Summary
In dit werk werd een decellularisatieprotocol geoptimaliseerd om gedecellulariseerde matrices van foetale skeletspieren van muizen te verkrijgen. C2C12-myoblasten kunnen deze matrices koloniseren, prolifereren en differentiëren. Dit in vitro model kan worden gebruikt om celgedrag te bestuderen in de context van skeletspierziekten zoals spierdystrofieën.
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) speelt een cruciale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor cellen en het overbrengen van signalen die belangrijk zijn voor verschillende cellulaire processen. Tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen vereenvoudigen de complexe interacties tussen cellen en de ECU te veel, omdat het ontbreken van een volledige driedimensionale (3D) ondersteuning het celgedrag kan veranderen, waardoor ze ontoereikend zijn voor het begrijpen van in vivo processen. Tekortkomingen in de samenstelling van ECM en cel-ECM interacties zijn belangrijke bijdragen aan een verscheidenheid van verschillende ziekten.
Een voorbeeld is LAMA2-congenitale spierdystrofie (LAMA2-CMD), waarbij de afwezigheid of vermindering van functionele laminine 211 en 221 kan leiden tot ernstige hypotonie, detecteerbaar bij of kort na de geboorte. Eerder werk met behulp van een muismodel van de ziekte suggereert dat het begin ervan optreedt tijdens foetale myogenese. De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een 3D in vitro model dat de studie van de interacties tussen spiercellen en de foetale spier-ECM mogelijk maakt, waarbij de inheemse micro-omgeving wordt nagebootst. Dit protocol maakt gebruik van diepe rugspieren ontleed van E18.5 muizenfoetussen, behandeld met een hypotone buffer, een anionisch reinigingsmiddel en DNase. De resulterende gedecellulariseerde matrices (dECM's) behielden alle geteste ECM-eiwitten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) in vergelijking met het inheemse weefsel.
Toen C2C12-myoblasten bovenop deze dECM's werden gezaaid, drongen ze de dECM's binnen en koloniseerden ze, wat hun proliferatie en differentiatie ondersteunde. Bovendien produceerden de C2C12-cellen ECM-eiwitten, wat bijdroeg aan de remodellering van hun niche binnen de dECM's. De oprichting van dit in vitro platform biedt een nieuwe veelbelovende aanpak om de processen te ontrafelen die betrokken zijn bij het ontstaan van LAMA2-CMD, en heeft het potentieel om te worden aangepast aan andere skeletspierziekten waarbij tekortkomingen in de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen bijdragen aan de progressie van de ziekte.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) is een belangrijk bestanddeel van weefsels, die hun niet-cellulaire component vertegenwoordigen. Deze driedimensionale (3D) structuur biedt niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen, maar speelt ook een cruciale rol in de biochemische processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organismen1. De vorming van een weefselspecifieke ECM vindt plaats tijdens de ontwikkeling, als gevolg van de complexe interacties tussen cellen en hun niches, beïnvloed door verschillende intra- en extracellulaire stimuli. De ECM is een zeer dynamische structuur die chemische en mechanische herschikkingen ondergaat op een temporeel-ruimtelijke manier en direct van invloed is op het lot van de cel2. Een van de meest opvallende kenmerken van de ECM is de functionele diversiteit, omdat elke weefsel-ECM een unieke combinatie van moleculen vertoont die verschillende topologieën en eigenschappen bieden die zijn afgestemd op de cellen die het bevat1.
ECM-signalering en -ondersteuning zijn cruciaal voor ontwikkeling en homeostase en kunnen bij verstoring leiden tot meerdere pathologische aandoeningen 3,4. Een voorbeeld is LAMA2-deficiënte congenitale dystrofie (LAMA2-CMD), de meest voorkomende vorm van congenitale spierdystrofie. Het LAMA2-gen codeert voor de laminine α2-keten, die aanwezig is in laminine 211 en laminine 221, en wanneer gemuteerd kan leiden tot LAMA2-CMD 5. Laminine 211 is de belangrijkste isovorm die wordt aangetroffen in het keldermembraan rond skeletspiervezels. Wanneer laminine 211 abnormaal of afwezig is, wordt de verbinding tussen het keldermembraan en spiercellen verstoord, wat leidt tot het begin van de ziekte6. Patiënten met LAMA2-CMD vertonen een mild tot ernstig fenotype, afhankelijk van het type mutatie in het LAMA2-gen.
Wanneer de functie van het laminine α2-eiwit wordt beïnvloed, kunnen patiënten bij de geboorte ernstige spierhypotonie ervaren en chronische ontsteking, fibrose en spieratrofie ontwikkelen, wat leidt tot een verminderde levensverwachting. Tot op heden zijn er geen gerichte behandelingen ontwikkeld en zijn therapeutische benaderingen beperkt tot het verlichten van de symptomen van de ziekte7. Daarom is het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan van deze ziekte cruciaal voor het ontwikkelen van geschikte therapeutische strategieën 6,8. Eerder werk met behulp van de dyW-muis 9, een model voor LAMA2-CMD, suggereert dat het begin van de ziekte begint in utero, met name tijdens foetale myogenese10. Een beter begrip van hoe het foetale myogenesedefect ontstaat, zou een game changer zijn bij het genereren van nieuwe therapeutische benaderingen voor LAMA2-CMD.
In vitro systemen bieden een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van cel-cel en cel-ECM interacties, maar 2D-cultuurmodellen missen de complexiteit van inheemse weefsels. Decellularisatie van weefsels produceert weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke acellulaire ECM-scaffolds die de natuurlijke celmicro-omgeving nauwkeuriger nabootsen in vergelijking met 2D-modellen en gemanipuleerde / synthetische steigers. Gedecellulariseerde matrices (dECM's) hebben het potentieel om de moleculaire en mechanische signalen van het gastheerweefsel te behouden, waardoor ze betere alternatieve modellen zijn voor het begrijpen van in vivo processen11.
Er zijn verschillende technieken, reagentia en aandoeningen die kunnen worden gebruikt voor decellularisatie12,13. In deze studie wordt een decellularisatieprotocol voor het foetale muizenhart, beschreven door Silva et al.14,15, aangepast aan de skeletspieren van de foetale muis en blijkt het alle geteste ECM-componenten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) te behouden. Het protocol omvat drie stappen: cellyse door osmotische shock (hypotone buffer), plasmamembraanoplossing en eiwitdissociatie (0,05% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en enzymatische vernietiging van DNA (DNase-behandeling). Voor zover wij weten, is dit het eerste vastgestelde protocol voor het decellulariseren van foetale skeletspieren van muizen.
Om dit 3D in vitro systeem te gebruiken voor het bestuderen van LAMA2-CMD, is het cruciaal om de laminine α2 keten te behouden na decellularisatie. Daarom werd een optimalisatieprotocol geïmplementeerd waarbij verschillende detergentia (SDS en Triton X-100) en concentraties (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% en 0,5%) werden getest (gegevens niet getoond). De optimale keuze voor celverwijdering en conservering van het laminine α2-eiwit bleek 0,05% SDS te zijn. C2C12-cellen, een gevestigde myoblastcellijn16,17, werden gebruikt om de dECM's te zaaien. Deze cellen dringen de dECM binnen, prolifereren en differentiëren in deze steigers, waardoor nieuwe ECM-eiwitten worden gesynthetiseerd. De succesvolle productie van dit 3D in vitro model biedt een nieuwe benadering voor het begrijpen van de moleculaire en cellulaire processen die betrokken zijn bij foetale myogenese, het begin van LAMA2-CMD, en kan worden uitgebreid naar andere spierziekten waar de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen wordt verstoord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven methodologieën zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn (ORBEA) van de Faculteit Wetenschappen, Universiteit van Lissabon en Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) en zijn in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU.
1. Voorbereiding van decellularisatiebuffers en reagentia
OPMERKING: Alle oplossingen die tijdens het decellularisatieprotocol worden gebruikt, moeten door autoclaveren worden gesteriliseerd en maximaal 3 maanden worden bewaard, tenzij anders vermeld.
- Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (10x PBS) door natriumchloride (NaCl) toe te voegen bij 137 mM, kaliumchloride (KCl) bij 2,68 mM, kalium-diwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4) bij 8,1 mM en dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na 2 HPO4) bij 1,47 mM toe te voegen aan gedemineraliseerd water (dH2O) en de pH aan tepassen naar 6,8. Voeg 100 ml 10x PBS toe aan 900 ml gedemineraliseerd H2O om 1x PBS te genereren. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur (RT). Voeg steriele penicilline/streptomycine stockoplossing (10.000 E/ml penicilline en 10 mg/ml streptomycine [pen/streptokokken]) toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% vóór gebruik.
- Bereid de hypotone buffer door 1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris-base) en 1 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) op te lossen in 1 L dH2O (10 mM Tris-base 0,1% EDTA). Gebruik een magneetroerder totdat deze is opgelost en stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij RT. Voeg pen/streptokokken toe tot een eindconcentratie van 1% voor gebruik.
- Bereid de hypotone wasbuffer door 1,21 g Tris-base op te lossen in 1 L dH2O (10 mM Tris-base). Gebruik een magneetroerder totdat deze is opgelost en stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Autoclaaf en bewaren bij RT. Voeg pen/streptokokken toe aan 1% voor gebruik.
- Bereid de behandeling met anionisch wasmiddel voor door 0,05 g natriumdodecylsulfaat (SDS) toe te voegen aan 100 ml hypotone wasbuffer om een 0,05% SDS-behandelingsoplossing te produceren. Filtreer door een membraanfilter van 0,22 μm. Bewaren bij RT voor maximaal 1 maand.
OPMERKING: De SDS-oplossing mag niet worden geautoclaveerd, omdat SDS neerslaat en afbreekt bij autoclaveren. - Bereid de DNase-behandelingsoplossing door 1,21 g Tris-base op te lossen in 0,5 ml dH 2 O envoeg 1 ml 1 M magnesiumchloride (MgCl2) toe. Stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Autoclaaf en bewaar bij RT. Voeg DNase I toe voor gebruik (50 U/ml).
2. Monsterverzameling
OPMERKING: Wild-type C57 / BL6-muizen werden gebruikt in de studie. Alle technieken werden uitgevoerd in een laminaire stromingskap onder steriele omstandigheden.
- Euthanaseer volwassen zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag (E) 18,5 van de zwangerschap met behulp van isofluraaninhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Onderwerp de muizen aan terminale dissectie om de foetussen te extraheren.
- Spuit de buik van de muis in met 70% ethanol.
- Til met behulp van een chirurgische tang en schaar een huidplooi in de onderbuik op en maak een U-vormige incisie om de buikholte bloot te leggen18.
- Verzamel de baarmoederhoorns met de E18.5-foetussen door de eileiders en baarmoederhals te snijden en breng ze onmiddellijk over naar een petrischaaltje met ijskoude 1x PBS met 1% pen / streptokokken18.
- Verwijder snel de foetussen uit de baarmoeder en extra-embryonale weefsels en euthanaseer ze door onthoofding met een schaar18.
- Breng één foetus per keer over naar een petrischaaltje met ijskoude 1x PBS. Verwijder met behulp van een stereomicroscoop de huid en snijd de ledematen af. Snijd vanaf de ventrale kant door de ribbenkast en verwijder het borstbeen en de onderliggende organen.
- Draai de foetale romp dorsale kant naar boven. Verwijder het cervicale deel van de wervelkolom, de dorsale vetafzettingen en het bindweefsel bovenop de diepe rugspieren.
- Gebruik een chirurgische tang om de ribbenkast te verankeren en schraap en maak de diepe rugspieren voorzichtig los van de omliggende weefsels met behulp van een micro-scalpel10. Deze procedure resulteert in de isolatie van twee spierstukken per foetus (links en rechts), beide voornamelijk samengesteld uit longissimus - en iliocostalisspieren , met enkele van de transversospinalis - en levator-costarumspieren inbegrepen.
- Bewaar de spiermonsters in 1x PBS met 1% pen/streptokokken bij 4 °C voor korte opslag (<1 week), of bij -80 °C voor langere periodes.
OPMERKING: Gebruik vers verzamelde monsters voor de beste resultaten. Monsters die gedurende langere perioden (>3 maanden) zijn ingevroren, vertonen een lagere decellularisatie-efficiëntie en meer eiwitafbraak. Epaxiale spiermassa's werden gebruikt voor de decellularisatie-experimenten, maar andere spieren (bijv. Ledemaatspieren) kunnen worden verwerkt voor decellularisatie met behulp van hetzelfde protocol.
3. Decellularisatie van de foetale skeletspieren
OPMERKING: Alle technieken werden uitgevoerd in een laminaire stromingskap onder steriele omstandigheden. Voor een gedetailleerde schematische weergave, zie figuur 1A. Alle stappen werden uitgevoerd met roeren in een orbitale schudder met een diameter van 120 mm (165 tpm) bij 25 °C, tenzij anders vermeld. Voeg voor gebruik 1% pen/streptokokken toe aan oplossingen. Zuig bij het verwijderen van de oplossingen voorzichtig aan om beknelling van het monster in de pipet te voorkomen.
- Dag 1 - Bereid ongeveer 2 mm x 1 mm x 1 mm (~ 3,5 mg) weefselfragmenten van de epaxiale spiermassa's. Voeg 3 ml hypotone buffer met 1% pen/streptokokken toe aan elke put van een 12-well plaat en voeg één heel spierweefselfragment per put toe.
- Incubeer de weefselfragmenten in hypotone buffer met roeren gedurende 18 uur (nacht) (O / N).
- Dag 2 - Zuig de hypotone buffer op met behulp van een pipet met fijne punt en was de monsters 3 x 1 uur met 3 ml 1x PBS telkens met roeren.
- Incubeer de monsters gedurende 24 uur met 3 ml 0,05% SDS-reinigingsmiddeloplossing met roeren.
OPMERKING: (CHECK POINT) Na SDS-incubatie moeten de monsters er transparant uitzien. De monsters vertonen een gelatine-achtige consistentie en zijn daarom meer geneigd om zich aan de pipet te hechten bij het verwijderen van de vloeistoffen.
- Incubeer de monsters gedurende 24 uur met 3 ml 0,05% SDS-reinigingsmiddeloplossing met roeren.
- Dag 3 - Verwijder de SDS-wasmiddeloplossing met een pipet met fijne punt en was de weefselfragmenten 3 x 20 minuten met 3 ml hypotone wasbuffer telkens met roeren.
OPMERKING: (PAUZEPUNT) De monsters kunnen gedurende 18 uur (O/N) in hypotone wasbuffer op 4 °C worden gehouden. Zorg ervoor dat SDS goed wordt verwijderd tijdens wasstappen, omdat resterende SDS cytotoxisch kan zijn.- Incubeer de weefselfragmenten gedurende 3 uur met 2 ml DNase-oplossing met roeren bij 37 °C.
- Verwijder de DNase-oplossing met een pipet met fijne punt en was de weefselfragmenten 3 x 20 minuten met 3 ml 1x PBS telkens met roeren. Was ten slotte O/N met roeren (60 tpm).
OPMERKING: Na de DNase-behandeling worden de dECM's kleverig door de aanwezigheid van DNA-residuen. Daarom is zorgvuldig wassen noodzakelijk. - Bewaar de dECM's in 1x PBS met 1% pen/streptokokken bij 4 °C tot recellularisatie (<1 week). Voor andere toepassingen, bewaren bij -80 °C.
4. Kwaliteitsbeoordeling van decellularisatie
OPMERKING: DNA-kwantificering, DAPI/methylgroene kleuring en falloidinekleuring werden uitgevoerd om de aanwezigheid van resterende celinhoud na decellularisatie te evalueren. Immunohistochemie en western blot-analyses werden uitgevoerd om de retentie van belangrijke ECM-eiwitten na decellularisatie te beoordelen.
- Kwantificering van het DNA aanwezig in de dECM
OPMERKING: De dECM's moeten worden vergeleken met het inheemse weefsel om de aanwezigheid van DNA te detecteren.- Weeg voorafgaand aan de decellularisatie een microcentrifugebuis van 1,5 ml op een zeer nauwkeurige digitale weegschaal. Voordat u het spiermonster naar de buis overbrengt, verwijdert u alle resterende 1x PBS met een papieren handdoek. Weeg de tube af met het monster. Bereken het natte gewicht van de monsters met behulp van vergelijking (1):
Monster nat gewicht =gewichtsbuis met monsters-gewicht lege buis (1) - Decellulariseer de monsters volgens het protocol beschreven in rubriek 3.
- Plaats de monsters in microcentrifugebuizen van 2 ml.
OPMERKING: De monsters kunnen bij -20 °C worden bewaard tot DNA-extractie en kwantificering. - Voer DNA-extractie uit van de dECM's en inheemse weefselmonsters met behulp van een op spinkolommen gebaseerde kit. Voeg de verteringsbuffer toe volgens de instructies van de fabrikant.
- Homogeniseer de monsters in een kralenmolen twee keer gedurende 2,5 minuten telkens (de steunen omdraaien) met behulp van één wolfraamcarbidekraal per buis (gebruik gekoelde buisbevestigingen).
- Voeg proteïnase K toe en incubeer O/N met langzaam roeren bij 56 °C.
- Ga verder met het protocol zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
- Elueer met de door de fabrikant geleverde buffer en centrifugeer 2 x 1 min bij ≥6.000 x g, telkens bij 4 °C om de DNA-opbrengst te verhogen.
OPMERKING: DNA kan worden bewaard bij -20 °C tot kwantificering. - Kwantificeer het DNA dat aanwezig is in de monsters met behulp van een fluorescerende dsDNA-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Normaliseer het DNA-gehalte als nanogram DNA per milligram oorspronkelijk nat gewicht van het monster.
- Analyseer de gegevens met behulp van een tweezijdige student's t-test en druk uit als de gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Weeg voorafgaand aan de decellularisatie een microcentrifugebuis van 1,5 ml op een zeer nauwkeurige digitale weegschaal. Voordat u het spiermonster naar de buis overbrengt, verwijdert u alle resterende 1x PBS met een papieren handdoek. Weeg de tube af met het monster. Bereken het natte gewicht van de monsters met behulp van vergelijking (1):
- Immunohistochemie
OPMERKING: Oplossingen 1, 2 en 3 en de fixatieve oplossing moeten vóór gebruik worden bereid en kunnen maximaal 6 maanden bevroren worden bewaard. Alle gebruikte antilichamen en kleurstoffen en respectieve verdunningen worden vermeld in Tabel 1.- Bereiding van oplossingen
- Bereid fixatieve oplossing door 2 g paraformaldehyde (PFA), 8 g sucrose en 24 μL 1 M CaCl 2 toe te voegen aan 77 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 en 23 ml 0,2 M NaH2 PO 4, aan een eindvolume van 200 ml door toevoeging van dH2 O.Stel de pH in op7,4.
- Bereid 0,12 M fosfaatbuffer door 13,5 g Na 2 HPO 4 en 3,2 g NaH 2 PO 4 toe te voegen aan 1 L dH2O. Stel de pH in op7,4.
- Bereid oplossing 1 door 4 g sucrose toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M.
- Bereid oplossing 2 door 15 g sacharose toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M.
- Bereid oplossing 3 door 15 g sacharose en 7,5 g gelatine toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M. Verwarm op 37 °C tot de gelatine is opgelost.
- Bereid methylgroene stockoplossing (2% methylgroen poeder opgelost in dH2O)19.
- Immunodetectie
- Bevestig de monsters met de fixatieve oplossing gedurende ten minste 4 uur bij 4 °C.
- Was de monsters 2x gedurende 10 minuten met 1x PBS.
- O/N of meer dan 1 dag bewaren in oplossing 1 bij 4 °C.
- Was en bewaar O/N of meer dan 1 dag in oplossing 2 bij 4 °C. Laat de monsters opwarmen tot RT.
- Incubeer gedurende 3 uur in oplossing 3 bij 37 °C. Bewaar extra oplossing 3 bij 37 °C om later te gebruiken.
- Vorm kleine (2 cm x 1 cm x 1 cm) containers in aluminiumfolie. Plaats een dunne laag oplossing 3 in de gegoten container en laat deze opstijven. Leg de monsters op de gestolde oplossing 3 en dek af met warme oplossing 3. Oriënteer de monsters en laat ze stollen. Markeer de locatie op de gestolde oplossing 3 met een kleurenpen.
- Bevries door de containers op het oppervlak van droogijsgekoeld of vloeibaar stikstofgekoeld isopentaan te plaatsen.
- Met behulp van een optimale snijtemperatuur (O.C.T.) compound, bevestigt u de bevroren gelatineblokjes met de monsters op de cryostaat.
- Snijd de bevroren gelatineblokjes en breng de weefselsecties over naar de dia's. Laat ze 60 min drogen.
- Gebruik een hydrofobe marker om een lijn rond de secties te volgen.
- Was de dia's 3 x 10 min in 1x PBS.
- Bedek de secties met 1% runderserumalbumine (BSA), 1% geitenserum en 0,05% Triton X-100 verdund in 1x PBS (blokkeringsoplossing) gedurende 30 minuten (blokkeringsstap).
- Verdun de primaire antilichamen in een blokkerende oplossing en bedek de secties. Incubeer O/N bij 4 °C in een gesloten doos, met vochtig papier, om te voorkomen dat de secties uitdrogen.
- Was de dia's 3 x 10 min met 1x PBS.
- Verdun de secundaire antilichamen in een blokkerende oplossing en bedek de secties. Incubeer gedurende 1,5 uur bij RT in het donker.
OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht om degradatie van fluoroforen te voorkomen. - Was de dia's 3 x 10 min met 4x PBS.
OPMERKING: Een hogere concentratie PBS kan worden gebruikt wanneer een sterke achtergrond aanwezig is. - Dompel de dia's onder in DAPI-oplossing (5 μg/ml 1,4-diazabicyclo-2,2,2-octaan in 0,1% Triton X-100/1x PBS) gedurende elk 30 s.
- Afspoelen in 1x PBS.
- Monteer de secties in antifadingmedium (50 mg/ml n-propylgallaat in 1x PBS:glycerol [1:9]) en sluit af met een coverslip. Bewaren bij 4 °C tot observatie en beeldacquisitie in een fluorescentiemicroscoop20.
OPMERKING: Voor de in toto immunohistochemische experimenten werd hetzelfde protocol (zie stappen 4.2.2.12-4.2.2.18) gebruikt, behalve dat de monsters eerder waren gefixeerd in 4% PFA verdund in 1x PBS gedurende 3 uur bij RT. DNA-kleuring werd uitgevoerd door methylgroen toe te voegen aan de secundaire antilichaamoplossing. Alle gebruikte antilichamen en kleurstoffen, en hun respectieve verdunningen, zijn vermeld in tabel 1. Monsters werden vervolgens gemonteerd in anti-fading medium tussen twee coverslips gescheiden door stalen ringen, aan elkaar gelijmd met bijenwas, en 100 μm beeldstapels werden verkregen met behulp van een confocale microscoop21.
- Bereiding van oplossingen
- Western blot analyse
OPMERKING: Alle gebruikte antilichamen en respectieve verdunningen zijn vermeld in Tabel 1.- Bereiding van oplossingen
- Bereid de 2x SDS-PAGE-laadbuffer voor door 20 ml glycerol, 4 g SDS en 0,2 ml broomfenolblauw toe te voegen aan 80 ml 100 ml Tris-basisoplossing. Stel de pH in op 6,8. Voeg voor gebruik verse dithiothreitol (DTT) toe.
- Bereid de Tris gebufferde zoutoplossing wasbuffer met Tween 20 (TBST) oplossing door 2,4 g Tris-base, 8,8 g NaCl en 1 ml Tween-20 tot dH2O toe te voegen aan een eindvolume van 1 L. Stel de pH in op 7,4-7,6 met HCl.
- Bereid de 10x lopende buffer (RB) voor door 30,2 g Tris-base, 144,2 g glycine en 10 g SDS toe te voegen aan 1 L dH2O. Voeg voor gebruik 100 ml 10x RB toe aan 900 ml dH2O om 1x RB (werkoplossing) te bereiden.
OPMERKING: Terwijl 10x RB enkele maanden bij RT kan worden opgeslagen, kan 1x RB op verschillende runs worden hergebruikt. - Bereid de overdrachtsbuffer (TB) voor door 5,82 g Tris-base, 2,93 g glycine en 0,5 g SDS toe te voegen aan 800 ml dH2O. Nadat de componenten zijn opgelost, voegt u 200 ml methanol toe. Afkoelen bij 4 °C.
OPMERKING: De TB moet voor elk gebruik vers worden bereid.
- Eiwitextractie
- Verzamel epaxiale spieren van E18.5-muizen en plaats ze onmiddellijk in een microcentrifugebuis (2 ml) met 2x SDS-PAGE-laadbuffer met vers toegevoegde DTT (100 mM DTT). Verwerk E18.5 dECM op dezelfde manier.
- Voeg één wolfraamcarbide kraal per buis toe. Homogeniseer 2x in een kralenmolen telkens 2,5 min (draai de steunen om).
- Soniceer de monsters gedurende 5 minuten in een echobad.
- Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 50 °C.
- Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 12.000 × g .
- Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Kwantificeer het eiwit met behulp van een microvolumespectrofotometer.
- Bewaren bij -20 °C tot verder gebruik.
- Polyacrylamide gel elektroforese
- Gebruik prefab acrylamide gradiëntgel (4%-20%)
- Monteer de gel in de elektroforesetank. Verwijder de kam voorzichtig. Voeg 1x RB toe tot de lijn die in de elektroforesetank wordt weergegeven. Zorg ervoor dat de putten gevuld zijn met RB.
- Laad 100 μg eiwit per monster in de putjes. Laad 12 μL eiwitstandaard met een hoog molecuulgewicht.
- Loop in totaal 100 minuten met constante spanning (10 min bij 150 V en 90 min bij 185 V).
- Overdracht
- Week de filterpads en sponzen met gekoelde TB (4 °C) terwijl de gel loopt.
- Snijd de polyvinylideendifluoridemembranen op de grootte van de gel. Activeer ze met methanol en was ze met dH2O. Week in de TB.
- Monteer de transfercassette met de sponzen, filterpads, gels en geactiveerde membranen volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats de cassette in de elektroforesetank met de gekoelde TB (op een bed van ijs). Voeg de koeleenheid toe. Loop gedurende 90 minuten op 100 V.
- Na de overdracht beitsen met een Coomassie blauwe vervanger om de transferkwaliteit te beoordelen.
- Immunodetectie
- Bereid de blokkerende oplossing (TBST met 5% magere melk). Incubeer de membranen met roeren gedurende 1 uur bij RT.
- Spoel 3 x 5 s af met TBST.
- Incubeer de membranen O/N met de primaire antilichamen verdund in TBST met 2% BSA en 0,02% natriumazide (3 ml per membraan) in een koude kamer (4 °C) met roeren.
- De volgende dag 3 x 5 min wassen met TBST.
- Incubeer de membranen met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in TBST met 5% magere melk (5 ml voor elk membraan) gedurende 1 uur bij RT.
- Was de vliezen met TBST 3 x 5 min. Houd in TBST tot de detectiestap.
- Visualiseer het eiwit met behulp van een in de handel verkrijgbare ontwikkelkit. Voeg detectiereagentia toe volgens de instructies van de fabrikant. Verkrijg beelden van de bands.
- Om meer dan één antilichaam per membraan te testen, stript u na de detectiestap de voormalige antilichamen met drie wasbeurten (elk 5 minuten) met TBST en herhaalt u de stappen 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Bereiding van oplossingen
Tabel 1: Antilichamen en kleurstoffen die worden gebruikt in immunohistochemie en western blot-analyse en de respectieve verdunningen. Klik hier om deze tabel te downloaden.10,22
5. Celkweek in gedecellulariseerde matrices
OPMERKING: Alle technieken werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap. Alle incubaties werden uitgevoerd bij 37 °C en met 5% CO2.
- Bereid het celkweekmedium, hoog glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium met stabiele glutamine en met natriumpyruvaat (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% pen/streptokokken (compleet kweekmedium).
- Plaats de dECM's in een petrischaaltje in 1x PBS met 1% pen/streptokokken in een laminaire flowkap en scheid ze in stukjes van ongeveer 500 μm x 500 μm x 250 μm, met behulp van een micro scalpel en pincet.
OPMERKING: dECM's hebben een zachte textuur en daarom is het vaak gemakkelijker om een pincet te gebruiken om ze in ongeveer even grote stukken te scheiden in plaats van ze met het micro-scalpel te snijden. - Breng de fragmenten over in een plaat van 96 putten (drie of vier stuks per put) met 200 μL volledig kweekmedium, vooraf opgewarmd tot 37 °C. Incubeer gedurende 2 uur in de couveuse.
- Voeg 500 μL trypsine toe aan een T25-kolf bezaaid met sub-confluente (~70%) C2C12-cellen. Resuspendie in 1 ml volledig medium.
- Voeg 10 μL van de resuspensie toe aan 10 μL Trypan blauwe kleurstof en laad in een hemocytometer. Tel en bereken het celnummer en bevestig de levensvatbaarheid van de cel.
- Zuig het medium op uit de 96-putplaat met de dECM's en voeg 200 μL volledig kweekmedium toe met 50.000 levensvatbare C2C12-cellen.
- Incubeer gedurende 2 dagen en breng vervolgens, met behulp van een pincet, de dECM's (met de cellen) over op een 48-wellige plaat met 400 μL volledig kweekmedium. Zuig om de 2 dagen het medium voorzichtig op met een micropipette om te voorkomen dat de dECM's loskomen van de bodem van de put en voeg vers medium toe tot dag 8.
OPMERKING: Matrices worden gedurende 2 dagen bewaard in 96-putplaten om de C2C12-celhechting aan de dECM's te bevorderen en worden vervolgens overgebracht naar een 48-well-plaat om toegang te krijgen tot een groter volume medium met voedingsstoffen. dECM's moeten zich hechten aan de bodem van de putten. - Vervang voor het differentiatie-experiment het volledige kweekmedium door differentiatiemedium (DMEM aangevuld met 2% paardenserum en 1% pen/streptokokken) op dag 8, gevolgd door incubatie in differentiatiemedium gedurende 4 dagen tot dag 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het decellularisatieprotocol is om dECM's te produceren die sterk lijken op de samenstelling van inheems weefsel. Om de effectiviteit van het decellularisatieproces te bepalen, werden verschillende methoden gebruikt, waaronder onderzoek van weefselmorfologie, meting van DNA-niveaus, kleuring voor F-actine en analyse van belangrijke ECM-componenten met behulp van immunohistochemie en westerse blottingtechnieken. In het bijzonder werden vijf belangrijke ECM-componenten van skeletspierweefsels geanalyseerd.
Gedurende het protocol veranderen monsters van uiterlijk (figuur 1B 1-4). Na isolatie lijkt het spierweefsel roodachtig door de aanwezigheid van myoglobine (figuur 1B1). Na incubatie in de hypotone buffer, die cellen lyseert en de meeste cytoplasmatische eiwitten verwijdert, worden de monsters wit (figuur 1B2). SDS, een anionisch reinigingsmiddel dat vaak wordt gebruikt bij weefseldecellularisatie12, verwijdert effectief cytoplasmatisch en nucleair materiaal, evenals membranen. Hierdoor worden de monsters transparanter na SDS-behandeling (figuur 1B3). Hoge concentraties of langdurige blootstelling aan dit wasmiddel kunnen echter eiwitdenaturatie, verlies van glycosaminoglycanen en verstoring van collageenvezels veroorzaken12. De optimale balans tussen celverwijdering en behoud van de ECU wordt bereikt met 0,05% SDS gedurende 24 uur, zoals weergegeven in figuur 2 en figuur 3. Ten slotte wordt DNA verwijderd door middel van DNase-behandeling, wat resulteert in transparante dECM-steigers die iets kleiner zijn dan na SDS-behandeling (figuur 1B4).
Het succes van het decellularisatieprotocol wordt aangegeven door de hoeveelheid rest-DNA die na het proces in de matrices aanwezig is. DNA-kwantificering onthult een afname van bijna 100% in de dECM's in vergelijking met het inheemse weefsel (figuur 1C). DAPI-kleuring bevestigt ook de afwezigheid van DNA in de dECM's (figuur 2B, D, F, H, J).
De aanwezigheid van vijf belangrijke ECM-eiwitten werd geëvalueerd door immunohistochemie en door western blot na decellularisatie en vergeleken met het inheemse weefsel. Immunostaining voor de laminine α2-subeenheid (figuur 2A,B) en totale lamininen (figuur 2C,D) laat zien dat de dECM's een buisvormige kleuring voor deze eiwitten vertonen (pijlen in figuur 2B,D), vergelijkbaar met de lamininematrix rond myotubes in het inheemse weefsel (pijlen in figuur 2A,C). Western blot-analyse voor laminine α2-subeenheid onthult de aanwezigheid van twee banden in het inheemse weefsel (figuur 2A'), terwijl drie banden, met een kleiner molecuulgewicht dan verwacht, kunnen worden gedetecteerd in de dECM (figuur 2B'). Dit kan het gevolg zijn van eiwitafbraak of -verwijdering tijdens het decellularisatieproces. Western blot-analyse voor totale lamininen toont enige fragmentatie van deze eiwitten in de dECM in vergelijking met monsters van het inheemse weefsel (figuur 2C',D').
Figuur 1: Decellularisatieprocedure van de foetale skeletspieren en evaluatie van weefselmorfologie en DNA-gehalte. (A) Schematische weergave van het decellularisatieprotocol. (B) Weefselmorfologie gedurende het hele protocol, van vers verzameld tot gedecellulariseerd weefsel. Schaalbalk = 1 mm. (C) Kwantificering van DNA aanwezig in de dECM's in vergelijking met het inheemse weefsel. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Student's t-test, tweezijdige **p < 0,01. Het decellularisatieprotocol verwijdert efficiënt nucleaire inhoud die acellulaire dECM's produceert. Afkortingen: dECM's = gedecellulariseerde matrices; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing; SDS = natriumdodecylsulfaat; NT = inheems weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Immunostaining voor fibronectine (figuur 2E,F) en collageen I (figuur 2G,H) toont de aanwezigheid van deze eiwitten in de interstitiële ruimte tussen cellen in het inheemse weefsel (pijlen in figuur 2E,G) en een vergelijkbare kleuring in de dECM's (pijlen figuur 2F,H). Western blot-analyse toont vergelijkbare banden voor fibronectine in beide omstandigheden (figuur 2E',F'), wat aangeeft dat dit eiwit niet bijzonder wordt beïnvloed door het decellularisatieproces. In het geval van collageen I (figuur 2G',H') zijn er echter minder banden in de dECM's, wat wijst op een zekere mate van afbraak. Immunostaining voor collageen IV toont een buisvormig kleuringspatroon in het inheemse weefsel (pijl in figuur 2I) en een vergelijkbare kleuring in de dECM, hoewel de buisvormige structuren smaller zijn (pijl in figuur 2J). Western blot-analyse voor collageen IV onthult de aanwezigheid van drie banden in het inheemse weefsel (figuur 2I'). Hoewel dezelfde drie banden worden waargenomen in de dECM's (figuur 2J'), is het molecuulgewicht hiervan lager dan verwacht. Net als laminine α2 kan dit het gevolg zijn van eiwitafbraak of -verwijdering tijdens de decellularisatie.
dECM's worden vervolgens gezaaid met C2C12-myoblasten en gedurende 8 dagen gekweekt in een volledig kweekmedium. C2C12-cellen koloniseren de dECM's en prolifereren, zoals blijkt uit fosfo-histon 3-kernkleuring (pijlen in figuur 3A). Na nog eens 4 dagen kweek in differentiatiemedium differentiëren C2C12-cellen en fuseren ze tot meerkernige (blauwe pijlen in figuur 3B) myotubes die een myosine-zware keten tot expressie brengen (stippellijn in figuur 3B). Interessant is dat intracellulaire en / of pericellulaire kleuring voor de laminine α2-keten (gele pijlen in figuur 3C, D), totale lamininen (magentapijl in figuur 3C) en fibronectine (magentapijl in figuur 3D) kunnen worden gedetecteerd in C2C12-cellen gekweekt in volledig kweekmedium, wat suggereert dat deze cellen in staat zijn om deze ECM-eiwitten de novo te synthetiseren , dus bijdragend aan de vorming van hun niche. Deze resultaten tonen aan dat het decellularisatieprotocol een dECM-micro-omgeving genereert waar C2C12-myoblasten zich kunnen vermenigvuldigen, differentiëren en multinucleaire myotubes kunnen vormen.
Figuur 2: Beoordeling van vijf ECM-eiwitten in inheems versus gedecellulariseerd E18.5 foetaal spierweefsel. Immunohistochemie op secties van inheems weefsel (A,C,E,G,I) en kleuring van dECM's (B,D,F,H,J) met DAPI, een DNA-marker, falloïdine die F-actine detecteert, en voor ECM-eiwitten. Schaalbalk = 15 μm. In het inheemse weefsel is immunokleuring voor lamininen en collageen IV aanwezig rond de myofiberen (A, C, I; gele pijlen) en kleuring voor fibronectine en collageen I wordt gedetecteerd in de interstitiële ruimte tussen myofiberen (E, G; gele pijlen). In de dECM's vertonen kleuringen voor lamininen en collageen IV (B,D,J; gele pijlen) een buisvormig patroon, rondom de ruimtes die de myofiberen na decellularisatie achterlaten. Fibronectine en collageen I immunostaining van dECM's is consistent met hun aanwezigheid in de interstitiële ruimte (F,H; gele pijlen). (A'-J') Western blot-analyse voor vijf ECM-eiwitten in inheems weefsel (A',C',E',G',I') en in dECM-monsters (B',D',F',H',J'). Beide benaderingen tonen eiwitbehoud na decellularisatie. De gebruikte antilichamen en de respectieve verdunningen zijn vermeld in tabel 1. Afkortingen: LNα2 = laminine α2 keten; LNp = pan-spier laminines; FN = fibronectine; Col I = collageen I; Col IV = collageen IV; MHC = myosine zware keten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: dECM-recellularisatie met een myoblastcellijn (C2C12-myoblasten). (A) Maximale intensiteitsprojectie van een confocale afbeelding van een stapel van 100 μm gerecellulariseerde matrix, gekoloniseerd met C2C12-cellen gelabeld met methylgroen kleurend DNA, falloïdine dat F-actine detecteert en anti-pH3-antilichaam, een proliferatiemarker (magentapijlen). Schaalbalk = 35 μm. (B) Maximale intensiteitsprojectie van een confocaal beeld van een stapel van 100 μm met een meerkernige (blauwe pijlen geven de kernen aan) myosine zware ketenpositieve myobuis (stippellijn) gevormd tijdens de kweek. Schaalbalk = 35 μm. (C,D) Immunohistochemie confocaal beeld met intra- of pericellulaire kleuring voor laminine α2-keten (gele pijlen), totale lamininen (magentapijlen in C) en fibronectine (magentapijlen in D) in myoblasten, wat de novo eiwitsynthese suggereert. Schaalbalk = 10 μm. De gebruikte antilichamen en de respectieve verdunningen zijn vermeld in tabel 1. Afkortingen: pH3 = fosfo-histon 3; LNα2 = laminine α2-keten; LNp = pan-spier laminines; FN = fibronectine; MHC = myosine zware keten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ECM is een complex netwerk van macromoleculen dat in alle weefsels aanwezig is en een cruciale rol speelt bij het reguleren van celgedrag en -functie2. De ECU fungeert als een fysieke steiger voor cellen om zich aan te hechten en biedt signalen die actief cellulaire processen moduleren, zoals proliferatie, motiliteit, differentiatie en apoptose. Een goede vorming en onderhoud van de ECM is dus essentieel voor zowel de ontwikkeling als de homeostase1.
Hoewel 2D-celkweekmodellen op grote schaal worden gebruikt, worden ze steeds vaker vervangen door geavanceerdere 3D-platforms. Dit komt omdat 2D-culturen de chemische en fysieke signalen missen die het celgedrag beïnvloeden, terwijl 3D-culturen worden beschouwd als een realistischer alternatief voor het bestuderen van moleculaire en cellulaire dynamica in inheemse weefsels11. Decellularisatie van weefsels resulteert in de productie van steigers die de micro-omgevingen van biologische weefsels beter nabootsen, zoals aangetoond in een aantal studies over verschillende weefsel- of orgaansystemen 14,15,23,24,25. Het vermogen van dECM's om inheemse weefselmicro-omgevingen te repliceren, biedt een groot potentieel voor onderzoek naar normale ontwikkeling, verschillende ziektetoestanden en het effect van geneesmiddelen of toxines op weefsels11.
Het protocol dat in deze studie wordt gebruikt, bouwt voort op het protocol dat Silva et al. hebben ontwikkeld voor het decellulariseren van foetaal hartweefsel14 als uitgangspunt. Het gaat om een combinatie van een hypotone buffer, behandeling met een anionisch wasmiddel (SDS) en een DNasebehandeling. Een van de belangrijkste uitdagingen in decellularisatieprotocollen is het vinden van een balans tussen het verwijderen van cellen en het behoud van de ECM-eiwitsamenstelling. Gezien onze focus op het gebruik van dit 3D-celkweeksysteem om de vroege stadia van LAMA2-CMD te bestuderen, werd speciale aandacht besteed aan het behoud van laminine 211 tijdens decellularisatie. Het protocol van Silva et al.14 leidde tot het verlies van laminine α2 keten immunoreactiviteit in de gedecellulariseerde foetale spieren; dit kan te wijten zijn aan de gebruikte SDS-concentratie. Daarom werden alternatieven voor de 0,2% SDS-wasmiddeloplossingsstap getest, zoals lagere concentraties SDS (0,1%, 0,05% en 0,02%) en de vervanging van SDS door verschillende concentraties Triton X-100 (0,5% en 0,2%). De beste resultaten werden bereikt door gedurende 24 uur 0,05% SDS-wasmiddelbehandeling te gebruiken. Deze concentratie verwijderde effectief de celinhoud met behoud van laminine α2-keten immunoreactiviteit na decellularisatie. Dit protocol produceert reproduceerbaar acellulaire dECM's die vrij zijn van cellulaire residuen, waaronder DNA.
Het protocol dat in deze studie wordt gebruikt, behoudt zowel de interstitiële matrixeiwitten (fibronectine en collageen I) als keldermembraaneiwitten (lamininen en collageen IV). Toekomstige studies moeten beoordelen of collageen VI ook behouden blijft, omdat het ook een speler is in spierdystrofieën26. Het is bekend dat SDS de ultrastructuur van eiwitten kan verstoren en collageen kan beschadigen12; voor foetale skeletspieren was het belangrijk om een lage concentratie SDS (0,05%) te gebruiken om laminine α2 immunoreactiviteit te behouden. De western blot-resultaten tonen echter aan dat de gedecellulariseerde monsters meer banden vertonen na immunodetectie van lamininen en collageen in vergelijking met het inheemse weefsel, wat aangeeft dat er enige eiwitafbraak optrad als gevolg van het decellularisatieproces27.
Belangrijk is dat de recellularisatie-experimenten aantonen dat deze matrices betrouwbare steigers zijn die consequent celadhesie, proliferatie en differentiatie ondersteunen. Van SDS is gemeld dat het cytotoxisch28 is en daarom zijn de wasstappen in het protocol cruciaal als de matrices moeten worden gebruikt voor recellularisatie. Deze steigers werden effectief gekoloniseerd door C2C12-cellen, wat hun geschiktheid aangeeft als een modelsysteem voor 3D-kweek van cellen. De observatie van intracellulaire en pericellulaire kleuring voor ECM-eiwitten rond de C2C12-cellen suggereert verder dat de cellen actief bijdragen aan hun micro-omgeving binnen de dECM's. Bovendien, wanneer geplaatst in differentiatiemedium, de C2C12-cellen gedifferentieerd, gefuseerd en gevormd myotubes binnen de dECM's.
Een belangrijke uitdaging in deze procedure is de manipulatie van de monsters in het hele protocol. De monsters zijn zeer klein en zacht en vereisen zorg en vaardigheid bij het hanteren om beknelling in de pipet met fijne punt en verlies van de monsters te voorkomen. De beste resultaten worden verkregen bij het starten van het protocol met vers weefsel. Het gebruik van bevroren, opgeslagen monsters kan de verwijdering van de cellulaire inhoud belemmeren en leiden tot verhoogde eiwitafbraak, waardoor eiwitdetectie wordt belemmerd en de decellularisatie-efficiëntie wordt verminderd.
Slechts een paar studies hebben de decellularisatie van foetale weefselsgemeld 15,29,30,31. Specifiek, met betrekking tot de decellularisatie van foetale skeletspieren, heeft slechts één eerdere studie gerapporteerd over de decellularisatie van samengestelde monsters van dermis, onderhuids weefsel en panniculus carnosus31. Voor zover de auteurs weten, is dit de eerste keer dat een decellularisatieprotocol voor geïsoleerde foetale skeletspieren van muizen is vastgesteld. Dit protocol kan dienen als basis voor het creëren van soortgelijke protocollen voor foetale spierweefsels van andere soorten, zoals varkens en mensen13.
Het huidige protocol voor het decellulariseren van E18.5 muizenskeletspieren lijkt sterk op de procedure van Silva et al.14, die het toepasten op een E18-muizenhart. Het enige verschil is de gebruikte SDS-concentratie, die aanzienlijk lager is dan die voor het foetale hart (0,05% versus 0,2%), mogelijk als gevolg van verschillende fysieke eigenschappen van deze twee foetale weefsels.
De ontwikkeling van dit in vitro model maakt het niet alleen mogelijk om de processen die betrokken zijn bij de normale foetale spierontwikkeling te bestuderen, maar maakt ook het parallelle onderzoek mogelijk van spierdystrofieën en myopathieën met vroege aanvang, zoals LAMA2-CMD, die zich manifesteert als een myogenesedefect bij E18.5 in het dy W-muismodel 10. Er moet echter worden opgemerkt dat dit systeem beperkt is omdat het alleen de ECM en spiercellen omvat en geen andere celtypen bevat, zoals neuronen, endotheelcellen en fibroblasten. De relevantie van deze extra celtypen kan variëren afhankelijk van de ziekte, en aanpassingen aan het kweeksysteem kunnen nodig zijn om ze op te nemen. Over het algemeen kan het gebruik van dECM's zoals beschreven in deze studie worden toegepast in de studie van verschillende vroeg beginnende spierdystrofieën en myopathieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contract nr. 23049), het MATRIHEALTH-project en cE3c-eenheidsfinanciering UIDB/00329/2020. We willen graag onze donateur Henrique Meirelles bedanken die ervoor heeft gekozen om het MATRIHEALTH-project te ondersteunen. Dit werk profiteerde van de infrastructuren van de Faculteit Wetenschappen Microscopie Faciliteit, een knooppunt van het Portugese Platform van BioImaging (referentie PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), en we danken Luís Marques voor zijn hulp bij beeldacquisitie en -verwerking. Tot slot bedanken we Marta Palma voor de technische ondersteuning en ons onderzoeksteam voor hun genereuze bijdragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
