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Chemistry

फ्लो साइटोमेट्री में मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए पोर्फिरीन-संशोधित मोती

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

प्रोटोकॉल बताता है कि फ्लो साइटोमेट्री के लिए पोर्फिरीन-आधारित मुआवजा मोती पोर्फिरीन टीसीपीपी और एमाइड युग्मन अभिकर्मक ईडीसी के साथ अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों की प्रतिक्रिया से कैसे तैयार किए जाते हैं। पार्टिकुलेट बायप्रोडक्ट्स को कम करने के लिए एक निस्पंदन प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है।

Abstract

फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस माप के आधार पर विभिन्न सेल आबादी को तेजी से चिह्नित और निर्धारित कर सकती है। कोशिकाओं को पहले एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से दाग दिया जाता है, प्रत्येक को एक अलग फ्लोरोसेंट अणु (फ्लोरोफोरे) के साथ कार्यात्मक किया जाता है जो कोशिकाओं को उनकी फेनोटाइपिक विशेषताओं, जैसे सेल सतह एंटीजन अभिव्यक्ति के आधार पर चुनिंदा रूप से बांधता है। कोशिकाओं से बंधे प्रत्येक अभिकर्मक से प्रतिदीप्ति की तीव्रता को प्रवाह साइटोमीटर पर चैनलों का उपयोग करके मापा जा सकता है जो तरंग दैर्ध्य की एक निर्दिष्ट सीमा का पता लगाते हैं। जब कई फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाता है, तो अलग-अलग फ्लोरोफोर से प्रकाश अक्सर अवांछित पहचान चैनलों में फैल जाता है, जिसके लिए मुआवजे नामक प्रक्रिया में प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा में सुधार की आवश्यकता होती है।

मुआवजा नियंत्रण कण, आमतौर पर एक एकल फ्लोरोफोरे से बंधे बहुलक मोती, सेल लेबलिंग प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोफोर े के लिए आवश्यक होते हैं। फ्लो साइटोमीटर से मुआवजा कणों से डेटा का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता माप में सुधार लागू करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट अभिकर्मक मेसो-टेट्रा (4-कार्बोक्सीफिनाइल) पोर्फिन (टीसीपीपी) और फ्लो साइटोमेट्री मुआवजे में उनके आवेदन के साथ सहसंयोजक रूप से कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मुआवजा मोतियों की तैयारी और शुद्धि का वर्णन करता है। इस काम में, अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों को टीसीपीपी और एमाइड युग्मन अभिकर्मक ईडीसी (एन-(3-डाइमिथाइलएमिनोप्रोपिल)-एन'-एथिलकार्बोडिमाइड हाइड्रोक्लोराइड) के साथ पीएच 6 पर और आंदोलन के साथ 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इलाज किया गया था। टीसीपीपी मोतियों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था और भंडारण के लिए पीएच 7 बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था। टीसीपीपी से संबंधित कणों को एक उपोत्पाद के रूप में देखा गया था। वैकल्पिक निस्पंदन प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन कणों की संख्या को कम किया जा सकता है। परिणामी टीसीपीपी मोतियों को कई फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए मानव थूक कोशिकाओं के साथ प्रयोगों में मुआवजे के लिए प्रवाह साइटोमीटर पर सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था। 300 दिनों के लिए रेफ्रिजरेटर में भंडारण के बाद टीसीपीपी मोती स्थिर साबित हुए।

Introduction

पोर्फिरीन अपने प्रतिदीप्ति और ट्यूमर-लक्ष्यीकरणगुणों 1,2,3 के कारण बायोमेडिकल क्षेत्र में कई वर्षों से रुचि रखते हैं। फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) और सोनोडायनामिक थेरेपी (एसडीटी) जैसे चिकित्सीय अनुप्रयोगों में कैंसर रोगी को पोर्फिरीन का प्रणालीगत प्रशासन, ट्यूमर में दवा का संचय और एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य या अल्ट्रासाउंड के लेजर प्रकाश के लिए ट्यूमर के स्थानीय जोखिम शामिल हैं। लेजर प्रकाश या अल्ट्रासाउंड के संपर्क में पोर्फिरीन द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उत्पत्ति होती है और बाद में कोशिका मृत्यु 4,5 होती है। फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) में, पोर्फिरीन प्रतिदीप्ति का उपयोग कैंसर कोशिकाओं कोसामान्य कोशिकाओं से अलग करने के लिए किया जाता है। इस संदर्भ में, प्रोटोपोर्फिरीन IX, एक प्राकृतिक फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन जो अपने अग्रदूत, 5-एमिनोलेवुलिनिक एसिड (5-एएलए) के प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन पर ट्यूमर में जमा होता है, का उपयोग गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर, मूत्राशय के कैंसर और मस्तिष्क कैंसर 7,8 की पहचान करने के लिए किया जाता है। हाल ही में, मल्टीपल मायलोमा9 में न्यूनतम अवशिष्ट बीमारी का पता लगाने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में 5-एएलए उपचार का पता लगाया गया था। हमारी प्रयोगशाला मानव थूक के नमूनों में फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं और कैंसर से जुड़ी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से दागने की क्षमता के लिए टेट्रारिल पोर्फिरीन टीसीपीपी (5,10,15,20-टेट्राकिस-(4-कार्बोक्सीफिनाइल)-21,23एच-पोर्फिन) का उपयोग कर रही है, जो एक ऐसा गुण है जिसका उपयोग स्लाइड-आधारित और फ्लो साइटोमेट्रिक डायग्नोस्टिक परख10 में किया गया है।

कुछ पोर्फिरीन द्विक्रियाशील हैं कि उन्हें चिकित्सीय और नैदानिक एजेंटों 2,11 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। बायोमेडिकल अनुसंधान में, इस तरह के द्विक्रियाशील पोर्फिरीन का उपयोग यह मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है कि कैंसर कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से लक्षित करने और मारने की उनकी क्षमता उनकी संरचना का एक कार्य है और साथ ही यह अन्य यौगिकों 12,13,14,15,16 की उपस्थिति से कैसे प्रभावित होता है। पोर्फिरीन के सेलुलर उत्थान और उनके साइटोटॉक्सिसिटी दोनों को उच्च-थ्रूपुट तरीके से फ्लो साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर मापा जा सकता है। फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन के अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा जटिल हैं, लेकिन अधिकांश प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म उन्हें सही ढंग से पहचानने के लिए सुसज्जित हैं। फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन के अवशोषण स्पेक्ट्रम को 380-500 एनएम रेंज में एक मजबूत अवशोषण बैंड की विशेषता है, जिसे सोरेट बैंड के रूप में जाना जाता है। दो से चार कमजोर अवशोषण बैंड आमतौर पर 500-750 एनएम रेंज (क्यू बैंड) 17 में देखे जाते हैं। एक नीला 488 एनएम लेजर, जो अधिकांश प्रवाह साइटोमीटर में मौजूद है, या एक बैंगनी लेजर (405 एनएम) पोर्फिरीन को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्पन्न कर सकता है। पोर्फिरीन का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा आमतौर पर 600-800 एनएम रेंज18 में चोटियों को प्रदर्शित करता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट या फाइकोएरिथ्रिन (पीई) फ्लोरोफोरे के साथ बहुत कम वर्णक्रमीय ओवरलैप होता है, लेकिन अन्य अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोफोरे के साथ काफी ओवरलैप होता है, जैसे कि एलोफिकोसाइनिन (एपीसी), साथ ही साथ टेंडम फ्लोरोफोरेस, जैसे पीई-साइ 5 और अन्य। इसलिए, बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री परख में पोर्फिरीन का उपयोग करते समय, पोर्फिरीन के प्रतिदीप्ति को मापने के लिए निर्दिष्ट चैनलों के अलावा अन्य चैनलों में प्रतिदीप्ति के स्पिलओवर को पर्याप्त रूप से सही करने के लिए एकल-फ्लोरोफोर नियंत्रण आवश्यक हैं।

आदर्श रूप से, फ्लोरोफोर के पैनल के लिए स्पिलओवर मैट्रिक्स की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एकल-फ्लोरोफोर नियंत्रण (जिसे "मुआवजा नियंत्रण" भी कहा जाता है) में नमूने के समान सेल प्रकार (ओं) शामिल होना चाहिए। हालांकि, इस उद्देश्य के लिए नमूने का उपयोग करना इष्टतम नहीं है यदि शुरू करने के लिए बहुत कम नमूना है या यदि नमूने के भीतर लक्षित आबादी बहुत छोटी है (उदाहरण के लिए, यदि कोई बीमारी के शुरुआती चरणों में न्यूनतम अवशिष्ट रोग या कैंसर कोशिकाओं को देखना चाहता है)। कोशिकाओं का एक उपयोगी विकल्प उसी फ्लोरोफोरे के साथ युग्मित मोती है जिसका उपयोग नमूने का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। ऐसे कई मोती व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; इन मोतियों को या तो वांछित फ्लोरोफोरे (प्रीलेबल फ्लोरोफोरे-विशिष्ट मोती) 19,20 के साथ प्रीलेबल किया जाता है, या एक फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी को उनसे जोड़ा जा सकता है (एंटीबॉडी कैप्चर बीड्स) 20,21। जबकि वाणिज्यिक क्षतिपूर्ति मोती कई फ्लोरोफोरे के लिए उपलब्ध हैं, ऐसे मोती पोर्फिरीन के लिए अनुपलब्ध हैं, बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान में उनके बढ़ते उपयोग के बावजूद।

नमूना संरक्षण और उचित आकार के सकारात्मक बनाम नकारात्मक आबादी के अलावा, मुआवजा नियंत्रण के रूप में मोतियों का उपयोग करने के अन्य फायदे तैयारी में आसानी, कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, और समयके साथ उत्कृष्ट स्थिरता हैं। क्षतिपूर्ति नियंत्रण के रूप में मोतियों का उपयोग करने का संभावित नुकसान यह है कि मोतियों पर कैप्चर किए गए फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी एंटीबॉडी से भिन्न हो सकता है। वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमीटर20 का उपयोग करते समय यह विशिष्ट महत्व का हो सकता है। इसलिए, मुआवजा नियंत्रण के रूप में मोतियों के विकास को प्रवाह साइटोमीटर पर किया जाना चाहिए जिसका उपयोग परख के लिए किया जाएगा जिसके लिए मोती विकसित किए गए हैं। इसके अलावा, मोतियों के विकास में एक ही फ्लोरोसेंट स्टेनिंग अभिकर्मक के साथ लेबल की गई कोशिकाओं के साथ तुलना शामिल करने की आवश्यकता होती है।

यहां, हम टीसीपीपी अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मुआवजा मोतियों की तैयारी का वर्णन करते हैं, जिनकी पहचान चैनल में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता थूक में टीसीपीपी-लेबल कोशिकाओं के बराबर थी, और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में उनका उपयोग किया गया था। समकक्ष, गैर-कार्यात्मक मोतियों की ऑटोफ्लोरेसेंस नकारात्मक प्रतिदीप्ति मुआवजा नियंत्रण के रूप में उनके उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से कम थी। इसके अलावा, इन मोतियों ने लगभग 1 वर्ष तक भंडारण में स्थिरता का प्रदर्शन किया।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके किया जाना चाहिए।

1. टीसीपीपी स्टॉक समाधान की तैयारी, 1.0 मिलीग्राम /

नोट: यह मासिक रूप से तैयार किया जा सकता है।

  1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन, स्पैटुला और वजन पेपर का उपयोग करके, टीसीपीपी के 49.0-50.9 मिलीग्राम वजन होता है। एक मिलीग्राम के 1/10 तक वजन को गोल करें। प्रकाश से संरक्षित टीसीपीपी की मापी गई मात्रा को अलग रखें।
    नोट: यदि वजन पढ़ना अस्थिर है तो एक स्थिर बंदूक का उपयोग करें।
  2. चरण 1.1 में वजन किए गए टीसीपीपी की मात्रा के आधार पर तालिका 1 से शुद्ध पानी और आइसोप्रोपेनोल (आईपीए) की आवश्यक मात्रा निर्धारित करें। शुद्ध पानी और आइसोप्रोपेनोल को 100 एमएल ग्लास बीकर में जोड़ें, और वाष्पीकरण से बचाने के लिए पैराफिल्म के साथ कवर करें।
  3. चरण 1.1 में वजन किए गए टीसीपीपी की मात्रा के आधार पर तालिका 1 से सोडियम बाइकार्बोनेट की आवश्यक मात्रा निर्धारित करें।
  4. विश्लेषणात्मक संतुलन, स्पैटुला और वजन पेपर का उपयोग करके, चरण 1.3 में निर्धारित सोडियम बाइकार्बोनेट की आवश्यक मात्रा का वजन करें। एक मिलीग्राम के 1/10 तक वजन को गोल करें।
    नोट: यदि वजन पढ़ना अस्थिर है तो एक स्थिर बंदूक का उपयोग करें।
  5. शुद्ध पानी और आइसोप्रोपेनोल युक्त 100 एमएल बीकर में सोडियम बाइकार्बोनेट जोड़ें। वाष्पीकरण से बचाने के लिए पैराफिल्म के साथ घोल को कवर करें।
  6. चरण 1.5 से घोल को एक हलचल प्लेट पर रखें, और घुलने तक हिलाएं (लगभग 10 मिनट)।
  7. यह सुनिश्चित करने के लिए पीएच को मापें कि चरण 1.6 से सोडियम बाइकार्बोनेट युक्त समाधान में 9 और 10 के बीच पीएच है।
  8. धीरे-धीरे चरण 1.7 से समाधान में चरण 1.1 में वजन किए गए टीसीपीपी जोड़ें, और घुलने तक हिलाना जारी रखें (~ 30 मिनट)। इस चरण के दौरान प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  9. कमरे के तापमान पर एक ग्लास या पॉलीप्रोपाइलीन कंटेनर में स्टोर करें और प्रकाश से सुरक्षित रहें।

2. 2-(एन-मोर्फोलिनो)-एथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस) और हेमिसोडियम नमक बफर समाधान, 0.1 एम, पीएच 6.0-6.2 ("एमईएस बफर") की तैयारी।

नोट: यह उपयोग के दिन तैयार किया जाना चाहिए और कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए।

  1. एमईएस हेमिसोडियम नमक के 2.50 ग्राम वजन करें, और इसे 150 एमएल प्लास्टिक की बोतल में जोड़ें।
  2. शुद्ध पानी के 121 मिलीलीटर जोड़ें, और मैन्युअल हिलाकर तब तक घोलें जब तक कि कोई ठोस दिखाई न दे।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए एमईएस बफर के पीएच को मापें कि यह 6 और 6.2 के बीच है।
  4. उसी दिन उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर बनाए रखें।

3. एन-(3-डिमेथलयामिनोप्रोपिल)-एन-एथिलकार्बोडिमाइड (ईडीसी) पाउडर

  1. ईडीसी पाउडर को फ्रीजर से बाहर निकालें, और चरण 5 में उपयोग तक कमरे के तापमान पर बैठने दें।

4. टीसीपीपी समाधान के साथ अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों का संयोजन

  1. चरण 2 में तैयार 0.1 एम एमईएस बफर समाधान के 4.3 एमएल को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में जोड़ें।
  2. अधिकतम गति पर 60 सेकंड के लिए अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन बीड सस्पेंशन (10 μm, 2.5% w / v) भंवर।
  3. चरण 4.1 से एमईएस बफर में इस ताजा भंवर मोती निलंबन के 288 μL जोड़ें।
  4. भंवर अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए एमईएस / मोती घोल है।
  5. भंवर 1 मिलीग्राम / एमएल टीसीपीपी समाधान अधिकतम गति पर 60 सेकंड के लिए चरण 1 में तैयार किया गया है।
  6. चरण 4.4 से एमईएस / बीड सस्पेंशन में इस ताजा भंवर वाले टीसीपीपी स्टॉक समाधान के 1.20 एमएल जोड़ें।
  7. भंवर अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए एमईएस / बीड / टीसीपीपी सस्पेंशन।
  8. ईडीसी समाधान तैयार होने के दौरान ट्यूब को पन्नी के साथ कवर करें।

5. एन-(3-डिमेथलएमिनोप्रोपिल)-एन-एथिलकार्बोडिमाइड (ईडीसी) हाइड्रोकोलोराइड (एचसीएल) स्टॉक समाधान की तैयारी

नोट: ईडीसी समाधान खराब होने वाला है और तैयारी के तुरंत बाद इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

  1. एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 20.0 एमएल शुद्ध पानी जोड़ें।
  2. चरण 3 से 200 मिलीग्राम ईडीसी एचसीएल का वजन करें, और इसे पानी में जोड़ें (चरण 5.1)।
  3. एक स्पष्ट समाधान उत्पन्न करने के लिए अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए ईडीसी एचसीएल को भंवर करें।

6. ईडीसी एचसीएल / एमईएस कार्य समाधान की तैयारी

नोट: ईडीसी एचसीएल / एमईएस समाधान खराब होने वाला है और तैयारी के तुरंत बाद उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. 150 एमएल प्लास्टिक की बोतल में एमईएस बफर समाधान (चरण 2 में तैयार) के 54.0 एमएल जोड़ें।
  2. एमईएस बफर समाधान में ईडीसी एचसीएल स्टॉक समाधान (चरण 5 में तैयार) के 6.0 एमएल जोड़ें, और 10 सेकंड के लिए हिलाकर मिलाएं।

7. टीसीपीपी के साथ मोतियों को लेबल करना

  1. एमईएस बफर (चरण 4.7) में मोती और टीसीपीपी युक्त 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 4.5 एमएल ईडीसी वर्किंग सॉल्यूशन (चरण 6 से) जोड़ें।
  2. ट्यूब को कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए 35 आरपीएम पर एक इनवर्टिंग रोटेटर में रखें और प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  3. 1,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 0.8 एमएल में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  5. मोती के घोल को 1 एमएल पिपेट के साथ एम्बर पॉलीप्रोपाइलीन शीशी में स्थानांतरित करें, और आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: मोती इस बिंदु पर कम से कम 3 महीने के लिए स्थिर हैं।

8. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टीसीपीपी मोतियों की गुणवत्ता जांच (क्यूसी)

नोट: क्यूसी को इस बात पर केंद्रित होना चाहिए कि क्या टीसीपीपी मोतियों की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) उनके इच्छित उपयोग और प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न कणों की मात्रा के लिए पर्याप्त रूप से उज्ज्वल है। अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।

  1. एक 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन ट्यूब को "टीसीपीपी नकारात्मक मोती" के रूप में लेबल करें।
    नोट: नकारात्मक मोती लेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अमाइन-कार्यात्मक मोतियों से अलग हैं। सामग्री की तालिका देखें।
  2. एक और ट्यूब को "टीसीपीपी पॉजिटिव मोती" के रूप में लेबल करें।
  3. एक और ट्यूब को "इंद्रधनुष मोती" के रूप में लेबल करें।
  4. "टीसीपीपी नकारात्मक मोती" और "टीसीपीपी सकारात्मक मोती" के साथ लेबल किए गए ट्यूबों में बर्फ-ठंडे एचबीएसएस के 300 μL का एलिकोट करें।
  5. "इंद्रधनुष मोती" के रूप में लेबल की गई ट्यूब में बर्फ-ठंडा HBSS के 500 μL जोड़ें।
  6. भंवर गैर-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन (बिना लेबल वाले) मोती निलंबन को अधिकतम गति (2-3 एस) पर संक्षेप में जोड़ता है, और "टीसीपीपी नकारात्मक मोती" लेबल वाली ट्यूब में इसके 10 μL जोड़ता है।
  7. भंवर टीसीपीपी-लेबल बीड सस्पेंशन (चरण 7.5 में अंतिम रूप दिया गया) संक्षेप में अधिकतम गति पर, और "टीसीपीपी पॉजिटिव बीड्स" ट्यूब में इसके 3 μL जोड़ें।
  8. भंवर इंद्रधनुष मोती निलंबन को अधिकतम गति पर संक्षेप में जोड़ें, और इसकी दो बूंदों को "इंद्रधनुष मोती" ट्यूब में जोड़ें।
  9. बर्फ पर सभी ट्यूबों को ढककर रखें, और प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  10. प्रवाह साइटोमीटर की उपयुक्त दैनिक स्टार्टअप प्रक्रियाओं को शुरू करें, और इष्टतम तरल पदार्थ और लेजर संरेखण को सत्यापित करने के लिए क्यूसी करें।
    नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग के लिए, यह माना जाता है कि ऑपरेटर को प्रवाह साइटोमीटर के उपयोग में प्रशिक्षित किया जाता है जो उपलब्ध है, जिसमें प्रकाश स्कैटर और प्रतिदीप्ति तीव्रता को मानकीकृत करने की प्रक्रियाओं के साथ-साथ सही मुआवजा मैट्रिक्स की गणना के बुनियादी सिद्धांत भी शामिल हैं।
  11. विभिन्न रन के बीच वोल्टेज सेटिंग्स को बदले बिना इंद्रधनुष मोती और टीसीपीपी मोती चलाएं।
    1. इंद्रधनुष मोतियों की 10,000 घटनाओं को चलाएं और एकत्र करें।
    2. पानी से कुल्ला करें, और टीसीपीपी-नकारात्मक मोतियों की 10,000 घटनाओं को इकट्ठा करें।
    3. पानी से कुल्ला करें, और टीसीपीपी-पॉजिटिव मोतियों की 10,000 घटनाओं को इकट्ठा करें।
    4. 1 मिनट के लिए पानी धो लें।
      नोट: टीसीपीपी मोतियों को चलाने के बाद पानी से कुल्ला करना महत्वपूर्ण है। यदि टीसीपीपी को साइटोमीटर में लाइनों से धोया नहीं जाता है, तो संभावना है कि अवशिष्ट टीसीपीपी अधिग्रहित की जाने वाली अगली ट्यूब में कोशिकाओं को लेबल कर सकता है।
    5. साइटोमीटर के लिए निर्माता के निर्देशों के लिए विशिष्ट उचित सफाई और शटडाउन प्रोटोकॉल का पालन करें।
      नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, चित्र 1 देखें।

9. बीड फिल्ट्रेशन

नोट: यदि फ्लो साइटोमेट्री (चरण 8) द्वारा मोतियों का क्यूसी कणों (70% या अधिक) का एक उच्च अनुपात दिखाता है, तो नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके मोती निलंबन को फ़िल्टर करने पर विचार करें (चित्रा 2)।

  1. चरण 7.5 में अंतिम रूप दिए गए टीसीपीपी बीड सस्पेंशन के 0.8 एमएल में 3.20 एमएल आइस-कोल्ड एचबीएसएस जोड़ें (पांच गुना कमजोर पड़ने का निर्माण)।
  2. 15 सेकंड के लिए अधिकतम गति से पतला मोती निलंबन भंवर।
  3. एक डिस्पोजेबल 5 एमएल सिरिंज से प्लंजर निकालें।
  4. एक ग्लास फाइबर टिप फिल्टर (5 μm, 13 मिमी व्यास) के साथ सिरिंज फिट करें।
  5. सिरिंज में 4 मिलीलीटर एचबीएसएस जोड़ें।
  6. 0.5 एमएल भंवर पतला मोती निलंबन जोड़ें (चरण 9.2)।
  7. लगभग 2 बूंदों / सेकंड पर सिरिंज / फ़िल्टर सेटअप के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करने के लिए प्लंजर का उपयोग करें।
  8. लगभग 2 बूंदों / सेकंड पर फ़िल्टर के माध्यम से सिरिंज में ताजा एचबीएसएस के 5 मिलीलीटर खींचकर मोतियों को धोएं।
  9. एचबीएसएस को लगभग 2 बूंदों / सेकंड पर अपशिष्ट कंटेनर में फिर से धक्का दें।
  10. फ़िल्टर से मोतियों को हटाने के लिए, फ़िल्टर के माध्यम से सिरिंज में ताजा एचबीएसएस का एक और 5 एमएल खींचें।
  11. सावधानी से फ़िल्टर को सिरिंज से हटा दें।
  12. सिरिंज से मोती निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निकालें।
  13. फ़िल्टर को वापस सिरिंज पर रखें, और चरण 9.10-9.12 को चार बार दोहराएं। फिर फिल्टर और सिरिंज को छोड़ दें।
  14. चरण 9.2-9.13 को तब तक दोहराएं जब तक चरण 9.1 से सभी मोतियों को फ़िल्टर नहीं किया गया है। हर बार एक ताजा सिरिंज और फ़िल्टर का उपयोग करें।
  15. फ़िल्टर किए गए बीड सस्पेंशन को कमरे के तापमान पर 1,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  16. प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब के सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें, और धीरे से मोतियों को फिर से निलंबित करें, उन्हें 0.5 एमएल ताजा एचबीएसएस में मिलाएं।
  17. पी 1,000 माइक्रोपिपेट के साथ मोतियों को एक नए एम्बर, ग्लास, या पॉलीप्रोपाइलीन शीशी में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  18. फ़िल्टर किए गए बीड सस्पेंशन में टीसीपीपी से संबंधित कणों का अनुपात कम हो गया है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए चरण 8 दोहराएं। प्रतिनिधि परिणामों के लिए, चित्र 3 देखें.

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Representative Results

मोतियों के टीसीपीपी लेबलिंग के लिए यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत तेज और कुशल है। चित्रा 1 फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित टीसीपीपी बीड-लेबलिंग प्रक्रिया का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। चित्रा 1 ए इंद्रधनुष मोतियों की मानकीकृत प्रोफ़ाइल दिखाता है, जैसा कि टीसीपीपी का पता लगाने के लिए उपयुक्त चैनल में पता चला है। ये मोती प्रवाह साइटोमीटर द्वारा टीसीपीपी का पता लगाने के लिए लेजर वोल्टेज के मानकीकरण के लिए क्यूसी के रूप में काम करते हैं। चित्रा 1 बी अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन, टीसीपीपी-लेबल मोतियों के प्रकाश-स्कैटर प्रोफाइल को दर्शाता है। चित्रा 1 सी गैर-कार्यात्मक मोतियों (बिना लेबल वाले मोतियों) के प्रकाश-स्कैटर प्रोफाइल को दर्शाता है; हम क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स की गणना करने के लिए इन्हें नकारात्मक मोती नियंत्रण के रूप में उपयोग करते हैं। लाल आयत द्वारा इंगित आबादी, जो बिना लेबल वाले मोती निलंबन में अनुपस्थित है, टीसीपीपी से संबंधित कणों का प्रतिनिधित्व करती है जब टीसीपीपी युग्मन अभिकर्मक ईडीसी के संपर्क में आता है। इस तरह के समुच्चय को बाहर रखा जाना चाहिए जब मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई) निर्धारित की जाती है। चित्रा 1 डी लेबल किए गए मोतियों के एफआई को दर्शाता है, जिसे चित्रा 1 बी में ब्लैक गेट द्वारा चुना गया है, जो स्पष्ट रूप से (अनगेटेड) अनलेबल मोतियों के एफआई से कई लॉग अधिक है (चित्रा 1 डी की तुलना चित्रा 1 ई से की जाती है)।

कणों का अनुपात (यानी, चित्रा 1 बी में लाल गेट द्वारा इंगित घटनाएं) प्रति लेबलिंग बैच में भिन्न हो सकती हैं। अधिकांश मानक फ्लो साइटोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए, 50% कणों या उससे कम के साथ एक मोती निलंबन टीसीपीपी का उपयोग करके बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग में मुआवजे को सही ढंग से स्थापित करने की अनुमति देता है। हालांकि ऐसे अनुप्रयोग हैं, उदाहरण के लिए, जहां स्वचालित डेटा विश्लेषण का उपयोग किया जाता है, जिसके लिए बहुत अधिक कण सामग्री उचित मुआवजा सेटिंग्स में हस्तक्षेप कर सकती है। ऐसे मामलों में, निस्पंदन की सिफारिश की जाती है (प्रोटोकॉल चरण 9 और चित्रा 2)। चित्रा 3 मोती निलंबन पर निस्पंदन के प्रभाव को दर्शाता है जिसमें ~ 65% कण (चित्रा 3 ए, बी के बाएं पैनल) शामिल हैं। निस्पंदन के बाद, कण सामग्री ~ 12% तक कम हो गई। निस्पंदन के प्रतिकूल प्रभाव मोतियों के कुछ नुकसान (दिखाए नहीं गए) और एफआई (चित्रा 3 सी) का मामूली नुकसान है। इन प्रभावों को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब बीड सस्पेंशन के निस्पंदन पर विचार किया जा रहा है। कण सामग्री को कम करने के लिए मोती निस्पंदन का एक विकल्प मोती, टीसीपीपी और युग्मन अभिकर्मक ईडीसी के बीच अनुपात को बदलना है। हालांकि, इन अनुपातों में परिवर्तन मोतियों के एफआई को भी प्रभावित करते हैं।

पार्टिकुलेट फॉर्मेशन, एमएफआई और बीड/टीसीपीपी/ईडीसी अनुपात के बीच संबंध को चित्र 4 और चित्रा 5 में चित्रित किया गया है। चित्रा 4 ए और चित्रा 5 ए क्रमशः ईडीसी / टीसीपीपी अनुपात और टीसीपीपी / बीड अनुपात के कार्य के रूप में लेबल मोतियों के एमएफआई को दिखाते हैं। बढ़ते अनुपात के साथ, एमएफआई तब तक बढ़ता है जब तक कि यह स्थिर न हो जाए। चित्रा 4 बी और चित्रा 5 बी में प्रतिनिधि उदाहरण बताते हैं कि कण सामग्री संबंधित बढ़ते अनुपात के साथ बढ़ती है। इस टीसीपीपी लेबलिंग प्रोटोकॉल को अधिकतम एमएफआई के लिए अनुकूलित किया गया था, जबकि कण सामग्री को यथासंभव कम रखा गया था (चित्रा 4 ए और चित्रा 5 ए में तीर)। कण केवल तब दिखाई देते हैं जब लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान ईडीसी को युग्मन अभिकर्मक के रूप में उपयोग किया जाता है। केवल मोतियों और टीसीपीपी का उपयोग करके, कण ों का निर्माण नहीं किया जाता है (दिखाया नहीं गया है), लेकिन मोतियों के लेबलिंग के परिणामस्वरूप बहुत कम एफआई वाले मोती होते हैं (चित्रा 6 बी के साथ चित्रा 6 ए की तुलना में)। हमने इस ईडीसी-आधारित युग्मन विधि को टीसीपीपी23 के सक्रिय एनएचएस (एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड) एस्टर पर आधारित विधि के साथ बदलने की कोशिश की। हालांकि, हमें केवल मोतियों और टीसीपीपी का एक साथ उपयोग करने की तुलना में इस वैकल्पिक युग्मन विधि का उपयोग करके एफआई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला, यह सुझाव देते हुए कि इस विधि के साथ मोतियों के लिए टीसीपीपी का नगण्य सहसंयोजक बंधन है (चित्रा 6 सी के साथ चित्रा 6 बी की तुलना में)।

अब तक के सभी आंकड़ों में प्रस्तुत डेटा 10.6 μm व्यास मोतियों का उपयोग करके एकत्र किया गया था। हमने अनुमान लगाया कि बड़े मोतियों में बढ़े हुए सतह क्षेत्र के कारण अधिक TCPP बाइंडिंग साइटें हो सकती हैं और इसलिए, उच्च FI प्रदर्शित कर सकती हैं। इसके विपरीत, हमने अनुमान लगाया कि छोटे सतह क्षेत्रों और कम TCPP बाइंडिंग साइटों वाले छोटे मोतियों को कम FI प्रदर्शित करना चाहिए। यहां वर्णित समान लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके लेकिन 8.6 μm मोतियों या 20 μm मोतियों (10.6 μm मोतियों के बजाय) के साथ, हमने 10.6 μm मोतियों की तुलना में 8.6 μm मोतियों में FI में अनुमानित कमी पाई (चित्रा 6 A के साथ चित्रा 6 D की तुलना में)। 20 μm मोतियों ने हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर (डेटा नहीं दिखाया गया) के पैमाने पर एक एफआई प्रदर्शित किया, लेकिन ये बड़े मोती इसके तुरंत बाद समाधान से बाहर निकल गए और आगे नहीं बढ़े।

टीसीपीपी के साथ मोतियों को लेबल करने के लिए यह प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों में एक विश्वसनीय मुआवजा उपकरण होने के उद्देश्य से विकसित किया गया था जहां टीसीपीपी का उपयोग कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है। अतीत में, हमने इस उद्देश्य24 के लिए ए 549 कोशिकाओं का उपयोग किया था, लेकिन लेबलिंग प्रक्रिया के परिणामस्वरूप हमेशा उच्च एफआई नहीं होता था। इसके अलावा, कोशिकाओं, निर्धारण के बाद भी, 1 महीने से अधिक समय तक उपयोग नहीं किया जा सकता है। यहां वर्णित टीसीपीपी के साथ लेबलिंग (10.6 μm) मोतियों के लिए प्रोटोकॉल लगातार चमकीले दाग वाले मोतियों के परिणामस्वरूप होता है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इसके अलावा, जब 300 दिनों के बाद फ्लो साइटोमेट्री द्वारा उसी टीसीपीपी-लेबल मोतियों का परीक्षण किया गया था, तो हमने एमएफआई में और न ही कण सामग्री में महत्वपूर्ण बदलाव देखा (चित्रा 7)। मोतियों के लिए टीसीपीपी के युग्मन का इसके प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर बहुत कम प्रभाव पड़ा (चित्रा 8 ए; डैश्ड ब्लैक लाइन की तुलना ठोस काली रेखा से करना, जो समाधान में टीसीपीपी के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है)। टीसीपीपी-लेबल मोतियों का प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ए 549 फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं के अंदर मापा गया टीसीपीपी के स्पेक्ट्रम से अधिक भिन्न था, विशेष रूप से 700-725 एनएम तरंग दैर्ध्य के आसपास (चित्रा 8 ए; नारंगी रेखा की तुलना में डैश्ड ब्लैक लाइन, क्रमशः)। हालांकि, मल्टी-फ्लोरोफोर-लेबल थूक नमूने में अन्य संकेतों से टीसीपीपी सिग्नल की भरपाई करने की क्षमता के साथ, टीसीपीपी-लेबल मोती ने टीसीपीपी-दाग वाले ए 549 कोशिकाओं के समान ही अच्छी तरह से काम किया (क्रमशः चित्रा 8 सी के साथ चित्रा 8 बी की तुलना)।

वही। एलएमडी फाइलें फ्लोरिपॉजिटरी (https://flowrepository.org) में आईडी एफआर-एफसीएम-जेड 6 जेडपी (चित्रा 1) के तहत पाई जा सकती हैं; एफआर-एफसीएम-जेड 5 यूजे (चित्रा 3 बी, सी); एफआर-एफसीएम-जेड 6 जेडआर (चित्रा 4 बी); एफआर-एफसीएम-जेड 6 जेडएस (चित्रा 5 बी); एफआर-एफसीएम-जेड 6 जेडबी (चित्रा 6); एफआर-एफसीएम-जेड 6 वाई 5 (चित्रा 8 बी); और एफआर-एफसीएम-जेड 6 जेडटी (चित्रा 8 सी)।

Figure 1
चित्र 1: टीसीपीपी के साथ लेबल किए गए मोतियों की गुणवत्ता की जांच। प्रस्तुत इंद्रधनुष मोतियों का हिस्टोग्राम है जैसा कि एपीसी फ्लोरोफोरे के लिए विशिष्ट चैनल में पाया गया है। इस चैनल का उपयोग टीसीपीपी प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। इंद्रधनुष मोती एपीसी लेजर के लिए क्यूसी के रूप में काम करते हैं; पहली और चौथी चोटियां संबंधित कोष्ठक द्वारा इंगित क्षेत्र में पड़नी चाहिए। (B, D) टीसीपीपी-लेबल मोती। (C, E) बिना लेबल वाले मोती। टीसीपीपी-लेबल मोती समाधान के इस विशेष नमूने में 51.9% मोती (बी में काला आयत गेट) शामिल थे। लाल आयत में घटनाएं टीसीपीपी लेबलिंग के दौरान बनने वाले कणों का प्रतिनिधित्व करती हैं। ऐसे कण अनलेबल मोती समाधान (बी और सी में लाल आयताकारों की तुलना) में अनुपस्थित थे। टीसीपीपी-लेबल और अनलेबल मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता क्रमशः डी और ई में प्रस्तुत की जाती है। संक्षेप: एसएससी = साइड स्कैटर; एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; टीसीपीपी = मेसो-टेट्रा (4-कार्बोक्सीफिनाइल) पोर्फिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल चरण 9.3-9.12 में उपयोग की जाने वाली बीड फ़िल्टरिंग विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कणों और प्रतिदीप्ति तीव्रता पर निस्पंदन के प्रभाव। (ए) निस्पंदन से पहले (बाएं चित्र) और निस्पंदन (दाईं छवि) के बाद टीसीपीपी के साथ लेबल किए गए 10 μm मोतियों की माइक्रोस्कोपी छवियां। छवियों को 20x प्रवर्धन पर लिया गया था। स्केल बार = 20 μm. (B) निस्पंदन (बाएं प्रोफ़ाइल) से पहले TCPP-बीड निलंबन में 25.6% मोती (काला आयत) और 65.7% मलबे या कण (लाल आयत) शामिल थे। निस्पंदन (दाएं प्रोफाइल; काले आयत) के बाद निलंबन में मोतियों का अनुपात बढ़कर 74.7% हो गया, और मलबे में 11.9% की कमी आई। (सी) बी में पहचाने गए मोतियों के टीसीपीपी एफआई के हिस्टोग्राम। बाईं ओर का हिस्टोग्राम निस्पंदन से पहले टीसीपीपी-लेबल मोतियों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें निस्पंदन (दाईं ओर हिस्टोग्राम) के बाद मोतियों की तुलना में एफआई थोड़ा अधिक होता है। दोनों आंकड़ों में 1 × 103 के एफआई पर रखी गई लाल रेखाएं, दोनों हिस्टोग्राम की तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए हैं। संक्षेप: एसएससी = साइड स्कैटर; एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; टीसीपीपी = मेसो-टेट्रा (4-कार्बोक्सीफिनाइल) पोर्फिन; एफआई = प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईडीसी / टीसीपीपी अनुपात, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई), और कण गठन के बीच संबंध। (ए) प्रस्तुत मोती लेबलिंग प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ईडीसी / टीसीपीपी अनुपात और आगामी टीसीपीपी-लेबल मोतियों के एमएफआई के बीच संबंध है। वक्र मानक विचलन (एसडी) ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत एमएफआई को दर्शाता है। लाल तीर (3.75) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ईडीसी और टीसीपीपी समाधानों के वॉल्यूमेट्रिक अनुपात को इंगित करता है। (बी) प्रत्येक प्रोफाइल के ऊपर दर्शाए अनुसार ईडीसी/टीसीपीपी अनुपात के साथ तैयार किए गए बीड सस्पेंशन के प्रतिनिधि लाइट स्कैटर प्रोफाइल। सभी प्रोफाइल एक ही प्रयोग से प्राप्त होते हैं। मोतियों को काले आयत द्वारा इंगित किया जाता है। लाल आयताकार द्वारा इंगित कण गठन, बढ़ते ईडीसी / टीसीपीपी अनुपात के साथ बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. बीड्स अनुपात, एमएफआई और कण निर्माण के बीच संबंध। (ए) प्रस्तुत बीड लेबलिंग प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टीसीपीपी / बीड्स वॉल्यूमेट्रिक अनुपात और आगामी टीसीपीपी-लेबल मोतियों के एमएफआई के बीच संबंध है। एमएफआई तेजी से बढ़ता है, 2 के टीसीपीपी / मोती अनुपात के बाद एक पठार चरण तक पहुंच जाता है। वक्र मानक विचलन (एसडी) ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत एमएफआई को दर्शाता है। लाल तीर (4.17) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अनुपात को इंगित करता है। (बी) प्रत्येक प्रोफाइल के ऊपर दर्शाए गए टीसीसीपी/बीड्स अनुपात के साथ तैयार किए गए बीड्स सस्पेंशन के प्रतिनिधि लाइट स्कैटर प्रोफाइल। सभी प्रोफाइल एक ही प्रयोग से प्राप्त होते हैं। मोतियों को काले आयताकार द्वारा इंगित किया जाता है। लाल आयताकार द्वारा इंगित कण गठन, बढ़ते टीसीपीपी / मोती अनुपात के साथ बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उपयोग किए गए युग्मन विधियों और मोतियों के आकार की तुलना। टीसीपीपी के साथ लेबल किए गए मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता के हिस्टोग्राम दिखाए गए हैं। (ए) 10.6 μm मोतियों को प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल किया गया था, जिसमें युग्मन अभिकर्मक ईडीसी का उपयोग भी शामिल था। (बी) (ए) के समान, लेकिन लेबलिंग प्रोटोकॉल के दौरान ईडीसी को छोड़ दिया गया था। (सी) काबे एट अल .23 द्वारा वर्णित विधि के अनुसार, एनएचएस एस्टर का उपयोग करके 10.6 μm मोतियों को लेबल किया गया था। (डी) (ए) के समान, लेकिन 10.6 μm मोतियों के बजाय, 8.6 μm मोतियों का उपयोग किया गया था। हिस्टोग्राम के बीच तुलना की सुविधा के लिए प्रत्येक प्रोफ़ाइल में ऊर्ध्वाधर लाल रेखाओं को मनमाने ढंग से 1 × 103 पर सेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: समय के साथ टीसीपीपी मोतियों की स्थिरता। टीसीपीपी-लेबल मोती (10 μm) को प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल किया गया था, रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, और अंधेरे में रखा गया था। दिन 0 लेबलिंग का दिन है। इसके बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर, संग्रहीत मोतियों के एलिकोट को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फिर से विश्लेषण किया गया। प्रस्तुत किए गए दिन 0 मान के सापेक्ष (ए) एमएफआई और (बी) प्रतिशत कणों के माप हैं, जिन्हें मनमाने ढंग से 100% पर सेट किया गया था। क्षैतिज नारंगी रेखाएं दिन 0 पर 10% ऊपर और 10% नीचे के मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: क्षतिपूर्ति उपकरण के रूप में टीसीपीपी-दाग वाली कोशिकाओं की तुलना में टीसीपीपी मोती। (ए) समाधान में टीसीसीपी के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, बीड्स के साथ युग्मित टीसीपीपी और ए 549 फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं के धुंधला होने के बाद टीसीपीपी को माइक्रोप्लेट रीडर पर मापा गया था। घुलनशील और मोती-बाध्य टीसीपीपी के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा बहुत समान हैं। दोनों 700 एनएम तरंग दैर्ध्य के आसपास लेबल ए 549 कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। (बी, सी)। एक थूक के नमूने को एकल कोशिकाओं में संसाधित किया गया था और कई फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया गया था: एएफ 488 (एफएल 1), बीवी 510 (एफएल 10), पीई (एफएल 2), पीई-सीएफ 594 (एफएल 3), और टीसीपीपी (एफएल 6)। प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए, हमने संबंधित फ्लोरोफोरे के साथ युग्मित मोतियों वाले एकल-रंग नियंत्रण ट्यूब तैयार किए। टीसीपीपी के लिए, दो नियंत्रण ट्यूब स्थापित किए गए थे: एक टीसीपीपी-लेबल मोतियों के साथ और एक टीसीपीपी के साथ लेबल किए गए निश्चित ए 549 कोशिकाओं के साथ। इसने हमें दो मुआवजा मैट्रिक्स बनाने की अनुमति दी: (बी) एक जिसमें टीसीपीपी-लेबल मोती का उपयोग टीसीपीपी (एफएल -6) के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में किया गया था और (सी) जिसमें टीसीपीपी-लेबल ए 549 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। ये दो मुआवजा मैट्रिक्स बहुत समान हैं, टीसीपीपी (एफएल 6) और एफएल -3 के बीच टीसीपीपी से संबंधित मुआवजे में सबसे बड़ा अंतर है। इन विशेष मापदंडों को प्रदर्शित करने वाले संलग्न डॉट प्लॉट लगभग समान प्रोफाइल दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: टीसीपीपी स्टॉक समाधान के लिए आवश्यक अभिकर्मक। NaHCO3, शुद्ध पानी, और आइसोप्रोपेनोल (IPA) की मात्रा चरण 1.1 (49.0 मिलीग्राम और 50.9 मिलीग्राम के बीच) में वजन किए गए टीसीपीपी की मात्रा पर आधारित है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

कैंसर निदान और चिकित्सीय2 में पोर्फिरीन के कई अनुप्रयोगों के बावजूद, प्राथमिक मानव ऊतकों में कैंसर बनाम गैर-कैंसर कोशिका आबादी की पहचान के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक अभिकर्मक के रूप में उनके संभावित उपयोग पर सीमित साहित्य है। मानव थूक24,27 के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण पर हमारे शोध के लिए टीसीपीपी और कई अन्य फ्लोरोफोर के साथ विघटित थूक कोशिकाओं के धुंधला होने की आवश्यकता होती है। हालांकि, अन्य फ्लोरोफोर के लिए नामित डिटेक्शन चैनलों में टीसीपीपी के फ्लोरेसेंस स्पिलओवर का मतलब था कि क्षतिपूर्ति नियंत्रण के रूप में टीसीपीपी-लेबल मोती की आवश्यकता थी। हालांकि, ऐसा कोई मोती व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं था और इसे विकसित किया जाना था। सिलिकॉन डाइऑक्साइड-आधारित आणविक छलनी28,29 के लिए टेट्रारिल पोर्फिरीन का लगाव बताया गया है। हालांकि, सिलिकॉन डाइऑक्साइड-आधारित कण प्रवाह साइटोमेट्री मानकों (डेटा नहीं दिखाया गया) तैयार करने के उद्देश्य से अनुपयुक्त साबित हुए। इसलिए, हमारे अध्ययन ने पॉलीस्टाइनिन मोतियों पर ध्यान केंद्रित किया।

आइसोप्रोपेनोल-पानी (1: 1 वी / वी) 30 में टीसीपीपी का एक समाधान पीएच 6 पर पॉलीस्टाइनिन मोतियों को लेबल करता है, लेकिन एमएफआई हमारे परख में दाग वाली कोशिकाओं के सापेक्ष बहुत कम था। हमने एमएफआई को बढ़ाने के तरीके के रूप में सहसंयोजक मोती संशोधन का पता लगाया। टीसीपीपी के एनएचएस एस्टर के साथ अमाइन-कार्यात्मक लेटेक्स मोतियों के सहसंयोजक संशोधन को पहले काबे एट अल .23 द्वारा गैर-वाणिज्यिक 2 μm व्यास मोती31 का उपयोग करके वर्णित किया गया था। काबे एट अल.23 द्वारा किए गए अध्ययन में, टीसीपीपी को टीसीपीपी के सक्रिय एनएचएस मोनो-एस्टर को तैयार करने के लिए 5 घंटे के लिए एन-हाइड्रॉक्सीसुसिनिमाइड (एनएचएस) 32 के साथ डीएमएफ में इनक्यूबेट किया गया था। इस सक्रिय एस्टर समाधान को तब टर्मिनल अमाइन लिंकर युक्त मोतियों के साथ प्रतिक्रिया की गई थी। हालांकि, जब हमने इस प्रोटोकॉल को वाणिज्यिक अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों पर लागू किया, तो लेबलिंग के परिणामस्वरूप मुआवजे के लिए अपर्याप्त रूप से उज्ज्वल एमएफआई के साथ मोती बने। इसलिए, हमने एनएचएस एस्टर मध्यवर्ती का उपयोग किए बिना अमाइन पॉलीस्टाइनिन मोतियों के प्रत्यक्ष प्रसार का पता लगाया।

इस काम में, बीड्स पर अमीनो समूहों और टीसीपीपी पर कार्बोक्सी समूहों के बीच एमाइड बॉन्ड उत्पन्न करने के लिए एमाइड युग्मन अभिकर्मक ईडीसी की उपस्थिति में टीसीपीपी के साथ अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों का इलाज किया गया था। ईडीसी को इसकी जलीय घुलनशीलता, एक विस्तृत पीएच रेंज, कम लागत और उत्पादों33,34 द्वारा पानी में घुलनशील प्रतिक्रियाओं में सिद्ध उपयोगिता के कारण चुना गया था। हमने पीएच 6 पर पानी में टीसीपीपी और ईडीसी के साथ 8.6 μm, 10.6 μm, और 20 μm के व्यास के साथ अमाइन पॉलीस्टाइनिन मोतियों की प्रतिक्रिया की। पहले के अध्ययनों ने संकेत दिया है कि टीसीपीपी इस पीएच पर घुलनशील रहता है, और यह पीएच ईडीसी33 के साथ भी संगत है। लेबल 8.6 μm मोतियों के परिणामस्वरूप एक एमएफआई हुआ जो हमारे परख के लिए बहुत कम था। 20 μm मोतियों में पर्याप्त रूप से उच्च एमएफआई था, लेकिन निलंबन से बाहर निकलने और प्रवाह साइटोमीटर को बंद करने का खतरा था (दिखाया नहीं गया)। 10.6 μm मोतियों में पर्याप्त MFI था, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए लंबे समय तक निलंबन में रहा और इस प्रकार मुआवजे के मानकों के रूप में अनुकूलित किया गया। विशेष रूप से, समकक्ष अनलेबल मोतियों में कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति थी और मुआवजे के लिए नकारात्मक नियंत्रण मोतियों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता था।

मोतियों की मात्रा को स्थिर रखते हुए ईडीसी से टीसीपीपी के वॉल्यूमेट्रिक अभिकर्मक अनुपात में वृद्धि ने मोती एमएफआई को तब तक बढ़ाया जब तक कि लगभग 2 के अनुपात में एक पठार तक नहीं पहुंच गया। एक एमएफआई पठार भी देखा गया क्योंकि ईडीसी से टीसीपीपी अनुपात को स्थिर रखते हुए टीसीपीपी से मोतियों के अनुपात में वृद्धि हुई थी। चूंकि टीसीपीपी ने ईडीसी की अनुपस्थिति में मोतियों को लेबल किया है, इसलिए एमएफआई पठार मोती की सतह पर संतृप्त होने वाले सहसंयोजक और गैर-सहसंयोजक बाध्यकारी साइटों का परिणाम हो सकता है। जब ईडीसी और टीसीपीपी को पीएच 6 पर जोड़ा गया तो टीसीपीपी से संबंधित कण उपोत्पाद देखा गया। इस कण में टीसीपीपी के समान प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम था, लेकिन ईडीसी की अनुपस्थिति में नहीं बना, यह सुझाव देते हुए कि यह टीसीपीपी के साथ ईडीसी की प्रतिक्रिया से एक अघुलनशील उपोत्पाद है। कण अनियमित आकार के थे और, जबकि आम तौर पर 5 μm से छोटे होते हैं, बड़े समुच्चय बना सकते हैं और मोतियों की सतह का भी पालन कर सकते हैं। टीसीपीपी से संबंधित कणों को भी देखा गया जब अमाइन पॉलीस्टाइनिन मोती को टीसीपीपी और ईडीसी के साथ प्रतिक्रिया की गई थी। उच्च ईडीसी से टीसीपीपी अनुपात और उच्च टीसीपीपी टू बीड्स अनुपात दोनों के साथ कणों की मात्रा में वृद्धि हुई। अंतिम प्रोटोकॉल में चुने गए अभिकर्मक अनुपात मोती लेबलिंग प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे यह सुनिश्चित करते हैं कि परिणामस्वरूप मोती निलंबन में उच्च एमएफआई है जबकि कण स्तर स्वीकार्य रहता है। इस प्रोटोकॉल में उत्पादित कणों का स्तर मुआवजे के लिए टीसीपीपी मोतियों के उपयोग को नहीं रोकता है, लेकिन कणों के उच्च स्तरमुआवजा सेटिंग्स की सटीकता में बाधा डाल सकते हैं। हमने एक निस्पंदन प्रक्रिया भी विकसित की है जो कणों के स्तर को काफी कम कर सकती है यदि ये उच्च स्तर पर मौजूद हों।

हमने एक घूर्णन आंदोलनकारी का उपयोग करके अपनी प्रतिक्रिया आयोजित की। प्रतिक्रिया को उत्तेजित नहीं करने से धीमी धुंधलापन होता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। 16 घंटे की प्रतिक्रिया समय की सिफारिश की जाती है। लंबे प्रतिक्रिया समय (>24 घंटे) के परिणामस्वरूप टीसीपीपी कणों का उच्च स्तर होता है, जबकि कम प्रतिक्रिया समय (<8 घंटे) के परिणामस्वरूप कम मोती एमएफआई होता है। अनलेबल मोती नियंत्रण के लिए, हमने अमाइन-कार्यात्मक मोतियों का उपयोग नहीं किया था जिन्हें टीसीपीपी के साथ लेबल नहीं किया गया था क्योंकि बिना लेबल वाले मोतियों की ऑटोफ्लोरेसेंस मुआवजे मैट्रिक्स की सही गणना में हस्तक्षेप कर रही थी। इसके बजाय, हमने गैर-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों का उपयोग किया जो मेक और आकार में समान हैं। इसके अलावा, हमने बिना लेबल वाले और टीसीपीपी-लेबल वाले मोतियों को अलग-अलग ट्यूबों में रखा। एक ही ट्यूब में मोतियों के दोनों सेटों के साथ, हमने टीसीपीपी के कुछ हस्तांतरण को बिना लेबल वाले मोतियों (डेटा नहीं दिखाया गया) में देखा, जिसके कारण एमएफआई में राइट-शिफ्ट हुआ जिसने मुआवजा मैट्रिक्स की सही गणना को प्रतिबंधित कर दिया।

सारांश में, टीसीपीपी-लेबल मोतियों के उच्च एमएफआई को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदु धुंधला प्रतिक्रिया के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक अनुपात, धुंधला प्रतिक्रिया का समय और बिना लेबल वाले मोतियों का व्यास है। इस काम में, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल ने टीसीपीपी-दाग वाले मोतियों को वहन किया जो प्रवाह साइटोमीटर में उपयोग के लिए उचित आकार के थे और मुआवजे के लिए पर्याप्त रूप से फ्लोरोसेंट थे। टीसीपीपी-दाग वाले मोतियों ने 300 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर महत्वपूर्ण एमएफआई नहीं खोया। टीसीपीपी मोतियों का प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम समाधान में टीसीपीपी के बराबर था। इसके अलावा, टीसीपीपी-लेबल मोतियों और दाग वाले ए 549 कोशिकाओं के साथ गणना की गई क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स ने हमारे परख में लगभग समान थूक प्रोफाइल उत्पन्न किए, जो इन मोतियों की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।

यह प्रोटोकॉल टीसीपीपी मुआवजा मोतियों की तैयारी का वर्णन करता है जो नेवियस ईएक्स उपकरण पर उपयोगी थे, लेकिन ये समान मोती अलग-अलग संवेदनशीलता36 और एक अलग डिटेक्टर कॉन्फ़िगरेशन20 के साथ एक अलग उपकरण पर काम नहीं कर सकते हैं। हालांकि, यह काम मोती के आकार और अभिकर्मक अनुपात के माध्यम से प्रतिदीप्ति को संशोधित करने के तरीकों का सुझाव देता है। टीसीपीपी केवल कई फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन में से एक है जिसने विट्रो और विवो 2,37,38,39 में कैंसर सेल चयनात्मकता का प्रदर्शन किया है। सभी फ्लोरोसेंट पोर्फिरीन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अमाइन-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोतियों से बंध नहीं सकते हैं। वास्तव में, इन मोतियों का उपयोग पोर्फिरीन तक सीमित है जिसमें कार्बोक्जिलिक एसिड होता है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया पोर्फिरीन के साथ मानव ऊतक नमूनों में विविध कोशिका आबादी का अंतर धुंधलापन, कैंसर के शुरुआती विकास, इसकी प्रगति और इसके पूर्वानुमान में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। मानव ऊतक के नमूनों को दागने के लिए अन्य पोर्फिरीन का उपयोग और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा उनका विश्लेषण, मुआवजे के मानकों के रूप में उचित नियंत्रण मोतियों का उपयोग करना, आगे के शोध के लिए एक आकर्षक दिशा है।

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Disclosures

सभी लेखक बायोएफिनिटी टेक्नोलॉजीज के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

हम डेविड रोड्रिग्ज को आंकड़ा तैयार करने और प्रेसिजन पैथोलॉजी सर्विसेज (सैन एंटोनियो, टेक्सास) के साथ सहायता के लिए अपने नेवियस ईएक्स फ्लो साइटोमीटर के उपयोग के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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References

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Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

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