Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Protokollet beskriver hur porfyrinbaserade kompensationspärlor för flödescytometri framställs genom reaktion av aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med porfyrin TCPP och amidkopplingsreagenset EDC. Ett filtreringsförfarande används för att minska partikelbiprodukterna.

Abstract

Flödescytometri kan snabbt karakterisera och kvantifiera olika cellpopulationer baserat på fluorescensmätningar. Cellerna färgas först med ett eller flera fluorescerande reagens, var och en funktionaliserad med en annan fluorescerande molekyl (fluorofor) som binder till celler selektivt baserat på deras fenotypiska egenskaper, såsom cellytans antigenuttryck. Intensiteten av fluorescens från varje reagens bundet till celler kan mätas på flödescytometern med hjälp av kanaler som detekterar ett specificerat våglängdsområde. När flera fluoroforer används spiller ljuset från enskilda fluoroforer ofta över till oönskade detektionskanaler, vilket kräver en korrigering av fluorescensintensitetsdata i en process som kallas kompensation.

Kompensationskontrollpartiklar, vanligtvis polymerpärlor bundna till en enda fluorofor, behövs för varje fluorofor som används i ett cellmärkningsexperiment. Data från kompensationspartiklar från flödescytometern används för att tillämpa en korrigering på fluorescensintensitetsmätningarna. Detta protokoll beskriver beredning och rening av polystyrenkompensationspärlor kovalent funktionaliserade med det fluorescerande reagenset mesotetra (4-karboxifenyl) porfin (TCPP) och deras tillämpning i flödescytometrikompensation. I detta arbete behandlades aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med TCPP och amidkopplingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) vid pH 6 och vid rumstemperatur i 16 timmar med omrörning. TCPP-pärlorna isolerades genom centrifugering och återsuspenderades i en pH 7-buffert för lagring. TCPP-relaterade partiklar observerades som en biprodukt. Antalet av dessa partiklar kan minskas med hjälp av ett valfritt filtreringsprotokoll. De resulterande TCPP-pärlorna användes framgångsrikt på en flödescytometer för kompensation i experiment med humana sputumceller märkta med flera fluoroforer. TCPP-pärlorna visade sig vara stabila efter förvaring i kylskåp i 300 dagar.

Introduction

Porfyriner har varit av intresse i många år inom det biomedicinska området på grund av deras fluorescens och tumörriktade egenskaper 1,2,3. Terapeutiska tillämpningar såsom fotodynamisk terapi (PDT) och sonodynamisk terapi (SDT) innefattar systemisk administrering av ett porfyrin till en cancerpatient, ackumulering av läkemedlet i tumören och lokaliserad exponering av tumören för ett laserljus med en specifik våglängd eller ultraljud. Exponeringen för laserljus eller ultraljud leder till generering av reaktiva syreradikaler av porfyrinet och efterföljande celldöd 4,5. Vid fotodynamisk diagnos (PDD) används porfyrinfluorescens för att skilja cancerceller från normala celler6. I detta sammanhang används protoporfyrin IX, ett naturligt fluorescerande porfyrin som ackumuleras i tumörer vid systemisk eller lokal injektion av dess föregångare, 5-aminolevulinsyra (5-ALA), för att identifiera gastrointestinala stromatumörer, blåscancer och hjärncancer 7,8. På senare tid undersöktes 5-ALA-behandling som ett tillvägagångssätt för att upptäcka minimal kvarvarande sjukdom i multipelt myelom9. Vårt laboratorium har använt tetraarylporfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboxifenyl)-21,23 H-porfin) för sin förmåga att selektivt färga lungcancerceller och cancerassocierade celler i humana sputumprover, vilket är en egenskap som har utnyttjats i objektglasbaserade och flödescytometriska diagnostiska analyser10.

Vissa porfyriner är bifunktionella genom att de kan användas som terapeutiska och diagnostiska medel 2,11. I biomedicinsk forskning används sådana bifunktionella porfyriner för att utvärdera hur deras förmåga att selektivt rikta in sig på och döda cancerceller är en funktion av deras struktur samt hur den påverkas av närvaron av andra föreningar 12,13,14,15,16. Både det cellulära upptaget av porfyriner och deras cytotoxicitet kan mätas på en flödescytometrisk plattform på ett sätt med hög genomströmning. Absorptions- och emissionsspektra för fluorescerande porfyriner är komplexa, men de flesta flödescytometriska plattformar är utrustade för att korrekt identifiera dem. Absorptionsspektrumet för fluorescerande porfyriner kännetecknas av ett starkt absorptionsband i intervallet 380-500 nm, känt som Soret-bandet. Två till fyra svagare absorptionsband observeras i allmänhet i intervallet 500–750 nm (Q-band)17. En blå 488 nm laser, närvarande i de flesta flödescytometrar, eller en violett laser (405 nm) kan generera ljus med lämplig våglängd för att excitera porfyriner. Emissionsspektra för porfyriner visar typiskt toppar i 600-800 nm-området18, vilket resulterar i mycket liten spektral överlappning med fluoresceinisotiocyanat eller fykoerytrin (PE) fluoroforer men betydande överlappning med andra ofta använda fluoroforer, såsom allophycocyanin (APC), liksom tandemfluoroforer, såsom PE-Cy5 och andra. Vid användning av porfyriner i flerfärgsflödescytometrianalyser är därför enkelfluoroforkontroller väsentliga för att på ett adekvat sätt korrigera spridningen av fluorescens i andra kanaler än den som är avsedd att mäta porfyrinets fluorescens.

Helst bör de enkelfluoroforkontroller som används för att beräkna spridningsmatrisen för en panel av fluoroforer (även kallade kompensationskontroller) bestå av samma celltyp(er) som provet. Att använda provet för detta ändamål är dock inte optimalt om det finns mycket lite prov till att börja med eller om målpopulationen inom provet är mycket liten (till exempel om man vill titta på minimal kvarvarande sjukdom eller cancerceller i de tidiga stadierna av sjukdomen). Ett användbart alternativ till celler är pärlor i kombination med samma fluorofor som används för att analysera provet. Många sådana pärlor är kommersiellt tillgängliga; Dessa pärlor är antingen förmärkta med önskad fluorofor (förmärkta fluoroforspecifika pärlor)19,20, eller en fluorescerande märkt antikropp kan fästas på dem (antikroppsfångande pärlor)20,21. Medan kommersiella kompensationspärlor är tillgängliga för många fluoroforer, är sådana pärlor inte tillgängliga för porfyriner, trots deras ökande användning i grundforskning och klinisk forskning.

Förutom provbevarande och positivt kontra negativa populationer av lämplig storlek är de andra fördelarna med att använda pärlor som kompensationskontroller enkel förberedelse, låg bakgrundsfluorescens och utmärkt stabilitet över tid22. Den potentiella nackdelen med att använda pärlor som kompensationskontroll är att emissionsspektrumet för den fluorescerande antikroppen som fångas på pärlor kan skilja sig från samma antikropp som används för att märka cellerna. Detta kan vara av särskild betydelse vid användning av en spektralflödescytometer20. Därför måste utvecklingen av pärlor som kompensationskontroll utföras på flödescytometern som kommer att användas för analysen för vilken pärlorna utvecklas. Dessutom måste utvecklingen av pärlorna inkludera en jämförelse med celler märkta med samma fluorescerande färgningsreagens.

Här beskriver vi beredningen av TCPP-aminfunktionaliserade polystyrenkompensationspärlor, vars medianfluorescensintensitet i detektionskanalen var jämförbar med den för TCPP-märkta celler i sputum, och deras användning som kompensationskontroller för flödescytometri. Autofluorescensen hos ekvivalenta, icke-funktionaliserade kulor var tillräckligt låg för att de skulle kunna användas som negativa fluorescenskompensationskontroller. Dessutom visade dessa pärlor stabilitet i lagring i nästan 1 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer måste göras med lämplig personlig skyddsutrustning.

1. Beredning av TCPP-stamlösningen, 1,0 mg/ml

OBS: Detta kan förberedas varje månad.

  1. Använd en analytisk våg, spatel och vägningspapper och väga 49,0-50,9 mg TCPP. Avrunda vikten till 1/10 milligram. Ställ den uppmätta mängden TCPP åt sidan skyddad från ljus.
    OBS: Använd en statisk pistol om viktavläsningen är instabil.
  2. Bestäm de erforderliga mängderna renat vatten och isopropanol (IPA) från tabell 1 baserat på mängden TCPP som vägdes i steg 1.1 . Tillsätt renat vatten och isopropanol till en 100 ml glasbägare och täck med parafilm för att skydda mot avdunstning.
  3. Bestäm den erforderliga mängden natriumbikarbonat från tabell 1 baserat på mängden TCPP vägd i steg 1.1 .
  4. Väg med hjälp av analysvågen, spateln och vägningspapperet upp den erforderliga mängden natriumbikarbonat som bestämdes i steg 1.3. Avrunda vikten till 1/10 milligram.
    OBS: Använd en statisk pistol om viktavläsningen är instabil.
  5. Tillsätt natriumbikarbonatet till 100 ml bägaren som innehåller renat vatten och isopropanol. Täck lösningen med parafilm för att skydda mot avdunstning.
  6. Lägg lösningen från steg 1.5 på en omrörningsplatta och rör om tills den är upplöst (ca 10 min)
  7. Mät pH för att säkerställa att den natriumbikarbonathaltiga lösningen från steg 1.6 har ett pH mellan 9 och 10.
  8. Tillsätt långsamt den TCPP som vägts i steg 1.1 till lösningen från steg 1.7 och fortsätt omrörningen tills den är upplöst (~30 min). Skydda mot ljus under detta steg.
  9. Förvara i en glas- eller polypropenbehållare vid rumstemperatur och skyddad mot ljus.

2. Beredning av 2-(N-morfolino)-etansulfonsyra (MES) och heminatriumsaltbuffertlösning, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-buffert")

OBS: Detta måste förberedas på användningsdagen och förvaras vid rumstemperatur.

  1. Väg upp 2,50 g MES-heminatriumsalt och tillsätt detta till en 150 ml plastflaska.
  2. Tillsätt 121 ml renat vatten och lös upp genom manuell skakning tills inget fast ämne syns.
  3. Mät MES-buffertens pH för att säkerställa att det ligger mellan 6 och 6,2.
  4. Förvaras i rumstemperatur för användning samma dag.

3. N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidpulver (EDC)

  1. Ta ut EDC-pulvret ur frysen och låt stå i rumstemperatur tills det används i steg 5.

4. Kombinera aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med TCPP-lösning

  1. Tillsätt 4,3 ml av den 0,1 M MES-buffertlösning som beretts i steg 2 till ett 15 ml polypropenrör.
  2. Virvla den aminfunktionaliserade polystyrenpärlsuspensionen (10 μm, 2,5% w/v) i 60 s vid maximal hastighet.
  3. Tillsätt 288 μL av denna nyvirvlade strängsuspension till MES-bufferten från steg 4.1.
  4. Vortex MES/pärllösningen för 15 s vid maximal hastighet.
  5. Vortex 1 mg/ml TCPP-lösning beredd i steg 1 i 60 s vid maximal hastighet.
  6. Tillsätt 1,20 ml av denna nyvirvlade TCPP-stamlösning till MES/pärlsuspensionen från steg 4.4.
  7. Vortex MES/pärla/TCPP-upphängningen i 15 s vid maximal hastighet.
  8. Täck röret med folie medan EDC-lösningen bereds.

5. Beredning av stamlösning av N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydrokoloritid (HCl)

EDC-lösningen är lättfördärvlig och bör användas omedelbart efter beredningen.

  1. Tillsätt 20,0 ml renat vatten till ett nytt 50 ml koniskt rör.
  2. Väg upp 200 mg EDC HCl från steg 3 och tillsätt det i vattnet (steg 5.1).
  3. Virvla EDC HCL i 15 s vid maximal hastighet för att generera en tydlig lösning.

6. Beredning av EDC HCl/MES-arbetslösningen

EDC HCl/MES-lösningen är lättfördärvlig och ska användas omedelbart efter beredningen.

  1. Tillsätt 54,0 ml MES-buffertlösning (beredd i steg 2) till en 150 ml plastflaska.
  2. Tillsätt 6,0 ml EDC HCl-stamlösning (beredd i steg 5) till MES-buffertlösningen och blanda genom att skaka i 10 sekunder.

7. Märka pärlorna med TCPP

  1. Tillsätt 4,5 ml EDC-arbetslösning (från steg 6) till 15 ml polypropenröret som innehåller pärlorna och TCPP i MES-buffert (steg 4.7).
  2. Placera röret i en inverterande rotator vid 35 rpm i 16 timmar vid rumstemperatur och skyddad från ljus.
  3. Centrifugera röret vid rumstemperatur i 10 minuter vid 1 000 × g.
  4. Aspirera supernatanten och återsuspendera pärlorna i 0,8 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
  5. Överför vulstlösningen till en injektionsflaska av bärnstensfärgad polypropen med en 1 ml pipett och förvara vid 4 °C tills vidare användning.
    OBS: Pärlorna är stabila i minst 3 månader vid denna tidpunkt.

8. Kvalitetskontroll (QC) av TCPP-pärlorna genom flödescytometri

OBS: QC bör centreras på huruvida medianfluorescensintensiteten (MFI) för TCPP-pärlorna är tillräckligt ljus för deras avsedda användning och mängden partiklar som genereras av proceduren. Se avsnittet representativa resultat för mer information.

  1. Märk ett 5 ml polystyrenrör som "TCPP-negativa pärlor."
    OBS: De negativa pärlorna skiljer sig från de aminfunktionaliserade pärlorna som används för märkning. Se materialförteckningen.
  2. Märk ett annat rör som "TCPP-positiva pärlor".
  3. Märk ett annat rör som "Rainbow beads."
  4. Alikvot 300 μL iskall HBSS i rören märkta med "TCPP negativa pärlor" och "TCPP positiva pärlor."
  5. Tillsätt 500 μL iskall HBSS i röret märkt som "Rainbow beads."
  6. Virvla den icke-funktionaliserade polystyren (omärkta) pärlsuspensionen kort med maximal hastighet (2-3 s) och tillsätt 10 μL av den till röret märkt "TCPP negativa pärlor."
  7. Virvla den TCPP-märkta strängsuspensionen (slutförd i steg 7.5) kort med maximal hastighet och tillsätt 3 μL av den till röret "TCPP positive beads".
  8. Vortex Rainbow pärlupphängningen kort med maximal hastighet och tillsätt två droppar av den i "Rainbow beads" -röret.
  9. Håll alla rör på is, täckta och skyddade från ljus.
  10. Initiera lämpliga dagliga startprocedurer för flödescytometern och utför en QC för att verifiera optimala vätskor och laserinriktning.
    OBS: För denna del av protokollet antas att operatören är utbildad i användningen av den tillgängliga flödescytometern, inklusive procedurerna för standardisering av ljusspridning och fluorescensintensitet, samt de grundläggande principerna för beräkning av rätt kompensationsmatris.
  11. Kör Rainbow-pärlorna och TCPP-pärlorna utan att ändra spänningsinställningarna mellan de olika körningarna.
    1. Kör och samla 10 000 händelser av regnbågspärlorna.
    2. Skölj med vatten och samla in 10 000 händelser av de TCPP-negativa pärlorna.
    3. Skölj med vatten och samla in 10 000 händelser av de TCPP-positiva pärlorna.
    4. Utför en 1 min vattensköljning.
      OBS: Det är viktigt att skölja med vatten efter att ha kört TCPP-pärlorna. Om TCPP inte sköljs från linjerna i cytometern finns det möjlighet att kvarvarande TCPP kan märka celler i nästa rör som ska förvärvas.
    5. Utför lämpliga rengörings- och avstängningsprotokoll som är specifika för tillverkarens instruktioner för cytometern.
      OBS: För representativa resultat, se figur 1.

9. Filtrering av pärlor

OBS: Om QC för pärlorna med flödescytometri (steg 8) visar en hög andel partiklar (70% eller högre), överväg att filtrera pärlsuspensionen med protokollet nedan (figur 2).

  1. Tillsätt 3,20 ml iskall HBSS till 0,8 ml av TCPP-strängsuspensionen som slutfördes i steg 7.5 (vilket skapar en femfaldig utspädning).
  2. Virvla den utspädda pärlsuspensionen med maximal hastighet i 15 sekunder.
  3. Ta bort kolven från en 5 ml engångsspruta.
  4. Montera sprutan med ett glasfiberspetsfilter (5 μm, 13 mm diameter).
  5. Tillsätt 4 ml HBSS till sprutan.
  6. Tillsätt 0,5 ml av den virvlade utspädda strängsuspensionen (steg 9.2).
  7. Använd kolven för att filtrera suspensionen genom sprutan/filtret med ungefär 2 droppar/s.
  8. Tvätta pärlorna genom att dra 5 ml färsk HBSS i sprutan genom filtret med cirka 2 droppar/s.
  9. Tryck ut HBSS igen i avfallsbehållaren med cirka 2 droppar/s.
  10. För att ta bort pärlorna från filtret, dra ytterligare 5 ml färsk HBSS i sprutan genom filtret.
  11. Ta försiktigt bort filtret från sprutan.
  12. Mata ut strängsuspensionen från sprutan i ett 50 ml koniskt centrifugrör.
  13. Sätt tillbaka filtret på sprutan och upprepa steg 9.10-9.12 fyra gånger till. Kassera sedan filtret och sprutan.
  14. Upprepa steg 9.2-9.13 tills alla pärlor från steg 9.1 har filtrerats. Använd en ny spruta och filtrera varje gång.
  15. Centrifugera de filtrerade strängsuspensionerna i 10 minuter vid 1 000 × g vid rumstemperatur.
  16. Aspirera supernatanten på varje 50 ml rör och resuspendera försiktigt pärlorna och kombinera dem i 0,5 ml färsk HBSS.
  17. Överför pärlorna med en p1 000 mikropipett till en ny injektionsflaska med bärnsten, glas eller polypropen och förvara vid 4 °C.
  18. Upprepa steg 8 för att avgöra om andelen TCPP-relaterade partiklar i den filtrerade strängsuspensionen har minskat. För representativa resultat, se figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll för TCPP-märkning av pärlor är relativt snabbt och effektivt. Figur 1 visar ett representativt resultat av TCPP-pärlmärkningsprocessen som bestäms av flödescytometri. Figur 1A visar den standardiserade profilen för regnbågspärlor, som detekterats i lämplig kanal för detektering av TCPP. Dessa pärlor fungerar som en QC för standardisering av laserspänningarna för detektering av TCPP av flödescytometern. Figur 1B visar ljusspridningsprofilen för aminfunktionaliserad polystyren, TCPP-märkta pärlor. Figur 1C visar ljusspridningsprofilen för icke-funktionaliserade pärlor (omärkta pärlor); Vi använder dessa som en negativ pärlkontroll för att beräkna kompensationsmatrisen. Populationen som indikeras av den röda rektangeln, som saknas i den omärkta pärlsuspensionen, representerar de TCPP-relaterade partiklar som bildas när TCPP exponeras för kopplingsreagens-EDC. Sådana aggregat bör uteslutas när kulans fluorescensintensitet (FI) bestäms. Figur 1D visar FI för de märkta pärlorna, valda av den svarta grinden i figur 1B, vilket är tydligt flera stockar högre än FI för de (omärkta) omärkta pärlorna (jämför figur 1D med figur 1E).

Andelen partiklar (dvs. de händelser som indikeras av den röda grinden i figur 1B) kan variera per märkningssats. För de flesta standardflödescytometriapplikationer tillåter en strängsuspension med 50% partiklar eller mindre att man korrekt ställer in kompensation i ett flerfärgsflödescytometriexperiment med TCPP. Det finns dock applikationer där automatiserad dataanalys används, för vilken mycket högre partikelinnehåll kan störa korrekta kompensationsinställningar. I sådana fall rekommenderas filtrering (protokollsteg 9 och figur 2). Figur 3 visar effekten av filtrering på strängsuspensionen som bestod av ~ 65% partiklar (vänstra paneler i figur 3A, B). Efter filtrering minskade partikelhalten till ~ 12%. De negativa effekterna av filtrering är viss förlust av pärlor (visas inte) och en liten förlust av FI (figur 3C). Dessa effekter bör beaktas när filtrering av strängsuspensionen övervägs. Ett alternativ till strängfiltrering för att sänka partikelinnehållet är att ändra förhållandet mellan pärlorna, TCPP och kopplingsreagenset EDC. Förändringar i dessa förhållanden påverkar emellertid också pärlornas FI.

Förhållandet mellan partikelbildning, MFI och förhållandet mellan sträng/TCPP/EDC illustreras i figur 4 och figur 5. Figur 4A och figur 5A visar MFI för de märkta pärlorna som en funktion av EDC / TCPP-förhållandet respektive TCPP / pärlförhållandet. Med ökande förhållanden ökar MFI tills den platåer. De representativa exemplen i figur 4B och figur 5B visar att partikelhalten ökar med respektive ökande kvot. Detta TCPP-märkningsprotokoll optimerades för maximal MFI samtidigt som partikelinnehållet hölls så lågt som möjligt (pilarna i figur 4A och figur 5A). Partiklarna uppträder endast när EDC används som kopplingsreagens under märkningsproceduren. Med endast pärlor och TCPP bildas inte partiklar (visas inte), men märkningen av pärlorna resulterar i pärlor med mycket lägre FI (jämför figur 6A med figur 6B). Vi försökte ersätta denna EDC-baserade kopplingsmetod med en metod baserad på en aktiverad NHS (N-hydroxisuccinimid) ester av TCPP23. Vi fann dock ingen signifikant skillnad i FI med denna alternativa kopplingsmetod jämfört med att bara använda pärlor och TCPP tillsammans, vilket tyder på att det finns försumbar kovalent bindning av TCPP till pärlorna med denna metod (jämför figur 6B med figur 6C).

De data som hittills presenterats i alla siffror har samlats in med pärlor med en diameter på 10,6 μm. Vi antog att större pärlor kan ha fler TCPP-bindningsställen på grund av den ökade ytan och därför kan visa högre FI. Omvänt antog vi att mindre pärlor med mindre ytor och färre TCPP-bindningsställen borde visa lägre FI. Använda samma märkningsprotokoll som beskrivs här men med 8,6 μm pärlor eller 20 μm pärlor (istället för 10,6 μm pärlor), Vi fann den förväntade minskningen av FI i 8,6 μm-pärlorna jämfört med 10,6 μm-pärlorna (jämför figur 6D med figur 6A). De 20 μm pärlorna visade en FI utanför skalan för flödescytometern vi använde (data visas inte), men dessa större pärlor bosatte sig snabbt ur lösningen därefter och följdes inte vidare.

Detta protokoll för märkning av pärlor med TCPP utvecklades i syfte att ha ett tillförlitligt kompensationsverktyg i flödescytometriexperiment där TCPP används för att märka celler. Tidigare använde vi A549-celler för detta ändamål24, men märkningsförfarandet resulterade inte alltid i en hög FI. Dessutom kunde cellerna, även efter fixering, inte användas i mer än 1 månad. Protokollet för märkning (10,6 μm) pärlor med TCPP som beskrivs här resulterade konsekvent i ljust färgade pärlor, som visas i figur 1. Dessutom, när samma TCPP-märkta pärlor testades med flödescytometri efter 300 dagar, observerade vi inte en signifikant förändring i MFI eller i partikelinnehållet (figur 7). Kopplingen av TCPP till pärlorna hade liten effekt på dess fluorescensemissionsspektrum (figur 8A; jämför den streckade svarta linjen med den heldragna svarta linjen, som representerar fluorescensemissionsspektrumet för TCPP i lösning). Fluorescensemissionsspektrumet för TCPP-märkta pärlor skilde sig mer från spektrumet för TCPP mätt inuti A549-lungcancerceller, särskilt runt våglängderna 700-725 nm (figur 8A; streckad svart linje jämfört med den orange linjen). Men med förmågan att kompensera TCPP-signalen från de andra signalerna i ett multifluoroformärkt sputumprov fungerade de TCPP-märkta pärlorna lika bra som de TCPP-färgade A549-cellerna (jämför figur 8B med figur 8C).

Den. LMD-filer finns i FlowRepository (https://flowrepository.org), under ID: n FR-FCM-Z6ZP (figur 1); FR-FCM-Z5UJ (figur 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (figur 4B). FR-FCM-Z6ZS (figur 5B). FR-FCM-Z6ZB (figur 6). FR-FCM-Z6Y5 (figur 8B). och FR-FCM-Z6ZT (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Kvalitetskontroll av pärlor märkta med TCPP. (A) Regnbågspärlor. Presenterat är histogrammet för regnbågspärlorna som detekterats i kanalen som är specifik för APC-fluoroforen. Denna kanal kan också användas för att detektera TCPP-fluorescens. Rainbow-pärlorna fungerar som en QC för APC-lasern; Den första och fjärde toppen bör falla i det område som anges av respektive parentes. (B, D) TCPP-märkta pärlor. (C,E) Omärkta pärlor. Detta speciella prov av TCPP-märkt pärllösning inkluderade 51,9% pärlor (svart rektangelgrind i B). Händelserna i den röda rektangeln representerar de partiklar som bildades under TCPP-märkningen. Sådana partiklar saknades i den omärkta pärllösningen (jämförelse av de röda rektanglarna i B och C). Fluorescensintensiteterna hos de TCPP-märkta och omärkta pärlorna presenteras i D respektive E. Förkortningar: SSC = sidospridning; FSC = framåtriktad spridning; APC = allofykocyanin; TCPP = meso-tetra(4-karboxifenyl) porfin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schematisk representation av strängfiltreringsmetoden som används i protokollsteg 9.3-9.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Filtreringens effekter på partiklar och fluorescensintensitet. (A) Mikroskopibilder av 10 μm pärlor märkta med TCPP före (vänster bild) och efter filtrering (höger bild). Bilderna togs med en 20x förstärkning. Skalstång = 20 μm. (B) TCPP-pärlsuspensionen före filtrering (vänster profil) inkluderade 25,6% pärlor (svart rektangel) och 65,7% skräp eller partiklar (röd rektangel). Andelen pärlor i suspensionen ökade till 74,7% efter filtrering (höger profil; svart rektangel) och skräpet minskade till 11,9%. c) Histogram för pärlornas TCPP FI enligt B. Histogrammet till vänster representerar de TCPP-märkta pärlorna före filtrering, med ett FI något högre än pärlornas efter filtrering (histogram till höger). De röda linjerna, placerade vid en FI på 1 × 103 i båda figurerna, ska underlätta jämförelsen av båda histogrammen. Förkortningar: SSC = sidospridning; FSC = framåtriktad spridning; APC = allofykocyanin; TCPP = meso-tetra(4-karboxifenyl) porfin; FI = fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Förhållandet mellan EDC/TCPP-förhållandet, medianfluorescensintensiteten (MFI) och partikelbildning. (A) Presenteras är förhållandet mellan EDC / TCPP-förhållandet som används i pärlmärkningsprotokollet och MFI för de efterföljande TCPP-märkta pärlorna. Kurvan visar den genomsnittliga MFI för tre oberoende experiment ± standardavvikelse (SD). Den röda pilen (3,75) anger volymförhållandet för EDC- och TCPP-lösningarna som används i detta protokoll. b) Representativa ljusspridningsprofiler för strängsuspensionerna beredda med EDC/TCPP-förhållandena enligt ovan för varje profil. Alla profiler härleds från samma experiment. Pärlorna indikeras med den svarta rektangeln. Partikelbildningen, indikerad av de röda rektanglarna, ökar med ökande EDC / TCPP-förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5. Förhållandet mellan TCPP / pärlor förhållande, MFI och partikelbildning. (A) Presenteras är förhållandet mellan TCPP / pärlor volymetriskt förhållande som används i pärlmärkningsprotokollet och MFI för de efterföljande TCPP-märkta pärlorna. MFI ökar snabbt och når en platåfas efter ett TCPP / pärlförhållande på 2. Kurvan visar den genomsnittliga MFI för tre oberoende experiment ± standardavvikelse (SD). Den röda pilen (4.17) anger förhållandet som används i detta protokoll. (B) Representativa ljusspridningsprofiler för strängsuspensionerna beredda med TCCP/strängförhållandena enligt vad som anges ovan för varje profil. Alla profiler härleds från samma experiment. Pärlorna indikeras av de svarta rektanglarna. Partikelbildningen, som indikeras av de röda rektanglarna, ökar med ökande TCPP / pärlförhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: En jämförelse av de kopplingsmetoder och strängstorlekar som används. Visas är histogram av fluorescensintensiteten hos pärlorna märkta med TCPP. (A) Pärlorna på 10,6 μm märktes enligt det tillhandahållna protokollet, inklusive användningen av kopplingsreagenset EDC. (B) Samma som (A), men EDC utelämnades under märkningsprotokollet. (C) Pärlorna på 10,6 μm märktes med NHS-ester, enligt den metod som beskrivs av Kabe et al.23. (D) Samma som (A), men istället för 10,6 μm pärlor användes 8,6 μm pärlor. De vertikala röda linjerna i varje profil är godtyckligt inställda på 1 × 103 för att underlätta jämförelser mellan histogrammen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: TCPP-pärlornas stabilitet över tid. TCPP-märkta pärlor (10 μm) märktes enligt protokollet, förvarades i kylskåp vid 4 °C och förvarades i mörker. Dag 0 är märkningsdagen. Vid olika tidpunkter därefter analyserades alikvoter av de lagrade pärlorna på nytt med flödescytometri. Presenterade är mätningar av (A) MFI och (B) procentuella partiklar i förhållande till dag 0-värdet, vilket godtyckligt sattes till 100%. De horisontella orange linjerna representerar värdena 10 % över och 10 % under värdena dag 0. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: TCPP-pärlor jämfört med TCPP-färgade celler som kompensationsverktyg. (A) Fluorescensemissionsspektra för TCCP i lösning, TCPP kopplad till pärlor och TCPP efter färgning av A549-lungcancerceller mättes på en mikroplattläsare. Emissionsspektra för löslig och pärlbunden TCPP är mycket lika. Båda skiljer sig från de märkta A549-cellerna runt 700 nm-våglängden. (B,C). Ett sputumprov bearbetades till enstaka celler och märktes med flera fluoroforer: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) och TCPP (FL6). För varje fluorofor förberedde vi enfärgade kontrollrör som innehåller pärlor i kombination med relevant fluorofor. För TCPP sattes två kontrollrör upp: ett med TCPP-märkta pärlor och ett med fasta A549-celler märkta med TCPP. Detta gjorde det möjligt för oss att skapa två kompensationsmatriser: (B) en där de TCPP-märkta pärlorna användes som kompensationskontroll för TCPP (FL-6) och (C) en där TCPP-märkta A549-celler användes. Dessa två kompensationsmatriser är mycket lika, med den största skillnaden i TCPP-relaterad kompensation mellan TCPP (FL6) och FL-3. De medföljande punktdiagrammen som visar dessa specifika parametrar visar nästan identiska profiler. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Reagenser som krävs för TCPP-lösningen. Mängderna NaHCO3, renat vatten och isopropanol (IPA) baseras på mängden TCPP vägd i steg 1.1 (mellan 49,0 mg och 50,9 mg). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots de många tillämpningarna av porfyriner vid cancerdiagnostik och terapi2 finns det begränsad litteratur om deras potentiella användning som flödescytometriskt reagens för identifiering av cancerogena kontra icke-cancerösa cellpopulationer i primära mänskliga vävnader24,25,26. Vår forskning om flödescytometrisk analys av humant sputum24,27 kräver färgning av dissocierade sputumceller med TCPP och flera andra fluoroforer. Fluorescensspillover av TCPP i detektionskanalerna avsedda för andra fluoroforer innebar dock att en TCPP-märkt sträng behövdes som kompensationskontroll. Ingen sådan pärla var dock kommersiellt tillgänglig och måste utvecklas. Bindning av tetraarylporfyriner till kiseldioxidbaserade molekylsiktar28,29 har rapporterats. Kiseldioxidbaserade partiklar visade sig dock vara olämpliga för framställning av flödescytometristandarder (data visas inte). Därför fokuserade våra studier på polystyrenpärlor.

En lösning av TCPP i isopropanol-vatten (1: 1 v / v) 30 märkte polystyrenpärlorna vid pH 6, men MFI var för låg i förhållande till de färgade cellerna i vår analys. Vi undersökte kovalent pärlmodifiering som ett sätt att öka MFI. Den kovalenta modifieringen av de aminfunktionaliserade latexpärlorna med NHS-estern av TCPP genom amidering beskrevs tidigare av Kabe et al.23 med användning av icke-kommersiella pärlor med 2 μm diameter31. I studien av Kabe et al.23 inkuberades TCPP i DMF med N-hydroxisuccinimid (NHS)32 i 5 timmar för att framställa en aktiverad NHS-monoester av TCPP. Denna aktiverade esterlösning reagerades sedan med pärlor innehållande en terminal aminlänkare. Men när vi tillämpade detta protokoll på kommersiella aminfunktionaliserade polystyrenpärlor resulterade märkningen i pärlor med en MFI som inte var tillräckligt ljusa för kompensation. Därför undersökte vi direkt amidering av aminpolystyrenpärlor utan att använda en NHS-estermellanprodukt.

I detta arbete behandlades aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med TCPP i närvaro av amidkopplingsreagenset EDC för att generera amidbindningar mellan aminogrupperna på pärlorna och karboxigrupperna på TCPP. EDC valdes på grund av dess vattenlöslighet, beprövad användbarhet i vattenhaltiga amideringsreaktioner över ett brett pH-område, låg kostnad och vattenlösliga av produkter33,34. Vi reagerade aminpolystyrenpärlor med diametrar på 8,6 μm, 10,6 μm och 20 μm med TCPP och EDC i vatten vid pH 6. Tidigare studier har visat att TCPP förblir lösligt vid detta pH, och detta pH är också kompatibelt med EDC33. De märkta 8,6 μm pärlorna resulterade i en MFI som var för låg för vår analys. 20 μm-pärlorna hade en tillräckligt hög MFI men var benägna att sätta sig ur suspensionen och täppa till flödescytometern (visas inte). Kulorna på 10,6 μm hade en adekvat MFI, förblev i suspension tillräckligt länge för flödescytometrianalys och optimerades därmed som kompensationsstandarder. Noterbart var att de motsvarande omärkta pärlorna hade låg bakgrundsfluorescens och kunde användas som negativa kontrollpärlor för kompensation.

Genom att öka det volymetriska reagensförhållandet mellan EDC och TCPP samtidigt som mängden pärlor hölls konstant ökade pärlans MFI tills en platå nåddes i ett förhållande av cirka 2. En MFI-platå observerades också när förhållandet mellan TCPP och pärlor ökades samtidigt som EDC till TCPP-förhållandet hölls konstant. Eftersom TCPP märkte pärlorna i frånvaro av EDC kan MFI-platån vara ett resultat av att kovalenta och icke-kovalenta bindningsställen mättas på pärlans yta. En TCPP-relaterad partikelbiprodukt observerades när EDC och TCPP kombinerades vid pH 6. Denna partikel hade ett fluorescensspektrum som liknade TCPP men bildades inte i frånvaro av EDC, vilket tyder på att det är en olöslig biprodukt från reaktionen av EDC med TCPP. Partiklarna var oregelbundet formade och, även om de i allmänhet var mindre än 5 μm, kunde de bilda större aggregat och kunde också fästa vid pärlans yta. TCPP-relaterade partiklar observerades också när aminpolystyrenpärlor reagerade med TCPP och EDC. Mängden partiklar ökade med både ett högre EDC till TCPP-förhållande och ett högre TCPP till pärlförhållande. Reagensförhållandena som valts i det slutliga protokollet är nyckeln till framgången för strängmärkningsproceduren eftersom de säkerställer att den resulterande strängsuspensionen har en hög MFI medan partikelnivån förblir acceptabel. Nivån av partiklar som produceras i detta protokoll utesluter inte användning av TCPP-pärlor för kompensation, men högre nivåer av partiklar kan hämma noggrannheten i kompensationsinställningarna35. Vi utvecklade också ett filtreringsförfarande som kan minska nivån av partiklar avsevärt om dessa förekommer på en hög nivå.

Vi genomförde vår reaktion med hjälp av en roterande omrörare. Att inte agitera reaktionen resulterar i långsammare färgning (data visas inte). En reaktionstid på 16 timmar rekommenderas. Längre reaktionstider (>24 timmar) resulterar i högre nivåer av TCPP-partiklar, medan kortare reaktionstider (<8 timmar) resulterar i MFI med lägre sträng. För den omärkta pärlkontrollen använde vi inte aminfunktionaliserade pärlor som inte var märkta med TCPP eftersom autofluorescensen hos de omärkta pärlorna störde beräkningen av kompensationsmatriserna korrekt. Istället använde vi icke-funktionaliserade polystyrenpärlor liknande i märke och storlek. Dessutom förvarade vi de omärkta och TCPP-märkta pärlorna i separata rör. Med båda uppsättningarna pärlor i samma rör observerade vi en viss överföring av TCPP till de omärkta pärlorna (data visas inte), vilket orsakade en högerförskjutning i MFI som förbjöd korrekt beräkning av kompensationsmatrisen.

Sammanfattningsvis är de kritiska punkterna för att uppnå en hög MFI för TCPP-märkta pärlor reagensförhållandena som används under färgningsreaktionen, tiden för färgningsreaktionen och diametern på de omärkta pärlorna. I detta arbete gav protokollet som beskrivits ovan TCPP-färgade pärlor som var lämpligt dimensionerade för användning i en flödescytometer och var tillräckligt fluorescerande för kompensation. De TCPP-färgade pärlorna förlorade inte signifikant MFI vid 4 °C under 300 dagar. Fluorescensspektrumet för TCPP-pärlorna var jämförbart med det för TCPP i lösning. Dessutom genererade kompensationsmatriserna beräknade med TCPP-märkta pärlor och färgade A549-celler praktiskt taget identiska sputumprofiler i vår analys, vilket visar användbarheten av dessa pärlor.

Detta protokoll beskriver beredningen av TCPP-kompensationspärlor som var användbara på Navios EX-instrumentet, men samma pärlor kanske inte fungerar på ett annat instrument med annan känslighet36 och en annan detektorkonfiguration20. Detta arbete föreslår emellertid sätt att modulera fluorescensen genom pärlstorlek och reagensförhållande. TCPP är bara en av flera fluorescerande porfyriner som har visat cancercellsselektivitet in vitro och in vivo 2,37,38,39. Inte alla fluorescerande porfyriner kan binda till de aminfunktionaliserade polystyrenpärlorna som används i detta protokoll. Faktum är att användningen av dessa pärlor är begränsad till porfyriner som innehåller en karboxylsyra. Den differentiella färgningen av olika cellpopulationer i humana vävnadsprover med porfyriner, mätt med flödescytometri, kan ge insikter om den tidiga utvecklingen av cancer, dess progression och dess prognos. Användningen av andra porfyriner för att färga mänskliga vävnadsprover och deras analys med flödescytometri, med lämpliga kontrollpärlor som kompensationsstandarder, är en attraktiv riktning för vidare forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare är anställda på bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Vi vill tacka David Rodriguez för hjälp med figurberedning och Precision Pathology Services (San Antonio, TX) för användningen av dess Navios EX-flödescytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193 Flödescytometri kompensationskontroll fluorofor märkning aminfunktionaliserade pärlor amidering porfyrin
Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter