Summary
이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
세포외 기질(ECM)은 세포에 대한 구조적 지지를 제공하고 다양한 세포 과정에 중요한 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 2차원(2D) 세포 배양 모델은 완전한 3차원(3D) 지지체가 부족하여 세포 거동을 변화시켜 생체 내 공정을 이해하기에 부적절할 수 있기 때문에 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 지나치게 단순화합니다. ECM 구성 및 세포-ECM 상호 작용의 결핍은 다양한 질병의 중요한 원인입니다.
한 가지 예는 LAMA2-선천성 근이영양증(LAMA2-CMD)이며, 여기서 기능성 라미닌 211 및 221의 부재 또는 감소는 출생 시 또는 출생 직후에 감지할 수 있는 심각한 저조를 유발할 수 있습니다. 이 질환의 마우스 모델을 사용한 이전 연구는 태아 근 발생 중에 발병이 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구는 천연 미세 환경을 모방하여 근육 세포와 태아 근육 ECM 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 3D 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 E18.5 마우스 태아에서 해부된 등 깊은 근육을 사용하여 저삼투압 완충액, 음이온성 세제 및 DNase로 처리합니다. 그 결과 탈세포화 매트릭스(dECM)는 천연 조직과 비교하여 테스트된 모든 ECM 단백질(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)을 유지했습니다.
C2C12 근모세포가 이러한 dECM 위에 시드되었을 때, 그들은 dECM에 침투하여 식민지화하여 증식과 분화를 지원했습니다. 또한, C2C12 세포는 ECM 단백질을 생산하여 dECM 내에서 틈새 시장의 리모델링에 기여했습니다. 이 시험관 내 플랫폼의 구축은 LAMA2-CMD의 발병과 관련된 과정을 밝히기 위한 새로운 유망한 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 사이의 통신 결함이 질병 진행에 기여하는 다른 골격근 질환에 적응할 가능성이 있습니다.
Introduction
세포외 기질(ECM)은 조직의 주요 구성 요소로, 비세포 구성 요소를 나타냅니다. 이 3차원(3D) 구조는 세포에 대한 물리적 지지를 제공할 뿐만 아니라 유기체1의 발달과 관련된 생화학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 조직 특이적 ECM의 형성은 다양한 세포 내 및 세포 외 자극의 영향을 받는 세포와 틈새 사이의 복잡한 상호 작용의 결과로 발달 중에 발생합니다. ECM은 시간적-공간적 방식으로 화학적, 기계적 재배열을 거쳐 세포 운명2에 직접적인 영향을 미치는 매우 역동적인 구조입니다. ECM의 가장 주목할만한 특징 중 하나는 기능적 다양성으로, 각 조직 ECM은 ECM이 포함하는 세포에 맞게 조정된 다양한 토폴로지와 특성을 제공하는 고유한 분자 조합을 표시하기 때문입니다1.
ECM 신호전달과 지원은 발달과 항상성에 매우 중요하며, 중단될 경우 여러 병리학적 상태를 유발할 수 있다 3,4. 한 가지 예는 선천성 근이영양증의 가장 흔한 형태인 LAMA2 결핍 선천성 이영양증(LAMA2-CMD)입니다. LAMA2 유전자는 라미닌 211 및 라미닌 221에 존재하는 라미닌 α2 사슬을 암호화하며, 돌연변이되면 LAMA2-CMD 5를 유발할 수 있습니다. 라미닌 211은 골격근 섬유를 둘러싸고 있는 기저막에서 발견되는 주요 동형입니다. 라미닌(211)이 비정상적이거나 부재하는 경우, 기저막과 근육 세포 사이의 연결이 끊어져 질병이 발병하게 된다6. LAMA2-CMD 환자는 LAMA2 유전자의 돌연변이 유형에 따라 경증에서 중증의 표현형을 보입니다.
라미닌 α2 단백질의 기능이 영향을 받으면 환자는 출생 시 심각한 근긴장저하를 경험하고 만성 염증, 섬유증 및 근육 위축이 발생하여 기대 수명이 단축될 수 있습니다. 현재까지 표적 치료법은 개발되지 않았으며 치료적 접근은 질병의 증상을 완화하는 데 국한되어 있다7. 따라서 이 질병의 발병과 관련된 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 적절한 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다 6,8. LAMA2-CMD의 모델인 dyW 마우스9를 사용한 이전 연구에서는 질병의 발병이 자궁 내에서, 특히 태아 근형성 동안 시작된다는 것을 시사한다10. 태아 근형성 결함이 어떻게 나타나는지에 대한 더 나은 이해는 LAMA2-CMD에 대한 새로운 치료 접근법을 생성하는 게임 체인저가 될 것입니다.
체외 시스템은 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 제어된 환경을 제공하지만, 2D 배양 모델은 천연 조직의 복잡성이 부족합니다. 조직의 탈세포화는 2D 모델 및 엔지니어링/합성 스캐폴드에 비해 자연 세포 미세 환경을 보다 정확하게 모방하는 조직 및 발달 단계별 무세포 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 탈세포화 매트릭스(decellularized matrice, dECM)는 숙주 조직의 분자 및 기계적 신호를 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있어, 생체 내 공정을 이해하기 위한 더 나은 대안 모델이 된다11.
탈세포화(decellularization)를 위해 사용될 수 있는 다양한 기술, 시약 및 조건이 존재한다12,13. 이 연구에서 Silva et al.14,15에 의해 설명된 태아 마우스 심장에 대한 탈세포화 프로토콜은 태아 마우스 골격근에 적용되었으며 테스트된 모든 ECM 구성 요소(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)를 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 프로토콜에는 삼투압 쇼크에 의한 세포 용해(저삼투압 완충액), 원형질막 용해 및 단백질 해리(0.05% 도데실 황산나트륨[SDS]), DNA의 효소 파괴(DNase 처리)의 세 단계가 포함됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 마우스 태아 골격근을 탈세포화하기 위해 확립된 최초의 프로토콜입니다.
