Summary
I dette arbejde blev en decellulariseringsprotokol optimeret til at opnå decellulariserede matricer af føtal museskeletmuskulatur. C2C12 myoblaster kan kolonisere disse matricer, sprede sig og differentiere. Denne in vitro-model kan bruges til at studere celleadfærd i forbindelse med skeletmuskelsygdomme såsom muskeldystrofier.
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til celler og formidle signaler, der er vigtige for forskellige cellulære processer. Todimensionelle (2D) cellekulturmodeller oversimplificerer de komplekse interaktioner mellem celler og ECM, da manglen på en komplet tredimensionel (3D) støtte kan ændre celleadfærd, hvilket gør dem utilstrækkelige til forståelse in vivo-processer . Mangler i ECM-sammensætning og celle-ECM-interaktioner er vigtige bidragydere til en række forskellige sygdomme.
Et eksempel er LAMA2-medfødt muskeldystrofi (LAMA2-CMD), hvor fravær eller reduktion af funktionel laminin 211 og 221 kan føre til alvorlig hypotoni, påviselig ved eller kort efter fødslen. Tidligere arbejde ved hjælp af en musemodel af sygdommen tyder på, at dens begyndelse forekommer under føtal myogenese. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D in vitro-model , der gjorde det muligt at studere interaktionerne mellem muskelceller og føtal muskel-ECM, der efterligner det oprindelige mikromiljø. Denne protokol bruger dybe rygmuskler dissekeret fra E18.5 musefostre, behandlet med en hypotonisk buffer, et anionisk rengøringsmiddel og DNase. De resulterende decellulariserede matricer (dECM'er) bevarede alle testede ECM-proteiner (laminin α2, samlede lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV) sammenlignet med det oprindelige væv.
Når C2C12 myoblaster blev podet oven på disse dECM'er, trængte de ind og koloniserede dECM'erne, hvilket understøttede deres spredning og differentiering. Desuden producerede C2C12-cellerne ECM-proteiner, hvilket bidrog til ombygningen af deres niche inden for dECM'erne. Etableringen af denne in vitro-platform giver en ny lovende tilgang til at optrævle de processer, der er involveret i begyndelsen af LAMA2-CMD, og har potentiale til at blive tilpasset andre skeletmuskelsygdomme, hvor mangler i kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller bidrager til sygdomsprogression.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en vigtig bestanddel af væv, der repræsenterer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensionelle (3D) struktur giver ikke kun fysisk støtte til celler, men spiller også en afgørende rolle i de biokemiske processer, der er involveret i udviklingen af organismer1. Dannelsen af en vævsspecifik ECM forekommer under udvikling som et resultat af de komplekse interaktioner mellem celler og deres nicher, påvirket af forskellige intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en meget dynamisk struktur, der gennemgår kemiske og mekaniske omlejringer på en tidsmæssig-rumlig måde og direkte påvirker celleskæbne2. Et af de mest bemærkelsesværdige kendetegn ved ECM er dets funktionelle mangfoldighed, da hver vævs-ECM viser en unik kombination af molekyler, der giver forskellige topologier og egenskaber, der er skræddersyet til de celler, den indeholder1.
ECM-signalering og støtte er afgørende for udvikling og homeostase, og når de forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstande 3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfuld medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den mest almindelige form for medfødt muskelsvind. LAMA2-genet koder for laminin α2-kæden, som er til stede i laminin 211 og laminin 221, og når det muteres, kan det føre til LAMA2-CMD5. Laminin 211 er den vigtigste isoform, der findes i kældermembranen, der omgiver skeletmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, forstyrres forbindelsen mellem kældermembranen og muskelcellerne, hvilket fører til sygdommens begyndelse6. Patienter med LAMA2-CMD viser en mild til svær fænotype afhængigt af typen af mutation i LAMA2-genet.
Når funktionen af laminin α2-proteinet påvirkes, kan patienterne opleve alvorlig muskelhypotoni ved fødslen og udvikle kronisk inflammation, fibrose og muskelatrofi, hvilket fører til en reduceret forventet levetid. Til dato er der ikke udviklet målrettede behandlinger, og terapeutiske tilgange er begrænset til at lindre symptomerne på sygdommen7. Derfor er forståelse af de underliggende molekylære mekanismer, der er involveret i begyndelsen af denne sygdom, afgørende for at udvikle passende terapeutiske strategier 6,8. Tidligere arbejde ved hjælp af dyW-musen 9, en model for LAMA2-CMD, tyder på, at sygdommens begyndelse starter i utero, specifikt under føtal myogenese10. En bedre forståelse af, hvordan fostrets myogenesedefekt opstår, ville være en spilskifter i generering af nye terapeutiske tilgange til LAMA2-CMD.
In vitro-systemer giver et kontrolleret miljø til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten af indfødte væv. Decellularisering af væv producerer vævs- og udviklingsfasespecifikke acellulære ECM-stilladser, der mere præcist efterligner det naturlige cellemikromiljø sammenlignet med 2D-modeller og konstruerede / syntetiske stilladser. Decellulariserede matricer (dECM'er) har potentialet til at bevare værtsvævets molekylære og mekaniske signaler, hvilket gør dem til bedre alternative modeller til forståelse af in vivo-processer 11.
Der er forskellige teknikker, reagenser og betingelser, der kan bruges til decellularisering12,13. I denne undersøgelse er en decellulariseringsprotokol for føtal musehjerte, beskrevet af Silva et al.14,15, tilpasset føtal museskeletmuskulatur og fundet at bevare alle testede ECM-komponenter (laminin α2, total lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV). Protokollen omfatter tre trin: cellelyse ved osmotisk shock (hypotonisk buffer), plasmamembranopløsning og proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) og enzymatisk ødelæggelse af DNA (DNase-behandling). Så vidt vi ved, er dette den første etablerede protokol til decellularisering af museføtal skeletmuskulatur.
For at bruge dette 3D in vitro-system til undersøgelse af LAMA2-CMD er det afgørende at opretholde laminin α2-kæden efter decellularisering. Derfor blev der implementeret en optimeringsprotokol, hvor forskellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) blev testet (data ikke vist). Det optimale valg til cellefjernelse og konservering af laminin α2-proteinet viste sig at være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletableret myoblastcellelinje16,17, blev brugt til at frø dECM'erne. Disse celler invaderer dECM, formerer sig og differentierer sig inde i disse stilladser og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produktion af denne 3D in vitro-model tilbyder en ny tilgang til forståelse af de molekylære og cellulære processer, der er involveret i føtal myogenese, begyndelsen af LAMA2-CMD, og kan udvides til andre muskelsygdomme, hvor kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller forstyrres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne metoder blev godkendt af dyrevelfærdsudvalget (ORBEA) ved Det Naturvidenskabelige Fakultet, Lissabon Universitet og Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) og er i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/EU.
1. Fremstilling af decellulariseringsbuffere og reagenser
BEMÆRK: Alle opløsninger, der anvendes under decellulariseringsprotokollen, skal steriliseres ved autoklavering og opbevares i op til 3 måneder, medmindre andet er angivet.
- Forbered 10x fosfatbufret saltvand (10x PBS) ved at tilsætte natriumchlorid (NaCl) ved 137 mM, kaliumchlorid (KCl) ved 2,68 mM, kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4) ved 8,1 mM og disodiumhydrogenphosphatdihydrat (Na2HPO4) ved 1,47 mM til demineraliseret vand (dH2O) og juster pH til 6,8. Tilsæt 100 ml 10x PBS til 900 ml demineraliseret H2O for at generere 1x PBS. Autoklave og opbevares ved stuetemperatur (RT). Tilsæt steril penicillin/streptomycin stamopløsning (10.000 E/ml penicillin og 10 mg/ml streptomycin [pen/strep]) til en slutkoncentration på 1% før brug.
- Forbered den hypotoniske buffer ved at opløse 1,21 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris base) og 1 g ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 1 liter dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Brug en magnetisk omrører, indtil den er opløst, og juster pH-værdien til 7,8 med NaOH/HCI. Steriliser ved autoklavering og opbevar ved RT. Tilsæt pen/strep til en slutkoncentration på 1% før brug.
- Forbered den hypotoniske vaskebuffer ved at opløse 1,21 g Tris-base i 1 literdH2O-(10 mM Tris-base). Brug en magnetisk omrører, indtil den er opløst, og juster pH-værdien til 7,8 med NaOH / HCI. Autoklave og opbevares på RT. Tilsæt pen / strep til 1% før brug.
- Forbered behandlingen af det anioniske vaskemiddel ved at tilsætte 0,05 g natriumdodecylsulfat (SDS) til 100 ml hypotonisk vaskebuffer for at fremstille en 0,05% SDS-behandlingsopløsning. Filtrer gennem et 0,22 μm membranfilter. Opbevares på RT i op til 1 måned.
BEMÆRK: SDS-opløsningen bør ikke autoklaveres, da SDS udfældes og nedbrydes ved autoklavering. - Forbered DNase-behandlingsopløsningen ved at opløse 1,21 g Tris-base i 0,5 mldH2O, og tilsæt 1 ml 1 M magnesiumchlorid (MgCl2). Juster pH-værdien til 7,8 med NaOH/HCl. Autoklave og opbevar ved RT. Tilføj DNase I før brug (50 E/ml).
2. Indsamling af prøver
BEMÆRK: Wild-type C57 / BL6 mus blev brugt i undersøgelsen. Alle teknikker blev udført i en laminar strømningshætte under sterile forhold.
- Aflive voksne drægtige hunmus på fosterdagen (E) 18,5 af graviditeten ved hjælp af isofluraninhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Udsæt musene for terminal dissektion for at udtrække fostrene.
- Sprøjt musens underliv med 70% ethanol.
- Brug kirurgisk tang og saks til at løfte en hudfold i underlivet og lav et U-formet snit for at udsætte bughulen18.
- Saml livmoderhornene, der indeholder E18.5-fostrene, ved at skære ovidukterne og livmoderhalsen og straks overføre dem til en petriskål med iskold 1x PBS med 1% pen / strep18.
- Fjern hurtigt fostrene fra livmoderen og ekstraembryonale væv og aflive dem ved halshugning ved hjælp af saks18.
- Overfør et foster ad gangen til en petriskål med iskold 1x PBS. Brug et stereomikroskop til at fjerne huden og afskære lemmerne. Fra den ventrale side skæres gennem brystkassen og fjerner brystbenet og de underliggende organer.
- Vend fosterstammen dorsal side opad. Fjern den cervikale del af rygsøjlen, de dorsale fedtdepoter og bindevævet oven på de dybe rygmuskler.
- Brug kirurgiske tang til at forankre brystkassen og forsigtigt skrabe og løsne de dybe rygmuskler fra det omgivende væv ved hjælp af en mikroskalpel10. Denne procedure resulterer i isolering af to muskelstykker pr. foster (venstre og højre), begge primært sammensat af longissimus og iliocostalis muskler, med nogle af transversospinalis og levator costarum muskler inkluderet.
- Opbevar muskelprøverne i 1x PBS med 1% pen/strep ved 4 °C til kortvarig opbevaring (<1 uge) eller ved -80 °C i længere perioder.
BEMÆRK: Brug friskindsamlede prøver for de bedste resultater. Prøver frosset i længere perioder (>3 måneder) viser lavere decellulariseringseffektivitet og mere proteinnedbrydning. Epaxiale muskelmasser blev brugt til decellulariseringseksperimenterne, men andre muskler (f.eks. Lemmermuskler) kan behandles til decellularisering ved hjælp af den samme protokol.
3. Decellularisering af føtal skeletmuskulatur
BEMÆRK: Alle teknikker blev udført i en laminar flowhætte under sterile forhold. For en detaljeret skematisk gengivelse, se figur 1A. Alle trin blev udført med omrøring i en orbitalryster med en diameter på 120 mm (165 omdr./min.) ved 25 °C, medmindre andet er angivet. Tilsæt 1% pen/strep til opløsningerne før brug. Når opløsningerne fjernes, aspireres forsigtigt for at undgå, at prøven indfanges i pipetten.
- Dag 1 - Forbered ca. 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) vævsfragmenter fra de epaxiale muskelmasser. Tilsæt 3 ml hypotonisk buffer med 1% pen / strep til hver brønd i en 12-brøndplade og tilsæt et helt muskelvævsfragment pr. Brønd.
- Vævsfragmenterne inkuberes i hypotonisk buffer med omrøring i 18 timer (natten over) (O/N).
- Dag 2 - Opsug den hypotoniske buffer med en pipette med fine spidser, og vask prøverne 3 x 1 time med 3 ml 1x PBS hver gang under omrøring.
- Inkuber prøverne i 24 timer med 3 ml 0,05% SDS vaskemiddelopløsning med omrøring.
BEMÆRK: (KONTROLPUNKT) Efter SDS-inkubation skal prøverne være gennemsigtige. Prøverne viser en gelatinelignende konsistens og er derfor mere tilbøjelige til at klæbe til pipetten, når væskerne fjernes.
- Inkuber prøverne i 24 timer med 3 ml 0,05% SDS vaskemiddelopløsning med omrøring.
- Dag 3 - Fjern SDS-vaskemiddelopløsningen med en finspidspipette, og vask vævsfragmenterne 3 x 20 min med 3 ml hypotonisk vaskebuffer hver gang under omrystning.
BEMÆRK: (PAUSEPUNKT) Prøverne kan opbevares i hypotonisk vaskebuffer ved 4 °C i 18 timer (O/N). Sørg for, at SDS fjernes godt under vasketrin, da resterende SDS kan være cytotoksisk.- Vævsfragmenterne inkuberes i 3 timer med 2 ml DNaseopløsning med omrøring ved 37 °C.
- DNase-opløsningen fjernes med en finspidspipette, og vævsfragmenterne vaskes 3 x 20 minutter med 3 ml 1x PBS hver gang under omrystning. Vask til sidst O/N med omrøring (60 omdr./min.).
BEMÆRK: Efter DNase-behandlingen bliver dECM'erne klæbrige på grund af tilstedeværelsen af DNA-rester. Derfor er omhyggelig vask nødvendig. - Opbevar dECM'erne i 1x PBS med 1% pen/strep ved 4 °C indtil recellularisering (<1 uge). Til anden anvendelse opbevares ved -80 °C.
4. Vurdering af decellulariseringskvalitet
BEMÆRK: DNA-kvantificering, GAPI / methylgrøn farvning og phalloidinfarvning blev udført for at evaluere tilstedeværelsen af resterende celleindhold efter decellularisering. Immunohistokemi og western blot-analyser blev udført for at vurdere tilbageholdelsen af vigtige ECM-proteiner efter decellularisering.
- Kvantificering af det DNA, der er til stede i dECM
BEMÆRK: dECM'erne skal sammenlignes med det oprindelige væv for at detektere tilstedeværelsen af DNA.- Før decellularisering vejes et 1,5 ml mikrocentrifugerør på en digital vægt med høj præcision. Før muskelprøven overføres til røret, skal du fjerne alle de resterende 1x PBS ved hjælp af et køkkenrulle. Røret vejes med prøven. Prøvernes vådvægt beregnes ved hjælp af ligning (1):
Prøvevådvægt =vægtrør med prøver- vægttom slange (1) - Prøverne decellulariseres efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 3.
- Prøverne anbringes i 2 ml mikrocentrifugeglas.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -20 °C indtil DNA-ekstraktion og kvantificering. - Udfør DNA-ekstraktion af dECM'erne og indfødte vævsprøver ved hjælp af et spin-kolonnebaseret kit. Tilsæt fordøjelsesbufferen i henhold til producentens anvisninger.
- Homogeniser prøverne i en perlemølle to gange i 2,5 min hver gang (vend monteringerne) ved hjælp af en wolframcarbidperle pr. rør (brug kølede rørbeslag).
- Der tilsættes proteinase K og inkuberes O/N under langsom omrøring ved 56 °C.
- Fortsæt med protokollen som beskrevet i producentens anvisninger.
- Eluer med bufferen leveret af producenten og centrifuger 2 x 1 min ved ≥6.000 x g, hver gang ved 4 °C for at øge DNA-udbyttet.
BEMÆRK: DNA kan opbevares ved -20 °C indtil kvantificering. - Kvantificer det DNA, der er til stede i prøverne, ved hjælp af et fluorescerende dsDNA-detektionssæt efter producentens anvisninger.
- Normaliser DNA-indholdet som nanogram DNA pr. milligram af den oprindelige vådvægt af prøven.
- Analyser dataene ved hjælp af en tosidet studerendes t-test og udtryk som middelværdien ± standardfejlen for middelværdien (SEM).
- Før decellularisering vejes et 1,5 ml mikrocentrifugerør på en digital vægt med høj præcision. Før muskelprøven overføres til røret, skal du fjerne alle de resterende 1x PBS ved hjælp af et køkkenrulle. Røret vejes med prøven. Prøvernes vådvægt beregnes ved hjælp af ligning (1):
- Immunhistokemi
BEMÆRK: Opløsning 1, 2 og 3 og fikseringsopløsningen skal tilberedes før brug og kan opbevares frosne i op til 6 måneder. Alle anvendte antistoffer og farvestoffer og respektive fortyndinger er anført i Tabel 1.- Fremstilling af opløsninger
- Der fremstilles fikseringsopløsning ved tilsætning af 2 g paraformaldehyd (PFA), 8 g saccharose og 24 μL 1 MCaCl2 til 77 ml 0,2 M Na2HPO 4 og 23 ml 0,2 M NaH2PO4 til et slutvolumen på 200 ml ved tilsætning afdH2O. pHjusteres til7,4.
- Der fremstilles 0,12 M fosfatbuffer ved tilsætning af 13,5 gNa2HPO 4 og 3,2 gNaH2PO4 til 1 liter dH2O. pH justeres til7,4.
- Opløsning 1 fremstilles ved tilsætning af 4 g saccharose til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer.
- Opløsning 2 fremstilles ved tilsætning af 15 g saccharose til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer.
- Opløsning 3 fremstilles ved tilsætning af 15 g saccharose og 7,5 g gelatine til 100 ml 0,12 M fosfatbuffer. Der opvarmes ved 37 °C, indtil gelatinen er opløst.
- Der fremstilles en opløsning af methylgrønt stampulver (2 % methylgrønt pulver opløst idH2O)19.
- Immundetektion
- Prøverne fastgøres med fikseringsopløsningen i mindst 4 timer ved 4 °C.
- Prøverne vaskes 2x i 10 min med 1x PBS.
- Opbevar O/N, eller mere end 1 dag, i opløsning 1 ved 4 °C.
- O/N eller over 1 dag vaskes og opbevares i opløsning 2 ved 4 °C. Lad prøverne varme op til RT.
- Der inkuberes i 3 timer i opløsning 3 ved 37 °C. Opbevar ekstra opløsning 3 ved 37 °C til senere brug.
- Form små (2 cm x 1 cm x 1 cm) beholdere i aluminiumsfolie. Læg et tyndt lag opløsning 3 i den støbte beholder og lad den sætte sig. Prøverne anbringes på den størknede opløsning 3 og dækkes med varm opløsning 3. Orienter prøverne og lad dem størkne. Marker placeringen på den størknede opløsning 3 med en farvepen.
- Beholderne fryses ved at anbringe beholderne på overfladen af tøriskølet eller flydende nitrogenkølet isopentan.
- Brug optimal skæretemperatur (O.C.T.) til at fastgøre de frosne gelatinerninger, der indeholder prøverne, til kryostatholderen.
- Skær de frosne gelatinerninger og overfør vævssektionerne til diasene. Lad dem tørre i 60 min.
- Brug en hydrofob markør til at spore en linje rundt om sektionerne.
- Vask rutsjebanerne 3 x 10 min i 1x PBS.
- Dæk sektionerne med 1% bovin serumalbumin (BSA), 1% gedeseserum og 0,05% Triton X-100 fortyndet i 1x PBS (blokeringsopløsning) i 30 minutter (blokeringstrin).
- Fortynd de primære antistoffer i blokeringsopløsning og dæk sektionerne. Der inkuberes O/N ved 4 °C i en lukket kasse med fugtigt papir for at forhindre, at sektionerne tørrer.
- Vask rutsjebanerne 3 x 10 min med 1x PBS.
- Fortynd de sekundære antistoffer i blokerende opløsning og dæk sektionerne. Inkuber i 1,5 time ved RT i mørke.
BEMÆRK: Undgå lyseksponering for at forhindre nedbrydning af fluorofor. - Vask rutsjebanerne 3 x 10 min med 4x PBS.
BEMÆRK: Højere koncentration af PBS kan anvendes, når en stærk baggrund er til stede. - Nedsænk diasene i DAPI-opløsning (5 μg/ml 1,4-diazabicyclo-2,2,2-oktan i 0,1% Triton X-100/1x PBS) i 30 s hver.
- Skyl i 1x PBS.
- Monter sektionerne i antifalmende medium (50 mg/ml n-propylgallat i 1x PBS:glycerol [1:9]) og forsegl med en dækseddel. Opbevares ved 4 °C indtil observation og billedoptagelse i et fluorescensmikroskop20.
BEMÆRK: Til in toto-immunhistokemiske eksperimenter blev den samme protokol (se trin 4.2.2.12-4.2.2.18) anvendt, bortset fra at prøverne tidligere var fikseret i 4% PFA fortyndet i 1x PBS i 3 timer ved RT. DNA-farvning blev udført ved tilsætning af methylgrønt til den sekundære antistofopløsning. Alle anvendte antistoffer og farvestoffer og deres respektive fortyndinger er anført i tabel 1. Prøverne blev derefter monteret i antifalmende medium mellem to dæksedler adskilt af stålringe, limet sammen med bivoks, og 100 μm billedstabler blev erhvervet ved hjælp af et konfokalmikroskop21.
- Fremstilling af opløsninger
- Western blot-analyse
BEMÆRK: Alle anvendte antistoffer og respektive fortyndinger er anført i Tabel 1.- Fremstilling af opløsninger
- Forbered 2x SDS-PAGE-belastningsbufferen ved at tilsætte 20 ml glycerol, 4 g SDS og 0,2 ml bromphenolblåt til 80 ml 100 mM Tris-baseopløsning. Juster pH-værdien til 6,8. Tilsæt frisk dithiothreitol (DTT) før brug.
- Forbered Tris bufferet saltvandsvaskebuffer med Tween 20 (TBST) opløsning ved at tilsætte 2,4 g Tris-base, 8,8 g NaCl og 1 ml Tween-20 til dH2O til et slutvolumen på 1 L. Juster pH til 7,4-7,6 ved hjælp af HCI.
- Forbered 10x løbende buffer (RB) ved at tilsætte 30,2 g Tris-base, 144,2 g glycin og 10 g SDS til 1 literdH2O. Før brug tilsættes 100 ml 10x RB til 900 ml dH2O for at forberede 1x RB (arbejdsløsning).
BEMÆRK: Mens 10x RB kan gemmes på RT i flere måneder, kan 1x RB genbruges på forskellige kørsler. - Forbered overførselsbufferen (TB) ved at tilsætte 5,82 g Tris-base, 2,93 g glycin og 0,5 g SDS til 800 mldH2O. Når komponenterne er opløst, tilsættes 200 ml methanol. Afkøles ved 4 °C.
BEMÆRK: TB'en skal tilberedes frisk før hver brug.
- Proteinekstraktion
- Opsaml epaxiale muskler fra E18,5-mus, og placer dem straks i et mikrocentrifugerør (2 ml) indeholdende 2x SDS-PAGE-belastningsbuffer med frisk tilsat DTT (100 mM DTT). Behandl E18.5 dECM på samme måde.
- Tilføj en wolframcarbidperle pr. Rør. Homogeniser 2x i en perlefræser i 2,5 min hver gang (vend monteringerne).
- Sonikere prøverne i 5 minutter i et ultralydbad.
- Prøverne opvarmes i 10 minutter ved 50 °C.
- Prøverne centrifugeres ved 12.000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Kvantificer proteinet ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
- Opbevares ved -20 °C indtil videre brug.
- Polyacrylamid gel elektroforese
- Brug præfabrikeret acrylamidgradientgel (4% -20%)
- Monter gelen i elektroforesetanken. Fjern kammen forsigtigt. Tilføj 1x RB indtil linjen, der vises i elektroforesetanken. Sørg for, at brøndene er fyldt med RB.
- Der fyldes 100 μg protein pr. prøve i hullerne. Fyld 12 μL proteinstandard med høj molekylvægt.
- Kør i alt 100 min med konstant spænding (10 min ved 150 V og 90 min ved 185 V).
- Overførsel
- Blødgør filterpuder og svampe med afkølet TB (4 °C), mens gelen kører.
- Skær polyvinylidendifluoridmembranerne til gelens størrelse. Aktivér dem med methanol og vask med dH2O. Sug i TB.
- Monter overførselskassetten med svampe, filterpuder, geler og aktiverede membraner i henhold til producentens anvisninger.
- Anbring kassetten i elektroforesetanken, der indeholder den afkølede TB (på en seng af is). Tilføj køleenheden. Kør i 90 min ved 100 V.
- Efter overførslen skal du plette med en Coomassie-blå erstatning for at vurdere overførselskvaliteten.
- Immundetektion
- Forbered blokeringsopløsningen (TBST med 5% fedtfattig mælk). Inkuber membranerne med omrøring i 1 time ved RT.
- Skyl 3 x 5 s med TBST.
- Inkuber membranerne O/N med de primære antistoffer fortyndet i TBST med 2% BSA og 0,02% natriumazid (3 ml pr. membran) i et kølekammer (4 °C) med omrøring.
- Næste dag vaskes 3 x 5 min med TBST.
- Membranerne inkuberes med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i TBST med 5% fedtfattig mælk (5 ml for hver membran) i 1 time ved RT.
- Vask membranerne med TBST 3 x 5 min. Opbevar TBST indtil registreringstrinnet.
- Visualiser proteinet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt udviklingssæt. Tilføj detektionsreagenser i henhold til producentens anvisninger. Få billeder af båndene.
- For at teste mere end ét antistof pr. membran fjernes de tidligere antistoffer efter detektionstrinnet med tre vaske (5 min hver) ved hjælp af TBST, og trin 4.3.5.2-4.3.5.7 gentages.
- Fremstilling af opløsninger
Tabel 1: Antistoffer og farvestoffer anvendt i immunhistokemi og western blot-analyse og de respektive fortyndinger. Klik her for at downloade denne tabel.10,22
5. Cellekultur i decellulariserede matricer
BEMÆRK: Alle teknikkerne blev udført under sterile forhold i en laminar flowhætte. Alle inkubationer blev udført ved 37 °C og med 5 % CO2.
- Forbered cellekulturmediet, Dulbeccos modificerede ørnemedium med høj glukose med stabilt glutamin og med natriumpyruvat (DMEM), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% pen / strep (komplet dyrkningsmedium).
- Anbring dECM'erne i en petriskål i 1x PBS med 1% pen/strep i en laminar flowhætte og adskil dem i stykker på ca. 500 μm x 500 μm x 250 μm ved hjælp af en mikroskalpel og pincet.
BEMÆRK: dECM'er har en blød tekstur, og derfor er det ofte lettere at bruge pincet til at adskille dem i omtrent samme størrelse i stykker i stedet for at skære dem med mikroskalpellen. - Fragmenterne overføres til en plade med 96 brønde (tre eller fire stykker pr. hul) med 200 μL komplet dyrkningsmedium, der forinden er opvarmet til 37 °C. Inkuber i 2 timer i inkubatoren.
- Tilsæt 500 μL trypsin til en T25-kolbe podet med sub-sammenflydende (~ 70%) C2C12-celler. Resuspender i 1 ml komplet medium.
- Der tilsættes 10 μL af resuspensionen til 10 μL trypanblåt farvestof og lægges i et hæmocytometer. Tæl og beregn cellenummeret og bekræft cellelevedygtighed.
- Substratet suges ud af 96-brøndspladen, der indeholder dECM'erne, og der tilsættes 200 μL komplet dyrkningsmedium indeholdende 50.000 levedygtige C2C12-celler.
- Der inkuberes i 2 dage, og overfør derefter dECM'erne (med cellerne) til en 48-brønds plade med 400 μL komplet dyrkningsmedium ved hjælp af pincet. Hver 2. dag skal du forsigtigt aspirere mediet med en mikropipette for at forhindre, at dECM'erne løsner sig fra bunden af brønden og tilsæt frisk medium indtil dag 8.
BEMÆRK: Matricer opbevares i 2 dage i plader med 96 brønde for at fremme C2C12-celleadhæsion til dECM'erne og overføres derefter til en 48-brøndplade for at give adgang til et større volumen medium med næringsstoffer. dECM'er skal klæbe til bunden af brøndene. - Til differentieringsforsøget erstattes det komplette dyrkningsmedium med differentieringsmedium (DMEM suppleret med 2% hesteserum og 1% pen/strep) på dag 8, efterfulgt af inkubation i differentieringsmedium i 4 dage indtil dag 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med decellulariseringsprotokollen er at producere dECM'er, der ligner sammensætningen af naturligt væv. For at bestemme effektiviteten af decellulariseringsprocessen blev der anvendt forskellige metoder, herunder undersøgelse af vævsmorfologi, måling af DNA-niveauer, farvning for F-actin og analyse af centrale ECM-komponenter ved hjælp af immunhistokemi og western blotting-teknikker. Specifikt blev fem store ECM-komponenter i skeletmuskelvæv analyseret.
I hele protokollen ændres prøvernes udseende (figur 1B 1-4). Efter isolering forekommer muskelvævet rødligt på grund af tilstedeværelsen af myoglobin (figur 1B1). Efter inkubation i den hypotoniske buffer, som lyserer celler og fjerner de fleste cytoplasmatiske proteiner, bliver prøverne hvide (figur 1B2). SDS, et anionisk vaskemiddel, der almindeligvis anvendes til vævsdecellularisering12, fjerner effektivt cytoplasmatisk og nukleart materiale såvel som membraner. Som følge heraf bliver prøverne mere gennemsigtige efter SDS-behandling (figur 1B3). Imidlertid kan høje koncentrationer eller langvarig eksponering for dette vaskemiddel forårsage proteindenaturering, tab af glycosaminoglycaner og forstyrrelse af kollagenfibre12. Den optimale balance mellem cellefjernelse og bevarelse af ECM opnås ved hjælp af 0,05% SDS i 24 timer, som vist i figur 2 og figur 3. Endelig fjernes DNA gennem DNase-behandling, hvilket resulterer i gennemsigtige dECM-stilladser, der er lidt mindre end efter SDS-behandling (figur 1B4).
Succesen med decellulariseringsprotokollen er indikeret af mængden af resterende DNA, der er til stede i matricerne efter processen. DNA-kvantificering afslører et fald på næsten 100% i dECM'erne sammenlignet med det oprindelige væv (figur 1C). DAPI-farvning bekræfter også fraværet af DNA i dECM'erne (figur 2B, D, F, H, J).
Tilstedeværelsen af fem store ECM-proteiner blev evalueret ved immunhistokemi og ved western blot efter decellularisering og sammenlignet med det oprindelige væv. Immunfarvning for laminin α2-underenheden (figur 2A, B) og total lamininer (figur 2C, D) viser, at dECM'erne viser en rørformet farvning for disse proteiner (pile i figur 2B, D), svarende til lamininmatrixen, der omgiver myorør i det oprindelige væv (pile i figur 2A, C). Western blot-analyse for laminin α2-underenhed afslører tilstedeværelsen af to bånd i det oprindelige væv (figur 2A'), mens tre bånd med en mindre molekylvægt end forventet kan påvises i dECM (figur 2B'). Dette kan være resultatet af proteinnedbrydning eller fjernelse under decellulariseringsprocessen. Western blot-analyse for totale lamininer viser en vis fragmentering af disse proteiner i dECM sammenlignet med prøver fra det oprindelige væv (figur 2C',D').
Figur 1: Føtal skeletmuskulatur decellulariseringsprocedure og evaluering af vævsmorfologi og DNA-indhold. (A) Skematisk gengivelse af decellulariseringsprotokollen. (B) Vævsmorfologi i hele protokollen, fra frisk indsamlet til decellulariseret væv. Skalabjælke = 1 mm. (C) Kvantificering af DNA til stede i dECM'erne sammenlignet med det oprindelige væv. Data udtrykt som gennemsnit ± SEM. Elevens t-test, tosidet **p < 0,01. Decellulariseringsprotokollen fjerner effektivt nukleart indhold, der producerer acellulære dECM'er. Forkortelser: dECM'er = decellulariserede matricer; PBS = fosfatbufret saltvand SDS = natriumdodecylsulfat; NT = naturligt væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Immunfarvning for fibronectin (figur 2E, F) og kollagen I (figur 2G, H) viser tilstedeværelsen af disse proteiner i det interstitielle rum mellem celler i det oprindelige væv (pile i figur 2E, G) og en lignende farvning i dECM'erne (pile figur 2F, H). Western blot-analyse viser lignende bånd for fibronectin under begge betingelser (figur 2E', F'), hvilket indikerer, at dette protein ikke er særlig påvirket af decellulariseringsprocessen. I tilfælde af kollagen I (figur 2G',H') er der imidlertid færre bånd i dECM'erne, hvilket indikerer en vis grad af nedbrydning. Immunfarvning for kollagen IV viser et rørformet farvningsmønster i det oprindelige væv (pil i figur 2I) og en lignende farvning i dECM, selvom de rørformede strukturer er smallere (pil i figur 2J). Western blot-analyse for kollagen IV afslører tilstedeværelsen af tre bånd i det oprindelige væv (figur 2I'). Mens de samme tre bånd observeres i dECM'erne (figur 2J'), er molekylvægten af disse lavere end forventet. På samme måde som laminin α2 kan dette være resultatet af proteinnedbrydning eller fjernelse under decellulariseringen.
dECM'er podes derefter med C2C12 myoblaster og dyrkes i 8 dage i komplet dyrkningsmedium. C2C12-celler koloniserer dECM'erne og formerer sig, som vist ved phospho-histon 3 nuklear farvning (pile i figur 3A). Efter yderligere 4 dages kultur i differentieringsmedium differentierer C2C12-celler og smelter sammen til multinucleated (blå pile i figur 3B) myorør, der udtrykker en myosin tung kæde (stiplede linje i figur 3B). Interessant nok kan intracellulær og/eller pericellulær farvning for laminin α2-kæden (gule pile i figur 3C, D), samlede lamininer (magenta pil i figur 3C) og fibronectin (magenta pil i figur 3D) detekteres i C2C12 celler dyrket i komplet dyrkningsmedium, hvilket tyder på, at disse celler er i stand til at syntetisere disse ECM-proteiner de novo , og bidrager derfor til dannelsen af deres niche. Disse resultater viser, at decellulariseringsprotokollen genererer et dECM-mikromiljø, hvor C2C12-myoblaster kan proliferere, differentiere og danne multinucleated myorør.
Figur 2: Vurdering af fem ECM-proteiner i naturligt versus decellulariseret E18.5 føtalt muskelvæv. Immunhistokemi på sektioner af naturligt væv (A, C, E, G, I) og farvning af dECM'er (B, D, F, H, J) med DAPI, en DNA-markør, phalloidin, der detekterer F-actin, og for ECM-proteiner. Skalabjælke = 15 μm. I det oprindelige væv er immunfarvning for lamininer og kollagen IV til stede omkring myofibrene (A, C, I; gule pile) og farvning for fibronectin og kollagen I detekteres i det interstitielle rum mellem myofibre (E, G; gule pile). I dECM'erne viser farvning for lamininer og kollagen IV (B, D, J; gule pile) et rørformet mønster, der omgiver de rum, der er efterladt af myofibrene efter decellularisering. Fibronectin og kollagen I immunfarvning af dECM'er er i overensstemmelse med deres tilstedeværelse i det interstitielle rum (F, H; gule pile). (A'-J') Western blot-analyse for fem ECM-proteiner i naturligt væv (A',C',E',G',I') og i dECM-prøver (B',D',F',H',J'). Begge tilgange viser proteinkonservering efter decellularisering. De anvendte antistoffer og de respektive fortyndinger er anført i tabel 1. Forkortelser: LNα2 = laminin α2 kæde; LNp = pan-muskel lamininer; FN = fibronectin; Col I = kollagen I; Col IV = kollagen IV; MHC = myosin tung kæde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: dECM-recellularisering med en myoblastcellelinje (C2C12 myoblaster). (A) Maksimal intensitetsprojektion af et konfokalbillede af en 100 μm stak recellulariseret matrix, koloniseret med C2C12-celler mærket med methylgrønt farvnings-DNA, phalloidindetekterende F-actin og anti-pH3-antistof, en proliferationsmarkør (magentapile). Skalabjælke = 35 μm. (B) Maksimal intensitetsprojektion af et konfokalbillede af en 100 μm stak, der viser en multinucleated (blå pile angiver kernerne) myosin tung kæde-positiv myotube (stiplede linje) dannet under kultur. Skalabjælke = 35 μm. (C,D) Immunohistokemisk konfokal billed, der viser intra- eller pericellulær farvning for laminin α2-kæde (gule pile), samlede lamininer (magenta pile i C) og fibronectin (magenta pile i D) i myoblaster, hvilket tyder på de novo proteinsyntese. Skalabjælke = 10 μm. De anvendte antistoffer og de respektive fortyndinger er anført i tabel 1. Forkortelser: pH3 = phosphohiston 3; LNα2 = laminin α2 kæde; LNp = pan-muskel lamininer; FN = fibronectin; MHC = myosin tung kæde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM er et komplekst netværk af makromolekyler, der er til stede i alle væv og spiller en afgørende rolle i reguleringen af celleadfærd og funktion2. ECM fungerer som et fysisk stillads, som celler kan fastgøres til og giver signaler, der aktivt modulerer cellulære processer såsom spredning, motilitet, differentiering og apoptose. Således er korrekt dannelse og vedligeholdelse af ECM afgørende for både udvikling og homeostase1.
Mens 2D-cellekulturmodeller er blevet brugt i vid udstrækning, erstattes de i stigende grad af mere avancerede 3D-platforme. Dette skyldes, at 2D-kulturer mangler de kemiske og fysiske signaler, der påvirker celleadfærd, mens 3D-kulturer betragtes som et mere realistisk alternativ til at studere molekylær og cellulær dynamik i indfødte væv11. Decellularisering af væv resulterer i produktion af stilladser, der tættere efterligner mikromiljøerne i biologiske væv, som demonstreret i en række undersøgelser på tværs af forskellige vævs- eller organsystemer 14,15,23,24,25. DECM'ers evne til at replikere naturlige vævsmikromiljøer rummer et stort potentiale for forskning i normal udvikling, forskellige sygdomstilstande og virkningen af lægemidler eller toksiner på væv11.
Protokollen, der anvendes i denne undersøgelse, bygger på protokollen udviklet af Silva et al. til decellularisering af føtalt hjertevæv14 som udgangspunkt. Det involverer en kombination af en hypotonisk buffer, behandling med et anionisk rengøringsmiddel (SDS) og en DNase-behandling. En af de største udfordringer i decellulariseringsprotokoller er at finde en balance mellem fjernelse af celler og bevarelse af ECM-proteinsammensætningen. I betragtning af vores fokus på at bruge dette 3D-cellekultursystem til at studere de tidlige stadier af LAMA2-CMD, blev der lagt særlig vægt på at bevare laminin 211 under decellularisering. Protokollen fra Silva et al.14 førte til tab af laminin α2-kædeimmunreaktivitet i de decellulariserede føtalmuskler; dette kan skyldes koncentrationen af SDS, der anvendes. Derfor blev alternativer til 0,2% SDS-opløsningsmiddelopløsningstrinnet testet, såsom lavere koncentrationer af SDS (0,1%, 0,05% og 0,02%) og substitution af SDS med forskellige koncentrationer af Triton X-100 (0,5% og 0,2%). De bedste resultater blev opnået ved at bruge 0,05% SDS vaskemiddelbehandling i 24 timer. Denne koncentration fjernede effektivt celleindholdet, samtidig med at laminin α2-kædens immunreaktivitet blev bevaret efter decellularisering. Denne protokol producerer reproducerbart acellulære dECM'er, der er fri for cellulære rester, herunder DNA.
Protokollen, der anvendes i denne undersøgelse, bevarer både de interstitielle matrixproteiner (fibronectin og kollagen I) og kældermembranproteiner (lamininer og kollagen IV). Fremtidige undersøgelser bør vurdere, om kollagen VI også bevares, da det også er en spiller i muskelsvind26. Det er kendt, at SDS kan forstyrre protein ultrastruktur og beskadige kollagener12; For føtal skeletmuskulatur var det vigtigt at anvende en lav koncentration af SDS (0,05 %) for at opretholde laminin α2 immunreaktivitet. Western blot-resultaterne viser imidlertid, at de decellulariserede prøver viser flere bånd efter immunodetektion af lamininer og kollagener sammenlignet med det oprindelige væv, hvilket indikerer, at der opstod en vis proteinnedbrydning som et resultat af decellulariseringsprocessen27.
Det er vigtigt, at recellulariseringseksperimenterne viser, at disse matricer er pålidelige stilladser, der konsekvent understøtter celleadhæsion, proliferation og differentiering. SDS er rapporteret at være cytotoksisk28, og derfor er vasketrinnene inkluderet i protokollen afgørende, hvis matricerne skal bruges til recellularisering. Disse stilladser blev effektivt koloniseret af C2C12-celler, hvilket indikerer deres egnethed som modelsystem til 3D-kultur af celler. Observationen af intracellulær og pericellulær farvning for ECM-proteiner, der omgiver C2C12-cellerne, antyder yderligere, at cellerne aktivt bidrager til deres mikromiljø inden for dECM'erne. Derudover differentierede, smeltede og dannede C2C12-cellerne, når de blev placeret i differentieringsmedium, myorør inden for dECM'erne.
En væsentlig udfordring i denne procedure er manipulation af prøverne i hele protokollen. Prøverne er meget små og bløde, hvilket kræver omhu og dygtighed i håndteringen for at forhindre indfangning i finspidspipetten og tab af prøverne. De bedste resultater opnås, når protokollen startes med frisk væv. Brug af frosne, lagrede prøver kan hindre fjernelse af cellulært indhold og føre til øget proteinnedbrydning, hindre proteindetektion og reducere decellulariseringseffektiviteten.
Kun få undersøgelser har rapporteret decellularisering af fostervæv 15,29,30,31. Specifikt med hensyn til decellularisering af føtal skeletmuskulatur har kun en tidligere undersøgelse rapporteret om decellularisering af sammensatte prøver af dermis, subkutant væv og panniculus carnosus31. Så vidt forfatterne ved, er det første gang, at der er etableret en decellulariseringsprotokol for isoleret føtal museskeletmuskulatur. Denne protokol kan tjene som grundlag for oprettelsen af lignende protokoller for føtalt muskelvæv af andre arter, såsom svin og mennesker13.
Den nuværende protokol til decellularisering af E18.5 museskeletmuskulatur ligner meget proceduren for Silva et al.14, der anvendte den på et E18-musehjerte. Den eneste forskel er koncentrationen af SDS, som er betydeligt lavere end den, der anvendes til fosterhjertet (0,05% vs. 0,2%), muligvis på grund af forskellige fysiske egenskaber ved disse to føtale væv.
Udviklingen af denne in vitro-model muliggør ikke kun undersøgelse af de processer, der er involveret i normal føtal muskeludvikling, men muliggør også parallel undersøgelse af tidligt indsættende muskeldystrofier og myopatier, såsom LAMA2-CMD, der manifesterer sig som en myogenesedefekt ved E18.5 i dyW-musemodel 10. Det skal dog bemærkes, at dette system er begrænset, idet det kun omfatter ECM og muskelceller og ikke indeholder andre celletyper såsom neuroner, endotelceller og fibroblaster. Relevansen af disse yderligere celletyper kan variere afhængigt af sygdommen, og ændringer i dyrkningssystemet kan være nødvendige for at inkludere dem. Samlet set kan brugen af dECM'er som beskrevet i denne undersøgelse anvendes i undersøgelsen af forskellige tidlige muskeldystrofier og myopatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr. 23049), MATRIHEALTH-projektet og cE3c-enhedsfinansiering UIDB/00329/2020. Vi vil gerne takke vores donor Henrique Meirelles, der valgte at støtte MATRIHEALTH-projektet. Dette arbejde nød godt af infrastrukturerne i Det Naturvidenskabelige Fakultets mikroskopifacilitet, en knude i den portugisiske platform for bioimaging (reference PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), og vi takker Luís Marques for hans hjælp med billedoptagelse og -behandling. Endelig takker vi Marta Palma for teknisk support og vores forskerteam for deres generøse bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
