Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantifisering av fagocytosekapasitet i høyt polariserte humane retinale pigmentepitelkulturer

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Denne protokollen beskriver en lipofuscinakkumuleringsmodell i svært differensierte og polariserte humane retinalpigmentepitelkulturer (RPE) og en forbedret ytre segment (OS) fagocytoseanalyse for å oppdage det totale OS-forbruket / nedbrytningskapasiteten til RPE. Disse metodene overvinner begrensningene i tidligere lipofuscinmodeller og klassiske pulsjakt ytre segmentfagocytoseanalyser.

Abstract

Den daglige fagocytosen av fotoreceptorens ytre segmenter av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar til akkumulering av et intracellulært aldringspigment kalt lipofuscin. Toksisiteten av lipofuscin er godt etablert i Stargardts sykdom, den vanligste arvelige retinal degenerasjonen, men er mer kontroversiell i aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), den ledende årsaken til irreversibel blindhet i den utviklede verden. Bestemmelse av lipofuscintoksisitet hos mennesker har vært vanskelig, og dyremodeller av Stargardts har begrenset toksisitet. Derfor er in vitro-modeller som etterligner human RPE in vivo nødvendig for bedre å forstå lipofuscingenerering, clearance og toksisitet. Flertallet av cellekulturlipofuscinmodeller hittil har vært i cellelinjer eller har involvert fôring av RPE en enkelt komponent av den komplekse lipofuscinblandingen i stedet for fragmenter / tips av hele fotoreceptorens ytre segment, noe som genererer en mer komplett og fysiologisk lipofuscinmodell. Beskrevet her er en metode for å indusere akkumulering av lipofuscinlignende materiale (kalt ufordøyelig autofluorescensmateriale, eller UAM) i høyt differensiert primær human prenatal RPE (hfRPE) og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) avledet RPE. UAM akkumulert i kulturer ved gjentatte tilførseler av ultrafiolette lysbehandlede OS-fragmenter tatt opp av RPE via fagocytose. De viktigste måtene som UAM tilnærmer seg og skiller seg fra lipofuscin in vivo diskuteres også. Sammen med denne modellen av lipofuscinlignende akkumulering innføres avbildningsmetoder for å skille det brede autofluorescensspekteret av UAM-granulater fra samtidig antistofffarging. Til slutt, for å vurdere virkningen av UAM på RPE-fagocytosekapasitet, er det innført en ny metode for å kvantifisere ytre segmentfragment / tipsopptak og sammenbrudd. Kalt "Total Consumptive Capacity", overvinter denne metoden potensielle feiltolkninger av RPE-fagocytosekapasitet som ligger i klassiske ytre segment "pulsjakt" analyser. Modellene og teknikkene introdusert her kan brukes til å studere lipofuscingenerering og clearanceveier og antatt toksisitet.

Introduction

Retinalpigmentepitelet (RPE) gir kritisk støtte til overliggende fotoreceptorer, inkludert daglig opptak og nedbrytning av fotoreceptorens ytre segmentspisser eller fragmenter (gjennom denne protokollen står forkortelsen OS for OS-tips eller fragmenter i stedet for hele ytre segmenter). Dette daglige opptaket i postmitotisk RPE overbelaster til slutt fagolysosomal kapasitet og fører til oppbygging av ufordøyelig, autofluorescerende intracellulært materiale, kalt lipofuscin. Interessant nok har flere studier også vist at RPE lipofuscin kan akkumuleres uten OS-fagocytose 1,2. Lipofuscin har mange komponenter, inkludert kryssbundne addukter avledet fra visuelle syklusretinoider, og kan oppta nesten 20% av RPE-cellevolumet for de over 80 år3.

Hvorvidt lipofuscin er giftig har vært heftig debattert. Stargardts sykdom er en autosomal recessiv degenerasjon av fotoreceptorene og RPE der en mutasjon i ABCA4 utløser feil behandling av visuelle syklusretinoider inneholdt i fotoreceptorens ytre segmenter. Feil retinoidbehandling fører til avvikende kryssbinding og dannelse av bis-retinoidarter, inkludert bis-retinoid N-retinyliden-N-retinyletanolamin (A2E). Studier har vist flere mekanismer for A2E toksisitet 4,5. Lipofuscin bidrar til fundus autofluorescenssignaler under klinisk bildebehandling, og både Stargardts pasienter og dyremodeller viser økt fundus autofluorescens før retinal degenerasjon, noe som tyder på en sammenheng mellom lipofuscinnivåer og toksisitet 6,7. Men med alderen akkumuleres lipofuscin hos alle mennesker uten å utløse en RPE-degenerasjon. Videre, i aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), hvor RPE-degenerasjon bare forekommer hos eldre pasienter, har de med tidlige og mellomliggende former for sykdommen mindre fundus autofluorescenssignaler enn aldersmatchede ikke-syke mennesker8. Disse kliniske funnene er verifisert på histologisk nivå samt 9,10.

Dyremodeller av RPE lipofuscin akkumulering har også forlatt noen tvetydighet om lipofuscin toksisitet. ABCA4 knockout-musen viser ikke retinal degenerasjon på pigmentert bakgrunn, mens den gjør det på albinobakgrunn eller når den utsettes for blått lys11,12. Videre er toksisiteten av lipofuscin avledet via ABCA4 knockout sannsynligvis forskjellig fra den langsommere akkumulerende lipofuscin som oppstår med naturlig aldring, som sett i AMD13.

In vitro-modeller av lipofuscinakkumulering gir et alternativ til å studere effekten av lipofuscinakkumulering på RPE-helse. Slike modeller tillater manipulering av lipofuscinkomponenter, fra fôring av enkelt retinoidkomponenter til fôring av OS, og tillater studier i RPE fra mennesker i stedet for dyr. I de siste par tiårene har flere metoder blitt utviklet for å modellere RPE lipofuscin i kultur. Sammen med andre grupper matet Dr. Boultons gruppe bovine OS daglig i opptil tre måneder på passasje 4 til 7 humane primære RPE-celler fra givere i alderen 4 til 85 år14. Alternativt har hemming av autofagi også ført til akkumulering av lipofuscin i passasjer 3 til 7 primære humane RPE-kulturer15. Imidlertid klarte ikke subletal lysosomal hemming i høyt differensiert, passasje 1, primær human prenatal RPE (hfRPE) kulturer å indusere lipofuscin, selv med gjentatt tillegg av OS daglig16.

Som en mer reduksjonistisk tilnærming har andre matet enkle lipofuscinkomponenter til kulturer, spesielt bis-retinoid A2E 4,17. Slike studier er verdifulle ved at de definerer potensielle direkte toksisitetsmekanismer for individuelle lipofuscinkomponenter, noe som innebærer for eksempel lysosomalt kolesterol og ceramidhomeostase18. Samtidig er det debatt om toksisiteten til A2E19, og å mate den direkte til celler omgår den typiske veien for lipofuscinakkumulering, som involverer fagocytose av fotoreceptor OS. I et forsøk på å levere alle komponenter av lipofuscin til RPE-kulturer, renset Boulton og Marshall lipofuscin fra menneskelige øyne og matet dette til passasje 4 til 7 menneskelige primære RPE-kulturer avledet fra både føtale og eldre menneskelige givere20. Selv om den er nyskapende, representerer denne metoden en begrenset lipofuscinkilde for gjentatte eksperimenter.

Mens gjentatte feedings av OS til RPE-kulturer produserer lipofuscin i mange systemer, unnlater det å gjøre det i svært differensierte primære RPE-kulturer16. Fotooksiderende OS induserer kryssbindingsreaksjoner som bis-retinoiddannelse som naturlig oppstår under lipofuscindannelse in vivo. Dette kan akselerere lipofuscinlignende granulatdannelse i RPE-kultursystemer, selv de som er svært differensierte og resistente mot lipofuscinakkumulering16. Her introduseres en metode for å indusere lipofuscinlignende granulatakkumulering i svært differensiert hfRPE og human iPSC-RPE, modifisert fra Wihlmarks publiserte protokoll21. Denne metoden har fordelen av å indusere lipofuscinlignende granulater ved bruk av samme kilde (fotoreseptor OS) og vei (fagolysosomalt OS-opptak) som forekommer for lipofuscinogenese in vivo. Videre er det gjort på menneskelige RPE-kulturer som er svært differensiert og validert i flere studier for å replikere human RPE in vivo22,23,24. Disse lipofuscinlignende granulatene kalles ufordøyelig autofluorescerende materiale (UAM), og gir data og diskusjon i denne protokollen som sammenligner UAM med in vivo lipofuscin. Sammen med metoder for å bygge og evaluere UAM-ladede kulturer i svært differensiert human RPE, introduseres også en oppdatert metode for å vurdere RPE OS-fagocytose. Flere gode pulsjaktmetoder for å kvantifisere OS-fagocytose har blitt introdusert, inkludert Western blotting, immunocytochemistry og FACS25,26,27. Men tidlig i OS-pulsjakten kan forhold som fører til dårlig OS-opptak sammenflettes med forhold som fremmer rask nedbrytning av internalisert OS. Metoden som presenteres her måler den totale mengden introdusert OS som er fullt konsumert / degradert av RPE ("Total Consumptive Capacity"), noe som bidrar til å eliminere denne tvetydigheten. Det forventes at innsikt om lipofuscintoksisitet ved bruk av disse protokollene, inkludert effekter på OS-fagocytosehastigheter ved bruk av metoden "Total Consumptive Capacity", vil bli brukt til å kaste lys over toksisiteten av lipofuscin in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nåværende protokollen som involverer oppkjøp og bruk av humant vev ble gjennomgått og godkjent av University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486).

1. Fremstilling av fotooksiderte ytre segmentspisser og fragmenter

MERK: Mørketilpassede storfe netthinner ble kjøpt og sendt på is (se materialfortegnelse). Fra disse netthinnene ble OS renset etter en tidligere publisert protokoll23.

  1. Ytre segment tverrbinding med en UV-lampe
    1. Dypp polytetrafluoretylenbelagte lysbilder (se materialfortegnelse) helt ned i 70 % etanol i 10 minutter i et biosikkerhetsskap for å sterilisere lysbildene. La lysbildene lufttørke i en steril 100 mm cellekulturfat.
    2. Plasser hvert lysbilde i en ny 100 mm cellekulturskål og tilsett 200 μL serumholdige cellekulturmedier (hvilket medium som vanligvis brukes til RPE-kulturer for hånden) i hvert rektangel, og plasser deretter et håndholdt 254 nm UV-lys (se materialfortegnelse) på 100 mm cellekulturfat (uten lokk) med pære rett mot lysbildet, og eksponere i 20 min. Mediene spesifikt brukt til denne studien og de spesifikke produktnumrene for komponentene i mediene har tidligere blitt publisert22,23. Dette mediet kalles "RPE media" gjennom hele denne protokollen.
      MERK: UV-behandling av mediet blokkerer glassoverflaten og forhindrer OS i å feste seg under de neste trinnene.
    3. Tine frosne alikoter av OS ved 37 °C (i hånd eller via vannbad). Mengden operativsystem som trengs, avhenger av applikasjonen. Generelt kan man behandle opptil 500 μL på 2 x 108 OS/ml per rektangel på lysbildet.
    4. Når det er tint, snurrer du operativsystemet ved 2400 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer umiddelbart supernatanten i biosikkerhetskabinettet ved hjelp av en pipette i stedet for et vakuum for å forhindre utilsiktet tap av pelleten.
    5. Bryt pelleten forsiktig med steril PBS.
      MERK: Hold oversikt over volumet som er resuspendert og konsentrasjonen som forventes. f.eks. resuspendering av pelleten fra et 1 ml rør på 1 x 10 8 OS/ml med 500 μL PBS gir 2 x 108 OS/ml. Maksimalt volum og konsentrasjon per rektangel på det polytetrafluoretylenbelagte lysbildet er 500 μL på 2 x 108 OS / ml.
    6. Aspirer mediet fra lysbildene og plasser opptil 500 μL 2 x 108 OS/ml PBS-oppløsning på hvert rektangel i lysbildet. Plasser det håndholdte UV-lyset over cellekulturfatet (uten lokk) med pæren rett mot operativsystemet. Utsett OS-løsningen for 254 nm lys i 40 minutter.
      MERK: I løpet av 40 min eksponering, dekk UV-lampen og fatet med et håndkle eller absorberende pute, lukk biosikkerhetsskaprammen og slå av blåseren. Dette vil forhindre at det oppstår betydelig fordampning. Hvis UV-lampen som brukes i denne protokollen ikke er tilgjengelig for en forsker, er det to alternativer for å sikre at riktig mengde tverrbinding oppnås. Den første er å følge den kvantitative UV-eksponeringen som er skissert i trinn 1.2, enten med enheten som er skissert i trinn 1.2 eller en annen enhet som kan gi samme kvantitative strålingseksponering som nevnte enhet i 1.2. Et annet alternativ er å utsette OS for UV-bestråling i en tid som induserer graden av kryssbinding på Coomassie-flekken sett i figur 1C.
    7. Samle den behandlede OS PBS-løsningen i sterile mikrosentrifugerør, vask rektangelet på det belagte lysbildet med 200-500 μL PBS (2-3x), og samle hver vask i mikrosentrifugerøret. Når du er ferdig, se på lysbildet under et vevskulturrommikroskop for å bekrefte at nesten alle operativsystemer er fjernet fra lysbildet.
    8. Spinn ned OS PBS-oppløsningen ved 2400 x g i 5 minutter ved romtemperatur, aspirer PBS i biosikkerhetskabinettet med en pipettor, og resuspender i 500 μL standardmedier som skal brukes til RPE-kulturer (f.eks. - "RPE-medier" definert i avsnitt 1.1.2). Resuspensjonsvolumet kan justeres basert på ønsket fotooksidert OS (OxOS) konsentrasjon.
    9. Plasser 10 μL av suspensjonen i et nytt mikrosentrifugerør, fortynn 50-100x med flere cellekulturmedier, og telle operativsystemer med et hemocytometer.
    10. Basert på OS-tellingen, fortynn OxOS-suspensjonen til en endelig stamkonsentrasjon. For fôring av svært modne RPE-kulturer i 24-brønns transbrønner (overflateareal på 0,33 cm 2; se materialfortegnelse), anbefales en endelig mediekonsentrasjon på2 x 107 OS/ml.
      1. For å oppnå dette, distribuer OxOS i 25 μL alikoter ved en 5,6 x 107 OS / ml konsentrasjon, suspendert i standard RPE kulturmedier. Etter tining av en 25 μL alikot, bland hele alikoten med 45 μL standard RPE-kulturmedier, og gi et endelig medievolum på 70 μL og OS-konsentrasjon på 2 x 107 OS/ml for hver OxOS Transwell-fôring.
    11. Før aliquoting av OxOS, legg til fagocytosebroligander (Protein S og MFG-E8, se materialtabell), som letter OS-opptak og lipofuscinakkumulering. Arbeidskonsentrasjonene av broligander i en 24-brønns Transwell er 4 μg / ml for humant renset protein S og 1,5 μg / ml for humant rekombinant MFG-E8. For 25 μL alikoter av OxOS ved 5,6 x 107 OS/ml er stamkonsentrasjonen for protein S 11,2 μg/ml, og for MFG-E8 4,2 μg/ml.
      MERK: Broligandkonsentrasjonene ble optimalisert for hfRPE-kulturer på 24-brønns Transwells, med et omtrentlig celletall på 320 000 celler per 0,33 cm2 brønn. Det kan være nødvendig å justere ligandkonsentrasjonene for andre RPE-typer og celletettheter, siden ligander som er tilstede utover fagocytosereseptortilgjengeligheten, paradoksalt nok kan blokkere OS-opptak28.
    12. Snap fryser alikotene i flytende nitrogen.
      MERK: Flere fryse-tiner er svært skadelig for OS-integriteten.
  2. Tverrbinding av ytre segment med en UV-tverrbindingsenhet
    MERK: Følg trinn 1.1, med unntak av trinnene nedenfor, som erstatter henholdsvis trinn 1.1.2 og 1.1.6:
    1. (erstatter trinn 1.1.2) Plasser hvert lysbilde i en ny 100 mm cellekulturskål og tilsett 200 μL serumholdig cellekulturmedium (f.eks. -"RPE media" eller annen erstatning) i hvert rektangel, og plasser deretter lysbilder i en ultrafiolett tverrbindingsenhet (se materialfortegnelse), behandle med 254 nm UV ved en strålende eksponering på 3-6 J / cm2 for å blokkere glassoverflaten og forhindre at OS fester seg under de neste trinnene.
    2. (erstatter trinn 1.1.6) Aspirer mediet fra lysbildene og plasser opptil 500 μL av 2 x 108 OS/ml i steril PBS på hvert rektangel i lysbildet. Plasser lysbilder i Ultraviolet Crosslinker-enheten, still inn behandlingsstråleeksponering etter behov (3-9 J / cm2) og behandle ved 254 nm.
      MERK: Den nødvendige strålingseksponeringen kan bestemmes nøye ved å titrere strålingseksponering mellom 3-9 J / cm2 til graden av autofluorescens og proteinkryssbinding (som vist i figur 1B og figur 1C) oppnås.
      FORSIKTIG: Håndtering av OS utenfor et biosikkerhetsskap kan føre til forurensning. Etter eksponering av OS til UV-tverrbindingsenheten, samle OS med sterile pipettespisser, overfør til sterile mikrosentrifugerør og håndter alle ytterligere trinn i biosikkerhetshetten.
  3. Karakterisering av oksidert OS
    1. Kvantifiser autofluorescensutslippsspektrum ved avbildning
      1. Plasser 20-50 μL stamløsning fra ubehandlet OS og OxOS i to separate mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 2400 x g i 5 min ved romtemperatur, resuspendere pellet i bufret (f.eks. PBS) 4% paraformaldehyd, og fikser i 15 minutter ved romtemperatur.
      2. Etter fiksering, sentrifugering som ovenfor, vask med PBS x 2 (spinn ned mellom vask), og resuspender deretter i mindre enn 30 μL PBS.
      3. Plasser noen mikroliter av resuspensjonen på et mikroskoplysbilde, legg til monteringsmedier (se materialfortegnelse), og til slutt et deksel.
      4. Bilde OxOS på et konfokalmikroskop (se materialfortegnelse).
        MERK: OxOS autofluorescens kan bli eksitert av et bredt spekter av laserbølgelengder, men en 405 nm eller 488 nm laserlinje brukes vanligvis. Utslippet er tilsvarende bredt, men et typisk GFP / FITC eksitasjon / utslippsfilteroppsett er tilstrekkelig til å se autofluorescens.
      5. For å måle OxOS-utslippsspekteret, bruk λ-skanning på et konfokalmikroskop. Typiske λ-skanneinnstillinger inkluderer eksitasjon med 405 nm eller 488 nm, og deteksjon av utslipp som varierer fra 10 nm rødforskjøvet fra lasereksitasjonslinjen helt til ca. 800 nm, med en λ trinnstørrelse på 10 nm. Hvert mikroskopisystem har sine egne instruksjoner om hvordan λ-modus skal brukes, og leseren må referere til manualen for deres spesifikke konfokale.
    2. Som et alternativ, kvantifiser autofluorescens ved flowcytometri.
      1. Spinn ned 2 x 10 7 ubehandlet OS og separat 2 x 107 OxOS i mikrosentrifugerør og resuspender i 1 ml PBS.
        MERK: Fiksasjon er ikke nødvendig hvis flowcytometri utføres rett etter tining.
      2. Legg ubehandlede OS- og OxOS-prøver på flowcytometer (se materialfortegnelse). Juster foroverpunkter (FSC) og sidepunkter (SSC) til et akseptabelt oppslag i FSC-SSC-punktdiagrammet. Bruk PBS som en kontroll for å utelukke forurensning av små partikler. Merk at OS er betydelig mindre enn celler.
      3. Bruk flowcytometerets standard FITC-kanal for autofluorescenskvantifisering. Tell minst 10 000 hendelser. Bruk FITC-histogrammets pulsområdeverdi til å representere fluorescensintensitet.
        MERK: For denne studien analyseres alle data ved hjelp av programvare for flowcytometeranalyse (se materialfortegnelse), i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Vurdere graden av kryssbinding i OxOS
      1. Spinn ned 2 x 10 7 ubehandlet OS og separat 2 x 107 OxOS i mikrosentrifugerør. Fjern supernatant og lyse pellet direkte ved å legge til 1,2x Laemmli prøvebuffer (nok til å dekke; se materialfortegnelse). Vortex, oppbevares i romtemperatur i 30 min, sentrifugeres ved romtemperatur ved lik eller større enn 12000 x g i 10 minutter, og samler supernatant.
        MERK: Vurdering av graden av proteinkryssbinding i OxOS gir en følelse av tilstrekkeligheten av UV-behandlingen. Sammenligning gjøres mellom ubehandlet OS og OxOS, og tilstrekkelig kryssbinding oppstår når det monomere rhodopsinbåndet som dominerer Coomassie-fargingen (figur 1C, pil) bare er merkbart, med fremvekst av høyere ordens aggregater og et proteinutstryk på toppen av gelen.
        FORSIKTIG: Når du bruker prøvebuffer til å lyse operativsystemet, må du ikke varme opp lysisløsningen etterpå, da dette kan utløse rhodopsinaggregering. Unngå også å kjøle ned det lyserte operativsystemet til det er klart for lagring, da dette vil utfelle SDS. Ubrukte lysater kan oppbevares ved -20 °C. Hvis du holder igjen, må du sørge for at lysatene tines helt ved romtemperatur før bruk.
      2. Kvantifiser proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en proteinanalyse som er tolerant mot høye SDS og reduksjonskonsentrasjoner29. Se materialfortegnelse for forslag til passende proteinanalysereagenser, og følg produsentens protokoll for disse reagensene.
      3. Kjør ubehandlede OS- og OxOS-prøver ved SDS-PAGE-elektroforese30 på en 4% -15% gradientgel, ved bruk av standard tris-glycin SDS-buffer. Gel kjøres ved 80 V til prøver kommer inn i stabelen, deretter ved 120 V i 50-60 min ved romtemperatur.
      4. Beis gelen med Coomassie blå ved hjelp av standardprotokoller31. Coomassie-fargingen vil demonstrere tilstrekkeligheten av tverrbinding indusert av UV-behandling.

