Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Protokollen beskriver hvordan porfyrinbaserte kompensasjonsperler for flowcytometri fremstilles ved reaksjon av aminfunksjonaliserte polystyrenkuler med porfyrin TCPP og amidkoblingsreagenset EDC. En filtreringsprosedyre brukes til å redusere partikkelformige biprodukter.

Abstract

Flowcytometri kan raskt karakterisere og kvantifisere ulike cellepopulasjoner basert på fluorescensmålinger. Cellene blir først farget med en eller flere fluorescerende reagenser, hver funksjonalisert med et annet fluorescerende molekyl (fluorofor) som binder seg til celler selektivt basert på deres fenotypiske egenskaper, for eksempel celleoverflateantigenuttrykk. Intensiteten av fluorescens fra hvert reagens bundet til celler kan måles på flowcytometeret ved hjelp av kanaler som oppdager et spesifisert bølgelengdeområde. Når flere fluoroforer brukes, søler lyset fra individuelle fluoroforer ofte over i uønskede deteksjonskanaler, noe som krever en korreksjon av fluorescensintensitetsdataene i en prosess som kalles kompensasjon.

Kompensasjonskontrollpartikler, vanligvis polymerperler bundet til en enkelt fluorofor, er nødvendig for hver fluorofor som brukes i et cellemerkingseksperiment. Data fra kompensasjonspartikler fra flowcytometeret brukes til å korrigere fluorescensintensitetsmålingene. Denne protokollen beskriver fremstilling og rensing av polystyrenkompensasjonsperler kovalent funksjonalisert med det fluorescerende reagenset meso-tetra (4-karboksyphenyl) porfin (TCPP) og deres anvendelse i flowcytometrikompensasjon. I dette arbeidet ble aminfunksjonaliserte polystyrenperler behandlet med TCPP og amidkoblingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) ved pH 6 og ved romtemperatur i 16 timer med omrøring. TCPP-kulene ble isolert ved sentrifugering og resuspendert i en pH 7-buffer for lagring. TCPP-relaterte partikler ble observert som biprodukt. Antallet av disse partiklene kan reduseres ved hjelp av en valgfri filtreringsprotokoll. De resulterende TCPP-perlene ble vellykket brukt på et flowcytometer for kompensasjon i eksperimenter med humane sputumceller merket med flere fluoroforer. TCPP-kulene viste seg å være stabile etter lagring i kjøleskap i 300 dager.

Introduction

Porfyriner har vært av interesse i mange år i det biomedisinske feltet på grunn av deres fluorescens og tumormålrettede egenskaper 1,2,3. Terapeutiske anvendelser som fotodynamisk terapi (PDT) og sonodynamisk terapi (SDT) medfører systemisk administrering av porfyrin til en kreftpasient, akkumulering av legemidlet i svulsten og lokalisert eksponering av svulsten til et laserlys med en bestemt bølgelengde eller ultralyd. Eksponeringen for laserlys eller ultralyd fører til generering av reaktive oksygenarter ved porfyrin og påfølgende celledød 4,5. Ved fotodynamisk diagnose (PDD) brukes porfyrinfluorescens for å skille kreftceller fra normale celler6. I denne sammenheng brukes protoporfyrin IX, et naturlig fluorescerende porfyrin som akkumuleres i svulster ved systemisk eller lokal injeksjon av forløperen, 5-aminolevulinsyre (5-ALA), til å identifisere gastrointestinale stromale svulster, blærekreft og hjernekreft 7,8. Mer nylig ble 5-ALA-behandling utforsket som en tilnærming for å oppdage minimal gjenværende sykdom i myelomatose9. Vårt laboratorium har brukt tetraaryl porfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksyphenyl)-21,23H-porfin) for sin evne til selektivt å flekke lungekreftceller og kreftassosierte celler i humane sputumprøver, som er en egenskap som har blitt utnyttet i lysbildebaserte og flowcytometriske diagnostiske analyser10.

Noen porfyriner er bifunksjonelle ved at de kan brukes som terapeutiske og diagnostiske midler 2,11. I biomedisinsk forskning brukes slike bifunksjonelle porfyriner til å evaluere hvordan deres evne til selektivt å målrette og drepe kreftceller er en funksjon av deres struktur, samt hvordan den påvirkes av tilstedeværelsen av andre forbindelser 12,13,14,15,16. Både det cellulære opptaket av porfyriner og deres cytotoksisitet kan måles på en flowcytometrisk plattform på en gjennomstrømningsmåte. Absorpsjons- og utslippsspektrene til fluorescerende porfyriner er komplekse, men de fleste flowcytometriske plattformer er utstyrt for å identifisere dem riktig. Absorpsjonsspekteret av fluorescerende porfyriner er preget av et sterkt absorpsjonsbånd i 380-500 nm-området, kjent som Soret-båndet. To til fire svakere absorpsjonsbånd observeres generelt i området 500-750 nm (Q-bånd)17. En blå 488 nm laser, tilstede i de fleste strømningscytometre, eller en fiolett laser (405 nm) kan generere lys med riktig bølgelengde for å opphisse porfyriner. Emisjonsspektrene til porfyriner viser vanligvis topper i området 600-800 nm18, noe som resulterer i svært lite spektral overlapping med fluoresceinisotiocyanat eller phycoerythrin (PE) fluoroforer, men betydelig overlapping med andre ofte brukte fluoroforer, som allophycocyanin (APC), samt tandemfluoroforer, som PE-Cy5 og andre. Derfor, når du bruker porfyriner i flerfargede flowcytometrianalyser, er enkeltfluoroforkontroller avgjørende for å korrigere sølet av fluorescens i andre kanaler enn den som er utpekt til å måle porfyrinens fluorescens.

Ideelt sett bør enkeltfluoroforkontrollene som brukes til å beregne spillovermatrisen for et panel av fluoroforer (også kalt "kompensasjonskontroller") bestå av samme celletype (er) som prøven. Det er imidlertid ikke optimalt å bruke utvalget til dette formålet hvis det er svært lite utvalg i utgangspunktet, eller hvis målpopulasjonen i utvalget er svært liten (for eksempel hvis man ønsker å se på minimal restsykdom eller kreftceller i de tidlige stadiene av sykdommen). Et nyttig alternativ til celler er perler kombinert med samme fluorofor som brukes til å analysere prøven. Mange slike perler er kommersielt tilgjengelige; Disse kulene er enten forhåndsmerket med ønsket fluorofor (forhåndsmerkede fluoroforspesifikke perler)19,20, eller et fluorescerende merket antistoff kan festes til dem (antistofffangstperler)20,21. Mens kommersielle kompensasjonsperler er tilgjengelige for mange fluoroforer, er slike perler utilgjengelige for porfyriner, til tross for deres økende bruk i grunnleggende og klinisk forskning.

I tillegg til prøvebevaring og passende størrelse positive versus negative populasjoner, er de andre fordelene ved å bruke perler som kompensasjonskontroller enkel forberedelse, lav bakgrunnsfluorescens og utmerket stabilitet over tid22. Den potensielle ulempen ved å bruke perler som kompensasjonskontroll er at utslippsspekteret til det fluorescerende antistoffet fanget på perler kan avvike fra det samme antistoffet som brukes til å merke cellene. Dette kan være av spesiell betydning ved bruk av spektralstrømningscytometer20. Derfor må utviklingen av perler som kompensasjonskontroll utføres på strømningscytometeret som skal brukes til analysen som perlene utvikles for. Videre må utviklingen av perlene inkludere en sammenligning med celler merket med samme fluorescerende fargereagens.

Her beskriver vi fremstillingen av TCPP-aminfunksjonaliserte polystyrenkompensasjonsperler, hvis median fluorescensintensitet i deteksjonskanalen var sammenlignbar med TCPP-merkede celler i sputum, og deres bruk som kompensasjonskontroller for flowcytometri. Autofluorescensen av ekvivalente, ikke-funksjonaliserte perler var tilstrekkelig lav til at de kunne brukes som negative fluorescenskompensasjonskontroller. I tillegg viste disse perlene stabilitet i lagring i nesten 1 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer må gjøres ved hjelp av passende personlig verneutstyr.

