I dette arbejde blev en decellulariseringsprotokol optimeret til at opnå decellulariserede matricer af føtal museskeletmuskulatur. C2C12 myoblaster kan kolonisere disse matricer, sprede sig og differentiere. Denne in vitro-model kan bruges til at studere celleadfærd i forbindelse med skeletmuskelsygdomme såsom muskeldystrofier.
Den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til celler og formidle signaler, der er vigtige for forskellige cellulære processer. Todimensionelle (2D) cellekulturmodeller oversimplificerer de komplekse interaktioner mellem celler og ECM, da manglen på en komplet tredimensionel (3D) støtte kan ændre celleadfærd, hvilket gør dem utilstrækkelige til forståelse in vivo-processer . Mangler i ECM-sammensætning og celle-ECM-interaktioner er vigtige bidragydere til en række forskellige sygdomme.
Et eksempel er LAMA2-medfødt muskeldystrofi (LAMA2-CMD), hvor fravær eller reduktion af funktionel laminin 211 og 221 kan føre til alvorlig hypotoni, påviselig ved eller kort efter fødslen. Tidligere arbejde ved hjælp af en musemodel af sygdommen tyder på, at dens begyndelse forekommer under føtal myogenese. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D in vitro-model , der gjorde det muligt at studere interaktionerne mellem muskelceller og føtal muskel-ECM, der efterligner det oprindelige mikromiljø. Denne protokol bruger dybe rygmuskler dissekeret fra E18.5 musefostre, behandlet med en hypotonisk buffer, et anionisk rengøringsmiddel og DNase. De resulterende decellulariserede matricer (dECM’er) bevarede alle testede ECM-proteiner (laminin α2, samlede lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV) sammenlignet med det oprindelige væv.
Når C2C12 myoblaster blev podet oven på disse dECM’er, trængte de ind og koloniserede dECM’erne, hvilket understøttede deres spredning og differentiering. Desuden producerede C2C12-cellerne ECM-proteiner, hvilket bidrog til ombygningen af deres niche inden for dECM’erne. Etableringen af denne in vitro-platform giver en ny lovende tilgang til at optrævle de processer, der er involveret i begyndelsen af LAMA2-CMD, og har potentiale til at blive tilpasset andre skeletmuskelsygdomme, hvor mangler i kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller bidrager til sygdomsprogression.
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en vigtig bestanddel af væv, der repræsenterer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensionelle (3D) struktur giver ikke kun fysisk støtte til celler, men spiller også en afgørende rolle i de biokemiske processer, der er involveret i udviklingen af organismer1. Dannelsen af en vævsspecifik ECM forekommer under udvikling som et resultat af de komplekse interaktioner mellem celler og deres nicher, påvirket af forskellige intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en meget dynamisk struktur, der gennemgår kemiske og mekaniske omlejringer på en tidsmæssig-rumlig måde og direkte påvirker celleskæbne2. Et af de mest bemærkelsesværdige kendetegn ved ECM er dets funktionelle mangfoldighed, da hver vævs-ECM viser en unik kombination af molekyler, der giver forskellige topologier og egenskaber, der er skræddersyet til de celler, den indeholder1.
ECM-signalering og støtte er afgørende for udvikling og homeostase, og når de forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstande 3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfuld medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den mest almindelige form for medfødt muskelsvind. LAMA2-genet koder for laminin α2-kæden, som er til stede i laminin 211 og laminin 221, og når det muteres, kan det føre til LAMA2-CMD5. Laminin 211 er den vigtigste isoform, der findes i kældermembranen, der omgiver skeletmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, forstyrres forbindelsen mellem kældermembranen og muskelcellerne, hvilket fører til sygdommens begyndelse6. Patienter med LAMA2-CMD viser en mild til svær fænotype afhængigt af typen af mutation i LAMA2-genet.
Når funktionen af laminin α2-proteinet påvirkes, kan patienterne opleve alvorlig muskelhypotoni ved fødslen og udvikle kronisk inflammation, fibrose og muskelatrofi, hvilket fører til en reduceret forventet levetid. Til dato er der ikke udviklet målrettede behandlinger, og terapeutiske tilgange er begrænset til at lindre symptomerne på sygdommen7. Derfor er forståelse af de underliggende molekylære mekanismer, der er involveret i begyndelsen af denne sygdom, afgørende for at udvikle passende terapeutiske strategier 6,8. Tidligere arbejde ved hjælp af dyW-musen 9, en model for LAMA2-CMD, tyder på, at sygdommens begyndelse starter i utero, specifikt under føtal myogenese10. En bedre forståelse af, hvordan fostrets myogenesedefekt opstår, ville være en spilskifter i generering af nye terapeutiske tilgange til LAMA2-CMD.
In vitro-systemer giver et kontrolleret miljø til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten af indfødte væv. Decellularisering af væv producerer vævs- og udviklingsfasespecifikke acellulære ECM-stilladser, der mere præcist efterligner det naturlige cellemikromiljø sammenlignet med 2D-modeller og konstruerede / syntetiske stilladser. Decellulariserede matricer (dECM’er) har potentialet til at bevare værtsvævets molekylære og mekaniske signaler, hvilket gør dem til bedre alternative modeller til forståelse af in vivo-processer 11.
Der er forskellige teknikker, reagenser og betingelser, der kan bruges til decellularisering12,13. I denne undersøgelse er en decellulariseringsprotokol for føtal musehjerte, beskrevet af Silva et al.14,15, tilpasset føtal museskeletmuskulatur og fundet at bevare alle testede ECM-komponenter (laminin α2, total lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV). Protokollen omfatter tre trin: cellelyse ved osmotisk shock (hypotonisk buffer), plasmamembranopløsning og proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) og enzymatisk ødelæggelse af DNA (DNase-behandling). Så vidt vi ved, er dette den første etablerede protokol til decellularisering af museføtal skeletmuskulatur.
For at bruge dette 3D in vitro-system til undersøgelse af LAMA2-CMD er det afgørende at opretholde laminin α2-kæden efter decellularisering. Derfor blev der implementeret en optimeringsprotokol, hvor forskellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) blev testet (data ikke vist). Det optimale valg til cellefjernelse og konservering af laminin α2-proteinet viste sig at være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletableret myoblastcellelinje16,17, blev brugt til at frø dECM’erne. Disse celler invaderer dECM, formerer sig og differentierer sig inde i disse stilladser og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produktion af denne 3D in vitro-model tilbyder en ny tilgang til forståelse af de molekylære og cellulære processer, der er involveret i føtal myogenese, begyndelsen af LAMA2-CMD, og kan udvides til andre muskelsygdomme, hvor kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller forstyrres.
ECM er et komplekst netværk af makromolekyler, der er til stede i alle væv og spiller en afgørende rolle i reguleringen af celleadfærd og funktion2. ECM fungerer som et fysisk stillads, som celler kan fastgøres til og giver signaler, der aktivt modulerer cellulære processer såsom spredning, motilitet, differentiering og apoptose. Således er korrekt dannelse og vedligeholdelse af ECM afgørende for både udvikling og homeostase1.
Mens 2D-c…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr. 23049), MATRIHEALTH-projektet og cE3c-enhedsfinansiering UIDB/00329/2020. Vi vil gerne takke vores donor Henrique Meirelles, der valgte at støtte MATRIHEALTH-projektet. Dette arbejde nød godt af infrastrukturerne i Det Naturvidenskabelige Fakultets mikroskopifacilitet, en knude i den portugisiske platform for bioimaging (reference PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), og vi takker Luís Marques for hans hjælp med billedoptagelse og -behandling. Endelig takker vi Marta Palma for teknisk support og vores forskerteam for deres generøse bidrag.
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
ImageJ v. 1.53t | |||
Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |