Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Porfyrinmodificerede perler til brug som kompensationskontrol i flowcytometri

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Protokollen beskriver, hvordan porfyrinbaserede kompensationsperler til flowcytometri fremstilles ved reaktionen af aminfunktionaliserede polystyrenperler med porfyrin-TCPP og amidkoblingsreagenset EDC. En filtreringsprocedure anvendes til at reducere partikelbiprodukterne.

Abstract

Flowcytometri kan hurtigt karakterisere og kvantificere forskellige cellepopulationer baseret på fluorescensmålinger. Cellerne farves først med et eller flere fluorescerende reagenser, der hver funktionaliseres med et andet fluorescerende molekyle (fluorofor), der binder selektivt til celler baseret på deres fænotypiske egenskaber, såsom celleoverfladeantigenekspression. Intensiteten af fluorescens fra hvert reagens bundet til celler kan måles på flowcytometeret ved hjælp af kanaler, der detekterer et specificeret bølgelængdeområde. Når der anvendes flere fluoroforer, spildes lyset fra individuelle fluoroforer ofte over i uønskede detektionskanaler, hvilket kræver en korrektion af fluorescensintensitetsdataene i en proces kaldet kompensation.

Kompensationskontrolpartikler, typisk polymerperler bundet til en enkelt fluorofor, er nødvendige for hver fluorofor, der anvendes i et cellemærkningseksperiment. Data fra kompensationspartikler fra flowcytometeret bruges til at anvende en korrektion på fluorescensintensitetsmålingerne. Denne protokol beskriver fremstilling og oprensning af polystyrenkompensationsperler, der er kovalent funktionaliseret med det fluorescerende reagens meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphin (TCPP) og deres anvendelse i flowcytometrikompensation. I dette arbejde blev aminfunktionaliserede polystyrenperler behandlet med TCPP og amidkoblingsreagenset EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid) ved pH 6 og ved stuetemperatur i 16 timer med omrøring. TCPP-perlerne blev isoleret ved centrifugering og resuspenderet i en pH 7-buffer til opbevaring. TCPP-relaterede partikler blev observeret som et biprodukt. Antallet af disse partikler kan reduceres ved hjælp af en valgfri filtreringsprotokol. De resulterende TCPP-perler blev med succes anvendt på et flowcytometer til kompensation i eksperimenter med humane sputumbeller mærket med flere fluoroforer. TCPP-perlerne viste sig stabile efter opbevaring i køleskab i 300 dage.

Introduction

Porfyriner har været af interesse i mange år på det biomedicinske område på grund af deres fluorescens og tumormålretningsegenskaber 1,2,3. Terapeutiske anvendelser såsom fotodynamisk terapi (PDT) og sonodynamisk terapi (SDT) indebærer systemisk administration af et porfyrin til en kræftpatient, akkumulering af lægemidlet i tumoren og den lokaliserede eksponering af tumoren for et laserlys med en bestemt bølgelængde eller ultralyd. Eksponeringen for laserlys eller ultralyd fører til porfyrinets dannelse af reaktive iltarter og efterfølgende celledød 4,5. Ved fotodynamisk diagnose (PDD) anvendes porfyrinfluorescens til at skelne kræftceller fra normale celler6. I denne sammenhæng anvendes protoporphyrin IX, et naturligt fluorescerende porfyrin, der akkumuleres i tumorer ved systemisk eller lokal injektion af dets forløber, 5-aminolevulinsyre (5-ALA), til at identificere gastrointestinale stromale tumorer, blærekræft og hjernekræft 7,8. For nylig blev 5-ALA behandling undersøgt som en tilgang til at detektere minimal resterende sygdom i myelomatose9. Vores laboratorium har brugt tetraaryl porfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphin) for dets evne til selektivt at plette lungekræftceller og kræftassocierede celler i humane sputumprøver, hvilket er en egenskab, der er blevet udnyttet i diasbaserede og flow cytometriske diagnostiske assays10.

Nogle porfyriner er bifunktionelle, idet de kan anvendes som terapeutiske og diagnostiske midler 2,11. I biomedicinsk forskning anvendes sådanne bifunktionelle porfyriner til at evaluere, hvordan deres evne til selektivt at målrette og dræbe kræftceller er en funktion af deres struktur, samt hvordan den påvirkes af tilstedeværelsen af andre forbindelser 12,13,14,15,16. Både den cellulære optagelse af porfyriner og deres cytotoksicitet kan måles på en flowcytometrisk platform på en høj gennemstrømningsmåde. Absorptions- og emissionsspektrene for fluorescerende porfyriner er komplekse, men de fleste flowcytometriske platforme er udstyret til korrekt at identificere dem. Absorptionsspektret af fluorescerende porfyriner er kendetegnet ved et stærkt absorptionsbånd i området 380-500 nm, kendt som Soret-båndet. To til fire svagere absorptionsbånd observeres generelt i området 500-750 nm (Q-bånd)17. En blå 488 nm laser, der findes i de fleste flowcytometre, eller en violet laser (405 nm) kan generere lys med den passende bølgelængde for at excitere porfyriner. Emissionsspektrene for porfyriner viser typisk toppe i området 600-800 nm18, hvilket resulterer i meget lidt spektral overlapning med fluoresceinisothiocyanat eller phycoerythrin (PE) fluoroforer, men betydelig overlapning med andre ofte anvendte fluoroforer, såsom allophycocyanin (APC), såvel som tandemfluoroforer, såsom PE-Cy5 og andre. Når der anvendes porfyriner i flerfarvede flowcytometriassays, er enkeltfluoroforkontroller derfor afgørende for tilstrækkeligt at korrigere afsmitningen af fluorescens i andre kanaler end den, der er udpeget til at måle porfyrinens fluorescens.

Ideelt set bør de enkeltfluoroforkontroller, der anvendes til beregning af spillovermatrixen for et panel af fluoroforer (også kaldet "kompensationskontrol"), bestå af samme celletype(r) som prøven. Det er imidlertid ikke optimalt at bruge prøven til dette formål, hvis der er meget lidt prøve til at begynde med, eller hvis målgruppen i prøven er meget lille (for eksempel hvis man ønsker at se på minimal restsygdom eller kræftceller i de tidlige stadier af sygdommen). Et nyttigt alternativ til celler er perler kombineret med den samme fluorofor, der bruges til at analysere prøven. Mange sådanne perler er kommercielt tilgængelige; Disse perler er enten formærket med den ønskede fluorofor (formærkede fluoroforspecifikke perler)19,20, eller et fluorescerende mærket antistof kan fastgøres til dem (antistofindfangningsperler)20,21. Mens kommercielle kompensationsperler er tilgængelige for mange fluoroforer, er sådanne perler ikke tilgængelige for porfyriner på trods af deres stigende anvendelse i grundlæggende og klinisk forskning.

Ud over prøvekonservering og positive versus negative populationer af passende størrelse er de andre fordele ved at bruge perler som kompensationskontrol den lette forberedelse, lav baggrundsfluorescens og fremragende stabilitet over tid22. Den potentielle ulempe ved at bruge perler som kompensationskontrol er, at emissionsspektret for det fluorescerende antistof, der er fanget på perler, kan afvige fra det samme antistof, der bruges til at mærke cellerne. Dette kan være af særlig betydning, når der anvendes et spektralflowcytometer20. Derfor skal udviklingen af perler som kompensationskontrol udføres på flowcytometeret, der vil blive brugt til det assay, som perlerne udvikles til. Desuden skal udviklingen af perlerne omfatte en sammenligning med celler mærket med det samme fluorescerende farvningsreagens.

Her beskriver vi fremstillingen af TCPP-aminfunktionaliserede polystyrenkompensationsperler, hvis medianfluorescensintensitet i detektionskanalen var sammenlignelig med TCPP-mærkede celler i sputum, og deres anvendelse som kompensationskontroller for flowcytometri. Autofluorescensen af ækvivalente, ikke-funktionaliserede perler var tilstrækkelig lav til deres anvendelse som negativ fluorescenskompensationskontrol. Derudover viste disse perler stabilitet i opbevaring i næsten 1 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer skal udføres ved hjælp af passende personlige værnemidler.

1. Fremstilling af TCPP-stamopløsningen, 1,0 mg/ml

BEMÆRK: Dette kan udarbejdes månedligt.

  1. Brug en analysevægt, spatel og vejepapir til at veje 49,0-50,9 mg TCPP. Afrund vægten til 1/10 milligram. Indstil den målte mængde TCPP til side beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Brug en statisk pistol, hvis vægtaflæsningen er ustabil.
  2. Bestem de krævede mængder renset vand og isopropanol (IPA) fra tabel 1 baseret på mængden af TCPP vejet i trin 1.1 . Tilsæt det rensede vand og isopropanol til et 100 ml glasbægerglas, og dæk med parafilm for at beskytte mod fordampning.
  3. Bestem den krævede mængde natriumbicarbonat fra tabel 1 baseret på mængden af TCPP vejet i trin 1.1 .
  4. Brug analysevægten, spatlen og vejepapiret til at afveje den nødvendige mængde natriumbicarbonat bestemt i trin 1.3. Afrund vægten til 1/10 milligram.
    BEMÆRK: Brug en statisk pistol, hvis vægtaflæsningen er ustabil.
  5. Natriumbicarbonatet tilsættes til 100 ml bægerglasset indeholdende renset vand og isopropanol. Dæk opløsningen med parafilm for at beskytte mod fordampning.
  6. Opløsningen fra trin 1.5 anbringes på en omrøringsplade, og der omrøres, indtil den er opløst (ca. 10 min)
  7. PH-værdien måles for at sikre, at den natriumbicarbonatholdige opløsning fra trin 1,6 har en pH-værdi på mellem 9 og 10.
  8. Tilsæt langsomt TCPP vejet i trin 1.1 til opløsningen fra trin 1.7, og fortsæt omrøringen, indtil den er opløst (~30 min). Beskyt mod lys under dette trin.
  9. Opbevares i en glas- eller polypropylenbeholder ved stuetemperatur og beskyttet mod lys.

2. Fremstilling af 2-(N-morpholino)-ethanesulfonsyre (MES) og heminatriumsaltbufferopløsning, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-buffer")

BEMÆRK: Dette skal tilberedes på brugsdagen og opbevares ved stuetemperatur.

  1. Afvej 2,50 g MES heminatriumsalt, og tilsæt dette til en 150 ml plastflaske.
  2. Tilsæt 121 ml renset vand, og opløs ved manuel omrystning, indtil der ikke er noget fast stof synligt.
  3. PMH-værdien i markedsøkonomisk buffer måles for at sikre, at den ligger mellem 6 og 6,2.
  4. Vedligehold ved stuetemperatur til brug samme dag.

3. N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC) pulver

  1. Tag EDC-pulveret ud af fryseren, og lad det sidde ved stuetemperatur indtil brug i trin 5.

4. Kombination af aminfunktionaliserede polystyrenperler med TCPP-opløsning

  1. Der tilsættes 4,3 ml 0,1 M MES-bufferopløsning fremstillet i trin 2 til et 15 ml polypropylenrør.
  2. Vortex den aminfunktionaliserede polystyrenperleophæng (10 μm, 2,5% w/v) i 60 s ved maksimal hastighed.
  3. Der tilsættes 288 μL af denne friskhvirvelformede perlesuspension til MES-bufferen fra trin 4.1.
  4. Vortex MES/perleopløsningen i 15 s ved maksimal hastighed.
  5. Vortex 1 mg/ml TCPP-opløsningen fremstillet i trin 1 i 60 s ved maksimal hastighed.
  6. Tilsæt 1,20 ml af denne friskhvirvlede TCPP-stamopløsning til MES/perleophænget fra trin 4.4.
  7. Vortex MES / perle / TCPP suspension i 15 s ved maksimal hastighed.
  8. Dæk røret med folie, mens EDC-opløsningen fremstilles.

5. Fremstilling af N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC) hydrocholorid (HCl) stamopløsning

BEMÆRK: EDC-opløsningen er letfordærvelig og skal anvendes umiddelbart efter tilberedning.

  1. Tilsæt 20,0 ml renset vand til et nyt 50 ml konisk rør.
  2. 200 mg EDC HCI fra trin 3 afvejes, og det tilsættes vandet (trin 5.1).
  3. Vortex EDC HCL i 15 s ved maksimal hastighed for at generere en klar løsning.

6. Udarbejdelse af EDC HCl/MES arbejdsløsningen

BEMÆRK: EDC HCl/MES-opløsningen er letfordærvelig og skal anvendes umiddelbart efter tilberedning.

  1. Tilsæt 54,0 ml MES-bufferopløsning (tilberedt i trin 2) til en 150 ml plastflaske.
  2. Der tilsættes 6,0 ml EDC HCl-stamopløsning (fremstillet i trin 5) til MES-bufferopløsningen, og blandingen blandes under omrystning i 10 sekunder.

7. Mærkning af perlerne med TCPP

  1. Der tilsættes 4,5 ml EDC-arbejdsløsning (fra trin 6) til 15 ml polypropylenrør, der indeholder perlerne og TCPP i MES-buffer (trin 4.7).
  2. Anbring røret i en inverterende rotator ved 35 o / min i 16 timer ved stuetemperatur og beskyttet mod lys.
  3. Centrifuger slangen ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1.000 × g.
  4. Supernatanten suges op, og perlerne resuspenderes i 0,8 ml af Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS).
  5. Overfør perleopløsningen til et gult hætteglas med polypropylen med en 1 ml pipette, og opbevar ved 4 °C indtil yderligere brug.
    BEMÆRK: Perlerne er stabile i mindst 3 måneder på dette tidspunkt.

8. Kvalitetskontrol (QC) af TCPP-perlerne ved flowcytometri

BEMÆRK: QC bør centreres om, hvorvidt TCPP-perlernes medianfluorescensintensitet (MFI) er tilstrækkelig lys til deres tilsigtede anvendelse, og mængden af partikler, der genereres ved proceduren. Se afsnittet om repræsentative resultater for at få flere oplysninger.

  1. Mærk et 5 ml polystyrenrør som "TCPP negative perler."
    BEMÆRK: De negative perler adskiller sig fra de aminfunktionaliserede perler, der anvendes til mærkning. Se materialetabellen.
  2. Mærk et andet rør som "TCPP-positive perler."
  3. Mærk et andet rør som "Regnbueperler."
  4. Alikvote 300 μL iskold HBSS i rørene mærket med "TCPP negative perler" og "TCPP positive perler."
  5. Tilsæt 500 μL iskold HBSS i røret mærket som "Rainbow perler."
  6. Vortex den ikke-funktionaliserede polystyren (umærkede) perleophæng kort ved maksimal hastighed (2-3 s), og tilsæt 10 μL af det til røret mærket "TCPP negative perler."
  7. Vortex den TCPP-mærkede perleophæng (afsluttet i trin 7.5) kortvarigt ved maksimal hastighed, og tilsæt 3 μL af den til røret "TCPP positive perler".
  8. Vortex Rainbow perleophænget kortvarigt ved maksimal hastighed, og tilsæt to dråber af det i røret "Rainbow beads".
  9. Hold alle rør på is, dækket og beskyttet mod lys.
  10. Start de relevante daglige opstartsprocedurer for flowcytometeret, og udfør en QC for at verificere de optimale væsker og laserjustering.
    BEMÆRK: For denne del af protokollen antages det, at operatøren er uddannet i brugen af det flowcytometer, der er tilgængeligt, herunder procedurerne for standardisering af lysspredning og fluorescensintensitet samt de grundlæggende principper for beregning af den korrekte kompensationsmatrix.
  11. Kør Rainbow perlerne og TCPP perlerne uden at ændre spændingsindstillingerne mellem de forskellige kørsler.
    1. Kør og saml 10.000 begivenheder af regnbueperlerne.
    2. Udfør en skylning med vand, og saml 10.000 hændelser af TCPP-negative perler.
    3. Udfør en skylning med vand, og saml 10.000 hændelser af de TCPP-positive perler.
    4. Udfør en 1 min vandskylning.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at skylle med vand efter kørsel af TCPP-perlerne. Hvis TCPP ikke skylles fra linjerne i cytometeret, er der mulighed for, at resterende TCPP kan mærke celler i det næste rør, der skal erhverves.
    5. Udfør de relevante rengørings- og nedlukningsprotokoller, der er specifikke for producentens instruktioner til cytometeret.
      BEMÆRK: For repræsentative resultater, se figur 1.

9. Perlefiltrering

BEMÆRK: Hvis perlernes QC ved flowcytometri (trin 8) viser en høj andel partikler (70% eller højere), skal du overveje at filtrere perlesuspensionen ved hjælp af nedenstående protokol (figur 2).

  1. Tilsæt 3,20 ml iskold HBSS til 0,8 ml af TCPP-perlesuspensionen, der blev afsluttet i trin 7.5 (hvilket skaber en fem gange fortynding).
  2. Vortex den fortyndede perleophæng ved maksimal hastighed i 15 s.
  3. Fjern stemplet fra en 5 ml engangssprøjte.
  4. Monter sprøjten med et glasfiberspidsfilter (5 μm, 13 mm diameter).
  5. Tilsæt 4 ml HBSS til sprøjten.
  6. Der tilsættes 0,5 ml hvirvelformet fortyndet perlesuspension (trin 9.2).
  7. Brug stemplet til at filtrere suspensionen gennem sprøjte-/filteropsætningen ved ca. 2 dråber/s.
  8. Perlerne vaskes ved at trække 5 ml frisk HBSS ind i sprøjten gennem filteret med ca. 2 dråber/s.
  9. Skub HBSS ud igen i affaldsbeholderen med ca. 2 dråber / s.
  10. For at fjerne perlerne fra filteret trækkes yderligere 5 ml frisk HBSS ind i sprøjten gennem filteret.
  11. Fjern forsigtigt filteret fra sprøjten.
  12. Skub perlesuspensionen ud af sprøjten i et 50 ml konisk centrifugeglas.
  13. Sæt filteret tilbage på sprøjten, og gentag trin 9.10-9.12 fire gange mere. Kassér derefter filteret og sprøjten.
  14. Gentag trin 9.2-9.13, indtil alle perlerne fra trin 9.1 er filtreret. Brug en frisk sprøjte og filtrer hver gang.
  15. De filtrerede perlesuspensioner centrifugeres i 10 minutter ved 1.000 × g ved stuetemperatur.
  16. Supernatanten på hvert 50 ml glas suges op, og perlerne opslæmmes forsigtigt, idet de kombineres i 0,5 ml frisk HBSS.
  17. Overfør perlerne med en p1.000 mikropipette til et nyt hætteglas med rav, glas eller polypropylen, og opbevar dem ved 4 °C.
  18. Gentag trin 8 for at afgøre, om andelen af TCPP-relaterede partikler i den filtrerede perlesuspension er faldet. For repræsentative resultater, se figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol til TCPP-mærkning af perler er relativt hurtig og effektiv. Figur 1 viser et repræsentativt resultat af TCPP-perlemærkningsprocessen bestemt ved flowcytometri. Figur 1A viser den standardiserede profil af regnbueperler, som detekteret i den relevante kanal til detektering af TCPP. Disse perler tjener som en QC til standardisering af laserspændingerne til påvisning af TCPP ved flowcytometeret. Figur 1B viser lysspredningsprofilen for aminfunktionaliseret polystyren, TCPP-mærkede perler. Figur 1C viser lysspredningsprofilen for ikke-funktionaliserede perler (umærkede perler); Vi bruger disse som en negativ perlekontrol til beregning af kompensationsmatrixen. Den population, der er angivet med det røde rektangel, som er fraværende i den umærkede perlesuspension, repræsenterer de TCPP-relaterede partikler, der dannes, når TCPP udsættes for koblingsreagenset EDC. Sådanne aggregater bør udelukkes, når perlernes fluorescensintensitet (FI) bestemmes. Figur 1D viser FI for de mærkede perler, valgt af den sorte port i figur 1B, som klart er flere logfiler højere end FI for de (umærkede) umærkede perler (sammenligning af figur 1D med figur 1E).

Andelen af partikler (dvs. de hændelser, der er angivet med den røde port i figur 1B) kan variere fra mærkningsbatch til mærkningsbatch. For de fleste standard flowcytometriapplikationer giver en perlesuspension med 50% partikler eller mindre mulighed for korrekt opsætning af kompensation i et flerfarvet flowcytometrieksperiment ved hjælp af TCPP. Der er dog applikationer, for eksempel, hvor automatiseret dataanalyse anvendes, hvor meget højere partikelindhold kan forstyrre korrekte kompensationsindstillinger. I sådanne tilfælde anbefales filtrering (protokoltrin 9 og figur 2). Figur 3 viser effekten af filtrering på perleophænget, der bestod af ~65% partikler (venstre panel i figur 3A,B). Efter filtrering faldt partikelindholdet til ~12%. De negative virkninger af filtrering er et vist tab af perler (ikke vist) og et lille tab af FI (figur 3C). Disse virkninger bør tages i betragtning, når filtrering af perlesuspensionen overvejes. Et alternativ til perlefiltrering for at sænke partikelindholdet er at ændre forholdet mellem perlerne, TCPP og koblingsreagenset EDC. Ændringer i disse forhold påvirker imidlertid også perlernes FI.

Forholdet mellem partikeldannelse, MFI og perle/TCPP/EDC-forhold er illustreret i figur 4 og figur 5. Figur 4A og figur 5A viser MFI for de mærkede perler som funktion af henholdsvis EDC / TCPP-forholdet og TCPP / perleforholdet. Med stigende forhold øges MFI'en, indtil den plateauer. De repræsentative eksempler i figur 4B og figur 5B viser, at partikelindholdet stiger med det respektive stigende forhold. Denne TCPP-mærkningsprotokol blev optimeret til maksimal MFI, samtidig med at partikelindholdet blev holdt så lavt som muligt (pile i figur 4A og figur 5A). Partiklerne vises kun, når EDC anvendes som koblingsreagens under mærkningsproceduren. Ved kun at bruge perler og TCPP dannes der ikke partikler (ikke vist), men mærkningen af perlerne resulterer i perler med meget lavere FI (sammenligning af figur 6A med figur 6B). Vi forsøgte at erstatte denne EDC-baserede koblingsmetode med en metode baseret på en aktiveret NHS (N-hydroxysuccinimid) ester af TCPP23. Vi fandt imidlertid ingen signifikant forskel i FI ved hjælp af denne alternative koblingsmetode sammenlignet med blot at bruge perler og TCPP sammen, hvilket tyder på, at der er ubetydelig kovalent binding af TCPP til perlerne med denne metode (sammenligning af figur 6B med figur 6C).

De data, der præsenteres i alle figurer hidtil, blev indsamlet ved hjælp af perler med en diameter på 10,6 μm. Vi antog, at større perler kan have flere TCPP-bindingssteder på grund af det øgede overfladeareal og derfor kunne vise højere FI. Omvendt antog vi, at mindre perler med mindre overfladearealer og færre TCPP-bindingssteder skulle vise lavere FI. Brug af den samme mærkningsprotokol som beskrevet her, men med 8,6 μm perler eller 20 μm perler (i stedet for 10,6 μm perler), vi fandt den forventede reduktion i FI i 8,6 μm perlerne sammenlignet med 10,6 μm perlerne (sammenligning af figur 6D med figur 6A). De 20 μm perler viste en FI uden for skalaen for det flowcytometer, vi brugte (data ikke vist), men disse større perler slog sig hurtigt ud af opløsningen og blev ikke forfulgt yderligere.

Denne protokol til mærkning af perler med TCPP blev udviklet med det formål at have et pålideligt kompensationsværktøj i flowcytometrieksperimenter, hvor TCPP bruges til at mærke celler. Tidligere brugte vi A549-celler til dette formål24, men mærkningsproceduren resulterede ikke altid i en høj FI. Desuden kunne cellerne, selv efter fiksering, ikke bruges i mere end 1 måned. Protokollen til mærkning (10,6 μm) perler med TCPP beskrevet heri resulterede konsekvent i farvestrålende perler, som vist i figur 1. Da de samme TCPP-mærkede perler blev testet ved flowcytometri efter 300 dage, observerede vi desuden ikke en signifikant ændring i MFI eller i partikelindholdet (figur 7). Koblingen af TCPP til perlerne havde ringe effekt på dets fluorescensemissionsspektrum (figur 8A; sammenligning af den stiplede sorte linje med den faste sorte linje, som repræsenterer TCPP's fluorescensemissionsspektrum i opløsning). Fluorescensemissionsspektret for TCPP-mærkede perler adskilte sig mere fra spektret af TCPP målt inde i A549 lungekræftceller, især omkring 700-725 nm bølgelængderne (figur 8A; stiplede sorte linje sammenlignet med den orange linje, henholdsvis). Men med evnen til at kompensere TCPP-signalet fra de andre signaler i en multifluoroformærket sputumprøve fungerede de TCPP-mærkede perler lige så godt som de TCPP-farvede A549-celler (sammenligning af henholdsvis figur 8B og figur 8C).

Den. LMD-filer findes i FlowRepository (https://flowrepository.org) under id'erne FR-FCM-Z6ZP (figur 1); FR-FCM-Z5UJ (figur 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (figur 4B); FR-FCM-Z6ZS (figur 5B); FR-FCM-Z6ZB (figur 6); FR-FCM-Z6Y5 (figur 8B); og FR-FCM-Z6ZT (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Kvalitetskontrol af perlerne mærket med TCPP. (A) Regnbueperler. Præsenteret er histogrammet for regnbueperlerne som detekteret i kanalen, der er specifik for APC-fluoroforen. Denne kanal kan også bruges til at detektere TCPP-fluorescens. Rainbow-perlerne fungerer som QC for APC-laseren; Den første og fjerde top bør falde i det område, der er angivet med de respektive parenteser. (B,D) TCPP-mærkede perler. (C,E) Umærkede perler. Denne særlige prøve af TCPP-mærket perleopløsning omfattede 51,9% perler (sort rektangelport i B). Begivenhederne i det røde rektangel repræsenterer de partikler, der dannede sig under TCPP-mærkningen. Sådanne partikler var fraværende i den umærkede perleopløsning (sammenligning af de røde rektangler i B og C). Fluorescensintensiteterne af TCPP-mærkede og umærkede perler præsenteres i henholdsvis D og E. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremadrettet spredning; APC = allophycocyanin; TCPP = meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk gengivelse af den perlefiltreringsmetode, der anvendes i protokoltrin 9.3-9.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Filtreringseffekter på partikler og fluorescensintensitet. (A) Mikroskopibilleder af 10 μm perler mærket med TCPP før (venstre billede) og efter filtrering (højre billede). Billederne blev taget med en 20x forstærkning. Skalabjælke = 20 μm. (B) TCPP-perleophænget før filtrering (venstre profil) omfattede 25,6% perler (sort rektangel) og 65,7% snavs eller partikler (rødt rektangel). Andelen af perler i suspensionen steg til 74,7% efter filtrering (højre profil, sort rektangel), og affaldet faldt til 11,9%. C) Histogrammer for TCPP FI for perlerne som identificeret i B. Histogrammet til venstre repræsenterer de TCPP-mærkede perler før filtrering, med en FI lidt højere end perlerne efter filtrering (histogram til højre). De røde linjer, der er placeret ved en FI på 1 × 103 i begge figurer, skal lette sammenligningen af begge histogrammer. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremadrettet spredning; APC = allophycocyanin; TCPP = meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphin; FI = fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forholdet mellem EDC/TCPP-forholdet, medianfluorescensintensiteten (MFI) og partikeldannelsen. (A) Præsenteret er forholdet mellem EDC / TCPP-forholdet, der anvendes i perlemærkningsprotokollen, og MFI for de efterfølgende TCPP-mærkede perler. Kurven viser den gennemsnitlige MFI for tre uafhængige eksperimenter ± standardafvigelse (SD). Den røde pil (3,75) angiver det volumetriske forhold mellem EDC- og TCPP-opløsningerne, der anvendes i denne protokol. B) Repræsentative lysspredningsprofiler for perleophængene fremstillet med EDC/TCPP-forholdet som angivet over hver profil. Alle profilerne er afledt af det samme eksperiment. Perlerne er angivet med det sorte rektangel. Partikeldannelsen, angivet med de røde rektangler, øges med stigende EDC / TCPP-forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Forholdet mellem TCPP / perleforholdet, MFI og partikeldannelse. (A) Præsenteret er forholdet mellem TCPP / perler volumetrisk forhold, der anvendes i perlemærkningsprotokollen og MFI for de efterfølgende TCPP-mærkede perler. MFI'en stiger hurtigt og når en plateaufase efter et TCPP / perleforhold på 2. Kurven viser den gennemsnitlige MFI for tre uafhængige eksperimenter ± standardafvigelse (SD). Den røde pil (4.17) angiver det forhold, der anvendes i denne protokol. B) Repræsentative lysspredningsprofiler af perleophængene fremstillet med TCCP/perleforholdet som angivet over hver profil. Alle profilerne er afledt af det samme eksperiment. Perlerne er angivet med de sorte rektangler. Partikeldannelsen, angivet med de røde rektangler, øges med stigende TCPP / perleforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: En sammenligning af de anvendte koblingsmetoder og perlestørrelser. Vist er histogrammer af fluorescensintensiteten af perlerne mærket med TCPP. (A) 10,6 μm perlerne blev mærket i henhold til den angivne protokol, herunder brugen af koblingsreagenset EDC. (B) Det samme som (A), men EDC blev udeladt under mærkningsprotokollen. (C) 10,6 μm perlerne blev mærket ved hjælp af NHS-esteren i overensstemmelse med metoden beskrevet af Kabe et al.23. (D) Samme som (A), men i stedet for 10,6 μm perler blev der brugt 8,6 μm perler. De lodrette røde linjer i hver profil er vilkårligt sat til 1 × 103 for at lette sammenligninger mellem histogrammerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: TCPP-perlernes stabilitet over tid. TCPP-mærkede perler (10 μm) blev mærket i henhold til protokollen, opbevaret i køleskabet ved 4 °C og opbevaret i mørke. Dag 0 er dagen for mærkning. På forskellige tidspunkter derefter blev alikvoter af de lagrede perler genanalyseret ved flowcytometri. Præsenteret er målinger af (A) MFI og (B) procentvise partikler i forhold til dag 0-værdien, som vilkårligt blev sat til 100%. De vandrette orange linjer repræsenterer værdierne 10 % over og 10 % under værdierne på dag 0. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: TCPP-perler sammenlignet med TCPP-farvede celler som kompensationsværktøjer. (A) Fluorescensemissionsspektrene for TCCP i opløsning, TCPP koblet til perler og TCPP efter farvning af A549 lungekræftceller blev målt på en mikropladelæser. Emissionsspektrene for opløselig og perlebundet TCPP er meget ens. Begge adskiller sig fra mærkede A549-celler omkring 700 nm bølgelængden. (B,C). En sputumprøve blev behandlet til enkeltceller og mærket med flere fluoroforer: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) og TCPP (FL6). For hver fluorofore forberedte vi ensfarvede kontrolrør indeholdende perler kombineret med den relevante fluorofor. Til TCPP blev der oprettet to kontrolrør: et med TCPP-mærkede perler og et med faste A549-celler mærket med TCPP. Dette gjorde det muligt for os at oprette to kompensationsmatricer: (B) en, hvor de TCPP-mærkede perler blev brugt som kompensationskontrol for TCPP (FL-6) og (C) en, hvor TCPP-mærkede A549-celler blev brugt. Disse to kompensationsmatricer er meget ens, med den største forskel i TCPP-relateret kompensation mellem TCPP (FL6) og FL-3. De ledsagende prikdiagrammer, der viser disse særlige parametre, viser næsten identiske profiler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Reagenser, der kræves til TCPP-stamopløsningen. Mængderne af NaHCO3, renset vand og isopropanol (IPA) er baseret på mængden af TCPP vejet i trin 1.1 (mellem 49,0 mg og 50,9 mg). Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På trods af de mange anvendelser af porfyriner i kræftdiagnose og terapi2 er der begrænset litteratur om deres potentielle anvendelse som et flowcytometrisk reagens til identifikation af kræftcellepopulationer versus ikke-kræftcellepopulationer i primært humant væv24,25,26. Vores forskning i flowcytometrisk analyse af humant sputum24,27 kræver farvning af dissocierede sputumceller med TCPP og flere andre fluoroforer. Imidlertid betød fluorescensafsmitning af TCPP i detektionskanalerne, der var udpeget til andre fluoroforer, at der var behov for en TCPP-mærket perle som kompensationskontrol. Imidlertid var ingen sådan perle kommercielt tilgængelig og måtte udvikles. Fastgørelsen af tetraarylporfyriner til siliciumdioxidbaserede molekylsigter28,29 er blevet rapporteret. Siliciumdioxidbaserede partikler viste sig imidlertid uegnede til fremstilling af flowcytometristandarder (data ikke vist). Derfor fokuserede vores undersøgelser på polystyrenperler.

En opløsning af TCPP i isopropanol-vand (1: 1 v / v) 30 mærkede polystyrenperlerne ved pH 6, men MFI'en var for lav i forhold til de farvede celler i vores analyse. Vi undersøgte kovalent perlemodifikation som en måde at øge MFI'en på. Den kovalente modifikation af aminfunktionaliserede latexperler med NHS-esteren af TCPP gennem amidering blev tidligere beskrevet af Kabe et al.23 ved anvendelse af ikke-kommercielle perler med en diameter på 2 μm31. I undersøgelsen af Kabe et al.23 blev TCPP inkuberet i DMF med N-hydroxysuccinimid (NHS)32 i 5 timer for at fremstille en aktiveret NHS-monoester af TCPP. Denne aktiverede esteropløsning blev derefter reageret med perler indeholdende en terminal aminlinker. Men da vi anvendte denne protokol på kommercielle aminfunktionaliserede polystyrenperler, resulterede mærkningen i perler med en MFI, der ikke var tilstrækkelig lys til kompensation. Derfor undersøgte vi den direkte amidering af aminpolystyrenperler uden at bruge et NHS-estermellemprodukt.

I dette arbejde blev aminfunktionaliserede polystyrenperler behandlet med TCPP i nærværelse af amidkoblingsreagenset EDC for at generere amidbindinger mellem aminogrupperne på perlerne og carboxygrupperne på TCPP. EDC blev valgt på grund af dets vandopløselighed, dokumenterede anvendelighed i vandige amideringsreaktioner over et bredt pH-område, lave omkostninger og vandopløselige biprodukter33,34. Vi reagerede aminpolystyrenperler med diametre på 8,6 μm, 10,6 μm og 20 μm med TCPP og EDC i vand ved pH 6. Tidligere undersøgelser har vist, at TCPP forbliver opløseligt ved denne pH, og denne pH er også kompatibel med EDC33. De mærkede 8,6 μm perler resulterede i en MFI, der var for lav til vores analyse. De 20 μm perler havde en tilstrækkelig høj MFI, men var tilbøjelige til at sætte sig ud af suspensionen og tilstoppe flowcytometeret (ikke vist). De 10,6 μm perler havde en passende MFI, forblev i suspension længe nok til flowcytometrianalyse og blev således optimeret som kompensationsstandarder. Især havde de tilsvarende umærkede perler lav baggrundsfluorescens og kunne bruges som negative kontrolperler til kompensation.

Forøgelse af det volumetriske reagensforhold mellem EDC og TCPP, samtidig med at mængden af perler holdes konstant, øgede perle-MFI'en, indtil et plateau blev nået i et forhold på ca. 2. Et MFI-plateau blev også observeret, da forholdet mellem TCPP og perler blev øget, mens EDC til TCPP-forholdet blev holdt konstant. Da TCPP mærkede perlerne i fravær af EDC, kan MFI-plateauet være et resultat af, at kovalente og ikke-kovalente bindingssteder er mættet på overfladen af perlen. Et TCPP-relateret partikelbiprodukt blev observeret, når EDC og TCPP blev kombineret ved pH 6. Dette partikelformet havde et fluorescensspektrum svarende til TCPP, men blev ikke dannet i fravær af EDC, hvilket tyder på, at det er et uopløseligt biprodukt fra EDC's reaktion med TCPP. Partiklerne var uregelmæssigt formede, og selvom de generelt var mindre end 5 μm, kunne de danne større aggregater og kunne også klæbe til perlernes overflade. TCPP-relaterede partikler blev også observeret, når aminpolystyrenperler blev reageret med TCPP og EDC. Mængden af partikler steg med både et højere EDC til TCPP-forhold og et højere TCPP til perleforhold. De reagensforhold, der er valgt i den endelige protokol, er nøglen til succes med perlemærkningsproceduren, fordi de sikrer, at den resulterende perlesuspension har en høj MFI, mens partikelniveauet forbliver acceptabelt. Niveauet af partikler, der produceres i denne protokol, udelukker ikke brugen af TCPP-perler til kompensation, men højere niveauer af partikler kan hæmme nøjagtigheden af kompensationsindstillingerne35. Vi udviklede også en filtreringsprocedure, der kan reducere niveauet af partikler betydeligt, hvis disse er til stede på et højt niveau.

Vi gennemførte vores reaktion ved hjælp af en roterende omrører. Hvis reaktionen ikke omrøres, resulterer det i langsommere farvning (data ikke vist). En reaktionstid på 16 timer anbefales. Længere reaktionstider (>24 timer) resulterer i højere niveauer af TCPP-partikler, mens kortere reaktionstider (<8 timer) resulterer i MFI med lavere perle. Til den umærkede perlekontrol brugte vi ikke aminfunktionaliserede perler, der ikke var mærket med TCPP, fordi autofluorescensen af de umærkede perler forstyrrede beregningen af kompensationsmatricerne korrekt. I stedet brugte vi ikke-funktionaliserede polystyrenperler, der ligner hinanden i mærke og størrelse. Derudover opbevarede vi de umærkede og TCPP-mærkede perler i separate rør. Med begge sæt perler i samme rør observerede vi en vis overførsel af TCPP til de umærkede perler (data ikke vist), hvilket forårsagede et højreskift i MFI'en, der forbød den korrekte beregning af kompensationsmatrixen.

Sammenfattende er de kritiske punkter for at opnå en høj MFI for de TCPP-mærkede perler de reagensforhold, der anvendes under farvningsreaktionen, tidspunktet for farvningsreaktionen og diameteren af de umærkede perler. I dette arbejde gav protokollen beskrevet ovenfor TCPP-farvede perler, der var passende dimensioneret til brug i et flowcytometer og var tilstrækkeligt fluorescerende til kompensation. De TCPP-farvede perler mistede ikke signifikant MFI ved 4 °C i 300 dage. TCPP-perlernes fluorescensspektrum var sammenligneligt med TCPP's i opløsning. Desuden genererede kompensationsmatricerne beregnet med TCPP-mærkede perler og farvede A549-celler næsten identiske sputumprofiler i vores analyse, hvilket demonstrerer nytten af disse perler.

Denne protokol beskriver forberedelsen af TCPP-kompensationsperler, der var nyttige på Navios EX-instrumentet, men de samme perler fungerer muligvis ikke på et andet instrument med forskellig følsomhed36 og en anden detektorkonfiguration20. Dette arbejde foreslår imidlertid måder at modulere fluorescensen gennem perlestørrelsen og reagensforholdet. TCPP er kun en af flere fluorescerende porfyriner, der har vist kræftcelleselektivitet in vitro og in vivo 2,37,38,39. Ikke alle fluorescerende porfyriner binder sig muligvis til de aminfunktionaliserede polystyrenperler, der anvendes i denne protokol. Faktisk er brugen af disse perler begrænset til porfyriner, der indeholder en carboxylsyre. Differentiel farvning af forskellige cellepopulationer i humane vævsprøver med porfyriner, målt ved flowcytometri, kan give indsigt i den tidlige udvikling af kræft, dens progression og dens prognose. Anvendelsen af andre porfyriner til farvning af humane vævsprøver og deres analyse ved flowcytometri ved hjælp af passende kontrolperler som kompensationsstandarder er en attraktiv retning for yderligere forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte i bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke David Rodriguez for hjælp med figurforberedelsen og Precision Pathology Services (San Antonio, TX) for brugen af dets Navios EX flowcytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 193 Flowcytometri kompensationskontrol fluorofor mærkning aminfunktionaliserede perler amidering porfyrin
Porfyrinmodificerede perler til brug som kompensationskontrol i flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter