Summary
Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.
Abstract
A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural para as células e na transmissão de sinais que são importantes para vários processos celulares. Modelos bidimensionais (2D) de cultura de células simplificam demais as complexas interações entre células e a MEC, pois a falta de um suporte tridimensional completo (3D) pode alterar o comportamento celular, tornando-as inadequadas para a compreensão de processos in vivo . Deficiências na composição da MEC e nas interações célula-MEC são importantes contribuintes para uma variedade de diferentes doenças.
Um exemplo é a distrofia muscular congênita LAMA2 (LAMA2-CMD), onde a ausência ou redução funcional das lamininas 211 e 221 pode levar a hipotonia grave, detectável no nascimento ou logo após o nascimento. Trabalhos anteriores usando um modelo murino da doença sugerem que seu início ocorre durante a miogênese fetal. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo 3D in vitro que permita o estudo das interações entre as células musculares e a MEC muscular fetal, mimetizando o microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos das costas dissecados de fetos de camundongos E18.5, tratados com tampão hipotônico, detergente aniônico e DNase. As matrizes decelularizadas resultantes (dECMs) retiveram todas as proteínas da MEC testadas (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV) em comparação com o tecido nativo.
Quando os mioblastos C2C12 foram semeados sobre essas dECMs, eles penetraram e colonizaram as dECMs, o que apoiou sua proliferação e diferenciação. Além disso, as células C2C12 produziram proteínas da MEC, contribuindo para o remodelamento de seu nicho dentro das dECMs. O estabelecimento desta plataforma in vitro fornece uma nova abordagem promissora para desvendar os processos envolvidos no aparecimento da LAMA2-CMD, e tem o potencial de ser adaptada a outras doenças musculares esqueléticas onde deficiências na comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas contribuem para a progressão da doença.
Introduction
A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos1. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente o destino dascélulas2. Uma das características mais notáveis da MEC é sua diversidade funcional, pois cada MEC tecidual apresenta uma combinação única de moléculas que fornecem diferentes topologias e propriedades adaptadas às células que contém1.
A sinalização e o suporte da MEC são cruciais para o desenvolvimento e a homeostase e, quando interrompidos, podem levar a múltiplas condições patológicas 3,4. Um exemplo é a distrofia congênita deficiente em LAMA2 (LAMA2-CMD), que é a forma mais comum de distrofia muscular congênita. O gene LAMA2 codifica a cadeia α2 da laminina, que está presente na laminina 211 e na laminina 221, e quando mutada pode levar à LAMA2-CMD 5. A laminina 211 é a principal isoforma encontrada na membrana basal que envolve as fibras musculares esqueléticas. Quando a laminina 211 é anormal ou ausente, a ligação entre a membrana basal e as células musculares é rompida, levando ao aparecimento da doença6. Pacientes com LAMA2-CMD apresentam um fenótipo leve a grave, dependendo do tipo de mutação no gene LAMA2.
Quando a função da proteína α2 da laminina é afetada, os pacientes podem experimentar hipotonia muscular grave ao nascimento e desenvolver inflamação crônica, fibrose e atrofia muscular, levando a uma redução da expectativa de vida. Até o momento, nenhum tratamento direcionado foi desenvolvido e as abordagens terapêuticas limitam-se a aliviar os sintomas da doença7. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidos no aparecimento dessa doença é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticasapropriadas6,8. Trabalhos anteriores utilizando o camundongo dyW 9, modelo para LAMA2-CMD, sugerem que o início da doença inicia-se no útero, especificamente durante a miogênese fetal10. Uma melhor compreensão de como o defeito da miogênese fetal emerge seria um divisor de águas na geração de novas abordagens terapêuticas para LAMA2-CMD.
Sistemas in vitro fornecem um ambiente controlado para o estudo de interações célula-célula e célula-MEC, mas os modelos de cultura 2D carecem da complexidade dos tecidos nativos. A descelularização dos tecidos produz arcabouços acelulares de MEC específicos para o estágio de desenvolvimento e tecido que mimetizam com mais precisão o microambiente celular natural em comparação com modelos 2D e arcabouços artificiais/sintéticos. As matrizes decelularizadas (dECMs) têm o potencial de preservar as pistas moleculares e mecânicas do tecido hospedeiro, tornando-as melhores modelos alternativos para o entendimento de processos in vivo11.
Existem várias técnicas, reagentes e condições que podem ser utilizadas para a descelularização12,13. Neste estudo, um protocolo de descelularização para o coração fetal de camundongos, descrito por Silva et al.14,15, é adaptado ao músculo esquelético fetal de camundongos e retém todos os componentes da MEC testados (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV). O protocolo inclui três etapas: lise celular por choque osmótico (tampão hipotônico), dissolução da membrana plasmática e dissociação proteica (dodecil sulfato de sódio a 0,05% [SDS]) e destruição enzimática do DNA (tratamento com DNase). Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo estabelecido para a descelularização do músculo esquelético fetal de camundongos.
Para utilizar este sistema 3D in vitro para o estudo do LAMA2-CMD, é crucial manter a cadeia α2 da laminina após a decelularização. Portanto, um protocolo de otimização foi implementado onde diferentes detergentes (SDS e Triton X-100) e concentrações (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) foram testados (dados não mostrados). A escolha ideal para remoção celular e preservação da proteína α2 da laminina foi SDS a 0,05%. Células C2C12, uma linhagem bem estabelecida de células mioblásticas16,17, foram usadas para semear as dECMs. Essas células invadem a dMEC, proliferam e se diferenciam no interior desses arcabouços, sintetizando novas proteínas da MEC. A produção bem-sucedida deste modelo in vitro 3D oferece uma nova abordagem para a compreensão dos processos moleculares e celulares envolvidos na miogênese fetal, no início da LAMA2-CMD, e pode ser estendida a outras doenças musculares onde a comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas é interrompida.
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Protocol
Todas as metodologias descritas foram aprovadas pela Comissão de Bem-Estar Animal (ORBEA) da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e pela Direção-Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), e estão em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE.
1. Preparação de tampões e reagentes de decelularização
NOTA: Todas as soluções utilizadas durante o protocolo de descelularização devem ser esterilizadas por autoclavagem e armazenadas por até 3 meses, salvo indicação em contrário.
- Preparar solução salina tamponada com fosfato 10x (10x PBS) adicionando cloreto de sódio (NaCl) a 137 mM, cloreto de potássio (KCl) a 2,68 mM, fosfato de potássio-dihidrogênio (KH 2 PO 4) a 8,1 mM e dissódico-hidrogênio-fosfato di-hidratado (Na 2 HPO4) a 1,47 mM à água desmineralizada (dH2O) eajustar o pH para 6,8. Adicione 100 mL de 10x PBS a 900 mL de H2O desmineralizado para gerar 1x PBS. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente (TR). Adicionar solução estoque estéril de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina [caneta/estreptococo]) a uma concentração final de 1% antes do uso.
- Preparar o tampão hipotónico dissolvendo 1,21 g de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris base) e 1 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 1 L de dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Use um agitador magnético até dissolver e ajuste o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Esterilizar em autoclave e armazenar em RT. Adicionar caneta/strep a uma concentração final de 1% antes de usar.
- Preparar o tampão de lavagem hipotónico dissolvendo 1,21 g de Tris base em 1 L de dH2O (10 mM Tris base). Use um agitador magnético até dissolver e ajuste o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Autoclave e armazenar em RT. Adicione caneta/strep a 1% antes de usar.
- Preparar o tratamento com detergente aniónico adicionando 0,05 g de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 100 ml de tampão de lavagem hipotónico para produzir uma solução de tratamento SDS a 0,05%. Filtrar através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Armazene na RT por até 1 mês.
NOTA: A solução de SDS não deve ser autoclavada, pois o SDS precipita e degrada após a autoclavagem. - Preparar a solução de tratamento DNase dissolvendo 1,21 g de Tris base em 0,5 ml de dH 2 O e adicionar1 ml de cloreto de magnésio 1 M (MgCl2). Ajustar o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Autoclave e armazenar em RT. Adicionar DNase I antes de usar (50 U/mL).
2. Coleta de amostras
NOTA: Camundongos selvagens C57/BL6 foram utilizados no estudo. Todas as técnicas foram conduzidas em capela de fluxo laminar sob condições estéreis.
- Eutanásia de camundongos fêmeas adultas prenhes no dia embrionário (E) 18,5 de prenhez utilizando inalação de isoflurano seguida de deslocamento cervical. Submeter os camundongos à dissecção terminal para extrair os fetos.
- Borrifar o abdómen do rato com etanol a 70%.
- Com o uso de pinça cirúrgica e tesoura, levantar uma prega de pele no abdome inferior e fazer uma incisão em U para expor a cavidade abdominal18.
- Coletar os cornos uterinos contendo os fetos E18.5 cortando os ovidutos e o colo do útero e transferi-los imediatamente para uma placa de Petri com PBS 1x gelado com caneta/strep 1% 1%.
- Retirar rapidamente os fetos do útero e dos tecidos extraembrionários e eutanasiá-los por decapitação com tesoura18.
- Transfira um feto de cada vez para uma placa de Petri com 1x PBS gelado. Usando um microscópio estéreo, remova a pele e corte os membros. Do lado ventral, corte a caixa torácica e remova o esterno e os órgãos subjacentes.
- Vire o dorsal do tronco fetal para cima. Remova a porção cervical da coluna vertebral, os depósitos de gordura dorsal e o tecido conjuntivo no topo dos músculos profundos das costas.
- Use pinça cirúrgica para ancorar a caixa torácica e raspe e desconecte cuidadosamente os músculos profundos das costas dos tecidos circundantes usando um microbisturi10. Esse procedimento resulta no isolamento de duas peças musculares por feto (esquerda e direita), ambas compostas primariamente pelos músculos longuíssimo e iliocostal, incluindo alguns músculos transversoespinhal e elevador costar.
- Armazenar as amostras de músculo em 1x PBS com caneta/strep a 1% a 4 °C para armazenamento de curto prazo (<1 semana), ou a -80 °C por períodos mais longos.
NOTA: Use amostras recém-coletadas para obter melhores resultados. Amostras congeladas por longos períodos (>3 meses) apresentam menor eficiência de decelularização e maior degradação proteica. Massas musculares epaxiais foram usadas para os experimentos de decelularização, mas outros músculos (por exemplo, músculos dos membros) podem ser processados para descelularização usando o mesmo protocolo.
3. Descelularização do músculo esquelético fetal
OBS: Todas as técnicas foram conduzidas em capela de fluxo laminar sob condições estéreis. Para obter uma representação esquemática detalhada, consulte a Figura 1A. Todos os passos foram realizados com agitação em um agitador orbital com diâmetro de 120 mm (165 rpm) a 25 °C, salvo indicação em contrário. Adicionar 1% de caneta/strep às soluções antes de usar. Ao remover as soluções, aspirar cuidadosamente para evitar o aprisionamento da amostra na pipeta.
- Dia 1 - Preparar aproximadamente 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) fragmentos de tecido das massas musculares epaxiais. Adicionar 3 mL de tampão hipotônico com caneta/strep a 1% a cada poço de uma placa de 12 poços e adicionar um fragmento de tecido muscular inteiro por poço.
- Incubar os fragmentos de tecido em tampão hipotônico com agitação por 18 h (durante a noite) (O/N).
- Dia 2 - Aspirar o tampão hipotônico com pipeta de ponta fina e lavar as amostras 3 x 1 h com 3 mL de PBS 1x cada vez com agitação.
- Incubar as amostras por 24 h com 3 mL de solução detergente SDS 0,05% com agitação.
NOTA: (CHECK POINT) Após a incubação em SDS, as amostras devem ter aparência transparente. As amostras apresentam uma consistência semelhante à gelatina e, portanto, são mais propensas a aderir à pipeta ao remover os líquidos.
- Incubar as amostras por 24 h com 3 mL de solução detergente SDS 0,05% com agitação.
- Dia 3 - Retirar a solução detergente SDS com pipeta de ponta fina e lavar os fragmentos de tecido 3 x 20 min com 3 mL de tampão de lavagem hipotônico cada vez com agitação.
NOTA: (PONTO DE PAUSA) As amostras podem ser mantidas em tampão de lavagem hipotônico a 4 °C por 18 h (O/N). Certifique-se de que o SDS seja bem removido durante as etapas de lavagem, pois o SDS residual pode ser citotóxico.- Incubar os fragmentos de tecido durante 3 h com 2 ml de solução de DNase com agitação a 37 °C.
- Remover a solução de DNase com uma pipeta de ponta fina e lavar os fragmentos de tecido 3 x 20 min com 3 mL de PBS 1x cada vez com agitação. Por fim, lave O/N com agitação (60 rpm).
NOTA: Após o tratamento com DNase, as dECMs tornam-se pegajosas devido à presença de resíduos de DNA. Portanto, a lavagem cuidadosa é necessária. - Armazenar as dECMs em 1x PBS com caneta/strep a 1% a 4 °C até a recelularização (<1 semana). Para outros usos, conservar a -80 °C.
4. Avaliação da qualidade da decelularização
NOTA: A quantificação de DNA, a coloração DAPI/verde de metila e a coloração com faloidina foram realizadas para avaliar a presença de conteúdo celular residual após a descelularização. Análises imunoistoquímicas e de western blot foram realizadas para avaliar a retenção de proteínas-chave da MEC após a descelularização.
- Quantificação do DNA presente na dECM
NOTA: As dECMs devem ser comparadas com o tecido nativo para detectar a presença de DNA.- Antes da descelularização, pesar um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em balança digital de alta precisão. Antes de transferir a amostra muscular para o tubo, remova todos os 1x PBS restantes usando uma toalha de papel. Pesar o tubo com a amostra. Calcular o peso húmido das amostras utilizando a equação (1):
Peso úmido da amostra = tubo de pesocom amostras -peso do tubo vazio (1) - Descelularizar as amostras seguindo o protocolo descrito na seção 3.
- Colocar as amostras em tubos de microcentrífuga de 2 mL.
NOTA: As amostras podem ser mantidas a -20 °C até à extracção e quantificação do ADN. - Realizar extração de DNA das dECMs e amostras de tecido nativo usando um kit baseado em coluna de spin. Adicione o tampão de digestão de acordo com as instruções do fabricante.
- Homogeneizar as amostras em um moinho de contas duas vezes por 2,5 min cada vez (virando os suportes) usando um grânulo de carboneto de tungstênio por tubo (use suportes de tubo refrigerados).
- Adicionar proteinase K e incubar O/N com agitação lenta a 56 °C.
- Prossiga com o protocolo conforme descrito nas instruções do fabricante.
- Eluir com o tampão fornecido pelo fabricante e centrifugar 2 x 1 min a ≥6.000 x g, cada vez a 4 °C para aumentar o rendimento de DNA.
NOTA: O ADN pode ser armazenado a -20 °C até à quantificação. - Quantifique o DNA presente nas amostras usando um kit de detecção de dsDNA fluorescente seguindo as instruções do fabricante.
- Normalizar o conteúdo de DNA como nanogramas de DNA por miligrama de peso úmido original da amostra.
- Analise os dados por meio do teste t de Student bicaudal e expresse como média ± erro padrão da média (EPM).
- Antes da descelularização, pesar um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em balança digital de alta precisão. Antes de transferir a amostra muscular para o tubo, remova todos os 1x PBS restantes usando uma toalha de papel. Pesar o tubo com a amostra. Calcular o peso húmido das amostras utilizando a equação (1):
- Imuno-histoquímica
NOTA: As soluções 1, 2 e 3 e a solução fixadora devem ser preparadas antes do uso e podem ser mantidas congeladas por até 6 meses. Todos os anticorpos e corantes utilizados e respectivas diluições estão listados em Tabela 1.- Preparação de soluções
- Preparar a solução fixadora adicionando 2 g de paraformaldeído (PFA), 8 g de sacarose e 24 μL de CaCl 1 M 2 a 77 mL de 0,2 M Na 2 HPO 4 e 23 mL de 0,2 MNaH 2 PO 4, a um volume final de 200 mL adicionando dH2 O.Ajuste o pH para7,4.
- Preparar tampão fosfato 0,12 M adicionando 13,5 g de Na 2 HPO 4 e3,2 g de NaH 2 PO 4 a 1 L de dH2O. Ajustar o pH para7,4.
- Preparar a solução 1 adicionando 4 g de sacarose a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M.
- Preparar a solução 2 adicionando 15 g de sacarose a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M.
- Preparar a solução 3 adicionando 15 g de sacarose e 7,5 g de gelatina a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M. Aqueça a 37 °C até dissolver a gelatina.
- Preparar solução-mãe verde metilo (pó verde metílico a 2% dissolvido em dH2O)19.
- Imunodetecção
- Fixar as amostras utilizando a solução fixadora durante, pelo menos, 4 h a 4 °C.
- Lave as amostras 2x por 10 min com 1x PBS.
- Conservar O/N, ou durante 1 dia, na solução 1 a 4 °C.
- Lavar e manter O/N ou durante 1 dia na solução 2 a 4 °C. Deixe as amostras aquecerem até RT.
- Incubar durante 3 h na solução 3 a 37 °C. Conservar a solução extra 3 a 37 °C para ser utilizada mais tarde.
- Molde recipientes pequenos (2 cm x 1 cm x 1 cm) em papel alumínio. Coloque uma fina camada de solução 3 no recipiente moldado e deixe assentar. Colocar as amostras sobre a solução solidificada 3 e cobrir com a solução quente 3. Orientar as amostras e deixá-las solidificar. Marque o local na solução solidificada 3 com uma caneta colorida.
- Congelar colocando os recipientes na superfície de isopentano seco refrigerado a gelo ou azoto líquido.
- Usando o composto de temperatura de corte ideal (O.C.T.), fixe os cubos de gelatina congelados contendo as amostras no suporte de criostato.
- Seccione os cubos de gelatina congelados e transfira os cortes de tecido para as lâminas. Deixe secar por 60 min.
- Use um marcador hidrofóbico para traçar uma linha ao redor das seções.
- Lave as lâminas 3 x 10 min em 1x PBS.
- Cobrir os cortes com albumina de soro bovino (BSA) a 1%, soro caprino a 1% e Triton X-100 a 0,05% diluído em 1x PBS (solução de bloqueio) por 30 min (etapa de bloqueio).
- Diluir os anticorpos primários em solução de bloqueio e cobrir as secções. Incubar O/N a 4 °C numa caixa fechada, com papel húmido, para evitar que as secções sequem.
- Lave as lâminas 3 x 10 min com 1x PBS.
- Diluir os anticorpos secundários em solução de bloqueio e cobrir as secções. Incubar por 1,5 h no TR no escuro.
NOTA: Evite a exposição à luz para evitar a degradação do fluoróforo. - Lave as lâminas 3 x 10 min com 4x PBS.
NOTA: Maior concentração de PBS pode ser usada quando um fundo forte está presente. - Submergir as lâminas em solução DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-octano em Triton X-100/1x PBS a 0,1%) por 30 s cada.
- Enxágue em 1x PBS.
- Monte as seções em meio anti-desbotamento (50 mg/mL de n-propil-galato em 1x PBS:glicerol [1:9]) e sele com uma lamínula. Conservar a 4 °C até observação e aquisição das imagens em microscópio de fluorescência20.
NOTA: Para os experimentos de imunohistoquímica in toto , o mesmo protocolo (ver etapas 4.2.2.12-4.2.2.18) foi usado, exceto que as amostras foram previamente fixadas em PFA a 4% diluído em 1x PBS por 3 h na RT. A coloração de DNA foi realizada pela adição de verde de metila à solução de anticorpos secundários. Todos os anticorpos e corantes utilizados, e suas respectivas diluições, estão listados na Tabela 1. As amostras foram então montadas em meio anti-desbotamento entre duas lamínulas separadas por anéis de aço, coladas com cera de abelha, e pilhas de imagens de 100 μm foram adquiridas usando um microscópio confocal21.
- Preparação de soluções
- Análise de Western blot
NOTA: Todos os anticorpos utilizados e respectivas diluições estão listados em Tabela 1.- Preparação de soluções
- Preparar o tampão de carregamento 2x SDS-PAGE adicionando 20 mL de glicerol, 4 g de SDS e 0,2 mL de azul de bromofenol a 80 mL de solução base de Tris 100 mM. Ajuste o pH para 6,8. Adicione ditiotreitol fresco (DTT) antes de usar.
- Preparar o tampão de lavagem salino tamponada Tris com solução de Tween 20 (TBST) adicionando 2,4 g de Tris base, 8,8 g de NaCl e 1 mL de Tween-20 a dH2O para um volume final de 1 L. Ajuste o pH para 7,4-7,6 usando HCl.
- Preparar o tampão de corrida (RB) de 10x adicionando 30,2 g de Tris base, 144,2 g de glicina e 10 g de SDS a 1 L de dH2O. Antes de usar, adicione 100 mL de 10x RB a 900 mL de dH2O para preparar 1x RB (solução de trabalho).
NOTA: Enquanto 10x RB pode ser armazenado no RT por vários meses, 1x RB pode ser reutilizado em execuções diferentes. - Preparar o tampão de transferência (TB) adicionando 5,82 g de Tris base, 2,93 g de glicina e 0,5 g de SDS a 800 mL de dH2O. Depois que os componentes estiverem dissolvidos, adicionar 200 mL de metanol. Frio a 4 °C.
NOTA: O TB deve ser preparado na hora antes de cada uso.
- Extração de proteínas
- Coletar músculos epaxiais de camundongos E18.5 e colocá-los imediatamente em um tubo de microcentrífuga (2 mL) contendo 2x tampão de carregamento SDS-PAGE com TDT recém-adicionado (100 mM TDT). Processo E18.5 dECM da mesma forma.
- Adicione um grânulo de carboneto de tungstênio por tubo. Homogeneizar 2x em um moinho de contas por 2,5 min cada vez (vire as montagens).
- Sonicar as amostras por 5 min em um banho de ultrassom.
- Aquecer as amostras durante 10 min a 50 °C.
- Centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL.
- Quantificar a proteína usando um espectrofotômetro de microvolume.
- Conservar a -20 °C até nova utilização.
- Eletroforese em gel de poliacrilamida
- Use gel de gradiente de acrilamida pré-moldada (4%-20%)
- Monte o gel no tanque de eletroforese. Retire o pente com cuidado. Adicione 1x RB até a linha exibida no tanque de eletroforese. Certifique-se de que os poços estão cheios de RB.
- Carregar 100 μg de proteína por amostra nos poços. Carga de 12 μL de proteína padrão de alto peso molecular.
- Execute por um total de 100 min com tensão constante (10 min a 150 V e 90 min a 185 V).
- Transferência
- Mergulhe as almofadas de filtro e as esponjas com TB refrigerada (4 °C) enquanto o gel estiver funcionando.
- Corte as membranas de difluoreto de polivinilideno até o tamanho do gel. Ativá-los com metanol e lavar com dH2O. Mergulhe no TB.
- Monte o de transferência com as esponjas, almofadas de filtro, géis e membranas ativadas de acordo com as instruções do fabricante.
- Coloque o no tanque de eletroforese contendo o TB resfriado (em um leito de gelo). Adicione a unidade de resfriamento. Corra por 90 min a 100 V.
- Após a transferência, corar com um substituto azul Coomassie para avaliar a qualidade da transferência.
- Imunodetecção
- Preparar a solução de bloqueio (TBST com 5% de leite desnatado). Incubar as membranas com agitação por 1 h na RT.
- Enxágue 3 x 5 s com TBST.
- Incubar as membranas O/N com os anticorpos primários diluídos em TBST com BSA a 2% e azida sódica a 0,02% (3 mL por membrana) em câmara fria (4 °C) com agitação.
- No dia seguinte, lave 3 x 5 min com TBST.
- Incubar as membranas com anticorpos secundários conjugados à horseradish peroxidase (HRP) diluídos em TBST com leite desnatado a 5% (5 mL para cada membrana) por 1 h no TR.
- Lave as membranas com TBST 3 x 5 min. Mantenha no TBST até a etapa de detecção.
- Visualize a proteína usando um kit de revelação disponível comercialmente. Adicione reagentes de detecção de acordo com as instruções do fabricante. Adquirir imagens das bandas.
- Para testar mais de um anticorpo por membrana, após a etapa de detecção, retirar os anticorpos anteriores com três lavagens (5 min cada) usando TBST e repetir os passos 4.3.5.2-4.3.5.7.
- Preparação de soluções
Tabela 1: Anticorpos e corantes utilizados na análise imunohistoquímica e western blot e respectivas diluições. Clique aqui para baixar esta tabela.10,22
5. Cultura celular em matrizes decelularizadas
OBS: Todas as técnicas foram realizadas em condições estéreis em capela de fluxo laminar. Todas as incubações foram realizadas a 37 °C e com 5% de CO2.
- Preparar o meio de cultura celular, meio Dulbecco's Modified Eagle com glicose alta com glutamina estável e com piruvato de sódio (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de pen/strep (meio de cultura completo).
- Colocar as dECMs em uma placa de Petri em PBS 1x com caneta/strep a 1% em uma capela de fluxo laminar e separá-las em pedaços de aproximadamente 500 μm x 500 μm x 250 μm, usando um microbisturi e uma pinça.
NOTA: Os dECMs têm uma textura macia e, portanto, muitas vezes é mais fácil usar pinças para separá-los em pedaços aproximadamente do mesmo tamanho em vez de cortá-los com o microbisturi. - Transferir os fragmentos para uma placa de 96 poços (três ou quatro pedaços por poço) com 200 μL de meio de cultura completo, previamente aquecido a 37 °C. Incubar por 2 h na incubadora.
- Adicionar 500 μL de tripsina a um frasco T25 semeado com células C2C12 subconfluentes (~70%). Ressuspender em 1 mL de meio completo.
- Adicionar 10 μL da ressuspensão a 10 μL do corante azul de Tripano e carregar em um hemocitômetro. Conte e calcule o número de células e confirme a viabilidade celular.
- Aspirar o meio da placa de 96 poços contendo as dECMs e adicionar 200 μL de meio de cultura completo contendo 50.000 células C2C12 viáveis.
- Incubar por 2 dias e, em seguida, com pinças, transferir as dECMs (com as células) para uma placa de 48 poços com 400 μL de meio de cultura completo. A cada 2 dias, aspirar cuidadosamente o meio com uma micropipeta para evitar que as dECMs se desprenda do fundo do poço e adicione meio fresco até o 8º dia.
NOTA: As matrizes são mantidas por 2 dias em placas de 96 poços para promover a adesão das células C2C12 às dECMs, e são então transferidas para uma placa de 48 poços para permitir o acesso a um maior volume de meio com nutrientes. Os dECMs devem aderir ao fundo dos poços. - Para o experimento de diferenciação, substituir o meio de cultura completo por meio de diferenciação (DMEM suplementado com 2% de soro de cavalo e 1% de pena/estreptococo) no 8º dia, seguido de incubação em meio de diferenciação por 4 dias até o 12º dia.
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Representative Results
O objetivo do protocolo de decelularização é produzir dECMs que se assemelhe à composição do tecido nativo. Para determinar a eficácia do processo de decelularização, vários métodos foram empregados, incluindo exame da morfologia tecidual, medição dos níveis de DNA, coloração para F-actina e análise dos principais componentes da MEC usando técnicas de imunohistoquímica e western blotting. Especificamente, cinco componentes principais da MEC do tecido muscular esquelético foram analisados.
Ao longo do protocolo, as amostras mudam de aspecto (Figura 1B 1-4). Após o isolamento, o tecido muscular apresenta-se avermelhado devido à presença de mioglobina (Figura 1B1). Após incubação no tampão hipotônico, que lisa as células e remove a maior parte das proteínas citoplasmáticas, as amostras ficam brancas (Figura 1B2). O SDS, detergente aniônico comumente utilizado na descelularização tecidual12, remove efetivamente material citoplasmático, nuclear e membranas. Como resultado, as amostras tornam-se mais transparentes após o tratamento com SDS (Figura 1B3). No entanto, altas concentrações ou exposição prolongada a esse detergente podem causar desnaturação proteica, perda de glicosaminoglicanos e ruptura das fibras colágenas12. O equilíbrio ideal entre a remoção celular e a preservação da MEC é obtido com SDS a 0,05% por 24 h, como mostram a Figura 2 e a Figura 3. Finalmente, o DNA é removido através do tratamento com DNase, resultando em arcabouços transparentes de dECM ligeiramente menores do que após o tratamento com SDS (Figura 1B4).
O sucesso do protocolo de decelularização é indicado pela quantidade de DNA residual presente nas matrizes após o processo. A quantificação do DNA revela uma diminuição de quase 100% nas dECMs em comparação com o tecido nativo (Figura 1C). A coloração DAPI também confirma a ausência de DNA nas dECMs (Figura 2B,D,F,H,J).
A presença das cinco principais proteínas da MEC foi avaliada por imunohistoquímica e por western blot após a decelularização e comparada com o tecido nativo. A imunomarcação para a subunidade α2 da laminina (Figura 2A,B) e lamininas totais (Figura 2C,D) mostra que as dECMs apresentam coloração tubular para essas proteínas (setas na Figura 2B,D), semelhante à matriz de laminina que envolve miotubos no tecido nativo (setas na Figura 2A,C). A análise do Western blot para a subunidade α2 da laminina revela a presença de duas bandas no tecido nativo (Figura 2A'), enquanto três bandas, com peso molecular menor do que o esperado, podem ser detectadas na dECM (Figura 2B'). Isso pode ser o resultado da degradação ou remoção de proteínas durante o processo de descelularização. A análise de Western blot para laminins totais mostra alguma fragmentação dessas proteínas na dECM em comparação com amostras de tecido nativo (Figura 2C',D').
Figura 1: Procedimento de descelularização do músculo esquelético fetal e avaliação da morfologia tecidual e conteúdo de DNA. (A) Representação esquemática do protocolo de decelularização. (B) Morfologia tecidual ao longo do protocolo, desde o recém-coletado até o tecido decelularizado. Barra de escala = 1 mm. (C) Quantificação do DNA presente nas dECMs em relação ao tecido nativo. Dados expressos como média ± EPM. Teste t de Student, bicaudal **p < 0,01. O protocolo de descelularização remove eficientemente o conteúdo nuclear produzindo dECMs acelulares. Abreviações: dECMs = matrizes decelularizadas; PBS = solução salina tamponada com fosfato; SDS = dodecil sulfato de sódio; NT = tecido nativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A imunomarcação para fibronectina (Figura 2E,F) e colágeno I (Figura 2G,H) mostra a presença dessas proteínas no espaço intersticial entre as células do tecido nativo (setas na Figura 2E,G) e coloração semelhante nas dECMs (setas Figura 2F,H). A análise de Western blot mostra bandas semelhantes para fibronectina em ambas as condições (Figura 2E',F'), indicando que esta proteína não é particularmente afetada pelo processo de decelularização. Entretanto, no caso do colágeno I (Figura 2G',H') há menos bandas nas dECMs, indicando algum grau de degradação. A imunomarcação para colágeno IV mostra padrão tubular de coloração no tecido nativo (seta na Figura 2I) e coloração semelhante na dECM, embora as estruturas tubulares sejam mais estreitas (seta na Figura 2J). A análise do Western blot para colágeno IV revela a presença de três bandas no tecido nativo (Figura 2I'). Enquanto as mesmas três bandas são observadas nas dECMs (Figura 2J'), o peso molecular destas é menor do que o esperado. Assim como a laminina α2, esta pode ser o resultado da degradação ou remoção de proteínas durante a decelularização.
As dECMs são então semeadas com mioblastos C2C12 e cultivadas por 8 dias em meio de cultura completo. As células C2C12 colonizam as dECMs e proliferam, como demonstrado pela coloração nuclear de fosfo-histona 3 (setas na Figura 3A). Após mais 4 dias de cultura em meio de diferenciação, as células C2C12 diferenciam-se e fundem-se em miotubos multinucleados (setas azuis na Figura 3B) que expressam uma cadeia pesada de miosina (linha tracejada na Figura 3B). Curiosamente, a coloração intracelular e/ou pericelular para a cadeia α2 da laminina (setas amarelas na Figura 3C,D), lamininas totais (seta magenta na Figura 3C) e fibronectina (seta magenta na Figura 3D) pode ser detectada em células C2C12 cultivadas em meio de cultura completo, sugerindo que essas células são capazes de sintetizar essas proteínas da MEC de novo , contribuindo, portanto, para a formação de seu nicho. Esses resultados demonstram que o protocolo de descelularização gera um microambiente dECM onde os mioblastos C2C12 podem proliferar, diferenciar e formar miotubos multinucleados.
Figura 2: Avaliação de cinco proteínas da MEC no tecido muscular fetal nativo versus descelularizado E18.5. Imunohistoquímica em cortes de tecido nativo (A,C,E,G,I) e coloração de dECMs (B,D,F,H,J) com DAPI, um marcador de DNA, faloidina detectando F-actina e para proteínas da MEC. Barra de escala = 15 μm. No tecido nativo, a imunomarcação para lamininas e colágeno IV está presente ao redor das miofibras (A,C,I; setas amarelas) e a coloração para fibronectina e colágeno I é detectada no espaço intersticial entre as miofibras (E,G; setas amarelas). Nas dECMs, a coloração para lamininas e colágeno IV (B,D,J; setas amarelas) mostra um padrão tubular, circundando os espaços deixados pelas miofibras após a descelularização. A imunomarcação de fibronectina e colágeno I das dECMs é consistente com sua presença no espaço intersticial (F,H; setas amarelas). (A'-J') Análise de Western blot para cinco proteínas da MEC em tecido nativo (A',C',E',G',I') e em amostras de DECM (B',D',F',H',J'). Ambas as abordagens mostram preservação proteica após a descelularização. Os anticorpos utilizados e respectivas diluições estão listados na Tabela 1. Abreviações: LNα2 = laminina cadeia α2; LNp = lamininas pan-musculares; NF = fibronectina; Col I = colágeno I; Col IV = colágeno IV; MHC = cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Recelularização da dECM com linhagem celular mioblástica (mioblastos C2C12). (A) Projeção de intensidade máxima de uma imagem confocal de uma pilha de 100 μm de matriz recelularizada, colonizada com células C2C12 marcadas com DNA corado com verde de metila, faloidina detectando F-actina e anticorpo anti-pH3, um marcador de proliferação (setas magenta). Barra de escala = 35 μm. (B) Projeção de intensidade máxima de uma imagem confocal de uma pilha de 100 μm mostrando um miotubo multinucleado (setas azuis indicam os núcleos) positivo para cadeia pesada de miosina (linha tracejada) formado durante a cultura. Barra de escala = 35 μm. (C,D) Imagem confocal de imuno-histoquímica mostrando coloração intra ou pericelular para laminina α2 (setas amarelas), lamininas totais (setas magenta em C) e fibronectina (setas magenta em D) em mioblastos, sugerindo síntese proteica de novo. Barra de escala = 10 μm. Os anticorpos utilizados e respectivas diluições estão listados na Tabela 1. Abreviações: pH3 = fosfo-histona 3; LNα2 = cadeia α2 da laminina; LNp = lamininas pan-musculares; NF = fibronectina; MHC = cadeia pesada de miosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A MEC é uma rede complexa de macromoléculas que está presente em todos os tecidos e desempenha um papel crucial na regulação do comportamento e função celular2. A MEC atua como um arcabouço físico para as células se ligarem e fornece pistas que modulam ativamente os processos celulares, como proliferação, motilidade, diferenciação e apoptose. Assim, a formação e manutenção adequadas da MEC são essenciais tanto para o desenvolvimento quanto para a homeostase1.
Embora os modelos de cultura de células 2D tenham sido amplamente utilizados, eles estão sendo cada vez mais substituídos por plataformas 3D mais avançadas. Isso ocorre porque as culturas 2D carecem de pistas químicas e físicas que afetam o comportamento celular, enquanto as culturas 3D são consideradas uma alternativa mais realista para o estudo da dinâmica celular e molecular em tecidosnativos11. A descelularização dos tecidos resulta na produção de arcabouços que mimetizam mais os microambientes dos tecidos biológicos, como demonstrado em vários estudos em vários tecidos ou sistemas orgânicos14,15,23,24,25. A capacidade das dECMs de replicar microambientes de tecidos nativos tem grande potencial para pesquisas sobre o desenvolvimento normal, vários estados patológicos e o efeito de drogas ou toxinas nos tecidos11.
O protocolo utilizado neste estudo baseia-se no protocolo desenvolvido por Silva e col. para a descelularização do tecido cardíacofetal14 como ponto de partida. Envolve uma combinação de um tampão hipotônico, tratamento com detergente aniônico (SDS) e tratamento com DNase. Um dos principais desafios nos protocolos de decelularização é encontrar um equilíbrio entre a remoção de células e a preservação da composição proteica da MEC. Dado nosso foco no uso deste sistema de cultura de células 3D para estudar os estágios iniciais da LAMA2-CMD, atenção especial foi dada à preservação da laminina 211 durante a decelularização. O protocolo de Silva et al.14 levou à perda da imunorreatividade da cadeia α2 da laminina nos músculos fetais decelularizados; isso pode ser devido à concentração de SDS utilizada. Portanto, alternativas à etapa de solução detergente SDS a 0,2% foram testadas, como menores concentrações de SDS (0,1%, 0,05% e 0,02%) e a substituição de SDS por diferentes concentrações de Triton X-100 (0,5% e 0,2%). Os melhores resultados foram obtidos com o uso do tratamento com detergente SDS 0,05% por 24 horas. Essa concentração efetivamente removeu o conteúdo celular, preservando a imunorreatividade da cadeia α2 da laminina após a descelularização. Este protocolo produz de forma reprodutível dECMs acelulares que são livres de resíduos celulares, incluindo DNA.
O protocolo utilizado neste estudo preserva tanto as proteínas da matriz intersticial (fibronectina e colágeno I) quanto as proteínas da membrana basal (lamininas e colágeno IV). Estudos futuros devem avaliar se o colágeno tipo VI também está preservado, pois também atua nas distrofias musculares26. Sabe-se que a SDS pode perturbar a ultraestrutura proteica e danificar o colágeno12; para o músculo esquelético fetal, foi importante utilizar uma baixa concentração de SDS (0,05%) para manter a imunorreatividade à laminina α2. No entanto, os resultados do western blot mostram que as amostras decelularizadas exibem mais bandas após a imunodetecção de lamininas e colágenos em comparação com o tecido nativo, indicando que alguma degradação proteica ocorreu como resultado do processo de decelularização27.
É importante ressaltar que os experimentos de recelularização demonstram que essas matrizes são arcabouços confiáveis que suportam consistentemente a adesão, proliferação e diferenciação celular. A SDS tem sido relatada como citotóxica28 e, portanto, as etapas de lavagem incluídas no protocolo são cruciais para que as matrizes sejam usadas para recelularização. Esses scaffolds foram efetivamente colonizados por células C2C12, indicando sua adequação como sistema modelo para cultivo 3D de células. A observação da coloração intracelular e pericelular para proteínas da MEC ao redor das células C2C12 sugere ainda que as células estão contribuindo ativamente para seu microambiente dentro das dECMs. Além disso, quando colocadas em meio de diferenciação, as células C2C12 diferenciaram, fundiram-se e formaram miotubos dentro das dECMs.
Um desafio significativo neste procedimento é a manipulação das amostras ao longo do protocolo. As amostras são muito pequenas e macias, exigindo cuidado e habilidade no manuseio para evitar aprisionamento na pipeta de ponta fina e perda das amostras. Os melhores resultados são obtidos quando se inicia o protocolo com tecido fresco. O uso de amostras congeladas e armazenadas pode impedir a remoção do conteúdo celular e levar ao aumento da degradação de proteínas, dificultando a detecção de proteínas e reduzindo a eficiência da decelularização.
Poucos estudos relatam a decelularização dos tecidos fetais 15,29,30,31. Especificamente, em relação à decelularização do músculo esquelético fetal, apenas um estudo prévio relatou a decelularização de amostras compostas de derme, tecido subcutâneo e panículo carnoso31. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que um protocolo de descelularização para músculo esquelético fetal isolado de camundongos é estabelecido. Esse protocolo pode servir de base para a criação de protocolos semelhantes para tecidos musculares fetais de outras espécies, como suínos ehumanos13.
O presente protocolo de descelularização do músculo esquelético de camundongos E18.5 é muito semelhante ao procedimento de Silva et al.14, que o aplicaram em um coração de camundongo E18. A única diferença é a concentração de SDS utilizada, que é consideravelmente menor do que a utilizada para o coração fetal (0,05% vs. 0,2%), possivelmente devido às diferentes propriedades físicas desses dois tecidos fetais.
O desenvolvimento deste modelo in vitro não só permite o estudo dos processos envolvidos no desenvolvimento normal da musculatura fetal, como também possibilita a investigação paralela de miofias e miopatias musculares de início precoce, como a LAMA2-CMD, que se manifesta como um defeito de miogênese em E18.5 no modelo de camundongos dy W10. No entanto, deve-se notar que esse sistema é limitado, pois inclui apenas a MEC e as células musculares e não contém outros tipos celulares, como neurônios, células endoteliais e fibroblastos. A relevância desses tipos celulares adicionais pode variar dependendo da doença, e modificações no sistema de cultura podem ser necessárias para incluí-los. De modo geral, o uso de dECMs como descrito neste estudo pode ser aplicado no estudo de várias distrofias musculares e miopatias de início precoce.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contrato nº 23049), pelo projeto MATRIHEALTH e pela unidade cE3c UIDB/00329/2020. Agradecemos ao nosso doador Henrique Meirelles que optou por apoiar o Projeto MATRIHEALTH. Este trabalho beneficiou das infraestruturas do Centro de Microscopia da Faculdade de Ciências, um nó da Plataforma Portuguesa de BioImagem (referência PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e agradecemos a Luís Marques pela sua assistência na aquisição e processamento de imagens. Finalmente, agradecemos a Marta Palma pelo apoio técnico e à nossa equipa de investigação pelas generosas contribuições.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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