Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

Summary

Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.

Abstract

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural para as células e na transmissão de sinais que são importantes para vários processos celulares. Modelos bidimensionais (2D) de cultura de células simplificam demais as complexas interações entre células e a MEC, pois a falta de um suporte tridimensional completo (3D) pode alterar o comportamento celular, tornando-as inadequadas para a compreensão de processos in vivo . Deficiências na composição da MEC e nas interações célula-MEC são importantes contribuintes para uma variedade de diferentes doenças.

Um exemplo é a distrofia muscular congênita LAMA2 (LAMA2-CMD), onde a ausência ou redução funcional das lamininas 211 e 221 pode levar a hipotonia grave, detectável no nascimento ou logo após o nascimento. Trabalhos anteriores usando um modelo murino da doença sugerem que seu início ocorre durante a miogênese fetal. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo 3D in vitro que permita o estudo das interações entre as células musculares e a MEC muscular fetal, mimetizando o microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos das costas dissecados de fetos de camundongos E18.5, tratados com tampão hipotônico, detergente aniônico e DNase. As matrizes decelularizadas resultantes (dECMs) retiveram todas as proteínas da MEC testadas (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV) em comparação com o tecido nativo.

Quando os mioblastos C2C12 foram semeados sobre essas dECMs, eles penetraram e colonizaram as dECMs, o que apoiou sua proliferação e diferenciação. Além disso, as células C2C12 produziram proteínas da MEC, contribuindo para o remodelamento de seu nicho dentro das dECMs. O estabelecimento desta plataforma in vitro fornece uma nova abordagem promissora para desvendar os processos envolvidos no aparecimento da LAMA2-CMD, e tem o potencial de ser adaptada a outras doenças musculares esqueléticas onde deficiências na comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas contribuem para a progressão da doença.

Introduction

A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos¹. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente ....

Protocol

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pela Comissão de Bem-Estar Animal (ORBEA) da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e pela Direção-Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), e estão em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE.

1. Preparação de tampões e reagentes de decelularização

NOTA: Todas as soluções utilizadas durante o protocolo de descelularização devem ser esterilizadas por autoclavagem e armazenadas por até 3 meses, salvo indicação em contrário.

1. Preparar solução salina tamponada com fosfato 10x (10x PBS) adicionando cloreto de sódio (N....

Results

O objetivo do protocolo de decelularização é produzir dECMs que se assemelhe à composição do tecido nativo. Para determinar a eficácia do processo de decelularização, vários métodos foram empregados, incluindo exame da morfologia tecidual, medição dos níveis de DNA, coloração para F-actina e análise dos principais componentes da MEC usando técnicas de imunohistoquímica e western blotting. Especificamente, cinco componentes principais da MEC do tecido muscular esquelético foram analisados.

Ao l.......

Discussion

A MEC é uma rede complexa de macromoléculas que está presente em todos os tecidos e desempenha um papel crucial na regulação do comportamento e função celular². A MEC atua como um arcabouço físico para as células se ligarem e fornece pistas que modulam ativamente os processos celulares, como proliferação, motilidade, diferenciação e apoptose. Assim, a formação e manutenção adequadas da MEC são essenciais tanto para o desenvolvimento quanto para a homeostase¹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de Cultura de Células de 12 Poços, Plana, TC, Abdos Estéril	Labware	P21021
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato	Merck	D8417
4– Placa de Cultura de Células de 48 Poços de Gel Pré-moldado Mini-PROTEAN TGX	Bio-Rad	4561093
Plana, TC, Material de	Laboratório Abdos	P21023
Placa de Cultura de Células de 96 Poços, Plana, TC, Material de Laboratório	Abdos	P21024
Albumina de Soro Bovino, Fração V	NZYtech	MB04601
BX60	Olympus
Criostato CM1860 UV	Leica
Ditiotreitol	ThermoFisher	R0862
DMEM glicose alta com glutamina estável com piruvato de sódio	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy Blood & Kit de lenços	Qiagen	69506
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Merck	108418
Soro fetal bovino	Biowest	S1560-500
Pipeta de transferência de ponta fina	ThermoFisher	15387823
Soro de cabra	Biowest	S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet	Heraeus
Heracell 150 Incubadora de CO2	Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard	Invitrogen
Horse Serum, origem neozelandesa	Gibco	16050122
HRP-α- Rabbit IgG	abcam	ab205718
HRP-α- Rat IgG	abcam	ab205720
HRP-α- Mouse IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
Metil Verde	Sigma-Aldrich	67060
MM400 Tissue Lyser	Retsch
NanoDrop ND-1000 Espectrofotômetro	ThermoFisher
Paraformaldeído, 16% p/v aq. soln., sem metanol	Alfa Aesar	043368-9M
Penicilina-Estreptomicina (100x)	GRiSP	GTC05.0100
Faloidina Alexa 488	Thermo Fisher Sci.	A12379
Placa de Petri de Poliestireno 60x15mm com aberturas (estéril)	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS kit	Thermo Scientific	Q32851
Qubit™ 3 Fluorômetro	Invitrogen	15387293
S6E Zoom Microscópio Estéreo Leica
Dodecil Sulfato de Sódio	Merck	11667289001
SuperFrost® Lâminas de adesão Plus	Thermo Scientific	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Substrato Quimioluminescente	Thermo Scientific	15626144
TCS SPE microscópio confocal	Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (base Tris) ≥ 99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Solução Azul de Tripano, 0.4%	Gibco	15250061
Tripsina-EDTA (0.05%) em DPBS (1X)	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20 (Solução 50%)	ThermoFisher	3005
WesternBright PVDF-CL rolo de membrana (0.22µ m)	Advansta	L-08024-001
α-Colágeno I	abcam	ab21286
&alfa;-Colágeno IV	Millipore	AB756P
α-Colágeno IV	Santa Cruz Biotecnologia	sc-398655
&alfa;-Fibronectina	Sigma	F-3648
&alfa;-Laminina &alfa; 2	Sigma	L-0663
α-MHC	D.S.H.B.	MF20
α-Mouse Alexa 488	Sondas Moleculares	A11017
α-Mouse Alexa 568	Sondas Moleculares	A11019
α-pan-Laminina	Sigma	L- 9393
&alfa;-fosfo-histona 3	Merk Millipore	06-570
α-Rabbit Alexa 568	Sondas Moleculares	A21069
α-Rabbit Alexa 488	Sondas Moleculares	A11070
α-Rato Alexa 488	Sondas Moleculares	A11006