días, aspirar cuidadosamente el medio con una micropipeta para evitar que los dECM se desprendan del fondo del pozo y añadir medio fresco hasta el día 8.
NOTA: Las matrices se mantienen durante 2 días en placas de 96 pocillos para promover la adhesión de las células C2C12 a los dECM, y luego se transfieren a una placa de 48 pocillos para permitir el acceso a un mayor volumen de medio con nutrientes. Los dECM deben adherirse al fondo de los pozos. - Para el experimento de diferenciación, reemplace el medio de cultivo completo con medio de diferenciación (DMEM suplementado con 2% de suero de caballo y 1% de pluma/estreptococo) el día 8, seguido de incubación en medio de diferenciación durante 4 días hasta el día 12.
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Representative Results
El objetivo del protocolo de descelularización es producir dECMs que se asemejen mucho a la composición del tejido nativo. Para determinar la efectividad del proceso de descelularización, se emplearon varios métodos, incluido el examen de la morfología del tejido, la medición de los niveles de ADN, la tinción de F-actina y el análisis de componentes clave de la ECM utilizando inmunohistoquímica y técnicas de western blotting. Específicamente, se analizaron cinco componentes principales de ECM de los tejidos del músculo esquelético.
A lo largo del protocolo, las muestras cambian de apariencia (Figura 1B 1-4). Después del aislamiento, el tejido muscular aparece rojizo debido a la presencia de mioglobina (Figura 1B1). Después de la incubación en el tampón hipotónico, que lisa las células y elimina la mayoría de las proteínas citoplasmáticas, las muestras se vuelven blancas (Figura 1B2). SDS, un detergente aniónico comúnmente utilizado en la descelularización de tejidos12, elimina eficazmente el material citoplasmático y nuclear, así como las membranas. Como resultado, las muestras se vuelven más transparentes después del tratamiento con SDS (Figura 1B3). Sin embargo, altas concentraciones o exposición prolongada a este detergente pueden causar desnaturalización de proteínas, pérdida de glicosaminoglicanos y alteración de las fibras de colágeno12. El equilibrio óptimo entre la eliminación celular y la preservación de la ECM se logra utilizando SDS al 0,05% durante 24 h, como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3. Finalmente, el ADN se elimina a través del tratamiento con DNasa, lo que resulta en andamios dECM transparentes que son ligeramente más pequeños que después del tratamiento con SDS (Figura 1B4).
El éxito del protocolo de descelularización está indicado por la cantidad de ADN residual presente en las matrices después del proceso. La cuantificación del ADN revela una disminución de casi el 100% en los dECM en comparación con el tejido nativo (Figura 1C). La tinción DAPI también confirma la ausencia de ADN en los dECM (Figura 2B, D, F, H, J).
La presencia de cinco proteínas principales de la ECM se evaluó mediante inmunohistoquímica y por western blot después de la descelularización y se comparó con el tejido nativo. La inmunotinción para la subunidad α2 de laminina (Figura 2A,B) y lamininas totales (Figura 2C,D) muestra que las dECMs muestran una tinción tubular para estas proteínas (flechas en la Figura 2B,D), similar a la matriz de laminina que rodea los miotubos en el tejido nativo (flechas en la Figura 2A,C). El análisis de Western blot para la subunidad α2 de laminina revela la presencia de dos bandas en el tejido nativo (Figura 2A'), mientras que tres bandas, con un peso molecular menor al esperado, pueden detectarse en la dECM (Figura 2B'). Esto puede ser el resultado de la degradación o eliminación de proteínas durante el proceso de descelularización. El análisis de Western blot para lamininas totales muestra cierta fragmentación de estas proteínas en el dECM en comparación con las muestras del tejido nativo (Figura 2C',D').
Figura 1: Procedimiento de descelularización del músculo esquelético fetal y evaluación de la morfología tisular y el contenido de ADN. (A) Representación esquemática del protocolo de descelularización. (B) Morfología tisular a lo largo del protocolo, desde tejido recién recolectado hasta tejido descelularizado. Barra de escala = 1 mm. (C) Cuantificación del ADN presente en los dECMs en comparación con el tejido nativo. Datos expresados como media ± SEM. Prueba t de Student, de dos colas **p < 0,01. El protocolo de descelularización elimina eficientemente el contenido nuclear que produce dECM acelulares. Abreviaturas: dECMs = matrices descelularizadas; PBS = solución salina tamponada con fosfato; SDS = dodecil sulfato de sodio; NT = tejido nativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La inmunotinción para fibronectina (Figura 2E,F) y colágeno I (Figura 2G,H) muestra la presencia de estas proteínas en el espacio intersticial entre células en el tejido nativo (flechas en la Figura 2E,G) y una tinción similar en las dECMs (flechas Figura 2F,H). El análisis de Western blot muestra bandas similares para la fibronectina en ambas condiciones (Figura 2E',F'), lo que indica que esta proteína no se ve particularmente afectada por el proceso de descelularización. Sin embargo, en el caso del colágeno I (Figura 2G',H') hay menos bandas en los dECMs, lo que indica cierto grado de degradación. La inmunotinción para colágeno IV muestra un patrón de tinción tubular en el tejido nativo (flecha en la Figura 2I) y una tinción similar en la DMEC, aunque las estructuras tubulares son más estrechas (flecha en la Figura 2J). El análisis de Western blot para colágeno IV revela la presencia de tres bandas en el tejido nativo (Figura 2I'). Mientras que las mismas tres bandas se observan en los dECMs (Figura 2J'), el peso molecular de estos es menor de lo esperado. De manera similar a la laminina α2, esto puede ser el resultado de la degradación o eliminación de proteínas durante la descelularización.
Luego, los dECM se siembran con mioblastos C2C12 y se cultivan durante 8 días en un medio de cultivo completo. Las células C2C12 colonizan los dECM y proliferan, como lo muestra la tinción nuclear de fosfohistona 3 (flechas en la Figura 3A). Después de 4 días adicionales de cultivo en medio de diferenciación, las células C2C12 se diferencian y se fusionan en miotubos multinucleados (flechas azules en la Figura 3B) que expresan una cadena pesada de miosina (línea discontinua en la Figura 3B). Curiosamente, la tinción intracelular y/o pericelular para la cadena α2 de laminina (flechas amarillas en la Figura 3C, D), lamininas totales (flecha magenta en la Figura 3C) y fibronectina (flecha magenta en la Figura 3D) se pueden detectar en células C2C12 cultivadas en medio de cultivo completo, lo que sugiere que estas células son capaces de sintetizar estas proteínas ECM de novo. , contribuyendo así a la formación de su nicho. Estos resultados demuestran que el protocolo de descelularización genera un microambiente dECM donde los mioblastos C2C12 pueden proliferar, diferenciarse y formar miotubos multinucleados.
Figura 2: Evaluación de cinco proteínas ECM en tejido muscular fetal E18.5 nativo versus descelularizado. Inmunohistoquímica en secciones de tejido nativo (A,C,E,G,I) y tinción de dECMs (B,D,F,H,J) con DAPI, un marcador de ADN, faloidina detectando F-actina, y para proteínas ECM. Barra de escala = 15 μm. En el tejido nativo, la inmunotinción para lamininas y colágeno IV está presente alrededor de las miofibras (A, C, I; flechas amarillas) y la tinción para fibronectina y colágeno I se detecta en el espacio intersticial entre las miofibras (E, G; flechas amarillas). En las dECM, la tinción de lamininas y colágeno IV (B, D, J; flechas amarillas) muestra un patrón tubular, rodeando los espacios dejados por las miofibras después de la descelularización. La inmunotinción de fibronectina y colágeno I de los dECMs es consistente con su presencia en el espacio intersticial (F,H; flechas amarillas). (A'-J') Análisis de Western blot para cinco proteínas ECM en tejido nativo (A',C',E',G',I') y en muestras dECM (B',D',F',H',J'). Ambos enfoques muestran la preservación de proteínas después de la descelularización. Los anticuerpos utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en la Tabla 1. Abreviaturas: LNα2 = cadena α2 de laminina; LNp = lamininas panmusculares; FN = fibronectina; Col I = colágeno I; Col IV = colágeno IV; MHC = cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: recelularización dECM con una línea celular de mioblastos (mioblastos C2C12). (A) Proyección de intensidad máxima de una imagen confocal de una pila de 100 μm de matriz recelularizada, colonizada con células C2C12 marcadas con ADN de tinción de verde de metilo, faloidina que detecta F-actina y anticuerpo anti-pH3, un marcador de proliferación (flechas magenta). Barra de escala = 35 μm. (B) Proyección de intensidad máxima de una imagen confocal de una pila de 100 μm que muestra un miotubo multinucleado (flechas azules indican los núcleos) de miosina positiva (línea discontinua) formado durante el cultivo. Barra de escala = 35 μm. (C,D) Imagen confocal de inmunohistoquímica que muestra tinción intra o pericelular para la cadena α2 de laminina (flechas amarillas), lamininas totales (flechas magenta en C) y fibronectina (flechas magenta en D) en mioblastos, lo que sugiere síntesis de novo de proteínas. Barra de escala = 10 μm. Los anticuerpos utilizados y las diluciones respectivas se enumeran en la Tabla 1. Abreviaturas: pH3 = fosfohistona 3; LNα2 = cadena α2 de laminina; LNp = lamininas panmusculares; FN = fibronectina; MHC = cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La ECM es una red compleja de macromoléculas que está presente en todos los tejidos y desempeña un papel crucial en la regulación del comportamiento y la función celular2. La ECM actúa como un andamio físico para que las células se adhieran y proporciona señales que modulan activamente los procesos celulares como la proliferación, la motilidad, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto, la formación y el mantenimiento adecuados de la MCE son esenciales tanto para el desarrollo como para la homeostasis1.
Si bien los modelos de cultivo celular 2D se han utilizado ampliamente, están siendo reemplazados cada vez más por plataformas 3D más avanzadas. Esto se debe a que los cultivos 2D carecen de las señales químicas y físicas que afectan el comportamiento celular, mientras que los cultivos 3D se consideran una alternativa más realista para estudiar la dinámica molecular y celular en tejidos nativos11. La descelularización de los tejidos resulta en la producción de andamios que imitan más estrechamente los microambientes de los tejidos biológicos, como se demostró en una serie de estudios en varios sistemas de tejidos u órganos 14,15,23,24,25. La capacidad de los dECM para replicar microambientes de tejidos nativos tiene un gran potencial para la investigación sobre el desarrollo normal, diversos estados de enfermedad y el efecto de medicamentos o toxinas en los tejidos11.
El protocolo utilizado en este estudio se basa en el protocolo desarrollado por Silva et al. para descelularizar el tejido cardíaco fetal14 como punto de partida. Implica una combinación de un tampón hipotónico, tratamiento con un detergente aniónico (SDS) y un tratamiento con DNasa. Uno de los principales desafíos en los protocolos de descelularización es encontrar un equilibrio entre la eliminación de células y la preservación de la composición de la proteína ECM. Dado nuestro enfoque en el uso de este sistema de cultivo celular 3D para estudiar las primeras etapas de LAMA2-CMD, se prestó especial atención a la preservación de la laminina 211 durante la descelularización. El protocolo de Silva et al.14 condujo a la pérdida de inmunorreactividad de la cadena α2 de laminina en los músculos fetales descelularizados; esto podría deberse a la concentración de SDS utilizada. Por lo tanto, se probaron alternativas a la etapa de solución detergente SDS al 0,2%, como concentraciones más bajas de SDS (0,1%, 0,05% y 0,02%) y la sustitución de SDS con diferentes concentraciones de Triton X-100 (0,5% y 0,2%). Los mejores resultados se obtuvieron utilizando un tratamiento con detergente SDS al 0,05% durante 24 h. Esta concentración eliminó eficazmente el contenido celular al tiempo que preservó la inmunorreactividad de la cadena α2 de laminina después de la descelularización. Este protocolo produce reproduciblemente dECMs acelulares que están libres de residuos celulares, incluyendo ADN.
El protocolo utilizado en este estudio preserva tanto las proteínas de la matriz intersticial (fibronectina y colágeno I) como las proteínas de la membrana basal (lamininas y colágeno IV). Los estudios futuros deben evaluar si el colágeno VI también se conserva, ya que también es un jugador en las distrofias musculares26. Se sabe que SDS puede alterar la ultraestructura de las proteínas y dañar los colágenos12; para el músculo esquelético fetal, fue importante utilizar una baja concentración de SDS (0,05%) para mantener la inmunorreactividad de la laminina α2. Sin embargo, los resultados del western blot muestran que las muestras descelularizadas muestran más bandas después de la inmunodetección de lamininas y colágenos en comparación con el tejido nativo, indicando que alguna degradación de proteínas ocurrió como resultado del proceso de descelularización27.
Es importante destacar que los experimentos de recelularización demuestran que estas matrices son andamios confiables que apoyan consistentemente la adhesión, proliferación y diferenciación celular. Se ha informado que la SDS es citotóxica28 y, por lo tanto, los pasos de lavado incluidos en el protocolo son cruciales si las matrices se van a utilizar para la recelularización. Estos andamios fueron efectivamente colonizados por células C2C12, lo que indica su idoneidad como sistema modelo para el cultivo 3D de células. La observación de la tinción intracelular y pericelular para las proteínas ECM que rodean las células C2C12 sugiere además que las células están contribuyendo activamente a su microambiente dentro de las dECM. Además, cuando se colocaron en medio de diferenciación, las células C2C12 diferenciaron, fusionaron y formaron miotubos dentro de los dECM.
Un desafío importante en este procedimiento es la manipulación de las muestras a lo largo del protocolo. Las muestras son muy pequeñas y blandas, lo que requiere cuidado y habilidad en el manejo para evitar el atrapamiento en la pipeta de punta fina y la pérdida de las muestras. Los mejores resultados se obtienen al iniciar el protocolo con tejido fresco. El uso de muestras congeladas y almacenadas puede impedir la eliminación del contenido celular y conducir a una mayor degradación de proteínas, lo que dificulta la detección de proteínas y reduce la eficiencia de descelularización.
Sólo unos pocos estudios han reportado la descelularización de los tejidos fetales 15,29,30,31. Específicamente, con respecto a la descelularización del músculo esquelético fetal, solo un estudio previo ha informado sobre la descelularización de muestras compuestas de dermis, tejido subcutáneo y panículo carnoso31. Según el conocimiento de los autores, esta es la primera vez que se establece un protocolo de descelularización para el músculo esquelético del ratón fetal aislado. Este protocolo puede servir como base para la creación de protocolos similares para tejidos musculares fetales de otras especies, como cerdos y humanos13.
El protocolo actual para descelularizar el músculo esquelético del ratón E18.5 es muy similar al procedimiento de Silva et al.14, quienes lo aplicaron a un corazón de ratón E18. La única diferencia es la concentración de SDS utilizada, que es considerablemente menor que la utilizada para el corazón fetal (0,05% vs. 0,2%), posiblemente debido a las diferentes propiedades físicas de estos dos tejidos fetales.
El desarrollo de este modelo in vitro no sólo permite estudiar los procesos implicados en el desarrollo muscular fetal normal, sino que también permite la investigación paralela de distrofias musculares y miopatías de inicio precoz, como LAMA2-CMD, que se manifiesta como un defecto de miogénesis en E18.5 en el modelo de ratón dyW 10. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este sistema es limitado en el sentido de que solo incluye la ECM y las células musculares y no contiene otros tipos de células como neuronas, células endoteliales y fibroblastos. La relevancia de estos tipos de células adicionales puede variar dependiendo de la enfermedad, y pueden ser necesarias modificaciones en el sistema de cultivo para incluirlas. En general, el uso de dECM como se describe en este estudio se puede aplicar en el estudio de varias distrofias musculares y miopatías de inicio temprano.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Téléthon; contrato no. 23049), el proyecto MATRIHEALTH y la unidad de financiación del cE3c UIDB/00329/2020. Nos gustaría agradecer a nuestro donante Henrique Meirelles que eligió apoyar el Proyecto MATRIHEALTH. Este trabajo se benefició de las infraestructuras de la Instalación de Microscopía de la Facultad de Ciencias, un nodo de la Plataforma Portuguesa de BioImagen (referencia PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), y agradecemos a Luís Marques por su ayuda con la adquisición y procesamiento de imágenes. Finalmente, agradecemos a Marta Palma por el apoyo técnico y a nuestro equipo de investigación por sus generosas contribuciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
