Summary
Bu çalışmada, fetal fare iskelet kasının desellülarize matrislerini elde etmek için bir desellülarizasyon protokolü optimize edilmiştir. C2C12 miyoblastlar bu matrisleri kolonize edebilir, çoğalabilir ve farklılaşabilir. Bu in vitro model, kas distrofileri gibi iskelet kası hastalıkları bağlamında hücre davranışını incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Hücre dışı matris (ECM), hücreler için yapısal destek sağlamada ve çeşitli hücresel süreçler için önemli olan sinyalleri iletmede çok önemli bir rol oynar. İki boyutlu (2B) hücre kültürü modelleri, hücreler ve ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri aşırı basitleştirir, çünkü tam bir üç boyutlu (3B) desteğin olmaması hücre davranışını değiştirebilir ve in vivo süreçleri anlamak için onları yetersiz hale getirebilir. ECM kompozisyonundaki eksiklikler ve hücre-ECM etkileşimleri, çeşitli farklı hastalıklara önemli katkıda bulunur.
Bir örnek, fonksiyonel laminin 211 ve 221'in yokluğunun veya azalmasının, doğumda veya hemen sonrasında tespit edilebilen ciddi hipotoniye yol açabileceği LAMA2-konjenital kas distrofisidir (LAMA2-CMD). Hastalığın bir fare modelini kullanan önceki çalışmalar, başlangıcının fetal miyogenez sırasında meydana geldiğini göstermektedir. Bu çalışma, doğal mikro çevreyi taklit ederek, kas hücreleri ve fetal kas ECM arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin veren bir 3D in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. Bu protokol, E18.5 fare fetüslerinden diseke edilen, hipotonik tampon, anyonik deterjan ve DNaz ile muamele edilen derin sırt kaslarını kullanır. Elde edilen desellülarize matrisler (dECM'ler), doğal dokuya kıyasla test edilen tüm ECM proteinlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) korudu.
C2C12 miyoblastları bu dECM'lerin üzerine tohumlandığında, çoğalmalarını ve farklılaşmalarını destekleyen dECM'lere nüfuz ettiler ve kolonize oldular. Ayrıca, C2C12 hücreleri ECM proteinleri üretti ve dECM'ler içindeki nişlerinin yeniden şekillenmesine katkıda bulundu. Bu in vitro platformun kurulması, LAMA2-CMD'nin başlangıcında yer alan süreçleri çözmek için umut verici yeni bir yaklaşım sağlar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimdeki eksikliklerin hastalığın ilerlemesine katkıda bulunduğu diğer iskelet kası hastalıklarına uyarlanma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM), hücresel olmayan bileşenlerini temsil eden dokuların önemli bir bileşenidir. Bu üç boyutlu (3B) yapı sadece hücreler için fiziksel destek sağlamakla kalmaz, aynı zamanda organizmaların gelişiminde yer alan biyokimyasal süreçlerde de çok önemli bir rol oynar1. Dokuya özgü bir ECM'nin oluşumu, çeşitli hücre içi ve hücre dışı uyaranlardan etkilenen hücreler ve nişleri arasındaki karmaşık etkileşimlerin bir sonucu olarak, gelişim sırasında ortaya çıkar. ECM, zamansal-mekansal bir şekilde kimyasal ve mekanik yeniden düzenlemelere tabi tutulan ve hücre kaderini doğrudan etkileyen oldukça dinamik bir yapıdır2. ECM'nin en dikkat çekici özelliklerinden biri, fonksiyonel çeşitliliğidir, çünkü her doku ECM, içerdiği hücrelere uyarlanmış farklı topolojiler ve özellikler sağlayan benzersiz bir molekül kombinasyonu gösterir1.
ECM sinyalizasyonu ve desteği, gelişim ve homeostaz için çok önemlidir ve bozulduğunda çoklu patolojik durumlara yol açabilir 3,4. Bir örnek, konjenital müsküler distrofinin en yaygın şekli olan LAMA2 eksikliği konjenital distrofidir (LAMA2-CMD). LAMA2 geni, laminin 211 ve laminin 221'de bulunan laminin α2 zincirini kodlar ve mutasyona uğradığında LAMA2-CMD 5'e yol açabilir. Laminin 211, iskelet kası liflerini çevreleyen bazal membranda bulunan ana izoformdur. Laminin 211 anormal veya eksik olduğunda, bazal membran ve kas hücreleri arasındaki bağlantı bozulur ve hastalığın başlangıcına yol açar6. LAMA2-CMD'li hastalar, LAMA2 genindeki mutasyon tipine bağlı olarak hafif ila şiddetli bir fenotip gösterir.
Laminin α2 proteininin işlevi etkilendiğinde, hastalar doğumda ciddi kas hipotonisi yaşayabilir ve kronik inflamasyon, fibroz ve kas atrofisi geliştirerek yaşam beklentisinin azalmasına neden olabilir. Bugüne kadar hedefe yönelik herhangi bir tedavi geliştirilmemiştir ve tedavi yaklaşımları hastalığın semptomlarını hafifletmekle sınırlıdır7. Bu nedenle, bu hastalığın başlangıcında rol oynayan altta yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, uygun terapötik stratejilerin geliştirilmesi için çok önemlidir 6,8. LAMA2-CMD için bir model olan dyW fare9'u kullanan önceki çalışmalar, hastalığın başlangıcının utero'da, özellikle fetal miyogenez10 sırasında başladığını göstermektedir. Fetal miyogenez defektinin nasıl ortaya çıktığının daha iyi anlaşılması, LAMA2-CMD için yeni terapötik yaklaşımlar üretmede bir oyun değiştirici olacaktır.
İn vitro sistemler, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar, ancak 2D kültür modelleri doğal dokuların karmaşıklığından yoksundur. Dokuların desellülarizasyonu, 2D modellere ve mühendislik / sentetik iskelelere kıyasla doğal hücre mikro ortamını daha doğru bir şekilde taklit eden doku ve gelişim aşamasına özgü asellüler ECM iskeleleri üretir. Desellülarize matrisler (dECM'ler), konakçı dokunun moleküler ve mekanik ipuçlarını koruma potansiyeline sahiptir ve bu da onları in vivo süreçleri anlamak için daha iyi alternatif modeller haline getirir11.