2. Bygg lipofuscinlignende granulater (UAM) i RPE-kulturer

  1. OxOS feedings: mengde, frekvens og fagocytose bygge bro ligander
    MERK: Fôringer forekommer på humane iPSC-RPE- eller hfRPE-kulturer ved passasje 1, dyrket i henhold til protokollen skissert av Bharti-laboratoriet (for iPSC-RPE)32 eller vår tidligere skisserte protokoll for hfRPE, tilpasset fra Sheldon Miller-laboratoriet22,23. Alle beregningene nedenfor er basert på fôring av OxOS eller OS til en 24-brønns Transwell (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 vekstområde).
    1. Tine 25 μL på 5,6 x 107 OxOS/ml ved 37 °C og tilsett 45 μL cellekulturmedier til OxOS-alikoten, noe som resulterer i et endelig volum på 70 μL.
      MERK: OxOS-alikoter fremstilt i trinn 1 vil inneholde fagocytoseoverbyggende ligander MFG-E8 og Protein S. Imidlertid, hvis disse ligandene ikke ble tilsatt alikotene før frysing, kan de tilsettes på dette trinnet, slik at den endelige konsentrasjonen av ligandene i mediet som skal mates celler er 4 μg / ml for protein S og 1,5 μg / ml for MFG-E8. Som nevnt i trinn 1.1.11 kan det være nødvendig å endre konsentrasjoner av broligander for andre RPE-typer eller celletettheter.
    2. Fjern apikale medier fra Transwell og tilsett 70 μL av 2 x 107 OxOS / ml med fagocytosebroligander til apikalkammeret. Etter 24 timer, fjern og erstatt med en ny OxOS-fôring. Fôring skjer daglig i ukedagene, hopper over helgene, til 20 feedings er fullført (~ 1 måned). Endre basolaterale cellekulturmedier (400-550 μL) 2-3x/uke.
    3. Etter ferdigstillelse av 20 matinger, gjenoppta normale medieendringer for brønnen.
      MERK: Det tar flere ekstra medieendringer for å vaske av klebrig OxOS fra RPE-apikale overflaten, så eksperimenter med UAM-ladede kulturer må gjøres minst 1-2 uker etter at OxOS-feedings konkluderer.
      FORSIKTIG: Det er viktig å ha riktige kontroller for UAM-oppbygging via OxOS-feedings. Siden daglige medieendringer kan påvirke RPE-biologien, anbefales følgende kontrollbrønner: Kontroll 1: Bytt medier daglig på hverdager for samme antall matinger som OxOS-behandlet gruppe. Kontroll 2: Fôr RPE ubehandlet OS daglig på hverdager med samme konsentrasjon og volum som OxOS feedings, for samme antall feedings.
  2. Overvåking av helsen til kulturer lastet med lipofuscinlignende granulater ved transepitelial elektrisk motstand (TEER) og celledødsanalyser
    MERK: Under og etter OxOS feedings kan helsen til RPE-kulturer måles ved å vurdere RPE tight-junction integritet og celledød. Det er tidligere vist at vurdering av tett kryssintegritet, via måling av transepitelial elektrisk motstand (TEER), er en sensitiv markør for generell cellehelse33. Mer tradisjonelle ikke-invasive markører for celledød, som frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH), kan også benyttes.
    1. Utfør TEER
      MERK: TEER er testet med en TEER-måler (transepitelial elektrisk motstand) og TEER-elektrode, generelt i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelsen).
      1. For å sterilisere TEER-elektroden, bruk en oppgavevisker dynket i 70% etanol for å rengjøre elektroden og senk deretter spissene på elektrodesonden i 70% etanol i 10 minutter.
      2. La elektroden tørke helt, og senk deretter elektroden i sterile medier.
      3. Fjern sonden fra sterile medier og sett TEER-elektrodens to sonder inn i de apikale og basolaterale kamrene til en dyrket Transwell; Den lengre sondespissen passer inn i det basolaterale kammeret.
        MERK: Det er lett å skrape bunnen av det apikale kammeret med TEER-elektroden uten øvelse, og slik skraping vil dramatisk endre TEER-avlesninger ettersom det konfluente RPE-monolaget forstyrres. Derfor anbefales det at nybegynnere trener på ikke-viktige Transwells før testing på eksperimentelle RPE-kulturer. Videre, etter at hver plate av RPE-kulturer er testet, bør eksperimentøren sjekke for skraping av RPE-monolaget under et standard vevskulturmikroskop.
      4. Når de apikale og basolaterale sondene er på plass i Transwell, trykker du på leseknappen eller trinnet på fotbryteren på måleren for å registrere TEER. Mellom plater eller grupper av celler, vask elektrodesonden med sterile medier. Hvis infeksjon er en stor bekymring, resteriliser mellom platene.
      5. Beregn TEER ved å ta motstandsavlesningen fra måleren, trekke verdien av en tom Transwell med media, men ingen celler (vanligvis 100-110 Ω for en 24-brønns Transwell med 0,33 cm2 overflateareal), og deretter multiplisere med overflaten av Transwell.
        MERK: TEER-verdier må rapporteres normalisert til celleoverflaten. Typiske verdier for sunne hfRPE-kulturer varierer fra 350-1100 Ωcm2. TEER-verdiene øker når temperaturen synker. Når kulturer fjernes fra en 37 °C kuvøse til en hette for romtemperatur, vil TEER-verdiene derfor ha en tendens til å øke over hele platen. For å beskytte mot denne variasjonen, må du enten arbeide raskt (hvis du opplever) eller vente i 10-15 minutter for at platetemperaturen skal balanseres med romtemperaturen.
    2. Utfør LDH-utgivelsesanalyse
      MERK: Frigjøring av LDH til cellekultursupernatant skjer under celledød og måles med et standardsett (se materialfortegnelse).
      1. Samle supernatanten fra over cellene etter en 24 timers inkubasjon og fortynn til 1:100 ved bruk av standardmedier.
      2. Indusere total mulig LDH-frigjøring, noe som er viktig for normalisering av alle verdier fra trinn 2.2.2.1, ved tilsetning av 2 μL 10% triton X-100 til 100 μL apikale medier fra kontrollceller i en 24-brønns Transwell. Etter å ha inkubert triton/celle supernatantblandingen i 15 minutter ved 37 °C, bland mediet over de nå lyserte cellene og samle for å måle total mulig LDH-frigjøring.
      3. Når supernatanter er samlet, utfør analysen ved hjelp av produsentens standardinstruksjoner, og måler luminescens etter en 30 minutters inkubasjon ved hjelp av settets bufferløsning.
        MERK: Alle LDH-verdier normaliseres til den totale mulige mengden LDH-frigivelse.
  3. Karakterisering av lipofuscinlignende granulatspektrum og sammensetning
    1. Anskaffelse av autofluorescenskvantifisering og spektra
      1. Fest UAM-ladede kulturer med 4% PFA ved romtemperatur i 15 minutter, etterfulgt av PBS vask 5x.
      2. Hold en liten mengde PBS i det apikale kammeret og vend deretter Transwell opp ned. Bruk et dissekerende mikroskop og et barberblad, kutt den semi-porøse membranen fra Transwell, påfør skjærekraft ved krysset mellom membranen og Transwell.
        MERK: Hold konsekvent om hvor nær leppen til Transwell kuttet er laget, da Transwell-membranen har en tendens til å vri og rynke når kuttene ikke er konsistente.
      3. Når Transwell-membranen er kuttet, plasser umiddelbart på et mikroskopglass ved hjelp av tang, og vær forsiktig så du ikke berører deler av Transwell-membranen med celler. Transporter bort overflødig PBS med en arbeidsserviett, samtidig som du unngår å berøre cellene. Legg til monteringsmedier og en coverslip. Sørg for å holde styr på hvilken side av Transwell som er "høyre side opp" når du dekker Transwell.
      4. Skaff deg autofluorescerende intensitet og spektra ved å bruke de samme innstillingene og prosedyrene som trinn 1.3.1.4 og trinn 1.3.1.5.
        MERK: Ved avbildning av UAM er en viktig forstyrrelse at OxOS er autofluorescerende og ofte holder seg til RPE-apikal overflate i dager og noen ganger til og med uker etter ferdigstillelse av OxOS-fôring. Som et resultat, når du kvantifiserer UAM, må en metode brukes for å sikre at målt autofluorescens kommer fra UAM og ikke OxOS. Den enkleste metoden er å co-flekke lipofuscin kulturer med et rhodopsin antistoff. For eksempel kan anti-rhodopsin antistoff 4D2 brukes ved en 1:1000 fortynning og med en standard PFA-fiksering immunocytokjemisk protokoll34. Det sekundære antistoffet for rhodopsin bør være et langt rødt fargestoffkonjugert antistoff (f.eks. med en eksitasjonsmaksima nær 647 nm), da UAM og OxOS autofluorescens har en tendens til å være svakest i denne bølgelengden. Konfokale bilder kan deretter anskaffes sekvensielt i to kanaler, spennende UAM og OxOS autofluorescens med en 405 nm laser og utslipp fra 415 nm til 550 nm, mens gjenværende rhodopsin, som indikerer ufordøyd OxOS, kan bli begeistret med standard langt røde fargestoffavbildningsparametere i en egen kanal. Etter oppkjøpet kan rhodopsinkanalen brukes som en subtraktiv maske i et program som ImageJ for å fjerne autofluorescens som kommer fra klebrig gjenværende OxOS, og etterlater bare UAM-autofluorescens for å kvantifisere.
        FORSIKTIG: Selv OS som ikke er fotooksidert, viser noe autofluorescens, og selv med streng vask, holder noen OS og OxOS seg til RPE-overflaten. Således, uten å generere en subtraktiv maske ved bruk av rhodopsin immunostaining, som foreslått i ovennevnte NOTE, er nøyaktig kvantifisering av UAM-autofluorescensnivåer i kulturer matet OxOs eller standard OS ikke mulig.
    2. Utfør samtidig påvisning av lipofuscinlignende granulater og andre immunfluorescensmarkører
      MERK: Som beskrevet i trinn 2.3.1, begrenser det brede autofluorescensspekteret av lipofuscin valg for fluorescensfarging. Følgende metoder kan vurderes for å lette co-farging.
      1. Bruk en langt rød fluorofor. Autofluorescens fra lipofuscin er svak i nær infrarødt. Dermed kan bruk av et langt rødt fargestoff for fluorescensdeteksjon av et antigen av interesse, kombinert med nøye justeringer av kanalinnstillinger på et konfokalmikroskop, vanligvis skille autofluorescens fra medfarging av fluorescens.
      2. Dra nytte av den lange fluorescensutslippshalen til lipofuscin.
        MERK: Siden lipofuscin har et meget bredt fluorescensutslippsspektrum, kan det ofte eksiteres ved en lav nm bølgelengde (f.eks. 405 nm laser) og ha utslipp fortsatt detektert i den oransje / røde delen av spekteret (f.eks. 585-635nm). Denne unike kombinasjonen av eksitasjon og emisjonsbølgelengder kan ofte skreddersys rundt en annen co-staining fluorofor.
        1. Oppdag antigenet av interesse ved hjelp av en fluorofor som har topp eksitasjon rundt 488 nm, med utslippsdeteksjon ved 500-530 nm. Sett opp en egen kanal for autofluorescensdeteksjon med 405 nm eksitasjon og 585-635 nm utslipp. Denne andre kanalen vil bare oppdage UAM, mens den første kanalen vil oppdage antigenet av interesse pluss lipofuscin.
        2. Ved hjelp av et gratisprogram som ImageJ, bruk denne andre UAM-eneste kanalen som en subtraktiv maske for å fjerne UAM-signalet fra den første kanalen (som inneholder både antigensignalet og UAM-signalet).
      3. Bruk spektral unmixing. De fleste moderne konfokale mikroskoper inneholder et spektralt blandingsalternativ. Dette gjør at man kan skaffe seg spekteret av en prøve med bare UAM og en annen prøve med bare den medfargende fluoroforen av interesse. Den eksperimentelle prøven, som inneholder både UAM og co-farging fluorofor, kan deretter bli anskaffet og utsatt for lineære unmixing metoder for å beregne hvilken prosent av signalet kom fra autofluorescens vs co-farging.
        MERK: Omfattende guider til spektral unmixing er tilgjengelig med de fleste moderne konfokale mikroskoper.
      4. Bruk fluorescens levetidsavbildning. Mens utslippsspekteret mellom UAM og en co-staining fluorofor av interesse kan være lik, er det sannsynlig at deres fluorescenslevetid varierer betydelig. Generelt viser UAM kortere fluorescenslevetid enn de fleste spesifikke fluoroforer. Med tilgang til et konfokalmikroskop som muliggjør livstidsavbildning, kan man gate fluorescenssignaler for å oppdage de som er lengre enn den typiske lipofuscinlevetiden.
        MERK: Generelt reduserer gating fluorescens levetid til signaler lengre enn 2 ns kraftig UAM-forurensning, selv om det ikke helt eliminerer signalet.
      5. Bruk av en autofluorescensdemper. Tradisjonelt har Sudan Black blitt brukt til å slukke autofluorescens før spesifikk immunfluorescensfarging35. Flere kommersielt tilgjengelige autofluorescensslukkerprodukter rapporterer å forbedre resultatene av Sudan Black, og disse produktene er beskrevet i materialfortegnelsen. Autofluorescensslukking vil selvsagt ødelegge evnen til å oppdage lipofuscin.
    3. Bestem sammensetningen av lipofuscinlignende granulater
      1. Vurder nøytrale lipider
        1. Fest UAM-lastede RPE og kontrollbrønner (matet ubehandlet OS) i 4% PFA ved romtemperatur i 15 minutter, og vask med PBS 5x.
        2. Beis for nøytrale lipider med enten 10 μg / ml Nilrød eller 3,33 μg / ml Bodipy 493/503 i en 3% BSA PBS-løsning ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av vask med PBS i 5 min 3x.
        3. Klipp ut og monter Transwell som i trinn 2.3.1.2 og 2.3.1.3 og bilde. Bruk generelt følgende eksitasjons- og utslippsbåndbredder for avbildning: Nilrød - ex 543 nm, em 620-700 nm og Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Vurder forestret og uesterifisert kolesterol
        1. Følg trinn 2.3.3.1.1
        2. Filipin er et fluorescerende fargestoff som gjenkjenner uesterifisert kolesterol, men ikke forestret kolesterol36. For å vurdere mengden av totalt kolesterol (uesterifisert og forestret) i UAM, må du først forhåndsbehandle prøven med kolesterolesterase for å konvertere forestret kolesterol til uesterifisert kolesterol. Behandle cellene med 20 E/ml kolesterolesterase i 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7,2) (se materialfortegnelse) ved 37 °C i 3,5 timer, etterfulgt av vask med PBS i 5 min 3x.
        3. Beis med 50 μg/ml filipin (se materialfortegnelse) i PBS ved romtemperatur i 1 time, og vask med PBS i 5 min 3x. Hold prøvene dekket, vekk fra lys, som filipin fotobleker lett.
          MERK: Hvis bare uesterifisert kolesterol skal kvantifiseres, kan kolesterolesterasen i trinn 2.3.3.2.2 hoppes over. Hvis mengden forestret kolesterol skal kvantifiseres, kan det utledes av forskjellen mellom det totale kolesterolet og det uesterifiserte kolesterolet i prøven.
        4. Klipp ut og monter Transwell som i trinn 2.3.1.2 og 2.3.1.3 og bilde.
          MERK: Når du avbilder filipin, fotobleker det veldig raskt. Man må minimere intensiteten og varigheten av eksitasjon, og forvente at noe fotobleking til og med kan forekomme ved å se prøven gjennom okularene. Derfor, når man avbilder, bør man: (1) søke etter et passende område for å avbilde ved hjelp av en fluorescenskanal annet enn filipinkanalen, (2) bilde filipin på et bredt felt i stedet for konfokalmikroskop (for å begrense intensiteten av lyseksponering), og (3) unngå gjentatt avbildning av et område. Generelt bruker du følgende eksitasjons- og utslippsbåndbredder for avbildning av filipin - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Vurdere effekten av lipofuscinlignende granulater på RPE-fagocytose: Total forbrukskapasitet