LAMA2-CMD를 연구하기 위해 이 3D 체외 시스템을 사용하려면 탈세포화 후 라미닌 α2 사슬을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 다양한 세제(SDS 및 Triton X-100)와 농도(0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.5%)를 테스트하는 최적화 프로토콜이 구현되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 라미닌 α2 단백질의 세포 제거 및 보존을 위한 최적의 선택은 0.05% SDS인 것으로 밝혀졌다. 잘 확립된 근원모세포 세포주인 C2C12 세포주16,17을 사용하여 dECM을 시딩했습니다. 이 세포는 dECM을 침범하여 이 스캐폴드 내부에서 증식 및 분화하여 새로운 ECM 단백질을 합성합니다. 이 3D 체외 모델의 성공적인 생산은 태아 근 발생, LAMA2-CMD의 시작과 관련된 분자 및 세포 과정을 이해하는 새로운 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 간의 통신이 중단되는 다른 근육 질환으로 확장될 수 있습니다.
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Protocol
설명된 모든 방법론은 리스본 대학교 과학부 동물 복지 위원회(ORBEA) 및 Direção Geral de Veterinária(DGAV; ref. 0421/000/000/2022)의 승인을 받았으며 유럽 지침 2010/63/EU를 따릅니다.
1. 탈세포화 완충액 및 시약의 제조
알림: 탈세포화 프로토콜 중에 사용되는 모든 용액은 고압증기멸균으로 멸균해야 하며 달리 명시되지 않는 한 최대 3개월 동안 보관해야 합니다.
- 탈염수(dH2O)에 137 mM의 염화나트륨(NaCl), 2.68 mM의 염화칼륨(KCl), 8.1 mM의 인산이수소칼륨(KH2PO4), 1.47 mM의디소듐-하이드로겐-포스페이트 이수화물(Na2HPO4)을 첨가하여 10x 인산완충식염수(10x PBS)를 준비하고 pH를 6.8로 조절한다. 100 mL의 10x PBS를 900 mL의 탈염된H2O에 첨가하여 1x PBS를 생성한다. 오토클레이브 및 실온(RT)에서 보관하십시오. 멸균 페니실린/스트렙토마이신 원액(10,000U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마이신[펜/스트렙])을 사용하기 전에 최종 농도 1%에 첨가하십시오.
- 1.21 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(트리스 염기) 및 1 g의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 1 L의 dH2O(10 mM 트리스 염기 0.1% EDTA)에 용해시켜 저삼투압 완충액을 제조한다. 용해 될 때까지 자석 교반기를 사용하고 NaOH / HCl로 pH를 7.8로 조정하십시오. 오토 클레이빙으로 살균하고 RT에서 보관하십시오. 사용하기 전에 펜/연쇄상 구균을 최종 농도 1%에 첨가하십시오.
- 1.21 g의 트리스 염기를 1 L의dH2O(10 mM 트리스 염기)에 용해시켜 저삼투압 세척 완충액을 제조한다. 용해될 때까지 마그네틱 교반기를 사용하고 NaOH/HCl로 pH를 7.8로 조정합니다. 오토클레이브 및 RT에서 보관하십시오. 사용하기 전에 펜/연쇄상 구균을 1%에 추가하십시오.
- 100mL의 저삼투성 세척 완충액에 0.05g의 소듐도데실설페이트(SDS)를 첨가하여 음이온 세제를 준비하여 0.05% SDS 처리액을 제조한다. 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다. RT에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
알림: SDS 용액은 오토클레이빙 시 SDS가 침전되고 분해되므로 고압증기멸균해서는 안 됩니다. - 트리스 염기 1.21g을dH2O0.5mL에 용해시켜 DNase 처리액을 준비하고, 1M 염화마그네슘(MgCl2) 1mL를 첨가한다. NaOH/HCl로 pH를 7.8로 조정하십시오. RT에서 오토클레이브 및 보관하십시오. 사용하기 전에 DNase I을 추가하십시오(50U/mL).
2. 시료 채취
참고: 야생형 C57/BL6 마우스가 연구에 활용되었습니다. 모든 기술은 무균 조건 하에서 층류 후드에서 수행되었습니다.
- 임신 배아일(E) 18.5에 이소플루란 흡입 후 자궁경부 탈구를 사용하여 성인 임신한 암컷 마우스를 안락사시킵니다. 태아를 추출하기 위해 마우스를 말단 해부합니다.
- 마우스의 복부에 70 % 에탄올을 뿌립니다.
- 수술용 집게와 가위를 사용하여 하복부의 접힌 피부를 들어 올리고 U자형 절개를 하여 복강을 노출시킨다(18).
- 난관과 자궁경부를 절단하여 E18.5 태아가 들어 있는 자궁 뿔을 수집하고 즉시 1% 펜/연쇄상 구균18이 포함된 얼음처럼 차가운 1x PBS가 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
- 자궁과 배아 외 조직에서 태아를 신속하게 제거하고 가위를 사용하여 참수하여 안락사시킨다18.
- 한 번에 한 명의 태아를 얼음처럼 차가운 1x PBS가 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 실체 현미경을 사용하여 피부를 제거하고 팔다리를 잘라냅니다. 복부 쪽에서 흉곽을 자르고 흉골과 밑 기관을 제거하십시오.
- 태아의 몸통 등쪽을 위로 뒤집습니다. 척추의 자궁 경부 부분, 등쪽 지방 침착 및 깊은 등 근육 상단의 결합 조직을 제거합니다.
- 수술용 집게를 사용하여 흉곽을 고정하고 마이크로 메스(10)를 사용하여 주변 조직에서 깊은 등 근육을 조심스럽게 긁어내고 분리합니다. 이 절차는 태아당 두 개의 근육 조각(왼쪽 및 오른쪽)을 분리하는 결과를 가져오며, 둘 다 주로 longissimus 및 iliocostalis 근육으로 구성되며 일부 transversospinalis 및 levator costarum 근육이 포함됩니다.
- 근육 샘플을 1% 펜/연쇄상 구균이 있는 1x PBS에 4°C에서 단기 보관(<1주) 또는 -80°C에서 장기간 보관합니다.
알림: 최상의 결과를 위해 새로 수집한 샘플을 사용하십시오. 장기간(>3개월) 동안 냉동된 샘플은 탈세포화 효율이 낮고 단백질 분해가 더 많습니다. 에축 근육 덩어리가 탈세포화 실험에 사용되었지만, 다른 근육(예를 들어, 사지 근육)은 동일한 프로토콜을 사용하여 탈세포화를 위해 처리될 수 있다.
3. 태아 골격근 탈세포화
참고: 모든 기술은 무균 조건의 층류 후드에서 수행되었습니다. 자세한 회로도 표현은 그림 1A를 참조하십시오. 모든 단계는 달리 언급되지 않는 한 25°C에서 직경 120 mm (165 rpm)의 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 수행하였다. 사용하기 전에 용액에 1% 펜/연쇄상 구균을 첨가하십시오. 용액을 제거할 때 s가 피펫에 갇히지 않도록 조심스럽게 흡입하십시오.
- 1일차 - 에축 근육 덩어리에서 약 2mm x 1mm x 1mm(~3.5mg)의 조직 조각을 준비합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 1% pen/strep이 포함된 3mL의 저삼투압 완충액을 추가하고 웰당 하나의 전체 근육 조직 조각을 추가합니다.
- 조직 단편을 18시간(하룻밤) 동안 교반하면서 저삼투압 완충액에서 배양합니다(O/N).
- 2일 - 미세 팁 피펫을 사용하여 저삼투압 완충액을 흡인하고 교반하면서 매번 3mL의 1x PBS로 샘플을 3 x 1시간 세척합니다.
- 교반과 함께 3mL의 0.05% SDS 세제 용액으로 24시간 동안 샘플을 배양합니다.
참고: (체크 포인트) SDS 배양 후 샘플은 외관이 투명해야 합니다. 샘플은 젤라틴과 같은 일관성을 나타내므로 액체를 제거할 때 피펫에 달라붙는 경향이 있습니다.
- 교반과 함께 3mL의 0.05% SDS 세제 용액으로 24시간 동안 샘플을 배양합니다.
- 3일째 - 미세 팁 피펫을 사용하여 SDS 세제 용액을 제거하고 교반하면서 매번 3mL의 저삼투압 세척 완충액으로 조직 조각을 3 x 20분 동안 세척합니다.
참고: (일시 중지 지점) 샘플은 4°C에서 18시간(O/N) 동안 저삼투압 세척 버퍼에 보관할 수 있습니다. 잔류 SDS는 세포독성이 있을 수 있으므로 세척 단계에서 SDS가 잘 제거되었는지 확인하십시오.- 조직 단편을 37°C에서 교반하면서 2 mL의 DNase 용액과 함께 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 미세 팁 피펫을 사용하여 DNase 용액을 제거하고 교반하면서 매번 3mL의 1x PBS로 조직 조각을 3 x 20분 동안 세척합니다. 마지막으로 교반(60rpm)으로 O/N을 세척합니다.
참고: DNase 처리 후 DNA 잔기의 존재로 인해 dECM이 끈적거림이 됩니다. 따라서 신중한 세척이 필요합니다. - 재세포화될 때까지(<1주) 4°C에서 1% 펜/연쇄상구균이 있는 1x PBS에 dECM을 보관합니다. 다른 용도로 사용하려면 -80 °C에서 보관하십시오.
4. 탈세포화 품질 평가
참고: 탈세포화 후 잔류 세포 내용물의 존재를 평가하기 위해 DNA 정량화, DAPI/메틸 그린 염색 및 팔로이딘 염색을 수행했습니다. 탈세포화 후 주요 ECM 단백질의 보유를 평가하기 위해 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석이 수행되었습니다.
- dECM에 존재하는 DNA의 정량화
참고: dECM을 천연 조직과 비교하여 DNA의 존재를 감지해야 합니다.- 탈세포화하기 전에 고정밀 디지털 저울에서 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 무게를 잰다. 근육 샘플을 튜브로 옮기기 전에 종이 타월을 사용하여 나머지 1x PBS를 모두 제거합니다. 샘플로 튜브의 무게를 잰다. 방정식 (1)을 사용하여 샘플의 습윤 중량을 계산합니다.
시료습식 중량 =시료가 있는 중량 튜브 - 중량빈 튜브(1) - 섹션 3에 설명된 프로토콜에 따라 샘플을 탈세포화합니다.
- s를 배치amp2mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
참고: 샘플은 DNA 추출 및 정량화까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다. - 스핀 컬럼 기반 키트를 사용하여 dECM 및 천연 조직 샘플의 DNA 추출을 수행합니다. 제조업체의 지침에 따라 소화 버퍼를 추가합니다.
- 튜브당 하나의 텅스텐 카바이드 비드를 사용하여 매번 2.5분 동안 비드 밀에서 샘플을 두 번 균질화합니다(냉각 튜브 마운트 사용).
- 프로테이나제 K를 첨가하고 56°C에서 천천히 교반하면서 O/N을 배양합니다.
- 제조업체의 지침에 설명된 대로 프로토콜을 진행하십시오.
- 제조사에서 제공한 완충액으로 용리하고 4°C에서 매번 ≥6,000 x g에서 2 x 1분간 원심분리하여 DNA 수율을 높였다.
참고: DNA는 정량화될 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다. - 샘플에 존재하는 DNA를 정량화합니다.amp제조업체의 지침에 따라 형광 dsDNA 검출 키트를 사용합니다.
- DNA 함량을 샘플의 원래 습윤 중량의 밀리그램당 DNA의 나노그램으로 정규화합니다.
- 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 데이터를 분석하고 평균의 표준 오차(SEM)± 평균으로 표현합니다.
- 탈세포화하기 전에 고정밀 디지털 저울에서 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 무게를 잰다. 근육 샘플을 튜브로 옮기기 전에 종이 타월을 사용하여 나머지 1x PBS를 모두 제거합니다. 샘플로 튜브의 무게를 잰다. 방정식 (1)을 사용하여 샘플의 습윤 중량을 계산합니다.
- 면역조직화학
알림: 용액 1, 2, 3과 고정액은 사용 전에 준비해야 하며 최대 6개월 동안 냉동 보관할 수 있습니다. 사용된 모든 항체 및 염료 및 각각의 희석액은 표 1.- 용액 준비
- 파라포름알데히드(PFA) 2g, 자당 8g, 1MCaCl2 24μL를 0.2M Na2HPO4 77mL 및 0.2M NaH2PO4 23mL에 첨가하여 고정액을 제조하고,dH2O를 첨가하여 최종 부피 200mL에pH를 7.4로 조정한다.
- 1L의 dH2O에 13.5g의Na2HPO4와 3.2g의NaH2PO4를 첨가하여 0.12 M 인산염 완충액을 준비한다.
- 100 mL의 0.12 M 인산염 완충액에 4 g의 수크로오스를 첨가하여 용액 1을 제조한다.
- 15 g의 슈크로스를 100 mL의 0.12 M 포스페이트 완충액에 첨가하여 용액 2를 제조한다.
- 15 g의 수크로오스 및 7.5 g의 젤라틴을 0.12 M 인산염 완충액 100 mL에 첨가하여 용액 3을 제조한다. 젤라틴이 녹을 때까지 37°C로 가열합니다.
- 메틸 그린 원액(dH2O에 용해된 2% 메틸 그린 분말)19을 준비합니다.
- 면역 검출
- 4°C에서 최소 4시간 동안 고정 용액을 사용하여 샘플을 고정합니다.
- 샘플을 1x PBS로 10분 동안 2x 세척합니다.
- 1°C에서 용액 1에 O/N 또는 4일 이상 보관하십시오.
- 세척하고 1°C에서 용액 2에서 O/N 또는 4일 이상 유지합니다. 샘플을 RT로 데우십시오.
- 37°C에서 용액 3에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 나중에 사용할 수 있도록 추가 용액 3을 37°C에 보관하십시오.
- 알루미늄 호일에 작은 (2 cm x 1 cm x 1 cm) 용기를 몰딩합니다. 성형 용기에 용액 3을 얇게 놓고 굳힌다. 고형화 된 용액 3에 샘플을 놓고 따뜻한 용액 3으로 덮습니다. 샘플의 방향을 지정하고 굳게 합니다. 응고 된 용액 3의 위치를 컬러 펜으로 표시하십시오.
- 드라이 아이스 냉각 또는 액체 질소 냉각 이소 펜탄의 표면에 용기를 놓아 동결하십시오.
- 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 사용하여 샘플이 들어 있는 냉동 젤라틴 큐브를 저온 유지 장치 마운트에 고정합니다.
- 냉동 젤라틴 큐브를 절단하고 조직 섹션을 슬라이드로 옮깁니다. 60분 동안 말리십시오.
- 소수성 마커를 사용하여 단면 주위의 선을 추적합니다.
- 슬라이드를 1x PBS에서 3 x 10분 동안 세척합니다.
- 1x PBS(블로킹 용액)에 희석된 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 염소 혈청 및 0.05% Triton X-100으로 30분 동안 절편을 덮습니다(블로킹 단계).
- 차단 용액에 1차 항체를 희석하고 섹션을 덮습니다. 절편이 건조되는 것을 방지하기 위해 축축한 종이와 함께 밀폐된 상자에 4°C에서 O/N을 배양합니다.
- 슬라이드를 1x PBS로 3 x 10분 동안 세척합니다.
- 블로킹 용액에 2차 항체를 희석하고 절편을 덮습니다. 어둠 속에서 RT에서 1.5 시간 동안 배양하십시오.
알림: 형광단 분해를 방지하기 위해 빛 노출을 피하십시오. - 슬라이드를 4x PBS로 3 x 10분 동안 세척합니다.
참고: 강한 배경이 있을 때 더 높은 농도의 PBS를 사용할 수 있습니다. - 슬라이드를 DAPI 용액(5μg/mL 1,4-디아자비시클로-2,2,2-옥탄, 0.1% 트리톤 X-100/1x PBS 중)에 각각 30초 동안 담그십시오.
- PBS 1개로 헹굽니다.
- 페이딩 방지 배지(50mg/mL n-프로필-갈레이트 1x PBS:글리세롤[1:9])에 섹션을 장착하고 커버슬립으로 밀봉합니다. 형광현미경20에서 관찰 및 이미지 획득이 될 때까지 4°C에서 보관한다.
참고: 토토 면역조직화학 실험 의 경우, 동일한 프로토콜(단계 4.2.2.12-4.2.2.18 단계 참조)을 사용하되, 샘플을 RT에서 3시간 동안 1x PBS로 희석된 4% PFA에 미리 고정시켰다. 사용된 모든 항체 및 염료, 및 이들의 각각의 희석액은 표 1에 열거되어 있다. 그런 다음 샘플을 강철 링으로 분리된 두 개의 커버슬립 사이에 페이딩 방지 매체에 장착하고 밀랍으로 접착하고 컨포칼 현미경21을 사용하여 100μm 이미지 스택을 획득했습니다.
- 용액 준비
- 웨스턴 블롯 분석
참고: 사용된 모든 항체 및 각각의 희석액은 표 1.- 용액 준비
- 20mL의 글리세롤, 4g의 SDS 및 0.2mL의 브로모페놀 블루를 80mL의 100mM Tris 염기 용액에 첨가하여 2x SDS-PAGE 로딩 완충액을 준비합니다. pH를 6.8로 조정합니다. 사용하기 전에 신선한 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하십시오.
- 2.4 g의 트리스 염기, 8.8 g의 NaCl 및 1 mL의 트윈-20을 dH 2O에 첨가하여 트윈20(TBST) 용액으로 트리스 완충 식염수 세척 완충액을 1 L의 최종 부피에 첨가하여 트리스 완충 식염수 세척 완충액을 제조한다.
- 30.2 g의 트리스 염기, 144.2 g의 글리신, 및 10 g의 SDS를 1 L의dH2O에 첨가하여 10x 러닝 완충액 (RB)을 준비한다. 사용하기 전에 10x RB 100mL를 900mL의dH2O에 첨가하여 1x RB(작업 용액)를 제조합니다.
알림: 10x RB는 RT에서 몇 달 동안 저장할 수 있지만 1x RB는 다른 실행에서 재사용할 수 있습니다. - 800mL의 dH2O에5.82g의 Tris 염기, 2.93g의 글리신, 0.5g의 SDS를 첨가하여 전사 완충액(TB)을 준비한다. 성분이 용해 된 후, 200 mL의 메탄올을 첨가한다. 4 °C에서 식히십시오.
알림: TB는 매번 사용하기 전에 새로 준비해야 합니다.
- 단백질 추출
- E18.5 마우스에서 epaxial 근육을 수집하고 즉시 새로 DTT(100mM DTT)가 추가된 2x SDS-PAGE 로딩 버퍼가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브(2mL)에 넣습니다. E18.5 dECM도 같은 방법으로 처리합니다.
- 튜브 당 하나의 텅스텐 카바이드 비드를 추가하십시오. 매번 2분 동안 비드 밀에서 2.5배 균질화합니다(마운트 뒤집기).
- 초음파 욕조에서 5 분 동안 샘플을 초음파 처리하십시오.
- 샘플을 50°C에서 10분 동안 가열합니다.
- 샘플을 12,000 × g 에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리합니다.
- 상층액을 새로운 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 단백질을 정량화합니다.
- 나중에 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
- 프리캐스트 아크릴아마이드 그라디언트 젤(4%-20%) 사용
- 전기 영동 탱크에 젤을 장착합니다. 빗을 조심스럽게 제거하십시오. 전기영동 탱크에 선이 표시될 때까지 1x RB를 추가합니다. 우물이 RB로 채워져 있는지 확인하십시오.
- 웰에 샘플당 100μg의 단백질을 로드합니다. 12 μL의 고분자량 단백질 표준물질을 로딩합니다.
- 정전압으로 총 100분 동안 작동합니다(150V에서 10분, 185V에서 90분).
- 갈아타다
- 젤이 작동하는 동안 필터 패드와 스폰지를 식힌 TB(4°C)에 담그십시오.
- 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 겔 크기로 자릅니다. 메탄올로 활성화하고 dH2O로 씻으십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 스폰지, 필터 패드, 젤 및 활성화된 멤브레인과 함께 전사 카세트를 장착합니다.
- 카세트를 식힌 TB가 들어 있는 전기영동 탱크에 넣습니다(얼음 침대 위). 냉각 장치를 추가합니다. 90V에서 100분 동안 작동합니다.
- 전사 후 Coomassie blue 대체품으로 염색하여 전사 품질을 평가합니다.
- 면역 검출
- 차단 용액 (5 % 저지방 우유가 함유 된 TBST)을 준비하십시오. RT에서 1 시간 동안 교반하면서 멤브레인을 배양하십시오.
- TBST로 3 x 5초 동안 헹굽니다.
- 교반과 함께 저온 챔버(4°C)에서 2% BSA 및 0.02% 아지드화나트륨(멤브레인당 3mL)과 함께 TBST로 희석된 1차 항체와 함께 멤브레인 O/N을 배양합니다.
- 다음날 TBST로 3 x 5 분간 세척하십시오.
- TBST에 희석된 양고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 5% 저지방 우유(각 막당 5mL)로 막을 배양합니다.
- TBST 3 x 5 분으로 멤브레인을 세척하십시오. 감지 단계까지 TBST에 보관하십시오.
- 시판되는 현상 키트를 사용하여 단백질을 시각화합니다. 제조업체의 지침에 따라 검출 시약을 추가하십시오. 밴드의 이미지를 획득합니다.
- 멤브레인 당 하나 이상의 항체를 테스트하려면 검출 단계 후 TBST를 사용하여 3 회 세척 (각각 5 분)으로 이전 항체를 벗기고 4.3.5.2-4.3.5.7 단계를 반복하십시오.
- 용액 준비
표 1: 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석에 사용된 항체 및 염료 및 각각의 희석액. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.10,22
5. 탈세포화된 매트릭스에서의 세포 배양
참고: 모든 기술은 층류 후드의 무균 조건에서 수행되었습니다. 모든 인큐베이션은 37°C 및 5%CO2에서 수행하였다.
- 세포 배양 배지인 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium에 안정적인 글루타민과 피루브산나트륨(DMEM)을 함유하고 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% pen/strep(완전 배양 배지)을 보충하여 준비합니다.
- 층류 후드에 1% 펜/스트렙이 있는 1x PBS의 페트리 접시에 dECM을 넣고 마이크로 메스와 핀셋을 사용하여 약 500μm x 500μm x 250μm 조각으로 분리합니다.
알림: dECM은 질감이 부드럽기 때문에 마이크로 메스로 자르는 대신 핀셋을 사용하여 거의 같은 크기의 조각으로 분리하는 것이 더 쉬운 경우가 많습니다. - 단편을 200 μL의 완전 배양 배지와 함께 96-웰 플레이트 (웰 당 3 개 또는 4 개)로 옮기고, 이전에 37 °C로 가온했다. 인큐베이터에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 500μL의 트립신을 하위 융합성(~70%) C2C12 세포로 시딩된 T25 플라스크에 추가합니다. 1mL의 완전 배지에 재현탁합니다.
- 10 μL의 재현탁을 10 μL 트리판 블루 염료에 첨가하고 혈구계에 로딩합니다. 세포 수를 세고 계산하고 세포 생존율을 확인합니다.
- dECM이 포함된 96웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 50,000개의 생존 가능한 C2C12 세포를 포함하는 완전한 배양 배지 200μL를 추가합니다.
- 2일 동안 배양한 다음 핀셋을 사용하여 dECM(세포 포함)을 400μL의 완전 배양 배지가 있는 48웰 플레이트로 옮깁니다. 2일마다 마이크로피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하여 dECM이 웰 바닥에서 분리되는 것을 방지하고 8일까지 새 배지를 추가합니다.
참고: 매트릭스는 dECM에 대한 C2C96 세포 부착을 촉진하기 위해 12웰 플레이트에 2일 동안 보관한 다음 48웰 플레이트로 옮겨 영양분이 있는 더 많은 양의 배지에 접근할 수 있도록 합니다. dECM은 웰 바닥에 부착되어야 합니다. - 분화 실험을 위해 8일째에 완전 배양액을 분화 배지(2% 말 혈청 및 1% pen/strep이 보충된 DMEM)로 교체한 후 12일까지 4일 동안 분화 배지에서 배양합니다.
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Representative Results
탈세포화 프로토콜의 목표는 천연 조직의 구성과 매우 유사한 dECM을 생산하는 것입니다. 탈세포화 과정의 효과를 결정하기 위해 조직 형태 검사, DNA 수준 측정, F-액틴 염색, 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅 기술을 사용한 주요 ECM 성분 분석 등 다양한 방법이 사용되었습니다. 구체적으로, 골격근 조직의 5가지 주요 ECM 성분을 분석하였다.
프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 모양이 바뀝니다(그림 1B 1-4). 분리 후 근육 조직은 미오글로빈의 존재로 인해 붉게 나타납니다(그림 1B1). 세포를 용해시키고 대부분의 세포 혈장 단백질을 제거하는 저삼투압 완충액에서 배양한 후 샘플은 흰색으로 변합니다(그림 1B2). 조직 탈세포화(decellularization)에 통상적으로 사용되는 음이온성 세제인 SDS는 세포질과 핵물질, 세포막을 효과적으로 제거한다. 그 결과, 샘플은 SDS 처리 후 더 투명해진다(도 1B3). 그러나 이 세제에 고농도 또는 장기간 노출되면 단백질 변성, 글리코사미노글리칸 손실, 콜라겐 섬유 파괴를 유발할 수 있다12. 세포 제거와 ECM 보존 사이의 최적 균형은 그림 2 및 그림 3과 같이 24시간 동안 0.05% SDS를 사용하여 달성됩니다. 마지막으로, DNase 처리를 통해 DNA가 제거되어 SDS 처리 후보다 약간 작은 투명한 dECM 스캐폴드가 생성됩니다(그림 1B4).
탈세포화 프로토콜의 성공 여부는 공정 후 매트릭스에 존재하는 잔류 DNA의 양으로 표시됩니다. DNA 정량화는 천연 조직에 비해 dECM이 거의 100% 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1C). DAPI 염색은 또한 dECM에 DNA가 없음을 확인합니다(그림 2B,D,F,H,J).
5개의 주요 ECM 단백질의 존재를 면역조직화학과 탈세포화 후 웨스턴 블롯에 의해 평가하고 천연 조직과 비교했습니다. 라미닌 α2 서브유닛(그림 2A,B) 및 총 라미닌(그림 2C,D)에 대한 면역염색은 dECM이 천연 조직에서 근관을 둘러싸고 있는 라미닌 매트릭스와 유사하게 이러한 단백질에 대한 관형 염색을 표시한다는 것을 보여줍니다(그림 2A, D의 화살표). 라미닌 α2 서브유닛에 대한 웨스턴 블롯 분석은 천연 조직에 2개의 밴드가 존재함을 보여주며(그림 2A'), 예상보다 분자량이 작은 3개의 밴드가 dECM에서 검출될 수 있습니다(그림 2B'). 이는 탈세포화 과정에서 단백질 분해 또는 제거의 결과일 수 있습니다. 총 라미닌에 대한 웨스턴 블롯 분석은 천연 조직의 샘플과 비교하여 dECM에서 이러한 단백질의 일부 단편화를 보여줍니다(그림 2C',D').
그림 1: 태아 골격근 탈세포화 절차 및 조직 형태 및 DNA 함량 평가. (A) 탈세포화 프로토콜의 개략도. (B) 갓 채취한 조직에서 탈세포화된 조직에 이르기까지 프로토콜 전반에 걸친 조직 형태. 스케일 바 = 1mm. (C) 천연 조직과 비교하여 dECM에 존재하는 DNA의 정량화. SEM± 평균으로 표현된 데이터. 스튜던트 t-검정, 양측 **p < 0.01. 탈세포화 프로토콜은 무세포 dECM을 생성하는 핵 성분을 효율적으로 제거합니다. 약어: dECMs = 탈세포화된 매트릭스; PBS = 인산염 완충 식염수; SDS = 소듐 도데실 설페이트; NT = 천연 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피브로넥틴(그림 2E,F) 및 콜라겐 I(그림 2G,H)에 대한 면역염색은 천연 조직의 세포 간 간질 공간에 이러한 단백질의 존재를 보여주며(그림 2E, G의 화살표) dECM에서 유사한 염색(그림 2F, H)을 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 두 조건 모두에서 피브로넥틴에 대해 유사한 밴드를 보여주며(그림 2E',F'), 이는 이 단백질이 탈세포화 과정의 영향을 특별히 받지 않음을 나타냅니다. 그러나 콜라겐 I의 경우(그림 2G',H') dECM에 밴드가 더 적어 어느 정도 분해되었음을 나타냅니다. 콜라겐 IV에 대한 면역염색은 관형 구조가 더 좁지만(그림 2J의 화살표) 천연 조직에서 관형 염색 패턴(그림 2I의 화살표)과 dECM에서 유사한 염색을 보여줍니다. 콜라겐 IV에 대한 웨스턴 블롯 분석은 천연 조직에 3개의 밴드가 존재함을 보여줍니다(그림 2I'). dECM에서 동일한 세 개의 밴드가 관찰되지만(그림 2J'), 이들의 분자량은 예상보다 낮습니다. 라미닌 α2와 유사하게, 이것은 탈세포화 동안 단백질 분해 또는 제거의 결과일 수 있습니다.
그런 다음 dECM을 C2C12 근모세포로 시딩하고 완전 배양 배지에서 8일 동안 배양합니다. C2C12 세포는 포스포-히스톤 3 핵 염색에 의해 보여지는 바와 같이 dECM을 식민지화하고 증식한다 (도 3A의 화살표). 분화 배지에서 추가로 4일 동안 배양한 후, C2C12 세포는 분화하여 미오신 중쇄(도 3B의 점선)를 발현하는 다핵(도 3B의 파란색 화살표) 근관으로 융합합니다. 흥미롭게도, 라미닌 α2 사슬(그림 3C,D의 노란색 화살표), 총 라미닌(그림 3C의 마젠타 화살표) 및 피브로넥틴(그림 3D의 마젠타 화살표)에 대한 세포 내 및/또는 세포주위 염색은 완전한 배양 배지에서 배양된 C2C12 세포에서 검출될 수 있으며, 이는 이러한 세포가 이러한 ECM 단백질을 새로 합성할 수 있음을 시사합니다따라서 틈새 시장 형성에 기여합니다. 이러한 결과는 탈세포화 프로토콜이 C2C12 근모세포가 증식, 분화 및 다핵 근관을 형성할 수 있는 dECM 미세 환경을 생성한다는 것을 보여줍니다.
그림 2: 천연 대 탈세포화된 E18.5 태아 근육 조직에서 5가지 ECM 단백질의 평가. 천연 조직(A,C,E,G,I) 절편에 대한 면역조직화학 및 DAP, DEC(B,D,F,H,J)를 DAPI, DNA 마커, F-액틴 검출 및 ECM 단백질에 대한 염색. 스케일 바 = 15 μm. 천연 조직에서 라미닌 및 콜라겐 IV에 대한 면역염색은 근섬유를 둘러싸고 존재하며(A, C, I, 노란색 화살표) 피브로넥틴 및 콜라겐 I에 대한 염색은 근섬유 사이의 간질 공간에서 검출됩니다(예: 노란색 화살표). dECM에서 라미닌 및 콜라겐 IV(B,D,J; 노란색 화살표)에 대한 염색은 탈세포화 후 근섬유가 남긴 공간을 둘러싸는 관형 패턴을 보여줍니다. dECM의 피브로넥틴 및 콜라겐 I 면역염색은 간질 공간에서의 존재와 일치합니다(F, H, 노란색 화살표). (A'-J') 천연 조직(A',C',E',G',I') 및 dECM 샘플(B',D',F',H',J')에서 5개의 ECM 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석. 두 접근법 모두 탈세포화 후 단백질 보존을 보여줍니다. 사용된 항체 및 각각의 희석액은 표 1에 열거되어 있다. 약어: LNα2 = 라미닌 α2 사슬; LNp = 범근육 라미닌; F-N = 피브로넥틴; Col I = 콜라겐 I; Col IV = 콜라겐 IV; MHC = 미오신 중쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 근원세포 세포주(C2C12 근아세포)를 사용한 dECM 재세포화. (A) 메틸 그린 염색 DNA, 팔로이딘 검출 F-액틴 및 증식 마커인 항-pH3 항체로 표지된 C2C12 세포로 집락화된 재세포화된 매트릭스의 100μm 스택의 공초점 이미지의 최대 강도 투영(자홍색 화살표). 스케일 바 = 35 μm. (B) 배양 동안 형성된 다핵(파란색 화살표는 핵을 나타냄) 미오신 중쇄-양성 근관(점선)을 보여주는 100μm 스택의 공초점 이미지의 최대 강도 투영. 스케일 바 = 35 μm. (C,D) 근아세포에서 라미닌 α2 사슬(노란색 화살표), 총 라미닌(C의 경우 마젠타 화살표) 및 피브로넥틴(D의 경우 마젠타 화살표)에 대한 세포 내 또는 세포내 염색을 보여주는 면역조직화학 컨포칼 이미지로, 새로운 단백질 합성을 시사합니다. 스케일 바 = 10 μm. 사용된 항체 및 각각의 희석액은 표 1에 열거되어 있다. 약어: pH3 = 포스포-히스톤 3; LNα2 = 라미닌 α2 사슬; LNp = 범근육 라미닌; F-N = 피브로넥틴; MHC = 미오신 중쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
ECM은 모든 조직에 존재하는 거대분자의 복잡한 네트워크로, 세포 거동과 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다2. ECM은 세포가 부착할 물리적 스캐폴드 역할을 하며 증식, 운동성, 분화 및 세포자멸사와 같은 세포 과정을 능동적으로 조절하는 신호를 제공합니다. 따라서 ECM의 적절한 형성과 유지는 발달과 항상성 모두에 필수적이다1.
2D 세포 배양 모델이 널리 사용되어 왔지만 점점 더 발전된 3D 플랫폼으로 대체되고 있습니다. 이는 2D 배양에는 세포 행동에 영향을 미치는 화학적, 물리적 단서가 부족한 반면, 3D 배양은 천연 조직에서 분자 및 세포 역학을 연구하기 위한 보다 현실적인 대안으로 간주되기 때문입니다11. 조직의 탈세포화는 다양한 조직 또는 기관 시스템에 걸친 다수의 연구에서 입증된 바와 같이 생물학적 조직의 미세 환경을 보다 밀접하게 모방하는 스캐폴드의 생산을 초래한다 14,15,23,24,25. 천연 조직 미세 환경을 복제하는 dECM의 능력은 정상적인 발달, 다양한 질병 상태, 약물이나 독소가 조직에 미치는 영향에 대한 연구에 큰 잠재력을 가지고 있습니다11.
본 연구에서 사용된 프로토콜은 출발점으로서 태아 심장 조직(14 )을 탈세포화하기 위해 Silva et al.에 의해 개발된 프로토콜에 기초한다. 여기에는 저삼투압 완충액, 음이온성 세제(SDS) 처리 및 DNase 처리의 조합이 포함됩니다. 탈세포화 프로토콜의 주요 과제 중 하나는 세포 제거와 ECM 단백질 구성 보존 사이의 균형을 찾는 것입니다. 이 3D 세포 배양 시스템을 사용하여 LAMA2-CMD의 초기 단계를 연구하는 데 중점을 두었기 때문에 탈세포화 과정에서 라미닌 211을 보존하는 데 특별한 주의를 기울였습니다. Silva et al.14 의 프로토콜은 탈세포화된 태아 근육에서 라미닌 α2 사슬 면역반응성의 손실을 초래했습니다. 이것은 사용된 SDS의 농도 때문일 수 있습니다. 따라서 낮은 농도의 SDS(0.1%, 0.05% 및 0.02%) 및 SDS를 다른 농도의 Triton X-100(0.5% 및 0.2%)으로 대체하는 것과 같은 0.2% SDS 세제 용액 단계에 대한 대안을 테스트했습니다. 최상의 결과는 24시간 동안 0.05% SDS 세제 처리를 사용하여 달성되었습니다. 이 농도는 탈세포화 후 라미닌 α2 사슬 면역반응성을 보존하면서 세포 내용물을 효과적으로 제거했습니다. 이 프로토콜은 DNA를 포함한 세포 잔기가 없는 무세포 dECM을 재현 가능하게 생성합니다.
이 연구에 사용된 프로토콜은 간질 기질 단백질(피브로넥틴 및 콜라겐 I)과 기저막 단백질(라미닌 및 콜라겐 IV)을 모두 보존합니다. 향후 연구에서는 콜라겐 VI이 근이영양증의 원인이기도 하기 때문에 콜라겐 VI도 보존되는지 여부를 평가해야 한다26. SDS는 단백질 미세 구조를 파괴하고 콜라겐을 손상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다12; 태아 골격근의 경우 라미닌 α2 면역반응성을 유지하기 위해 저농도의 SDS(0.05%)를 사용하는 것이 중요했습니다. 그러나, 웨스턴 블롯 결과는 탈세포화된 샘플이 천연 조직에 비해 라미닌 및 콜라겐의 면역검출 후 더 많은 밴드를 나타낸다는 것을 보여주며, 이는 탈세포화 과정의 결과로 일부 단백질 분해가 발생했음을 나타낸다27.
중요하게도, 재세포화 실험은 이러한 매트릭스가 세포 부착, 증식 및 분화를 일관되게 지원하는 신뢰할 수 있는 스캐폴드임을 입증합니다. SDS는 세포독성이 있는 것으로 보고되었습니다28, 따라서 매트릭스가 재세포화에 사용되는 경우 프로토콜에 포함된 세척 단계가 중요합니다. 이러한 스캐폴드는 C2C12 세포에 의해 효과적으로 집락화되었으며, 이는 세포의 3D 배양을 위한 모델 시스템으로서의 적합성을 나타냅니다. C2C12 세포를 둘러싼 ECM 단백질에 대한 세포내 및 세포주위 염색의 관찰은 세포가 dECM 내의 미세 환경에 적극적으로 기여하고 있음을 시사합니다. 또한, 분화 배지에 넣었을 때, C2C12 세포는 분화, 융합 및 dECM 내에서 근관을 형성했습니다.
이 절차에서 중요한 과제는 프로토콜 전체에서 샘플을 조작하는 것입니다. 샘플은 매우 작고 부드러우며, 미세 팁 피펫에 갇히거나 샘플이 손실되는 것을 방지하기 위해 취급에 주의와 기술이 필요합니다. 신선한 조직으로 프로토콜을 시작할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 냉동된 저장된 샘플을 사용하면 세포 내용물 제거를 방해하고 단백질 분해를 증가시켜 단백질 검출을 방해하고 탈세포화 효율을 감소시킬 수 있습니다.
소수의 연구만이 태아 조직의 탈세포화를 보고했습니다 15,29,30,31. 구체적으로, 태아 골격근의 탈세포화와 관련하여 진피, 피하 조직 및 panniculus carnosus의 복합 샘플의 탈세포화에 대해 보고된 이전 연구는 단 한 건뿐입니다 31. 저자가 아는 한, 분리된 태아 마우스 골격근에 대한 탈세포화 프로토콜이 확립된 것은 이번이 처음입니다. 이 프로토콜은 돼지 및 인간과 같은 다른 종의 태아 근육 조직에 대한 유사한 프로토콜을 만들기 위한 기초가 될 수 있다13.
E18.5 마우스 골격근을 탈세포화하기 위한 현재 프로토콜은 E18 마우스 심장에 적용한 Silva et al.14의 절차와 매우 유사합니다. 유일한 차이점은 사용된 SDS의 농도로, 태아 심장에 사용된 농도보다 상당히 낮으며(0.05% 대 0.2%), 아마도 이 두 태아 조직의 물리적 특성이 다르기 때문일 수 있습니다.
이 시험관 내 모델의 개발은 정상적인 태아 근육 발달과 관련된 과정에 대한 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 dyW 마우스 모델10에서 E18.5에서 근형성 결함으로 나타나는 LAMA2-CMD와 같은 조기 발병 근이영양증 및 근병증의 병행 조사를 가능하게 합니다. 그러나, 이 시스템은 ECM 및 근육 세포만을 포함하고, 뉴런, 내피 세포 및 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형을 포함하지 않는다는 점에서 제한적이라는 점에 유의해야 한다. 이러한 추가 세포 유형의 관련성은 질병에 따라 다를 수 있으며 이를 포함하기 위해 배양 시스템에 대한 수정이 필요할 수 있습니다. 전반적으로, 본 연구에서 기술된 바와 같이 dECM의 사용은 다양한 초기 발병 근이영양증 및 근병증의 연구에 적용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon, 계약 번호 23049), MATRIHEALTH 프로젝트 및 cE3c 단위 자금 지원 UIDB/00329/2020의 자금 지원을 받았습니다. MATRIHEALTH 프로젝트를 지원하기로 선택한 기부자 Henrique Meirelles에게 감사드립니다. 이 작업은 포르투갈 바이오이미징 플랫폼(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 참조)의 노드인 과학부 현미경 시설의 인프라를 활용했으며, 이미지 획득 및 처리에 도움을 준 Luís Marques에게 감사드립니다. 마지막으로, 기술 지원에 대해 Marta Palma와 관대 한 기여에 대해 연구팀에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
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