Hücresizleştirme için kullanılabilecek çeşitli teknikler, reaktifler ve koşullar vardır12,13. Bu çalışmada, Silva ve ark.14,15 tarafından tanımlanan fetal fare kalbi için bir desellülarizasyon protokolü, fetal fare iskelet kasına uyarlanmış ve test edilen tüm ECM bileşenlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) koruduğu bulunmuştur. Protokol üç adımdan oluşur: ozmotik şok (hipotonik tampon) ile hücre lizisi, plazma membranı çözünmesi ve protein ayrışması (% 0.05 sodyum dodesil sülfat [SDS]) ve DNA'nın enzimatik yıkımı (DNaz tedavisi). Bildiğimiz kadarıyla bu, fare fetal iskelet kasının hücre deselülizasyonu için kurulan ilk protokoldür.
Bu 3D in vitro sistemi LAMA2-CMD'yi incelemek için kullanmak için, hücresizleştirmeden sonra laminin α2 zincirini korumak çok önemlidir. Bu nedenle, farklı deterjanların (SDS ve Triton X-100) ve konsantrasyonların (% 0.02,% 0.05,% 0.1,% 0.2 ve% 0.5) test edildiği bir optimizasyon protokolü uygulanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Laminin α2 proteininin hücre çıkarılması ve korunması için en uygun seçenek %0.05 SDS olarak bulunmuştur. İyi kurulmuş bir miyoblast hücre hattı olan C2C12 hücreleri16,17, dECM'leri tohumlamak için kullanıldı. Bu hücreler dECM'yi istila eder, çoğalır ve bu iskelelerin içinde farklılaşarak yeni ECM proteinlerini sentezler. Bu 3D in vitro modelin başarılı üretimi, fetal miyogenezde, LAMA2-CMD'nin başlangıcında yer alan moleküler ve hücresel süreçleri anlamak için yeni bir yaklaşım sunar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimin bozulduğu diğer kas hastalıklarına genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm metodolojiler, Lizbon Üniversitesi Fen Fakültesi Hayvan Refahı Komitesi (ORBEA) ve Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) tarafından onaylanmıştır ve 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uygundur.
1. Hücre çözme tamponlarının ve reaktiflerinin hazırlanması
NOT: Hücre çözme protokolü sırasında kullanılan tüm çözeltiler otoklavlama ile sterilize edilmeli ve aksi belirtilmedikçe 3 aya kadar saklanmalıdır.
- Demineralize suya (dH 2 O) 137 mM'de sodyum klorür (NaCl), 2,68 mM'de potasyum klorür (KCl), 8,1 mM'de potasyum-dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4) ve 1,47mM'de disodyum hidrojen-fosfat dihidrat (Na2HPO4) ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın ve pH'ı 6,8'e ayarlayın. 1x PBS üretmek için 900 mL demineralizeH2O'ya 100 mL 10x PBS ekleyin. Otoklav yapın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın. Steril penisilin / streptomisin stok çözeltisi (10.000 U / mL penisilin ve 10 mg / mL streptomisin [kalem / strep]) kullanımdan önce% 1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
- 1.21 g Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz) ve 1 g etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1 L dH2O (10 mM Tris baz% 0.1 EDTA) içinde çözerek hipotonik tamponu hazırlayın. Çözünene kadar manyetik bir karıştırıcı kullanın ve pH'ı NaOH / HCl ile 7.8'e ayarlayın. otoklavlama ile sterilize edin ve RT'de saklayın.
- Hipotonik yıkama tamponunu, 1.21 g Tris bazını 1 L dH2O (10 mM Tris baz) içinde çözerek hazırlayın. Çözünene kadar manyetik bir karıştırıcı kullanın ve pH'ı NaOH / HCl ile 7.8'e ayarlayın. otoklav ve RT'de saklayın.
- %0,05 SDS arıtma çözeltisi üretmek için 100 mL hipotonik yıkama tamponuna 0,05 g sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyerek anyonik deterjan tedavisini hazırlayın. 0,22 μm membran filtreden süzün. RT'de 1 aya kadar saklayın.
NOT: SDS otoklavlama sırasında çökeldiği ve bozunduğu için SDS çözeltisi otoklavlanmamalıdır. - DNaz arıtma çözeltisini, 1.21 g Tris bazını 0.5 mLdH2O içinde çözerek hazırlayın ve 1 mL 1 M magnezyum klorür (MgCl2) ekleyin. NaOH / HCl. Otoklav ile pH'ı 7.8'e ayarlayın ve RT'de saklayın. kullanımdan önce DNase I ekleyin (50 U / mL).
2. Örnek toplama
NOT: Çalışmada vahşi tip C57/BL6 fareler kullanılmıştır. Tüm teknikler steril koşullar altında laminer akış başlığında gerçekleştirildi.
- Gebeliğin embriyonik gününde (E) 18.5 yetişkin hamile dişi fareleri, izofluran inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın. Fetüsleri çıkarmak için fareleri terminal diseksiyona tabi tutun.
- Farenin karnına% 70 etanol püskürtün.
- Cerrahi forseps ve makas kullanarak, alt karın bölgesindeki bir deri kıvrımını kaldırın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için U şeklinde bir kesi yapın18.
- E18.5 fetüslerini içeren uterus boynuzlarını yumurta kanallarını ve serviksi keserek toplayın ve hemen% 1 kalem / strep 18 ile buz gibi soğuk1x PBS ile bir Petri kabına aktarın.
- Fetüsleri uterustan ve ekstraembriyonik dokulardan hızla çıkarın ve makas kullanarak başlarını keserek ötenazi yapın18.
- Her seferinde bir fetüsü buz gibi soğuk 1x PBS'li bir Petri kabına aktarın. Bir stereo mikroskop kullanarak cildi çıkarın ve uzuvları kesin. Ventral taraftan, göğüs kafesini kesin ve sternumu ve altta yatan organları çıkarın.
- Fetal gövde dorsal tarafını yukarı çevirin. Vertebral kolonun servikal kısmını, dorsal yağ birikintilerini ve derin sırt kaslarının üstündeki bağ dokusunu çıkarın.
- Göğüs kafesini sabitlemek için cerrahi forseps kullanın ve derin sırt kaslarını bir mikro neşter10 kullanarak çevredeki dokulardan dikkatlice kazıyın ve ayırın. Bu prosedür, fetüs başına iki kas parçasının (sol ve sağ), her ikisi de esas olarak longissimus ve iliocostalis kaslarından oluşan, transversospinalis ve levator costarum kaslarının bir kısmının dahil edilmesiyle sonuçlanır.