MERK: Begrunnelsen for å måle OS-fagocytose via OS-pulsprotokollen nedenfor er beskrevet i avsnittet om representative resultater. Metoden, som kalles "Total Consumptive Capacity", unngår tvetydigheter om fagocytoseeffektivitet som kan oppstå med tradisjonelle OS-pulsjaktfagocytoseanalyser. Analyser gjøres på 24-brønns Transwell-plater ved bruk av 50 μL medier som inneholder 4 x 106 OS / ml.

  1. Beregn antall brønner som trengs for eksperimentet, og tine deretter en passende mengde vanlig OS, spinn ned ved 2400 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og resuspender i standard RPE-cellekulturmedier til 4 x 106 OS / ml. Legg til broligander for å lette fagocytosehastigheten.
    MERK: Endelig konsentrasjon av broligandene i mediet som skal mates celler er 4 μg / ml for protein S og 1,5 μg / ml for MFG-E8. Som nevnt i trinn 1.1.11 kan det være nødvendig å endre konsentrasjoner av broligander for andre RPE-typer eller celletettheter.
  2. Fjern apikale medier og tilsett 50 μL 4 x 106 OS/ml, ideelt sett med passende konsentrasjoner av broligander.
  3. På forskjellige tidspunkter etter OS-tilsetning (f.eks. - 0 timer, 1 time, 4 timer og 24 timer), tilsett 16,67 μL 4x Laemmli prøvebuffer med proteasehemmere for å lyse begge celler og den overliggende OS-holdige supernatanten. Bruk en P-200-pipette til å skrape Transwell-overflaten, vær forsiktig så du ikke punkterer Transwell-membranen eller løsner membranen fra Transwell, og samler den kombinerte cellesupernatanten pluss cellelysatet sammen. Vortex, spinn ned, og la stå i romtemperatur i 30 min for grundig denaturering.
    FORSIKTIG: Til tross for bruk av prøvebuffer for å lyse operativsystemet, må du ikke varme opp lysisløsningen etterpå, da dette kan utløse rhodopsinaggregering. Unngå også å avkjøle det lyserte operativsystemet til det er klart for lagring, da dette vil utfelle protein. Frys ubrukte lysater ved -20 °C, og sørg for at lysatene tines helt før bruk.
  4. Kjør lysater på SDS PAGE med de samme innstillingene som i trinn 1.3.3, og last like store mengder lysater per brønn. GAPDH, β-aktin eller et annet husholdningsprotein bør brukes til å normalisere cellenummer, da fagocytosehastigheter er avhengig av cellenummer.
  5. Sonde vestlige flekker med antistoffer mot enten N- eller C- enden av rhodopsin. Bruk standard vestlige blottingsbetingelser, og antistofffortynninger er oppført i materialfortegnelsen.
    MERK: Under hovedrhodopsinbåndet vil det være flere rhodopsinfragmenter. Disse fragmentene representerer delvis fordøyd rhodopsin, en prosess som starter før fusjon av fagosomet med lysosomet32,33. En økning i antall rhodopsinfragmenter i UAM-ladet RPE sammenlignet med kontroll-RPE kan indikere en nedstrøms defekt i fagolysosomkapasitet, på nivået av fagosom-lysosomfusjon, lysosomal forsuring og / eller nedbrytende enzymfunksjon 16,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oppsettet for fotooksidasjon av OS er vist i figur 1Ai. De polytetrafluoretylenbelagte lysbildene gjør det mulig å laste et stort volum OS i løsning per åpent rektangel uten å spre seg over resten av lysbildet. Lysbildet med OS er plassert i en steril petriskål med lokket av, og en UV-lampe er plassert over lysbildet som vist i figur 1Aii. Alternativt kan lysbildet plasseres i en UV-tverrbindingsenhet, som vist i figur 1Aiii. Etter fotooksidasjon øker OS-autofluorescensen betydelig, vurdert ved både mikroskopi og flowcytometri (figur 1B). Graden av proteinkryssbinding etter fotooksidasjon kan vurderes ved SDS-PAGE med en Coomassie-flekk, vist som en konvertering av det dominerende proteinbåndet (monomert rhodopsin) til høyere ordens aggregater og utstryk (figur 1C). Sammenligning av fotooksidasjon med en håndholdt UV-lampe (figur 1Aii) versus UV-tverrbindingsenheten (figur 1Aiii) viser at den håndholdte UV-lampen produserer OxOS med like mye autofluorescens som en 3 J / cm 2-behandling fra UV-tverrbindingsenheten (figur 1B), og så mye proteinkryssbinding som en 6 J / cm2-behandling fra UV-tverrbindingsenheten (figur 1C). Hvis UV-lampen som er tilgjengelig for en forsker, er forskjellig fra den som brukes i denne protokollen, foreslår vi å titrere eksponeringstiden for å oppnå et nivå av tverrbinding sett i UV-lampebanen i figur 1C. Autofluorescensspekteret til OxOS er mildt blåforskjøvet sammenlignet med spekteret av ubehandlet OS, både i den proteinisolerte fraksjonen av operativsystemet og den lipidisolerte fraksjonen av OS16.

Mengden UAM-oppbygging i RPE-kulturer avhenger av antall OxOS-feedings (figur 2A), og 20 feedings i løpet av ca. 4 uker gir en robust mengde UAM-akkumulering. For å skille UAM-autofluorescens fra autofluorescens av gjenværende OxOS som forblir fast på RPE-apikal overflate selv dager til uker etter vask, flekker vi med et rhodopsinantistoff, oppdaget med et langt rødt fargestoff. Ved å bruke denne rhodopsinfluorescenskanalen som en maske, kan vi trekke ut OxOS-autofluorescens fra UAM-kanalen, slik at vi virkelig kvantifiserer autofluorescens fra UAM bare16. Ved hjelp av fargeprotokoller som er skissert ovenfor, har akkumulert UAM i denne modellen rikelig nøytrale lipider, vurdert av Nile Red-farging16, som ligner på innfødt lipofuscin. Imidlertid finner vi liten eller ingen forestret eller uesterifisert kolesterolakkumulering (figur 2B), noe som stemmer overens med mangelen på kolesterolakkumulering vi ser i innfødt lipofuscin fra friske øyne (data ikke vist).

Det er vanskelig å følge fluorescerende markører av interesse samtidig med lipofuscinautofluorescens, gitt det svært brede fluorescensemisjonsspekteret til lipofuscin. I metodeavsnittet ovenfor er flere metoder detaljert for å overvinne dette problemet. Metoden skissert i trinn 2.3.2.1 ovenfor utnytter den lave autofluorescensutslippsintensiteten for lipofuscin i langt rødt. I figur 2Ci vurderes samlokaliseringen av UAM og autofagimarkøren LC3 ved å farge LC3 med et Alexa 647-fargestoff. Til tross for noe blødning av UAM inn i LC3-kanalen, er det tydelig hvor lipofuscin og LC3 befinner seg i disse bildene. I metoden som er skissert i trinn 2.3.2.2 ovenfor, tillater de svært lange fluorescensutslippsspektrene til lipofuscin design av en emisjonskanal som bare inneholder fluorescens fra lipofuscin. I figur 2Cii er UAM begeistret med en 488 nm laser, mens utslipp oppdages ved både 500-535 nm og ved 600-645 nm. Prøven er co-farget med LC3, oppdaget med Alexa 488 fargestoff. Alexa 488-kanalen (eksitasjon: 488 nm, utslipp: 500-535 nm) inneholder både LC3- og UAM-signal. Den andre kanalen, med 488 nm eksitasjon og 600-645 nm utslipp, inneholder imidlertid bare UAM. Denne andre kanalen kan brukes som en maske, brukt på Alexa 488 / LC3-kanalen, for å trekke ut uønsket UAM-signal fra LC3-signalet. I metoden som er skissert i trinn 2.3.2.4 ovenfor, tillater den kortere fluorescenslevetiden til autofluorescerende lipofuscin en å skille lipofuscin fra co-farging fluorescens. I figur 2Ciii elimineres alle fluorescenssignaler som kommer til en fotontellingsdetektor før 2 ns, noe som utelukker mye av UAM-autofluorescenssignalet samtidig som det i stor grad bevarer medfargingssignalet fra LC3. En kombinasjon av metoder kan være nødvendig for å skille lipofuscin fra co-farging fluorescens hvis det er sterk co-lokalisering av lipofuscin og co-farging fluorofor.

Siden flere studier har postulert en innvirkning av RPE-lipofuscinakkumulering på OS-fagocytosehastigheter 5,36,37,38,39, ble OS-fagocytosekapasitet i UAM-ladede kulturer vurdert. Typiske fagocytoseanalyser involverer en kort inkubasjon av celler med OS ("puls") etterfulgt av vasking av ubundet OS og erstatning av media uten OS i en "jakt" -periode. Under jakten, som OS er degradert, er det et tap av rhodopsin, det rikeste proteinet i OS, i RPE. Ved ulike tidspunkter under jakten fjernes OS-frie medier, etterfulgt av cellelyse og SDS-PAGE for rhodopsin som forblir innenfor RPE-lysatene. Men siden OS-pulsperioden består av både opptak og nedbrytning av OS, kan RPE med høyt opptak og nedbrytning ("fagocytoseeffektive" celler) ha samme rhodopsinnivå tidlig i jaktperioden som RPE med lavt opptak og nedbrytning ("fagocytose ineffektive" celler). Dette er skjematisk representert i studien til Zhang et al23. For å overvinne denne tvetydigheten ble det brukt en "kun puls" -analyse her. I denne metoden pulseres OS på RPE, men ikke vaskes av. På forskjellige tidspunkter etter OS-tilsetning samles media og cellelysatet sammen. Mediet inneholder ufordøyd OS og cellelysatet inneholder en kombinasjon av intakt OS på celleoverflaten, delvis fordøyd OS som har blitt internalisert, og fullstendig fordøyd OS som har lykkes med å komme seg gjennom lysosomet. Som en kontroll blir celler utsatt for OS, men deretter samles cellelysatet og OS-holdig supernatant umiddelbart. Denne kontrollen avslører hvor mye totalt rhodopsin som ble introdusert til cellene. Siden lysat pluss supernatant samles på forskjellige punkter etter OS-introduksjon, kan man vurdere for hvilken brøkdel av det totale rhodopsinsignalet som har forsvunnet, ved å bruke dette som en markør for mengden av alle introduserte/startende OS som nå er fullstendig degradert. Avlesningen for denne analysen kalles "Total forbrukskapasitet", siden den nøyaktig måler all OS-degradering og ikke er underlagt de forvirrende tolkningene av et pulsjakteksperiment beskrevet ovenfor.

Figur 3A og tilleggsfigur 1 viser en vestlig flekk av gjenværende rhodopsin ved bruk av analysen Total Consumptive Capacity. Mengden OS matet til celler måles av rhodopsinbåndet ved 0 timer. Hovedrhodopsinbåndet nedbrytes med samme effektivitet mellom kontroll- og UAM-ladede RPE-prøver (enkeltpil ved 4 timer og 24 timer). Det er imidlertid forskjell mellom gruppene når man ser på delvis nedbrutte fragmenter av rhodopsin, som vises under hovedrhodopsinbåndet. Forskjellene i fragmentmengde innebærer redusert lysosomal kapasitet i UAM-gruppen, siden proteolytisk spaltede fragmenter av rhodopsin bør nedbrytes raskt med normal lysosomal funksjon. Økt overflod av disse fragmentene uten økt overflod av hovedrhodopsinfragmentet antyder mer subtile defekter i lysosomal nedbrytningskapasitet i UAM-ladede kulturer. Tidligere studier har antydet at lipofuscin faktisk kan indusere defekter i OS-fagocytose44, men ingen tidligere studier har undersøkt effekten av lipofuscin spesielt på rhodopsinfragmenter, noe som muliggjør en mer presis identifisering av dysfunksjonen til sluttstadiene av fagolysosomal nedbrytning. Figur 3B viser vestlig blotting av hovedrhodopsinbåndet pluss rhodopsinfragmenter ved bruk av to ulike anti-rhodopsinantistoffer. Antistoff 4D2 gjenkjenner N-terminalen av rhodopsin, og N-terminale fragmenter er den siste delen av rhodopsin som nedbrytes i lysosomet. I motsetning til dette gjenkjenner antistoff 1D4 C-terminalen av rhodopsin, som nedbrytes selv før fagosom-lysosomfusjon. Dermed forstår hvilke fragmenter flekk med hvilket antistoff gir en følelse av rhodopsin prosesseringsdefekter som er pre-lysosomale vs lysosomale 32,40,41.

Figure 1
Figur 1: Fotooksidert ytre segment (OxOS) behandling og karakterisering. (A) Avbildning av OS på et polytetrafluoretylenbelagt lysbilde (i) behandlet med enten en 254 nm UV håndholdt lampe (ii) eller en UV-tverrbindingsenhet (iii). (B) Sammenlignet med ubehandlet (vanlig) OS (RegOS) hadde behandlet OS (OxOS) økt autofluorescens som vist ved konfokal avbildning (venstre) (skala bar = 10 μm) og flowcytometri (høyre). Autofluorescerende intensitet av OxOS behandlet med den håndholdte UV-lampen var lik OS behandlet med UV-tverrbindingsenheten ved en strålende eksponering på 3 J / cm2 (feillinje = S.E.M.). (C) SDS-PAGE som viser kryssbinding av OS-protein indusert av UV-eksponering. OxOS-kryssbinding via den håndholdte UV-lampen var lik OS behandlet med UV-kryssbindingsenheten ved en strålende eksponering på 6 J/cm2. Monomere rhodopsin er uthevet med en pil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bildediagnostikk av OxOS-induserte lipofuscinlignende granulater i hfRPE-kulturer. (A) Autofluorescerende granulat (grønn) indusert av OxOS akkumulerte signifikant mer etter 20 feedings sammenlignet med 5 feedings. Resterende OxOS-flekk med rhodopsinantistoff (magenta). Skala bar = 10 μm. (B) UAM indusert av OxOS (grønn) ble ikke beriket med fritt kolesterol eller kolesterolester, vurdert ved filipinfarging ( rød). Scele bar = 10 μm. (C) Avbildningsmetoder for fluorescensfarging i nærvær av lipofuscin. (i ) Bruk av langt rød fluorofor (Alexa 647) for å flekke autofagimarkør LC3 (magenta), noe som minimerer UAM-blødning. Pure UAM (grønn) avbildet med et standard grønt kanaleksitasjons- og utslippsfilteroppsett. Skala bar = 2 μm. (ii) Bruk av ratiometrisk avbildning hjelper til med å dechiffrere UAM-autofluorescens fra LC3-farging merket med Alexa 488. Eksitasjon er 488 nm, grønn kanal utslipp bandpass er 500-535 nm mens rød kanal utslipp bandpass er 600-645 nm. Rød kanal kan brukes som en subtraktiv maske for å isolere LC3-signalet fra den grønne kanalen. Skala bar = 5 μm. (iii) Siden fluorescenslevetiden til lipofuscin/UAM vanligvis er kortere enn spesifikke fargestoffer, kan UAM-autofluorescens reduseres ved å utjevne fluorescenssignaler som kommer til en fotontellingsdetektor på mindre enn 2 ns. Toppbildet er uten gating. Bunnbildet er med gating, og holder bare fluorescenssignaler med en levetid lenger enn 2 ns. Det er en større relativ reduksjon i UAM-signal sammenlignet med spesifikt LC3-signal (merket med Alexa 488) mellom topp- og bunnbilder. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: "Total Consumptive Capacity" metode for måling av OS fagocytose. (A) Totalt gjenværende rhodopsinprotein i både cellelysat og supernatant etter introduksjon av OS til RPE-kultur, som analysert av western blot. Etter å ha matet vanlig OS i 50 μL medier, ble både det kondisjonerte mediet/supernatanten og cellene lysert sammen ved 0, 4 og 24 timer. 0 h tidspunktet fungerer som en kontroll, som indikerer den totale mengden OS matet til hver Transwell. Det intakte rhodopsinbåndet (enkeltpil) var ikke forskjellig mellom kontroll og UAM-ladede RPE-celler, noe som tyder på ingen stor effekt av UAM på RPE-fagocytose. Imidlertid var spaltningsproduktene av rhodopsin, indikert av dobbeltpilene, høyere i UAM-gruppen, noe som tyder på mild nedbrytende dysfunksjon i fagolysosomale systemet. Like nivåer av GAPDH indikerer at celletallet mellom brønner, som kan påvirke fagocytosehastigheten, var likt. (B) Ulike rhodopsinantistoffer gjenkjenner forskjellige nedbrytningsfragmenter. 4D2 gjenkjenner N-terminalen av rhodopsin, som er intakt til de aller siste trinnene av lysosomal nedbrytning. Fragmentene den gjenkjenner er derfor små (doble piler). I motsetning til dette gjenkjenner 1D4 C-terminalen av rhodopsin, som nedbrytes tidligere i fagolysosomal prosess. Dette antistoffet gjenkjenner derfor rhodopsinfragmenter med høyere molekylvekt (doble piler). Begge antistoffene gjenkjenner intakt rhodopsin (enkeltpil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Uredigert flekk tilsvarende figur 3A. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens RPE lipofuscin har blitt studert i flere tiår, er dets toksisitet diskutert 2,9,16,42. Gitt tvetydighet om toksisiteten av lipofuscin fra dyremodeller11, er in vitro-modeller ved bruk av human RPE verdifulle. En rekke in vitro lipofuscinakkumuleringsmodeller er beskrevet, men ingen har benyttet både OS-fôring og svært modne og differensierte humane RPE-kulturer. Denne kombinasjonen representerer en ideell modell, da OS-fôring rekapitulerer metoden for lipofuscinakkumulering in vivo og svært modne humane RPE-kulturer best replikerer RPE-oppførsel in vivo. Interessant, ved bruk av høyt differensierte hfRPE-kulturer, ble det oppdaget at rutinemessig OS-eksponering var utilstrekkelig til å indusere lipofuscinlignende materiale, selv etter gjentatte feedings16. Dermed akselererer denne protokollen lipofuscinakkumuleringsprosessen ved fotooksiderende OS (OxOS) på en kontrollert måte. Fôring av OxOS til både humane iPSC-RPE- og hfRPE-kulturer resulterte i robust akkumulering av lipofuscinlignende granulater, som kalles ufordøyelig autofluorescerende materiale (UAM). UAM-akkumulering tillater modellering av lipofuscin i kultursystemer som etterligner sunn human RPE in vivo 22,23,29,43,44. Både i en tidligere publikasjon og i denne studien viser omfattende karakterisering av UAM sammenlignet med native lipofuscin fra friske eldre voksne både likheter og forskjeller. UAM etterligner ultrastrukturen av lipofuscin in vivo, inkludert tendensen til at lipofuscingranulat smelter sammen med melaningranulat for å danne melanolipofuscin16. Både UAM og lipofuscin inneholder betydelige nøytrale lipider, ingen rhodopsin og ingen signifikant anrikning i kolesterol (figur 2A, B fra vår tidligere publikasjon16, figur 2A, B ovenfor, og upubliserte data). Vi sammenlignet også native lipofuscin granulat størrelse og spektrum til de fra UAM (figur 3 fra vår tidligere publikasjon16). UAM-granulater er i utgangspunktet litt større og blåforskjøvet sammenlignet med naturlig lipofuscin, men over betydelige perioder i kultur, UAM kompakt til en mindre størrelse og rødforskyvning i utslippsspekteret, blir mye mer lik størrelsen og spektraprofilen til innfødt lipofuscin.

OxOS UAM-modellen har blitt brukt til en rekke applikasjoner, inkludert effekten av autofagi-indusere på forebygging og fjerning av lipofuscingranulat50 og effekten av lipofuscin på RPE-polaritet og metabolisme16. Videre har disse granulatene vist seg å vedvare i dyrket RPE i mer enn et år, slik at man kan studere utviklingen av lipofuscinspektra, morfologi og oppførsel over lengre perioder16. Andre anvendelser for modellen inkluderer studier av lipofuscinakkumulering på komplementaktivering51, lysosomal stabilitet og inflammatorisk respons 52 og mitokondriell kompromiss53.

Det er noen kritiske trinn i denne protokollen. For det første må RPE-kulturer være svært differensierte og modne. OxOS feedings bør bare starte etter at RPE har vært på Transwells i minst 8 uker og har oppnådd alle egenskapene som er karakteristiske for svært moden RPE (de 5 'P'ene utarbeidet av Finnemann et al. - polygonal i morfologi, postmitotisk, pigmentert, polarisert og fagocytisk54). For det andre er operativsystemet svært skjørt og bør håndteres med forsiktighet under pipettering. Overdreven pipettering eller fryse-tining vil bryte fra hverandre operativsystemet. Til slutt er forholdet mellom OS og total UV-flukseksponering kritisk for å generere OxOS som forblir intakt, men kan fortsatt indusere UAM; Dette forholdet er forbedret i denne protokollen. For mye UV-lys for et gitt antall OS forårsaker overdreven tverrbinding og ødelegger kritiske kjemiske strukturer i operativsystemet. For lite UV-lys for et gitt antall OS vil mislykkes i å indusere UAM i kultur.

Endringer i protokollen innebærer i stor grad endring av OxOS fôringsvarighet eller konsentrasjon. Empirisk produserer 20 feedings i løpet av ca. 4 uker en robust mengde UAM-akkumulering. Fôringer utover dette kan gradvis legge til UAM-akkumulering, mens færre feedings sannsynligvis bare vil forårsake sporadisk UAM-akkumulering. Antall feedings kan justeres basert på formålet, behovene og ressursene til eksperimentet og eksperimentøren. I mindre differensierte RPE-kulturer (høyere passasjenummer, cellelinjer eller kulturer som demonstrerer epitel-mesenkymale overgangsegenskaper), er færre fôringer og lavere OxOS-konsentrasjoner nødvendig for robust UAM-induksjon.

Protokollen har flere begrensninger. Bruk av en håndholdt UV-lampe for fotooksidasjon av OS forhindrer presis kvantifisering av den totale strålingseksponeringen som leveres til OS. Imidlertid ble fotooksidasjon av OS ved hjelp av den håndholdte lampen korrelert i denne studien til en mye dyrere (men kvantitativ) UV-tverrbindingsenhet i figur 1 for å gi parametere for strålende eksponering. Det anbefales at eksperimenter endrer varigheten av UV-eksponering til kryssbinding / rhodopsin smøremønster etterligner det som ses i UV-lampesøylen i Western blot i figur 1C.

En annen begrensning av metoden er at den sannsynligvis mangler mange av funksjonene ved lipofuscinakkumulering in vivo. Faktisk, gjennom hele denne protokollen, blir de lipofuscinlignende granulatene referert til som ufordøyelig autofluroescerende materiale (UAM) for å gjøre dette skillet klart. Fotooksiderende OS rekapitulerer noen av de naturlige kjemiske kryssbindingene som skjer i fotoreceptorens ytre segmenter i sykdomstilstander, men tverrbindingen er sterkt akselerert og sannsynligvis mer uspesifikk i UAM-modellen. Videre, til tross for nesten en måned med OxOS-mating, representerer UAM-modellen fortsatt en "akutt" eksponering for lipofuscin-induserende OS, sammenlignet med tiårene det tar for lipofuscin å akkumulere hos mennesker. Med en mer langvarig lipofuscinakkumulering i kultur kan det være færre fenotypiske effekter. Likevel, fordi UAM-granulater vedvarer i mer enn et år i kultursystemet som presenteres her, er det mulighet til å studere deres langsiktige effekter på RPE-helse16.

En begrensning av "Total Consumptive Capacity" -metoden som presenteres her for å vurdere RPE-fagocytosekapasitet, er at den ikke klarer å skille om fagocytosedefekter kan skyldes OS-binding vs. opptak vs. nedbrytning. Faktisk, når målet med fagocytoseanalysen er mekanistisk innsikt i dysfunksjon av spesifikke trinn i fagocytoseprosessen, er tradisjonelle OS-pulsjaktanalyser mer hensiktsmessige. Måling av "total forbrukskapasitet" bør brukes når målet ganske enkelt er å entydig måle OS-fagocytosekompetansen til RPE-kulturen under kontroll versus eksperimentelle forhold.

Avslutningsvis presenteres en protokoll for lipofuscinlignende granulatakkumulering i høyt differensierte humane RPE-kulturer. Denne metoden fusjonerer den fysiologiske prosessen for lipofuscinakkumulering - gjentatt tilførsel av fotooksidert OS - med RPE-kulturmodeller som har blitt vist i gjentatte studier for sterkt å rekapitulere human RPE in vivo. De resulterende kulturer lastet med lipofuscinlignende granulater kan brukes til utallige applikasjoner, alt fra vurdering av lipofuscineffekter på RPE-biologi til tester av små molekyler, gener og signalveier som er viktige for modulering av lipofuscinakkumulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes delvis av tilskudd fra Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) og International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. støttes for tiden av et K08-stipend fra National Eye Institute (EY033420). Ingen føderale midler ble brukt til HFT-forskning. Ytterligere støtte kommer fra James Grosfeld Initiative for Dry AMD og følgende private givere: Barbara Dunn og Dee &; Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

Biologi utgave 194 lipofuscin retinalpigmentepitel (RPE) fotoreseptor ytre segmentspisser eller fragmenter (OS) fagocytose Stargardts sykdom aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) ufordøyelig autofluorescensmateriale (UAM)
Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantifisering av fagocytosekapasitet i høyt polariserte humane retinale pigmentepitelkulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter