Summary
В данной работе был оптимизирован протокол децеллюляризации для получения децеллюляризированных матриц скелетных мышц плода мыши. Миобласты C2C12 могут колонизировать эти матрицы, размножаться и дифференцироваться. Эта модель in vitro может быть использована для изучения поведения клеток в контексте заболеваний скелетных мышц, таких как мышечные дистрофии.
Abstract
Внеклеточный матрикс (ECM) играет решающую роль в обеспечении структурной поддержки клеток и передаче сигналов, которые важны для различных клеточных процессов. Двумерные (2D) модели клеточных культур чрезмерно упрощают сложные взаимодействия между клетками и ECM, поскольку отсутствие полной трехмерной (3D) поддержки может изменить поведение клеток, делая их неадекватными для понимания процессов in vivo . Недостатки в составе ECM и взаимодействиях между клетками и ECM являются важными факторами, способствующими множеству различных заболеваний.
Одним из примеров является врожденная мышечная дистрофия LAMA2 (LAMA2-CMD), при которой отсутствие или снижение функционального ламинина 211 и 221 может привести к тяжелой гипотонии, обнаруживаемой при рождении или вскоре после него. Предыдущая работа с использованием мышиной модели заболевания предполагает, что его начало происходит во время миогенеза плода. Настоящее исследование было направлено на разработку 3D-модели in vitro , позволяющей изучать взаимодействия между мышечными клетками и ECM мышц плода, имитируя нативное микроокружение. В этом протоколе используются глубокие мышцы спины, рассеченные из плодов мыши E18.5, обработанные гипотоническим буфером, анионным моющим средством и ДНКазой. Полученные децеллюляризованные матрицы (dECM) сохранили все протестированные белки ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV) по сравнению с нативной тканью.
Когда миобласты C2C12 были посеяны поверх этих dECM, они проникли и колонизировали dECM, что поддерживало их пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, клетки C2C12 продуцируют белки ECM, способствуя ремоделированию их ниши в dECM. Создание этой платформы in vitro обеспечивает новый многообещающий подход к разгадке процессов, связанных с возникновением LAMA2-CMD, и может быть адаптировано к другим заболеваниям скелетных мышц, где недостатки в коммуникации между ECM и клетками скелетных мышц способствуют прогрессированию заболевания.
Introduction
Внеклеточный матрикс (ECM) является основным компонентом тканей, представляя их неклеточный компонент. Эта трехмерная (3D) структура не только обеспечивает физическую поддержку клеток, но и играет решающую роль в биохимических процессах, участвующих в развитии организмов1. Формирование тканеспецифической ЭКМ происходит в процессе развития, в результате сложных взаимодействий между клетками и их нишами, на которые влияют различные внутри- и внеклеточные раздражители. ECM представляет собой высокодинамичную структуру, которая претерпевает химические и механические перестройки временно-пространственным образом и напрямую влияет на судьбу клетки2. Одной из наиболее примечательных характеристик ECM является его функциональное разнообразие, поскольку каждая тканевая ECM отображает уникальную комбинацию молекул, которые обеспечивают различные топологии и свойства, адаптированные к содержащимся в ней клеткам1.
Передача сигналов и поддержка ECM имеют решающее значение для развития и гомеостаза, и при нарушении могут привести к множественным патологическим состояниям 3,4. Одним из примеров является врожденная дистрофия с дефицитом LAMA2 (LAMA2-CMD), которая является наиболее распространенной формой врожденной мышечной дистрофии. Ген LAMA2 кодирует цепь ламинина α2, которая присутствует в ламинине 211 и ламинине 221, и при мутации может привести к LAMA2-CMD 5. Ламинин 211 является основной изоформой, обнаруженной в базальной мембране, окружающей волокна скелетных мышц. Когда ламинин 211 является аномальным или отсутствует, связь между базальной мембраной и мышечными клетками нарушается, что приводит к возникновению заболевания6. Пациенты с LAMA2-CMD демонстрируют фенотип от легкой до тяжелой степени в зависимости от типа мутации в гене LAMA2.
Когда нарушается функция белка ламинина α2, пациенты могут испытывать тяжелую мышечную гипотонию при рождении и развивать хроническое воспаление, фиброз и мышечную атрофию, что приводит к сокращению продолжительности жизни. На сегодняшний день не разработано таргетных методов лечения, а терапевтические подходы ограничиваются облегчением симптомов заболевания7. Таким образом, понимание основных молекулярных механизмов, участвующих в возникновении этого заболевания, имеет решающее значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий 6,8. Предыдущая работа с использованием мыши dyW 9, модели для LAMA2-CMD, предполагает, что начало заболевания начинается в утробе матери, особенно во время миогенезаплода 10. Лучшее понимание того, как возникает дефект миогенеза плода, изменит правила игры в создании новых терапевтических подходов для LAMA2-CMD.
Системы in vitro обеспечивают контролируемую среду для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий, но 2D-моделям культур не хватает сложности нативных тканей. Децеллюляризация тканей производит тканеспецифические и стадия развития бесклеточные каркасы ECM, которые более точно имитируют естественное микроокружение клеток по сравнению с 2D-моделями и инженерными/синтетическими каркасами. Децеллюлярные матрицы (dECM) обладают потенциалом для сохранения молекулярных и механических сигналов ткани хозяина, что делает их лучшими альтернативными моделями для понимания процессов in vivo 11.
Существуют различные методы, реагенты и условия, которые могут быть использованы для децеллюляризации12,13. В этом исследовании протокол децеллюляризации сердца плода мыши, описанный Silva et al.14,15, адаптирован к скелетным мышцам плода мыши и, как было обнаружено, сохраняет все протестированные компоненты ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV). Протокол включает три этапа: лизис клеток осмотическим шоком (гипотонический буфер), растворение плазматической мембраны и диссоциацию белка (0,05% додецилсульфата натрия [SDS]) и ферментативное разрушение ДНК (обработка ДНКазой). Насколько нам известно, это первый установленный протокол децеллюляризации скелетных мышц плода мыши.
Чтобы использовать эту 3D-систему in vitro для изучения LAMA2-CMD, крайне важно поддерживать цепь ламинина α2 после децеллюляризации. Поэтому был реализован протокол оптимизации, в котором тестировались различные моющие средства (SDS и Triton X-100) и концентрации (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,5%) (данные не показаны). Было обнаружено, что оптимальным выбором для удаления клеток и сохранения белка ламинина α2 является 0,05% SDS. Клетки C2C12, хорошо зарекомендовавшая себя линияклеток миобластов 16,17, были использованы для посева dECM. Эти клетки вторгаются в dECM, размножаются и дифференцируются внутри этих каркасов, синтезируя новые белки ECM. Успешное создание этой 3D-модели in vitro предлагает новый подход к пониманию молекулярных и клеточных процессов, участвующих в миогенезе плода, начале LAMA2-CMD, и может быть распространено на другие мышечные заболевания, при которых нарушается связь между ECM и клетками скелетных мышц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные методологии были одобрены Комитетом по благополучию животных (ORBEA) факультета естественных наук Лиссабонского университета и Direção Geral de Veterinária (DGAV; арт. 0421/000/000/2022) и соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС.
1. Приготовление децеллюляризационных буферов и реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые во время протокола децеллюляризации, должны быть стерилизованы автоклавированием и храниться до 3 месяцев, если не указано иное.
- Приготовьте 10-кратный фосфатно-буферный физиологический раствор (10x PBS), добавив хлорид натрия (NaCl) при 137 мМ, хлорид калия (KCl) при 2,68 мМ, дигидрофосфат калия (KH 2 PO 4) при 8,1 мМ и дигидрат натрий-водород-фосфата (Na 2 HPO4) при 1,47 мМ в деминерализованной воде (dH2O) и отрегулируйте рН до 6,8. Добавьте 100 мл 10x PBS к 900 мл деминерализованного H2O для получения 1x PBS. Автоклав и хранить при комнатной температуре (RT). Перед использованием добавьте стерильный исходный раствор пенициллина/стрептомицина (10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина [ручка/стрептококк]) до конечной концентрации 1%.
- Приготовьте гипотонический буфер, растворив 1,21 г трис(гидроксиметил)аминометана (трис-основания) и 1 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 1 лdH2O (10 мМ трис-основания 0,1% ЭДТА). Используйте магнитную мешалку до полного растворения и отрегулируйте pH до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Стерилизовать автоклавированием и хранить при RT. Перед использованием добавьте ручку/стрептококк до конечной концентрации 1%.
- Приготовьте гипотонический буфер для промывки, растворив 1,21 г основания Tris в 1 л dH2O (10 мМ основания Tris). Используйте магнитную мешалку до растворения и отрегулируйте pH до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Автоклав и хранить при RT. Добавьте ручку / стрептококк до 1% перед использованием.
- Приготовьте анионное моющее средство, добавив 0,05 г додецилсульфата натрия (SDS) к 100 мл гипотонического буфера для промывки для получения 0,05% раствора для обработки SDS. Фильтруйте через мембранный фильтр 0,22 мкм. Хранить при RT до 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор SDS не следует автоклавировать, так как SDS выпадает в осадок и разлагается при автоклавировании. - Приготовьте раствор для обработки ДНКазой, растворив 1,21 г основания Tris в 0,5 мл dH 2 O и добавив1 мл 1 М хлорида магния (MgCl2). Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Автоклав и храните при RT. Добавьте ДНКазу I перед использованием (50 ЕД / мл).
2. Сбор образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании использовались мыши дикого типа C57 / BL6. Все методики проводились в ламинарном колпаке в стерильных условиях.
- Усыпляют взрослых беременных самок мышей на эмбриональный день (E) 18,5 беременности с помощью ингаляции изофлурана с последующим вывихом шейки матки. Подвергните мышей терминальному вскрытию, чтобы извлечь плоды.
- Опрыскайте живот мыши 70% этанолом.
- С помощью хирургических щипцов и ножниц приподнимите складку кожи внизу живота и сделайте U-образный разрез, чтобы обнажить брюшную полость18.
- Соберите рога матки, содержащие плоды E18.5, разрезав яйцеводы и шейку матки, и немедленно перенесите их в чашку Петри с ледяным 1x PBS с 1% пером / стрептококком18.
- Быстро извлекают плоды из матки и внезародышевых тканей и усыпляют их путем обезглавливания с помощью ножниц18.
- Перекладывайте по одному плоду в чашку Петри с ледяным 1x PBS. С помощью стереомикроскопа снимают кожу и отрезают конечности. С брюшной стороны прорежьте грудную клетку и удалите грудину и нижележащие органы.
- Переверните туловище плода тыльной стороной вверх. Удалите шейную часть позвоночника, дорсальные жировые отложения и соединительную ткань поверх глубоких мышц спины.
- Используйте хирургические щипцы, чтобы закрепить грудную клетку и осторожно соскоблить и отделить глубокие мышцы спины от окружающих тканей с помощью микроскальпеля10. Эта процедура приводит к выделению двух мышечных частей на плод (левой и правой), которые в основном состоят из длинной и подвздошно-реберной мышц, включая некоторые трансверсоспинальные мышцы и мышцы, поднимающие костарную мышцу .
- Храните образцы мышц в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком при 4 ° C для краткосрочного хранения (<1 неделя) или при -80 ° C в течение более длительных периодов времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте свежесобранные образцы. Образцы, замороженные в течение длительных периодов времени (>3 месяца), демонстрируют более низкую эффективность децеллюляризации и большую деградацию белка. Для экспериментов по децеллюляризации использовались эпаксиальные мышечные массы, но другие мышцы (например, мышцы конечностей) могут быть обработаны для децеллюляризации с использованием того же протокола.
3. Децеллюляризация скелетных мышц плода
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методики проводились в ламинарном колпаке в стерильных условиях. Подробное схематическое изображение см. на рисунке 1A. Все шаги выполнялись с перемешиванием в орбитальном шейкере диаметром 120 мм (165 об/мин) при 25 °C, если не указано иное. Перед употреблением добавляйте в растворы 1% шприц-ручки/стрептококка. При удалении растворов тщательно аспирируйте, чтобы избежать попадания образца в пипетку.
- День 1 - Подготовьте примерно 2 мм x 1 мм x 1 мм (~ 3,5 мг) фрагменты ткани из эпаксиальных мышечных масс. Добавьте 3 мл гипотонического буфера с 1% ручкой/стрептококком в каждую лунку 12-луночной пластины и добавьте по одному цельному фрагменту мышечной ткани в каждую лунку.
- Инкубируют фрагменты тканей в гипотоническом буфере с перемешиванием в течение 18 ч (на ночь) (О/Н).
- День 2 - Аспирируйте гипотонический буфер с помощью пипетки с тонким наконечником и промывайте образцы 3 x 1 ч 3 мл 1x PBS каждый раз с перемешиванием.
- Инкубируют образцы в течение 24 ч с 3 мл 0,05% раствора моющего средства SDS при перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: (КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА) После инкубации SDS образцы должны быть прозрачными на вид. Образцы имеют желатиноподобную консистенцию и, следовательно, более склонны прилипать к пипетке при удалении жидкостей.
- Инкубируют образцы в течение 24 ч с 3 мл 0,05% раствора моющего средства SDS при перемешивании.
- День 3 - Удалите раствор моющего средства SDS с помощью пипетки с тонким наконечником и промойте фрагменты ткани 3 x 20 мин 3 мл гипотонического буфера для промывания каждый раз при перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Образцы можно выдерживать в гипотоническом буфере для промывки при 4 °C в течение 18 ч (М/Н). Убедитесь, что SDS хорошо удален на этапах стирки, так как остаточные SDS могут быть цитотоксичными.- Инкубируют фрагменты ткани в течение 3 ч с 2 мл раствора ДНКазы при перемешивании при 37 °C.
- Удалите раствор ДНКазы с помощью пипетки с тонким наконечником и промойте фрагменты ткани 3 x 20 мин 3 мл 1x PBS каждый раз с перемешиванием. Наконец, промойте O/N с перемешиванием (60 об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: После обработки ДНКазой dECM становятся липкими из-за присутствия остатков ДНК. Поэтому необходима тщательная стирка. - Храните dECM в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком при 4 °C до рецеллюляризации (<1 неделя). Для других целей хранить при температуре -80 °C.
4. Оценка качества децеллюляризации
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение ДНК, окрашивание DAPI / метиловым зеленым и окрашивание фаллоидином были выполнены для оценки наличия остаточного содержимого клеток после децеллюляризации. Иммуногистохимия и вестерн-блоттинг были проведены для оценки сохранения ключевых белков ECM после децеллюляризации.
- Количественная оценка ДНК, присутствующей в dECM
ПРИМЕЧАНИЕ: dECM следует сравнивать с нативной тканью, чтобы обнаружить присутствие ДНК.- Перед децеллюляризацией взвесьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на высокоточных цифровых весах. Перед переносом мышечного образца в пробирку удалите все оставшиеся 1x PBS с помощью бумажного полотенца. Взвесьте пробирку с образцом. Рассчитайте сырой вес образцов, используя уравнение (1):
Сырой вес образца = весоваяпробирка с образцами -вес пустой пробирки (1) - Децеллюляризируйте образцы в соответствии с протоколом, описанным в разделе 3.
- Поместите образцы в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при -20 ° C до экстракции и количественного определения ДНК. - Выполните экстракцию ДНК dECM и образцов нативных тканей с помощью набора на основе спиновой колонки. Добавьте буфер для разложения в соответствии с инструкциями производителя.
- Гомогенизируйте образцы в бисерной мельнице два раза в течение 2,5 минут каждый раз (переворачивая крепления), используя один шарик карбида вольфрама на трубку (используйте крепления для охлажденных труб).
- Добавьте протеиназу К и инкубируйте O/N при медленном перемешивании при 56 °C.
- Следуйте протоколу, как описано в инструкциях производителя.
- Разбавляют буфером, предоставленным производителем, и центрифугой 2 x 1 мин при ≥6000 x g, каждый раз при 4 °C для увеличения выхода ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно хранить при -20 ° C до количественного определения. - Количественно определите ДНК, присутствующую в образцах, с помощью флуоресцентного набора для обнаружения дцДНК, следуя инструкциям производителя.
- Нормализуйте содержание ДНК в нанограммах ДНК на миллиграмм исходного сырого веса образца.
- Проанализируйте данные с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента и выразите как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM).
- Перед децеллюляризацией взвесьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на высокоточных цифровых весах. Перед переносом мышечного образца в пробирку удалите все оставшиеся 1x PBS с помощью бумажного полотенца. Взвесьте пробирку с образцом. Рассчитайте сырой вес образцов, используя уравнение (1):
- Иммуногистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы 1, 2 и 3 и фиксирующий раствор должны быть приготовлены перед использованием и могут храниться в замороженном виде до 6 месяцев. Все используемые антитела и красители, а также соответствующие разведения перечислены в Таблица 1.- Приготовление растворов
- Приготовьте фиксирующий раствор, добавив 2 г параформальдегида (ПФА), 8 г сахарозы и 24 мкл 1 МCaCl2 до 77 мл 0,2 М Na 2 HPO 4 и 23 мл 0,2 М 2 PO 4 доконечного объема 200 мл, добавив dH2O. Отрегулируйте рН до7,4.
- Приготовьте 0,12 М фосфатного буфера, добавив 13,5 г Na 2 HPO 4и 3,2 г 2 PO 4 к 1 л dH2O. Отрегулируйте pH до7,4.
- Готовят раствор 1, добавляя 4 г сахарозы к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера.
- Готовят раствор 2, добавляя 15 г сахарозы к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера.
- Готовят раствор 3, добавляя 15 г сахарозы и 7,5 г желатина к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера. Нагрейте при 37 ° C, пока желатин не растворится.
- Приготовьте исходный раствор метилового зеленого (2% порошка метилового зеленого, растворенного в dH2O)19.
- Иммунодетекция
- Фиксируют образцы с помощью фиксирующего раствора в течение не менее 4 ч при 4 °C.
- Промойте образцы 2 раза в течение 10 минут с помощью 1x PBS.
- Хранить О / N или более 1 дня в растворе 1 при 4 ° C.
- Промыть и хранить М/Н или более 1 дня в растворе 2 при 4 °C. Дайте образцам нагреться до RT.
- Инкубировать в течение 3 ч в растворе 3 при 37 °C. Храните дополнительный раствор 3 при температуре 37 °C, чтобы использовать его позже.
- Формовка небольших (2 см х 1 см х 1 см) контейнеров в алюминиевой фольге. Поместите тонкий слой раствора 3 в формованную емкость и дайте ему застыть. Поместите образцы на застывший раствор 3 и залейте теплым раствором 3. Сориентируйте образцы и дайте им застыть. Отметьте место на застывшем растворе 3 цветной ручкой.
- Заморозьте, поместив контейнеры на поверхность сухого изопентана, охлажденного льдом или жидким азотом.
- Используя компаунд с оптимальной температурой резки (O.C.T.), прикрепите замороженные желатиновые кубики, содержащие образцы, к криостатному креплению.
- Нарежьте замороженные желатиновые кубики и перенесите срезы ткани на предметные стекла. Дайте им высохнуть в течение 60 минут.
- Используйте гидрофобный маркер, чтобы обвести линию вокруг участков.
- Промыть предметные стекла 3 x 10 мин в 1x PBS.
- Покройте срезы 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA), 1% козьей сывороткой и 0,05% Triton X-100, разведенными в 1x PBS (блокирующий раствор) в течение 30 мин (этап блокировки).
- Развести первичные антитела в блокирующем растворе и накрыть срезы. Инкубировать O/N при 4 °C в закрытой коробке с влажной бумагой, чтобы предотвратить высыхание срезов.
- Промойте предметные стекла 3 раза по 10 минут с помощью 1x PBS.
- Разбавьте вторичные антитела в блокирующем растворе и накройте срезы. Инкубировать в течение 1,5 ч при РТ в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия света, чтобы предотвратить деградацию флуорофора. - Промойте предметные стекла 3 раза по 10 минут с помощью 4x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокую концентрацию PBS можно использовать при наличии сильного фона. - Погрузите предметные стекла в раствор DAPI (5 мкг/мл 1,4-диазабицикло-2,2,2--октана в 0,1% Triton X-100/1x PBS) на 30 с каждый.
- Смойте в 1x PBS.
- Установите срезы в антивыцветающей среде (50 мг/мл н-пропилгаллата в 1x PBS:глицерин [1:9]) и запечатайте покровным стеклом. Хранить при температуре 4 °C до наблюдения и получения изображения во флуоресцентном микроскопе20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуногистохимических экспериментов in toto использовался тот же протокол (см. этапы 4.2.2.12-4.2.2.18), за исключением того, что образцы были предварительно зафиксированы в 4% PFA, разбавленном в 1x PBS в течение 3 ч при RT. Окрашивание ДНК проводили путем добавления метилового зеленого к раствору вторичного антитела. Все используемые антитела и красители, а также их соответствующие разведения перечислены в таблице 1. Затем образцы устанавливали в среде, препятствующей выцветанию, между двумя покровными стеклами, разделенными стальными кольцами, склеенными пчелиным воском, и с помощью конфокального микроскопа21 получали стеки изображений размером 100 мкм.
- Приготовление растворов
- Вестерн-блоттинг-анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые антитела и соответствующие разведения перечислены в Таблица 1.- Приготовление растворов
- Приготовьте 2-кратный загрузочный буфер SDS-PAGE, добавив 20 мл глицерина, 4 г SDS и 0,2 мл бромфенольного синего к 80 мл 100 мМ основного раствора Tris. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавьте свежий дитиотрейтол (DTT) перед использованием.
- Приготовьте буферный солевой буфер для промывки Tris раствором Tween 20 (TBST), добавив 2,4 г основания Tris, 8,8 г NaCl и 1 мл Tween-20 до dH2O до конечного объема 1 л. Отрегулируйте pH до 7,4-7,6 с помощью HCl.
- Приготовьте 10-кратный проточный буфер (RB), добавив 30,2 г основания Tris, 144,2 г глицина и 10 г SDS к 1 л dH2O. Перед использованием добавьте 100 мл 10x RB к 900 мл dH2O для приготовления 1x RB (рабочего раствора).
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 10x RB можно хранить в RT в течение нескольких месяцев, 1x RB можно повторно использовать в разных прогонах. - Приготовьте буфер переноса (TB), добавив 5,82 г основания Tris, 2,93 г глицина и 0,5 г SDS к 800 мл dH2O. После того, как компоненты растворятся, добавьте 200 мл метанола. Охладить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: TB следует готовить свежим перед каждым использованием.
- Экстракция белка
- Соберите эпаксиальные мышцы у мышей E18.5 и немедленно поместите их в микроцентрифужную пробирку (2 мл), содержащую 2x загрузочный буфер SDS-PAGE со свежедобавленным DTT (100 мМ DTT). Обработайте E18.5 dECM таким же образом.
- Добавьте один шарик карбида вольфрама на трубку. Гомогенизируйте 2 раза в бисерной мельнице в течение 2,5 минут каждый раз (переворачивайте крепления).
- Обработайте образцы ультразвуком в течение 5 минут в ультразвуковой ванне.
- Нагрейте образцы в течение 10 мин при 50 °C.
- Центрифугируют образцы при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C.
- Переведите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Количественное определение белка с помощью микрообъемного спектрофотометра.
- Хранить при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
- Электрофорез в полиакриламидном геле
- Используйте сборный акриламидный градиентный гель (4% -20%)
- Установите гель в резервуар для электрофореза. Аккуратно снимите расческу. Добавьте 1x RB до линии, отображаемой в резервуаре для электрофореза. Убедитесь, что скважины заполнены RB.
- Загрузите в лунки 100 мкг белка на образец. Загрузите 12 мкл стандарта высокомолекулярного белка.
- Работает в общей сложности 100 минут при постоянном напряжении (10 минут при 150 В и 90 минут при 185 В).
- Перенос
- Смочите фильтрующие прокладки и губки охлажденным TB (4 °C) во время работы геля.
- Разрежьте мембраны из поливинилидендифторида по размеру геля. Активируйте их метанолом и промойте dH2O. Замочите в ТБ.
- Установите передаточную кассету с губками, фильтрующими прокладками, гелями и активированными мембранами в соответствии с инструкциями производителя.
- Поместите кассету в резервуар для электрофореза, содержащий охлажденный ТБ (на ложе со льдом). Добавьте блок охлаждения. Работать в течение 90 минут при 100 В.
- После переноса окрашивайте синим заменителем Coomassie, чтобы оценить качество передачи.
- Иммунодетекция
- Приготовьте блокирующий раствор (ТБСТ с 5% нежирным молоком). Инкубируют мембраны при перемешивании в течение 1 ч при РТ.
- Смойте 3 x 5 с TBST.
- Инкубируют мембраны O/N с первичными антителами, разбавленными в TBST с 2% BSA и 0,02% азида натрия (3 мл на мембрану) в холодильной камере (4 °C) с перемешиванием.
- На следующий день умывайтесь 3 х 5 мин с TBST.
- Инкубируйте мембраны с конъюгированными вторичными антителами пероксидазы хрена (HRP), разведенными в TBST с 5% обезжиренным молоком (5 мл на каждую мембрану) в течение 1 ч при RT.
- Промойте мембраны с помощью TBST 3 x 5 мин. Хранить в TBST до момента обнаружения.
- Визуализируйте белок с помощью коммерчески доступного набора для проявки. Добавьте реагенты для обнаружения в соответствии с инструкциями производителя. Приобретите изображения групп.
- Чтобы протестировать более одного антитела на мембрану, после этапа обнаружения удалите прежние антитела тремя промывками (по 5 минут каждая) с использованием TBST и повторите шаги 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Приготовление растворов
Таблица 1: Антитела и красители, используемые в иммуногистохимии и вестерн-блоттинге, и соответствующие разведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.10,22
5. Культура клеток в децеллюлярных матрицах
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методики выполнялись в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу. Все инкубации проводили при 37 °C и с содержаниемСО2 5%.
- Приготовьте среду для культивирования клеток, модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium с высоким содержанием глюкозы со стабильным глютамином и пируватом натрия (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% ручкой / стрептококком (полная питательная среда).
- Поместите dECM в чашку Петри в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком в вытяжном шкафу с ламинарным потоком и разделите их на кусочки размером примерно 500 мкм x 500 мкм x 250 мкм с помощью микроскальпеля и пинцета.
ПРИМЕЧАНИЕ: dECM имеют мягкую текстуру, и поэтому часто проще использовать пинцет, чтобы разделить их на кусочки примерно одинакового размера, чем резать их микроскальпелем. - Перенесите фрагменты в 96-луночную тарелку (по три-четыре штуки на лунку) с 200 мкл полной питательной среды, предварительно нагретой до 37 °C. Инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе.
- Добавьте 500 мкл трипсина в колбу T25, засеянную субсливающимися (~ 70%) клетками C2C12. Ресуспендировать в 1 мл полной среды.
- Добавьте 10 мкл ресуспензии к 10 мкл красителя трипанового синего и загрузите в гемоцитометр. Подсчитайте и рассчитайте количество клеток и подтвердите жизнеспособность клеток.
- Аспирируют среду из 96-луночного планшета, содержащего dECM, и добавляют 200 мкл полной питательной среды, содержащей 50 000 жизнеспособных клеток C2C12.
- Инкубируют в течение 2 дней, а затем с помощью пинцета переносят dECM (с клетками) в 48-луночную пластину с 400 мкл полной питательной среды. Каждые 2 дня тщательно аспирируйте среду микропипеткой, чтобы предотвратить отрыв dECM от дна лунки, и добавляйте свежую среду до 8-го дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрицы выдерживают в течение 2 дней в 96-луночных планшетах, чтобы способствовать адгезии клеток C2C12 к dECM, а затем переносят на 48-луночную пластину, чтобы обеспечить доступ к большему объему среды с питательными веществами. dECM должны прилипать к дну скважин. - Для эксперимента по дифференцировке замените полную питательную среду дифференцирующей средой (DMEM с добавлением 2% лошадиной сыворотки и 1% пера/стрептококка) на 8-й день с последующей инкубацией в дифференцировочной среде в течение 4 дней до 12-го дня.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью протокола децеллюляризации является получение dECM, которые очень похожи на состав нативной ткани. Для определения эффективности процесса децеллюляризации использовались различные методы, включая изучение морфологии тканей, измерение уровня ДНК, окрашивание на F-актин и анализ ключевых компонентов ECM с использованием методов иммуногистохимии и вестерн-блоттинга. В частности, были проанализированы пять основных компонентов ECM тканей скелетных мышц.
На протяжении всего протокола образцы изменяются по внешнему виду (рис. 1B 1-4). После изоляции мышечная ткань приобретает красноватый оттенок из-за присутствия миоглобина (рис. 1B1). После инкубации в гипотоническом буфере, который лизирует клетки и удаляет большую часть цитоплазматических белков, образцы становятся белыми (рис. 1Б2). SDS, анионное детергент, обычно используемое при децеллюляризациитканей 12, эффективно удаляет цитоплазматический и ядерный материал, а также мембраны. В результате образцы становятся более прозрачными после обработки SDS (рис. 1B3). Однако высокие концентрации или длительное воздействие этого детергента могут вызвать денатурацию белка, потерю гликозаминогликанов и разрушение коллагеновых волокон12. Оптимальный баланс между удалением клеток и сохранением ECM достигается при использовании 0,05% SDS в течение 24 ч, как показано на рисунке 2 и рисунке 3. Наконец, ДНК удаляется с помощью обработки ДНКазой, в результате чего получаются прозрачные каркасы dECM, которые немного меньше, чем после обработки SDS (рис. 1B4).
Об успешности протокола децеллюляризации свидетельствует количество остаточной ДНК, присутствующей в матрицах после процесса. Количественное определение ДНК показывает почти 100% снижение dECM по сравнению с нативной тканью (рис. 1C). Окрашивание DAPI также подтверждает отсутствие ДНК в dECM (рис. 2B, D, F, H, J).
Наличие пяти основных белков ECM оценивали с помощью иммуногистохимии и вестерн-блоттинга после децеллюляризации и сравнивали с нативной тканью. Иммуноокрашивание субъединицы ламинина α2 (рис. 2A, B) и общего количества ламининов (рис. 2C, D) показывает, что dECM демонстрируют канальцевое окрашивание этих белков (стрелки на рисунке 2B, D), аналогичное ламининовому матриксу, окружающему миотубы в нативной ткани (стрелки на рисунке 2A, C). Анализ вестерн-блоттинга на субъединицу ламинина α2 выявляет наличие двух полос в нативной ткани (рис. 2A'), в то время как три полосы с меньшей молекулярной массой, чем ожидалось, могут быть обнаружены в dECM (рис. 2B'). Это может быть результатом деградации или удаления белка в процессе децеллюляризации. Вестерн-блоттинг для общего количества ламининов показывает некоторую фрагментацию этих белков в dECM по сравнению с образцами из нативной ткани (рис. 2C',D').
Рисунок 1: Процедура децеллюляризации скелетных мышц плода и оценка морфологии тканей и содержания ДНК. (А) Схематическое изображение протокола децеллюляризации. (B) Морфология тканей на протяжении всего протокола, от свежесобранной до децеллюляризированной ткани. Масштабная линейка = 1 мм. (C) Количественное определение ДНК, присутствующей в dECM, по сравнению с нативной тканью. Данные, выраженные в виде среднего значения ± SEM. t-критерий Стьюдента, двусторонний **p < 0,01. Протокол децеллюляризации эффективно удаляет ядерное содержимое, продуцирующее бесклеточные dECM. Сокращения: dECMs = децеллюлярные матрицы; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; SDS = додецилсульфат натрия; NT = нативная ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Иммуноокрашивание на фибронектин (рис. 2E, F) и коллаген I (рис. 2G, H) показывает присутствие этих белков в интерстициальном пространстве между клетками в нативной ткани (стрелки на рисунке 2E, G) и аналогичное окрашивание в dECM (стрелки рис. 2F, H). Анализ вестерн-блоттинга показывает сходные полосы для фибронектина в обоих условиях (рис. 2E',F'), что указывает на то, что этот белок не особенно подвержен влиянию процесса децеллюляризации. Однако в случае коллагена I (рис. 2G',H') в dECM меньше полос, что указывает на некоторую степень деградации. Иммуноокрашивание для коллагена IV показывает картину канальцевого окрашивания в нативной ткани (стрелка на рисунке 2I) и аналогичное окрашивание в dECM, хотя трубчатые структуры более узкие (стрелка на рисунке 2J). Вестерн-блоттинг на коллаген IV выявляет наличие трех полос в нативной ткани (рис. 2I'). В то время как те же три полосы наблюдаются в dECM (рис. 2J'), их молекулярная масса ниже, чем ожидалось. Как и в случае с ламинином α2, это может быть результатом деградации или удаления белка во время децеллюляризации.
Затем dECM засевают миобластами C2C12 и культивируют в течение 8 дней в полной питательной среде. Клетки C2C12 колонизируют dECM и размножаются, как показано при окрашивании фосфогистона 3 (стрелки на рисунке 3A). После дополнительных 4 дней культивирования в среде дифференцировки клетки C2C12 дифференцируются и сливаются в многоядерные (синие стрелки на рисунке 3B) миотрубки, экспрессирующие тяжелую цепь миозина (пунктирная линия на рисунке 3B). Интересно, что внутриклеточное и/или перицеллюлярное окрашивание цепи ламинина α2 (желтые стрелки на рисунке 3C, D), общих ламининов (пурпурная стрелка на рисунке 3C) и фибронектина (пурпурная стрелка на рисунке 3D) может быть обнаружено в клетках C2C12, культивируемых в полной питательной среде, что позволяет предположить, что эти клетки способны синтезировать эти белки ECM de novo , тем самым способствуя формированию своей ниши. Эти результаты показывают, что протокол децеллюляризации генерирует микроокружение dECM, в котором миобласты C2C12 могут размножаться, дифференцироваться и образовывать многоядерные миотрубки.
Рисунок 2: Оценка пяти белков ECM в нативной и децеллюляризованной мышечной ткани плода E18.5. Иммуногистохимия на срезах нативной ткани (A, C, E, G, I) и окрашивание dECM (B, D, F, H, J) с помощью DAPI, ДНК-маркера, фаллоидина, детектирующего F-актина, и белков ECM. Масштабная линейка = 15 мкм. В нативной ткани иммуноокрашивание на ламинины и коллаген IV присутствует вокруг миоволокон (A, C, I; желтые стрелки), а окрашивание на фибронектин и коллаген I обнаруживается в интерстициальном пространстве между миоволокнами (E, G; желтые стрелки). В dECM окрашивание на ламинины и коллаген IV (B, D, J; желтые стрелки) показывает канальцевый рисунок, окружающий пространства, оставленные миоволокнами после децеллюляризации. Иммуноокрашивание фибронектина и коллагена I dECM согласуется с их присутствием в интерстициальном пространстве (F, H; желтые стрелки). (А'-Ж') Вестерн-блоттинг для пяти белков ECM в нативных тканях (A', C',E',G',I') и в образцах dECM (B',D',F',H',J'). Оба подхода показывают сохранение белка после децеллюляризации. Используемые антитела и соответствующие разведения перечислены в таблице 1. Сокращения: LNα2 = цепь ламинина α2; LNp = панмышечные ламинины; FN = фибронектин; Col I = коллаген I; Col IV = коллаген IV; MHC = тяжелая цепь миозина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: рецеллюляризация dECM с клеточной линией миобластов (миобласты C2C12). (A) Проекция максимальной интенсивности конфокального изображения стека рецеллюляризованного матрикса размером 100 мкм, колонизированного клетками C2C12, меченными ДНК, окрашивающей метиловый зеленый цвет, фаллоидином, обнаруживающим F-актин, и антителом против pH3, маркером пролиферации (пурпурные стрелки). Масштабная линейка = 35 мкм. (B) Проекция максимальной интенсивности конфокального изображения стека 100 мкм, показывающего многоядерную (синие стрелки указывают ядра) миозиновую тяжелую цепную положительную миотубу (пунктирная линия), образованную во время культивирования. Шкала = 35 мкм. (C, D) Иммуногистохимическое конфокальное изображение, показывающее внутри- или периклеточное окрашивание цепи ламинина α2 (желтые стрелки), общих ламининов (пурпурные стрелки в C) и фибронектина (пурпурные стрелки в D) в миобластах, что свидетельствует о синтезе белка de novo. Масштабная линейка = 10 мкм. Используемые антитела и соответствующие разведения перечислены в таблице 1. Сокращения: рН3 = фосфо-гистон 3; LNα2 = цепь ламинина α2; LNp = панмышечные ламинины; FN = фибронектин; MHC = тяжелая цепь миозина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM представляет собой сложную сеть макромолекул, которая присутствует во всех тканях и играет решающую роль в регуляции поведения и функции клеток2. ECM действует как физический каркас для прикрепления клеток и обеспечивает сигналы, которые активно модулируют клеточные процессы, такие как пролиферация, подвижность, дифференцировка и апоптоз. Таким образом, правильное формирование и поддержание ECM имеет важное значение как для развития, так и для гомеостаза1.
В то время как 2D-модели клеточных культур широко используются, они все чаще заменяются более продвинутыми 3D-платформами. Это связано с тем, что в 2D-культурах отсутствуют химические и физические сигналы, влияющие на поведение клеток, в то время как 3D-культуры считаются более реалистичной альтернативой для изучения молекулярной и клеточной динамики в нативных тканях11. Децеллюляризация тканей приводит к образованию каркасов, которые более точно имитируют микроокружение биологических тканей, как показано в ряде исследований различных систем тканей или органов 14,15,23,24,25. Способность dECM воспроизводить микроокружение нативных тканей обладает большим потенциалом для исследований нормального развития, различных болезненных состояний и воздействия лекарств или токсинов на ткани11.
Протокол, используемый в этом исследовании, основан на протоколе, разработанном Silva et al. для децеллюляризации сердечной тканиплода 14 в качестве отправной точки. Он включает в себя комбинацию гипотонического буфера, обработки анионным моющим средством (SDS) и обработки ДНКазой. Одной из основных проблем в протоколах децеллюляризации является поиск баланса между удалением клеток и сохранением белкового состава ECM. Учитывая наше внимание к использованию этой системы 3D-культивирования клеток для изучения ранних стадий LAMA2-CMD, особое внимание было уделено сохранению ламинина-211 во время децеллюляризации. Протокол Silva et al.14 приводил к потере иммунореактивности цепи ламинина α2 в децеллюляризированных мышцах плода; это может быть связано с концентрацией используемых паспортов безопасности. Поэтому были протестированы альтернативы стадии 0,2% раствора моющего средства SDS, такие как более низкие концентрации SDS (0,1%, 0,05% и 0,02%) и замена SDS различными концентрациями Triton X-100 (0,5% и 0,2%). Наилучшие результаты были достигнуты при использовании 0,05% SDS моющего средства в течение 24 часов. Эта концентрация эффективно удаляла содержимое клеток, сохраняя при этом иммунореактивность α2-цепи ламинина после децеллюляризации. Этот протокол воспроизводимо производит бесклеточные dECM, свободные от клеточных остатков, включая ДНК.
Протокол, используемый в этом исследовании, сохраняет как белки интерстициального матрикса (фибронектин и коллаген I), так и белки базальной мембраны (ламинины и коллаген IV). Будущие исследования должны оценить, сохраняется ли коллаген VI, поскольку он также играет роль в мышечных дистрофиях26. Известно, что SDS может нарушать ультраструктуру белка и повреждать коллагены12; для скелетных мышц плода было важно использовать низкую концентрацию SDS (0,05%) для поддержания иммунореактивности ламинина α2. Тем не менее, результаты вестерн-блоттинга показывают, что децеллюляризированные образцы демонстрируют больше полос после иммунодетекции ламининов и коллагенов по сравнению с нативной тканью, что указывает на некоторую деградацию белка в результате процесса децеллюляризации27.
Важно отметить, что эксперименты по рецеллюляризации показывают, что эти матрицы являются надежными каркасами, которые последовательно поддерживают клеточную адгезию, пролиферацию и дифференцировку. Сообщалось, что SDS является цитотоксичным28, и поэтому этапы промывки, включенные в протокол, имеют решающее значение, если матрицы будут использоваться для рецеллюляризации. Эти скаффолды были эффективно колонизированы клетками C2C12, что указывает на их пригодность в качестве модельной системы для 3D-культивирования клеток. Наблюдение за внутриклеточным и перицеллюлярным окрашиванием белков ECM, окружающих клетки C2C12, также предполагает, что клетки активно вносят свой вклад в свое микроокружение в dECM. Кроме того, при помещении в дифференцировочную среду клетки C2C12 дифференцировались, сливались и образовывали миотрубки внутри dECM.
Существенной проблемой в этой процедуре является манипулирование образцами на протяжении всего протокола. Образцы очень маленькие и мягкие, требуют осторожности и навыков в обращении, чтобы предотвратить защемление в пипетке с тонким наконечником и потерю образцов. Наилучшие результаты получаются при запуске протокола со свежей тканью. Использование замороженных, хранящихся образцов может препятствовать удалению клеточного содержимого и приводить к усилению деградации белка, препятствуя обнаружению белка и снижая эффективность децеллюляризации.
Только в нескольких исследованиях сообщалось о децеллюляризации тканей плода 15,29,30,31. В частности, что касается децеллюляризации скелетных мышц плода, только в одном предыдущем исследовании сообщалось о децеллюляризации композитных образцов дермы, подкожной клетчатки и карнозального панникула31. Насколько известно авторам, это первый случай, когда был создан протокол децеллюляризации изолированных скелетных мышц плода мыши. Этот протокол может служить основой для создания аналогичных протоколов для мышечных тканей плода других видов, таких как свиньи и люди13.
Настоящий протокол децеллюляризации скелетных мышц мыши E18.5 очень похож на процедуру Silva et al.14, которые применили его к сердцу мыши E18. Единственное различие заключается в концентрации используемого SDS, которая значительно ниже, чем та, которая используется для сердца плода (0,05% против 0,2%), возможно, из-за разных физических свойств этих двух тканей плода.
Разработка этой модели in vitro не только позволяет изучать процессы, участвующие в нормальном развитии мышц плода, но также позволяет параллельно исследовать ранние мышечные дистрофии и миопатии, такие как LAMA2-CMD, который проявляется как дефект миогенеза при E18.5 в мышиной модели dy W 10. Однако следует отметить, что эта система ограничена тем, что включает только ECM и мышечные клетки и не содержит других типов клеток, таких как нейроны, эндотелиальные клетки и фибробласты. Значимость этих дополнительных типов клеток может варьироваться в зависимости от заболевания, и для их включения могут потребоваться модификации системы культивирования. В целом, использование dECM, как описано в этом исследовании, может быть применено при изучении различных мышечных дистрофий и миопатий с ранним началом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Французской ассоциацией борьбы с миопатиями (AFM-Téléthon; контракт No 23049), проектом MATRIHEALTH и финансированием подразделения cE3c UIDB/00329/2020. Мы хотели бы поблагодарить нашего донора Энрике Мейреллеса, который решил поддержать проект MATRIHEALTH. В этой работе использовалась инфраструктура Центра микроскопии факультета естественных наук, узла Португальской платформы биовизуализации (ссылка PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), и мы благодарим Луиса Маркеса за его помощь в получении и обработке изображений. Наконец, мы благодарим Марту Пальму за техническую поддержку и нашу исследовательскую группу за их щедрый вклад.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