- Kas örneklerini kısa süreli depolama için 4 ° C'de (<1 hafta) veya daha uzun süreler için -80 ° C'de% 1 kalem / strep ile% 1 PBS'de saklayın.
NOT: En iyi sonuçlar için taze toplanmış numuneler kullanın. Uzun süreler boyunca (>3 ay) dondurulmuş numuneler daha düşük hücre desellülarizasyon verimliliği ve daha fazla protein bozulması göstermektedir. Desellülarizasyon deneyleri için Epaxial kas kütleleri kullanılmıştır, ancak diğer kaslar (örneğin, uzuv kasları) aynı protokolü kullanarak desellülarizasyon için işlenebilir.
3. Fetal iskelet kası desellülarizasyonu
NOT: Tüm teknikler steril koşullar altında laminer akış davlumbazında gerçekleştirilmiştir. Ayrıntılı bir şematik gösterim için bkz: Şekil 1A. Tüm adımlar, aksi belirtilmedikçe, 25 ° C'de 120 mm (165 rpm) çapında bir yörüngesel çalkalayıcıda ajitasyonla gerçekleştirildi. Kullanmadan önce çözeltilere% 1 kalem / strep ekleyin. Çözeltileri çıkarırken, numunenin pipete sıkışmasını önlemek için dikkatlice aspire edin.
- 1. Gün - Epaxial kas kütlelerinden yaklaşık 2 mm x 1 mm x 1 mm (~ 3.5 mg) doku parçaları hazırlayın. 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna% 1 kalem / strep ile 3 mL hipotonik tampon ekleyin ve kuyucuk başına bir tam kas dokusu parçası ekleyin.
- Doku parçalarını hipotonik tamponda 18 saat (gecede) (O / N) ajitasyonla inkübe edin.
- 2. Gün - İnce uçlu bir pipet kullanarak hipotonik tamponu aspire edin ve numuneleri her seferinde 3 mL 1x PBS ile 3 x 1 saat yıkayın.
- Numuneleri 24 saat boyunca 3 mL% 0.05 SDS deterjan çözeltisi ile ajitasyonla inkübe edin.
NOT: (KONTROL NOKTASI) SDS inkübasyonundan sonra, numuneler görünüşte şeffaf olmalıdır. Numuneler jelatin benzeri bir kıvam gösterir ve bu nedenle sıvıları çıkarırken pipete yapışmaya daha yatkındır.
- Numuneleri 24 saat boyunca 3 mL% 0.05 SDS deterjan çözeltisi ile ajitasyonla inkübe edin.
- 3. Gün - SDS deterjan çözeltisini ince uçlu bir pipet kullanarak çıkarın ve doku parçalarını her seferinde 3 mL hipotonik yıkama tamponu ile 3 x 20 dakika karıştırarak yıkayın.
NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Numuneler hipotonik yıkama tamponunda 4 °C'de 18 saat (O/N) boyunca muhafaza edilebilir. Yıkama adımları sırasında SDS'nin iyi bir şekilde çıkarıldığından emin olun, çünkü artık SDS sitotoksik olabilir.- Doku parçalarını 37 ° C'de ajitasyon ile 2 mL DNaz çözeltisi ile 3 saat boyunca inkübe edin.
- DNaz çözeltisini ince uçlu bir pipet kullanarak çıkarın ve doku parçalarını her seferinde 3 mL 1x PBS ile 3 x 20 dakika yıkayın. Son olarak, O / N'yi ajitasyonla yıkayın (60 rpm).
NOT: DNaz tedavisinden sonra, DNA kalıntılarının varlığı nedeniyle dECM'ler yapışkan hale gelir. Bu nedenle, dikkatli yıkama gereklidir. - dECM'leri hücreselleşmeye kadar (<1 hafta) 4 °C'de %1 kalem/strep ile 1x PBS'de saklayın. Diğer kullanımlar için -80 °C'de saklayın.
4. Hücresizleştirme kalite değerlendirmesi
NOT: Desellülarizasyon sonrası artık hücre içeriğinin varlığını değerlendirmek için DNA nicelleştirme, DAPI/metil yeşili boyama ve faloidin boyama yapıldı. İmmünohistokimya ve western blot analizleri, desellülarizasyondan sonra anahtar ECM proteinlerinin tutulumunu değerlendirmek için yapıldı.
- dECM'de bulunan DNA'nın nicelleştirilmesi
NOT: DNA'nın varlığını tespit etmek için dECM'ler doğal doku ile karşılaştırılmalıdır.- Hücre sökümden önce, yüksek hassasiyetli bir dijital terazide 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü tartın. Kas örneğini tüpe aktarmadan önce, kalan tüm 1x PBS'yi bir kağıt havlu kullanarak çıkarın. Tüpü numuneyle tartın. Denklemi kullanarak numunelerin ıslak ağırlığını hesaplayın (1):
Numuneıslak ağırlığı =numuneli ağırlık tüpü - ağırlıkboş tüp (1) - Bölüm 3'te açıklanan protokolü izleyerek örnekleri hücre dışı bırakın.
- Numuneleri 2 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
NOT: Numuneler, DNA ekstraksiyonu ve nicelleştirilmesine kadar -20 ° C'de tutulabilir. - Spin kolon tabanlı bir kit kullanarak dECM'lerin ve doğal doku örneklerinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin. Sindirim tamponunu üreticinin talimatlarına göre ekleyin.
- Numuneleri bir boncuk değirmeninde her seferinde 2,5 dakika boyunca iki kez homojenize edin (montajları çevirerek) tüp başına bir tungsten karbür boncuk kullanarak (soğutulmuş tüp montajları kullanın).
- Proteinaz K ekleyin ve 56 ° C'de yavaş ajitasyonla O / N'yi inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi protokolle devam edin.
- Üretici tarafından sağlanan tamponla boşaltın ve DNA verimini artırmak için her seferinde 4 ° C'de ≥6.000 x g'de 2 x 1 dakika santrifüj yapın.
NOT: DNA, nicelleştirmeye kadar -20 ° C'de saklanabilir. - Üreticinin talimatlarını izleyerek floresan dsDNA tespit kiti kullanarak numunelerde bulunan DNA'yı sayısallaştırın.
- DNA içeriğini, numunenin orijinal ıslak ağırlığının miligramı başına DNA'nın nanogramları olarak normalleştirin.
- İki kuyruklu bir Öğrencinin t-testini kullanarak verileri analiz edin ve ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak ifade edin.
- Hücre sökümden önce, yüksek hassasiyetli bir dijital terazide 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü tartın. Kas örneğini tüpe aktarmadan önce, kalan tüm 1x PBS'yi bir kağıt havlu kullanarak çıkarın. Tüpü numuneyle tartın. Denklemi kullanarak numunelerin ıslak ağırlığını hesaplayın (1):
- İmmünohistokimya
NOT: Çözelti 1, 2 ve 3 ve fiksatif çözelti kullanımdan önce hazırlanmalıdır ve 6 aya kadar dondurulmuş halde tutulabilir. Kullanılan tüm antikorlar ve boyalar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1.- Çözümlerin hazırlanması
- 2 g paraformaldehit (PFA), 8 g sakkaroz ve 24 μL 1 M CaCl 2 ila 77 mL 0.2 M Na 2 HPO 4 ve 23 mL 0.2 M NaH 2 PO 4 ekleyerek fiksatif çözelti hazırlayın,dH 2O ekleyerek 200 mL'lik nihai hacme pH'ı7.4'e ayarlayın.
- 13.5 g Na 2 HPO 4 ve 3.2 g NaH 2 PO4 ila 1 L dH2O ekleyerek 0.12 M fosfat tamponu hazırlayın.
- 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 4 g sakkaroz ekleyerek çözelti 1'i hazırlayın.
- 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 15 g sakkaroz ekleyerek çözelti 2'yi hazırlayın.
- 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 15 g sakkaroz ve 7.5 g jelatin ekleyerek çözelti 3'ü hazırlayın. Jelatin eriyene kadar 37 °C'de ısıtın.
- Metil yeşili stok çözeltisi hazırlayın (dH 2 O içinde çözünmüş%2metil yeşil toz)19.
- İmmün tespiti
- Fiksatif çözeltiyi kullanarak numuneleri 4 °C'de en az 4 saat sabitleyin.
- Numuneleri 1x PBS ile 10 dakika boyunca 2x yıkayın.
- O/N'yi veya 1 günden fazla bir süreyi çözelti 1'de 4 °C'de tutun.
- O/N'yi yıkayın ve 4 °C'de çözelti 2'de 1 günden fazla tutun. Numunelerin RT'ye ısınmasına izin verin.
- 37 ° C'de 3 çözelti 3'te 3 saat inkübe edin. Daha sonra kullanmak üzere ekstra çözelti 3'ü 37 ° C'de tutun.
- Alüminyum folyoda kalıp küçük (2 cm x 1 cm x 1 cm) kaplar. Kalıplanmış kaba ince bir çözelti 3 tabakası yerleştirin ve ayarlanmasına izin verin. Numuneleri katılaşmış çözelti 3 üzerine yerleştirin ve ılık çözelti 3 ile örtün. Örnekleri yönlendirin ve katılaşmalarına izin verin. Katılaştırılmış çözelti 3 üzerindeki konumu renkli bir kalemle işaretleyin.
- Kapları kuru buz soğutmalı veya sıvı azot soğutmalı isopentan yüzeyine yerleştirerek dondurun.
- Optimum kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğini kullanarak, numuneleri içeren dondurulmuş jelatin küpleri kriyostat montajına sabitleyin.
- Dondurulmuş jelatin küpleri bölümlendirin ve doku bölümlerini slaytlara aktarın. 60 dakika kurumaya bırakın.
- Bölümlerin etrafındaki bir çizgiyi izlemek için hidrofobik bir işaretleyici kullanın.
- Slaytları 1x PBS'de 3 x 10 dakika yıkayın.
- Kesitleri %1 sığır serum albümini (BSA), %1 keçi serumu ve %0.05 Triton X-100 ile 1x PBS (blokaj çözeltisi) içinde 30 dakika boyunca seyreltilmiş olarak örtün (bloke adımı).
- Bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin ve bölümleri örtün. Bölümlerin kurumasını önlemek için O/N'yi 4 °C'de kapalı bir kutuda, nemli kağıtla inkübe edin.
- Slaytları 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
- İkincil antikorları bloke edici çözelti içinde seyreltin ve bölümleri örtün. Karanlıkta RT'de 1,5 saat inkübe edin.
NOT: Florofor bozulmasını önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının. - Slaytları 4x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
NOT: Güçlü bir arka plan mevcut olduğunda daha yüksek PBS konsantrasyonu kullanılabilir. - Slaytları DAPI çözeltisine (5 μg / mL 1,4-diazabicyclo-2,2,2-oktan % 0,1 Triton X-100 / 1x PBS) her biri 30 s boyunca daldırın.
- 1x PBS'de durulayın.
- Bölümleri solma önleyici ortama (1x PBS:gliserol [1:9] içinde 50 mg/mL n-propil-gallat) monte edin ve bir kapak kayması ile kapatın. Bir floresan mikroskobunda gözlem ve görüntü elde edene kadar 4 ° C'de saklayın20.
NOT: In toto immünohistokimya deneyleri için, aynı protokol (bkz. adım 4.2.2.12-4.2.2.18) kullanılmıştır, ancak numuneler daha önce RT'de 3 saat boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş% 4 PFA'da sabitlenmiştir. Kullanılan tüm antikorlar ve boyalar ve bunların ilgili seyreltmeleri Tablo 1'de listelenmiştir. Numuneler daha sonra çelik halkalarla ayrılmış iki kapak parçası arasında solma önleyici ortama monte edildi, balmumu ile yapıştırıldı ve konfokal mikroskop21 kullanılarak 100 μm görüntü yığınları elde edildi.
- Çözümlerin hazırlanması
- Batı leke analizi
NOT: Kullanılan tüm antikorlar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1.- Çözümlerin hazırlanması
- 2x SDS-PAGE yükleme tamponunu, 80 mL 100 mM Tris baz çözeltisine 20 mL gliserol, 4 g SDS ve 0,2 mL bromofenol mavisi ekleyerek hazırlayın. pH'ı 6,8'e ayarlayın. Kullanmadan önce taze ditiyotreitol (DTT) ekleyin.
- Tris tamponlu tuzlu su yıkama tamponunu, 2.4 g Tris bazı, 8.8 g NaCl ve 1 mL ara-20 ila dH2O ilave ederek Tween 20 (TBST) çözeltisi ile hazırlayın.
- 1 L dH 2 O'ya 30,2 g Tris baz, 144,2 g glisin ve 10 g SDS ekleyerek 10x çalışan arabelleği (RB) hazırlayın. Kullanmadan önce, 1x RB (çalışma çözeltisi) hazırlamak için 900 mL dH2O'ya 100 mL 10x RB ekleyin.
NOT: 10x RB RT'de birkaç ay saklanabilirken, 1x RB farklı çalıştırmalarda yeniden kullanılabilir. - 800 mLdH2O'ya 5,82 g Tris baz, 2,93 g glisin ve 0,5 g SDS ekleyerek transfer tamponunu (TB) hazırlayın. Bileşenler çözüldükten sonra, 200 mL metanol ekleyin. 4 °C'de soğutun.
NOT: TB her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
- Protein ekstraksiyonu
- E18.5 farelerden epaxial kasları toplayın ve hemen yeni eklenmiş DTT (100 mM DTT) ile 2x SDS-PAGE yükleme tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne (2 mL) yerleştirin. E18.5 dECM'yi aynı şekilde işleyin.
- Tüp başına bir tungsten karbür boncuk ekleyin. Her seferinde 2,5 dakika boyunca bir boncuk değirmeninde 2 kat homojenize edin (montajları çevirin).
- Bir ultrason banyosunda 5 dakika boyunca örnekleri sonikleştirin.
- Numuneleri 50 °C'de 10 dakika ısıtın.
- Numuneleri 12.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak proteini sayısallaştırın.
- Daha sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- Poliakrilamid jel elektroforezi
- Prekast akrilamid gradyan jeli kullanın (%4-%20)
- Jeli elektroforez tankına monte edin. Tarağı dikkatlice çıkarın. Elektroforez tankında görüntülenen çizgiye kadar 1x RB ekleyin. Kuyuların RB ile dolu olduğundan emin olun.
- Kuyucuklara numune başına 100 μg protein yükleyin. 12 μL yüksek molekül ağırlıklı protein standardı yükleyin.
- Sabit voltajla toplam 100 dakika çalıştırın (150 V'ta 10 dakika ve 185 V'ta 90 dakika).
- Aktarmak
- Jel çalışırken filtre pedlerini ve süngerleri soğutulmuş TB (4 °C) ile ıslatın.
- Poliviniliden diflorür membranlarını jelin boyutuna göre kesin. Onları metanol ile aktive edin ve dH2O ile yıkayın TB'ye batırın.
- Transfer kasetini süngerler, filtre pedleri, jeller ve aktif membranlarla üreticinin talimatlarına göre monte edin.
- Kaseti soğutulmuş TB'yi içeren elektroforez tankına yerleştirin (bir buz yatağında). Soğutma ünitesini ekleyin. 100 V'ta 90 dakika boyunca çalıştırın.
- Transferden sonra, transfer kalitesini değerlendirmek için Coomassie mavisi bir ikame ile lekeleyin.
- İmmün tespiti
- Blokaj çözeltisini hazırlayın (% 5 az yağlı süt ile TBST). Membranları RT'de 1 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin.
- TBST ile 3 x 5 s durulayın.
- O / N membranlarını, TBST'de% 2 BSA ve% 0.02 sodyum azid (membran başına 3 mL) ile seyreltilmiş birincil antikorlarla soğuk bir odada (4 ° C) ajitasyonla inkübe edin.
- Ertesi gün, TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
- Membranları, RT'de 1 saat boyunca% 5 az yağlı süt (her membran için 5 mL) ile TBST'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.
- Membranları TBST 3 x 5 dk ile yıkayın. Algılama adımına kadar TBST'de tutun.
- Ticari olarak temin edilebilen bir geliştirme kiti kullanarak proteini görselleştirin. Üreticinin talimatlarına göre algılama reaktifleri ekleyin. Grupların görüntülerini alın.
- Membran başına birden fazla antikoru test etmek için, algılama adımından sonra, TBST kullanarak eski antikorları üç yıkama (her biri 5 dakika) ile sıyırın ve 4.3.5.2-4.3.5.7 adımlarını tekrarlayın.
- Çözümlerin hazırlanması
Tablo 1: İmmünohistokimya ve batı leke analizinde kullanılan antikorlar ve boyalar ve ilgili seyreltmeler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.10,22
5. Hücre dışı matrislerde hücre kültürü
NOT: Tüm teknikler laminer akış davlumbazında steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Tüm inkübasyonlar 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile gerçekleştirildi.
- Hücre kültürü ortamını, yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 kalem / strep (tam kültür ortamı) ile desteklenmiş, stabil glutamin ve sodyum piruvat (DMEM) ile hazırlayın.
- dECM'leri laminer akış başlığında %1 kalem/strep ile 1x PBS'de bir Petri kabına yerleştirin ve mikro neşter ve cımbız kullanarak yaklaşık 500 μm x 500 μm x 250 μm'lik parçalara ayırın.
NOT: dECM'ler yumuşak bir dokuya sahiptir ve bu nedenle mikro neşterle kesmek yerine yaklaşık olarak aynı boyutta parçalara ayırmak için cımbız kullanmak genellikle daha kolaydır. - Parçaları, daha önce 37 ° C'ye ısıtılmış 200 μL tam kültür ortamına sahip 96 delikli bir plakaya (kuyucuk başına üç veya dört parça) aktarın. İnkübatörde 2 saat inkübe edin.
- Alt konfluent (~% 70) C2C12 hücreleri ile tohumlanmış bir T25 şişesine 500 μL tripsin ekleyin. 1 mL tam ortamda tekrar askıya alın.
- 10 μL Tripan mavisi boyaya 10 μL resüspansiyon ekleyin ve bir hemositometreye yükleyin. Hücre numarasını sayın ve hesaplayın ve hücre canlılığını onaylayın.
- Ortamı dECM'leri içeren 96 delikli plakadan aspire edin ve 50.000 canlı C2C12 hücresi içeren 200 μL tam kültür ortamı ekleyin.
- 2 gün boyunca inkübe edin ve daha sonra cımbız kullanarak, dECM'leri (hücrelerle birlikte) 400 μL tam kültür ortamına sahip 48 delikli bir plakaya aktarın. Her 2 günde bir, dECM'lerin kuyunun dibinden ayrılmasını önlemek için ortamı bir mikropipetle dikkatlice aspire edin ve 8. güne kadar taze ortam ekleyin.
NOT: Matrisler, dECM'lere C2C12 hücre yapışmasını teşvik etmek için 96 delikli plakalarda 2 gün bekletilir ve daha sonra besinlerle daha büyük hacimli bir ortama erişim sağlamak için 48 delikli bir plakaya aktarılır. dECM'ler kuyuların dibine yapışmalıdır. - Farklılaşma deneyi için, tüm kültür ortamını 8. günde farklılaştırma ortamı (DMEM% 2 at serumu ve% 1 kalem / strep ile desteklenmiş) ile değiştirin, ardından 12. güne kadar 4 gün boyunca farklılaşma ortamında inkübasyon yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Desellülarizasyon protokolünün amacı, doğal dokunun bileşimine çok benzeyen dECM'ler üretmektir. Desellülarizasyon sürecinin etkinliğini belirlemek için, doku morfolojisinin incelenmesi, DNA seviyelerinin ölçülmesi, F-aktin için boyama ve immünohistokimya ve batı lekeleme teknikleri kullanılarak anahtar ECM bileşenlerinin analizi dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Spesifik olarak, iskelet kası dokularının beş ana ECM bileşeni analiz edildi.
Protokol boyunca, örnekler görünüşte değişir (Şekil 1B 1-4). İzolasyondan sonra, kas dokusu miyoglobin varlığından dolayı kırmızımsı görünür (Şekil 1B1). Hücreleri lize eden ve sitoplazmatik proteinlerin çoğunu uzaklaştıran hipotonik tamponda inkübasyondan sonra, numuneler beyaza döner (Şekil 1B2). Doku desellülarizasyonunda yaygın olarak kullanılan anyonik bir deterjan olan SDS,12, sitoplazmik ve nükleer malzemenin yanı sıra membranları da etkili bir şekilde uzaklaştırır. Sonuç olarak, numuneler SDS işleminden sonra daha şeffaf hale gelir (Şekil 1B3). Bununla birlikte, yüksek konsantrasyonlar veya bu deterjana uzun süre maruz kalmak, protein denatürasyonuna, glikozaminoglikanların kaybına ve kollajen liflerinin bozulmasına neden olabilir12. Hücre çıkarılması ve ECM'nin korunması arasındaki optimum denge, Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, 24 saat boyunca% 0.05 SDS kullanılarak elde edilir. Son olarak, DNA, DNaz tedavisi ile çıkarılır, bu da SDS tedavisinden biraz daha küçük olan şeffaf dECM iskeleleri ile sonuçlanır (Şekil 1B4).
Desellülarizasyon protokolünün başarısı, işlemden sonra matrislerde bulunan artık DNA miktarı ile gösterilir. DNA nicelleştirmesi, doğal dokuya kıyasla dECM'lerde yaklaşık% 100'lük bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 1C). DAPI boyaması ayrıca dECM'lerde DNA yokluğunu doğrulamaktadır (Şekil 2B, D, F, H, J).
Beş ana ECM proteininin varlığı desellülarizasyon sonrası immünohistokimya ve western blot ile değerlendirildi ve doğal doku ile karşılaştırıldı. Laminin α2 alt birimi (Şekil 2A,B) ve toplam lamininler (Şekil 2C,D) için immün boyama, dECM'lerin bu proteinler için (Şekil 2B,D'deki oklar), doğal dokudaki miyotüpleri çevreleyen laminin matrisine benzer şekilde (Şekil 2A,C'deki oklar) boru şeklinde bir boyama gösterdiğini göstermektedir. Laminin α2 alt birimi için Western blot analizi, doğal dokuda iki bandın varlığını ortaya koyarken (Şekil 2A'), beklenenden daha küçük moleküler ağırlığa sahip üç bant dECM'de tespit edilebilir (Şekil 2B'). Bu, desellülarizasyon işlemi sırasında protein bozulmasının veya çıkarılmasının bir sonucu olabilir. Toplam lamininler için Western blot analizi, doğal dokudan alınan örneklere kıyasla dECM'de bu proteinlerin bir miktar parçalanmasını göstermektedir (Şekil 2C',D').
Şekil 1: Fetal iskelet kası desellülarizasyon prosedürü ve doku morfolojisi ile DNA içeriğinin değerlendirilmesi. (A) Desellülarizasyon protokolünün şematik gösterimi. (B) Protokol boyunca, taze toplananlardan hücre dışı dokuya kadar doku morfolojisi. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) Doğal dokuya kıyasla dECM'lerde bulunan DNA'nın miktarı. Ortalama olarak ifade edilen veriler ± SEM. Student's t-test, iki kuyruklu **p < 0.01. Desellülarizasyon protokolü, hücresel olmayan dECM'ler üreten nükleer içeriği etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Kısaltmalar: dECM'ler = desellülarize matrisler; PBS = fosfat tamponlu salin; SDS = sodyum dodesil sülfat; NT = doğal doku. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Fibronektin (Şekil 2E,F) ve kollajen I (Şekil 2G,H) için immün boyama, bu proteinlerin doğal dokudaki hücreler arasındaki interstisyel boşlukta (Şekil 2E,G'deki oklar) ve dECM'lerde benzer bir boyanmayı (oklar Şekil 2F,H) gösterir. Western blot analizi, her iki durumda da fibronektin için benzer bantlar göstermektedir (Şekil 2E', F'), bu proteinin desellülarizasyon işleminden özellikle etkilenmediğini göstermektedir. Bununla birlikte, kollajen I durumunda (Şekil 2G',H') dECM'lerde daha az bant vardır, bu da bir dereceye kadar bozulmayı gösterir. Kollajen IV için immün boyama, doğal dokuda tübüler bir boyama paterni (Şekil 2I'deki ok) ve dECM'de benzer bir boyama gösterir, ancak tübüler yapılar daha dardır (Şekil 2J'deki ok). Kollajen IV için Western blot analizi, doğal dokuda üç bandın varlığını ortaya koymaktadır (Şekil 2I'). Aynı üç bant dECM'lerde gözlenirken (Şekil 2J'), bunların moleküler ağırlığı beklenenden daha düşüktür. Laminin α2'ye benzer şekilde, bu, desellülarizasyon sırasında protein bozulmasının veya uzaklaştırılmasının bir sonucu olabilir.
dECM'ler daha sonra C2C12 miyoblastları ile tohumlanır ve tam kültür ortamında 8 gün boyunca kültürlenir. C2C12 hücreleri dECM'leri kolonize eder ve fosfo-histon 3 nükleer boyama ile gösterildiği gibi çoğalır (Şekil 3A'daki oklar). Farklılaşma ortamında ilave 4 günlük bir kültürden sonra, C2C12 hücreleri farklılaşır ve bir miyozin ağır zinciri (Şekil 3B'deki kesikli çizgi) eksprese eden çok çekirdekli (Şekil 3B'deki mavi oklar) miyotüplere kaynaşır. İlginç bir şekilde, laminin α2 zinciri (Şekil 3C, D'deki sarı oklar), toplam lamininler (Şekil 3C'deki macenta ok) ve fibronektin (Şekil 3D'deki macenta ok) için hücre içi ve / veya perisellüler boyama, tam kültür ortamında kültürlenen C2C12 hücrelerinde tespit edilebilir, bu da bu hücrelerin bu ECM proteinlerini de novo sentezleyebildiğini düşündürmektedir., bu nedenle nişlerinin oluşumuna katkıda bulunur. Bu sonuçlar, desellülarizasyon protokolünün, C2C12 miyoblastlarının çoğalabileceği, farklılaşabileceği ve çok çekirdekli miyotüpler oluşturabileceği bir dECM mikro ortamı oluşturduğunu göstermektedir.
Şekil 2: Beş ECM proteininin doğal ve desellülarize E18.5 fetal kas dokusunda değerlendirilmesi. Doğal doku kesitlerinde (A,C,E,G,I) immünohistokimya ve dECM'lerin (B,D,F,H,J) DAPI, bir DNA belirteci, F-aktin'i saptayan faloidin ve ECM proteinleri ile boyanması. Ölçek çubuğu = 15 μm. Doğal dokuda, miyofiberleri (A, C, I; sarı oklar) çevreleyen lamininler ve kollajen IV için immün boyama mevcuttur ve miyofiberler (E, G; sarı oklar) arasındaki interstisyel boşlukta fibronektin ve kollajen I için boyama tespit edilir. dECM'lerde, lamininler ve kollajen IV (B, D, J; sarı oklar) için boyama, desellülarizasyondan sonra miyofiberlerin bıraktığı boşlukları çevreleyen boru şeklinde bir desen gösterir. Fibronektin ve kollajen I dECM'lerin immün boyaması, interstisyel boşluktaki varlıkları ile tutarlıdır (F, H; sarı oklar). (A'-J') Doğal dokuda (A',C',E',G',I') ve dECM örneklerinde (B',D',F',H',J') beş ECM proteini için Western blot analizi. Her iki yaklaşım da desellülarizasyondan sonra protein korunumunu göstermektedir. Kullanılan antikorlar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1'de listelenmiştir. Kısaltmalar: LNα2 = laminin α2 zinciri; LNp = pan-kas lamininleri; FN = fibronektin; Kol I = kollajen I; Col IV = kollajen IV; MHC = miyozin ağır zincir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Bir miyoblast hücre hattı (C2C12 miyoblastlar) ile dECM resellülarizasyonu. (A) Metil yeşili boyama DNA'sı ile etiketlenmiş C2C12 hücreleri, F-aktin'i tespit eden faloidin ve bir proliferasyon belirteci (macenta okları) olan anti-pH3 antikoru ile kolonize edilmiş 100 μm'lik bir resellülarize matris yığınının konfokal görüntüsünün maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 35 μm. (B) Kültür sırasında oluşan çok çekirdekli (mavi oklar çekirdekleri gösterir) miyozin ağır zincir-pozitif miyotüp (kesikli çizgi) gösteren 100 μm'lik bir yığının konfokal görüntüsünün maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 35 μm. (C,D) Miyoblastlarda laminin α2 zinciri (sarı oklar), toplam lamininler (C'de macenta oklar) ve fibronektin (D'de macenta okları) için hücre içi veya peri-hücre boyamayı gösteren immünohistokimya konfokal görüntüsü, de novo protein sentezini düşündürmektedir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kullanılan antikorlar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1'de listelenmiştir. Kısaltmalar: pH3 = fosfo-histon 3; LNα2 = laminin α2 zinciri; LNp = pan-kas lamininleri; FN = fibronektin; MHC = miyozin ağır zincir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM, tüm dokularda bulunan ve hücre davranışını ve fonksiyonunu düzenlemede çok önemli bir rol oynayan karmaşık bir makromolekül ağıdır2. ECM, hücrelerin bağlanması için fiziksel bir iskele görevi görür ve proliferasyon, motilite, farklılaşma ve apoptoz gibi hücresel süreçleri aktif olarak modüle eden ipuçları sağlar. Bu nedenle, ECM'nin uygun şekilde oluşturulması ve sürdürülmesi hem gelişim hem de homeostaz1 için gereklidir.
2D hücre kültürü modelleri yaygın olarak kullanılırken, giderek daha gelişmiş 3D platformlarla değiştirilmektedir. Bunun nedeni, 2D kültürlerin hücre davranışını etkileyen kimyasal ve fiziksel ipuçlarından yoksun olması, 3D kültürlerin ise doğal dokulardaki moleküler ve hücresel dinamikleri incelemek için daha gerçekçi bir alternatif olarak kabul edilmesidir11. Dokuların desellülarizasyonu, çeşitli doku veya organ sistemlerinde yapılan bir dizi çalışmada gösterildiği gibi, biyolojik dokuların mikro ortamlarını daha yakından taklit eden iskelelerin üretilmesiyle sonuçlanır 14,15,23,24,25. dECM'lerin doğal doku mikro ortamlarını çoğaltma yeteneği, normal gelişim, çeşitli hastalık durumları ve ilaçların veya toksinlerin dokular üzerindeki etkisi üzerine araştırmalar için büyük bir potansiyele sahiptir11.
Bu çalışmada kullanılan protokol, Silva ve ark. tarafından fetal kalp dokusu14'ün hücre dışı bırakılması için bir başlangıç noktası olarak geliştirilen protokole dayanmaktadır. Hipotonik tampon, anyonik deterjan (SDS) ile tedavi ve DNaz tedavisinin bir kombinasyonunu içerir. Desellülarizasyon protokollerindeki ana zorluklardan biri, hücrelerin çıkarılması ve ECM protein bileşiminin korunması arasında bir denge bulmaktır. LAMA2-CMD'nin erken aşamalarını incelemek için bu 3D hücre kültürü sistemini kullanmaya odaklandığımız göz önüne alındığında, hücresizleştirme sırasında laminin 211'in korunmasına özel önem verildi. Silva ve ark.14'ün protokolü, desellülarize fetal kaslarda laminin α2 zincir immünoreaktivitesinin kaybına yol açmıştır; bu, kullanılan SDS konsantrasyonundan kaynaklanıyor olabilir. Bu nedenle, daha düşük SDS konsantrasyonları (% 0,1,% 0,05 ve% 0,02) ve SDS'nin farklı Triton X-100 konsantrasyonları (% 0,5 ve% 0,2) ile ikame edilmesi gibi% 0.2 SDS deterjan çözeltisi adımına alternatifler test edilmiştir. En iyi sonuçlar, 24 saat boyunca% 0.05 SDS deterjan tedavisi kullanılarak elde edildi. Bu konsantrasyon, desellülarizasyondan sonra laminin α2 zincir immünoreaktivitesini korurken hücre içeriğini etkili bir şekilde uzaklaştırdı. Bu protokol, DNA da dahil olmak üzere hücresel kalıntılardan arındırılmış asellüler dECM'leri yeniden üretilebilir şekilde üretir.
Bu çalışmada kullanılan protokol hem interstisyel matriks proteinlerini (fibronektin ve kollajen I) hem de bazal membran proteinlerini (lamininler ve kollajen IV) korur. Gelecekteki çalışmalar, kollajen VI'nın da kas distrofilerinde bir oyuncu olduğu için korunup korunmadığını değerlendirmelidir26. SDS'nin protein ultrayapısını bozabileceği ve kollajenlere zarar verebileceği bilinmektedir12; fetal iskelet kası için, laminin α2 immünoreaktivitesini korumak için düşük konsantrasyonda SDS (% 0.05) kullanmak önemliydi. Bununla birlikte, batı leke sonuçları, desellülarize numunelerin, lamininlerin ve kollajenlerin immün tespitinden sonra doğal dokuya kıyasla daha fazla bant gösterdiğini ve bazı protein bozulmalarının desellülarizasyon işleminin bir sonucu olarak meydana geldiğini göstermektedir27.
Önemli olarak, resellülarizasyon deneyleri, bu matrislerin hücre yapışmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını sürekli olarak destekleyen güvenilir iskeleler olduğunu göstermektedir. SDS'nin sitotoksik28 olduğu bildirilmiştir ve bu nedenle matrisler resellülarizasyon için kullanılacaksa protokolde yer alan yıkama adımları çok önemlidir. Bu iskeleler, C2C12 hücreleri tarafından etkili bir şekilde kolonize edildi ve bu da hücrelerin 3D kültürü için model bir sistem olarak uygunluklarını gösterdi. C2C12 hücrelerini çevreleyen ECM proteinleri için hücre içi ve hücre içi boyamanın gözlemlenmesi, hücrelerin dECM'ler içindeki mikro çevrelerine aktif olarak katkıda bulunduğunu göstermektedir. Ek olarak, farklılaşma ortamına yerleştirildiğinde, C2C12 hücreleri dECM'ler içinde farklılaştı, kaynaştı ve miyotüpler oluşturdu.
Bu prosedürdeki önemli bir zorluk, örneklerin protokol boyunca manipüle edilmesidir. Numuneler çok küçük ve yumuşaktır, ince uçlu pipete sıkışmayı ve numunelerin kaybolmasını önlemek için elleçlemede özen ve beceri gerektirir. Protokole taze doku ile başlandığında en iyi sonuçlar elde edilir. Dondurulmuş, depolanmış numunelerin kullanılması, hücresel içeriğin uzaklaştırılmasını engelleyebilir ve protein bozulmasının artmasına neden olabilir, protein tespitini engelleyebilir ve hücre dışı bırakma verimliliğini azaltabilir.
Sadece birkaç çalışma fetal dokuların desellülarizasyonunu bildirmiştir 15,29,30,31. Spesifik olarak, fetal iskelet kasının desellülarizasyonu ile ilgili olarak, sadece bir önceki çalışmada dermis, deri altı doku ve panniculus carnosus31'in kompozit örneklerinin desellülarizasyonu bildirilmiştir. Yazarların bilgisinin en iyisi, izole edilmiş fetal fare iskelet kası için ilk kez bir hücre desellülarizasyon protokolü oluşturulmuştur. Bu protokol, domuzlar ve insanlar gibi diğer türlerin fetal kas dokuları için benzer protokollerin oluşturulması için bir temel oluşturabilir13.
E18.5 fare iskelet kasının hücre deselülizasyonu için mevcut protokol, onu bir E18 fare kalbine uygulayan Silva ve ark.14'ün prosedürüne çok benzer. Tek fark, muhtemelen bu iki fetal dokunun farklı fiziksel özelliklerinden dolayı, fetal kalp için kullanılandan (% 0.05'e karşı% 0.2) oldukça düşük olan SDS konsantrasyonudur.
Bu in vitro modelin geliştirilmesi sadece normal fetal kas gelişiminde yer alan süreçlerin incelenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda dyW fare modeli10'da E18.5'te miyogenez defekti olarak ortaya çıkan LAMA2-CMD gibi erken başlangıçlı kas distrofilerinin ve miyopatilerin paralel olarak araştırılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu sistemin sadece ECM ve kas hücrelerini içermesi ve nöronlar, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi diğer hücre tiplerini içermemesi nedeniyle sınırlı olduğu belirtilmelidir. Bu ek hücre tiplerinin alaka düzeyi hastalığa bağlı olarak değişebilir ve bunları dahil etmek için kültür sisteminde değişiklikler yapılması gerekebilir. Genel olarak, bu çalışmada tarif edildiği gibi dECM'lerin kullanımı, çeşitli erken başlangıçlı kas distrofileri ve miyopatilerin çalışmasında uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; sözleşme no. 23049), MATRIHEALTH projesi ve UIDB/00329/2020 tarafından finanse edilen cE3c birimi tarafından finanse edilmiştir. MATRIHEALTH Projesi'ni desteklemeyi seçen bağışçımız Henrique Meirelles'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Portekiz BioImaging Platformunun bir düğümü olan Fen Fakültesi Mikroskopi Tesisi'nin altyapılarından yararlanmıştır (referans PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ve Luís Marques'e görüntü edinme ve işleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Son olarak, teknik destek için Marta Palma'ya ve cömert katkıları için araştırma ekibimize teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