1. Tilberedning av TCPP-stamløsningen, 1,0 mg/ml

MERK: Dette kan utarbeides månedlig.

  1. Ved hjelp av en analytisk vekt, slikkepott og veiepapir veier du 49,0-50,9 mg TCPP. Rund vekten til 1/10 av et milligram. Sett den målte mengden TCPP til side beskyttet mot lys.
    MERK: Bruk en statisk pistol hvis vektavlesningen er ustabil.
  2. Bestem de nødvendige mengdene renset vann og isopropanol (IPA) fra tabell 1 basert på mengden TCPP veid i trinn 1.1. Tilsett renset vann og isopropanol til et 100 ml glassbeger, og dekk med parafilm for å beskytte mot fordampning.
  3. Bestem den nødvendige mengden natriumbikarbonat fra tabell 1 basert på mengden TCPP veid i trinn 1.1.
  4. Bruk den analytiske balansen, slikkepotten og veiepapiret til å veie den nødvendige mengden natriumbikarbonat som ble bestemt i trinn 1.3. Rund vekten til 1/10 av et milligram.
    MERK: Bruk en statisk pistol hvis vektavlesningen er ustabil.
  5. Tilsett natriumbikarbonatet til 100 ml begeret som inneholder renset vann og isopropanol. Dekk løsningen med parafilm for å beskytte mot fordampning.
  6. Legg oppløsningen fra trinn 1.5 på en røreplate, og rør til den er oppløst (ca. 10 min)
  7. Mål pH for å sikre at natriumbikarbonatholdig oppløsning fra trinn 1,6 har en pH mellom 9 og 10.
  8. Tilsett langsomt TCPP som veide i trinn 1.1 til løsningen fra trinn 1.7, og fortsett omrøringen til den er oppløst (~30 min). Beskytt mot lys under dette trinnet.
  9. Oppbevares i en glass- eller polypropylenbeholder ved romtemperatur og beskyttet mot lys.

2. Fremstilling av 2- (N-morfolino)-etansulfonsyre (MES) og hemisodiumsaltbufferløsning, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-buffer")

MERK: Dette må tilberedes på bruksdagen og oppbevares i romtemperatur.

  1. Vei ut 2,50 g MES hemisodiumsalt, og tilsett dette i en 150 ml plastflaske.
  2. Tilsett 121 ml renset vann, og oppløs ved manuell risting til ingen faste stoffer er synlige.
  3. Mål pH-verdien til MES-bufferen for å sikre at den er mellom 6 og 6,2.
  4. Oppbevares ved romtemperatur for bruk samme dag.

3. N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid (EDC) pulver

  1. Ta EDC-pulveret ut av fryseren, og la det stå i romtemperatur til bruk i trinn 5.

4. Kombinere aminfunksjonaliserte polystyrenperler med TCPP-løsning

  1. Tilsett 4,3 ml av 0,1 M MES-bufferløsningen klargjort i trinn 2 til et 15 ml polypropylenrør.
  2. Vortex den aminfunksjonaliserte polystyrendråpesuspensjonen (10 μm, 2,5% w / v) i 60 s ved maksimal hastighet.
  3. Legg til 288 μL av denne ferske virveldråpesuspensjonen til MES-bufferen fra trinn 4.1.
  4. Vortex MES/perleløsningen i 15 s ved maksimal hastighet.
  5. Vortex, 1 mg/ml TCPP-oppløsningen tilberedt i trinn 1 for 60 s ved maksimal hastighet.
  6. Tilsett 1,20 ml av denne ferske virvelbaserte TCPP-stamløsningen til MES/perlesuspensjonen fra trinn 4.4.
  7. Vortex MES / perle / TCPP-fjæringen i 15 s ved maksimal hastighet.
  8. Dekk røret med folie mens EDC-løsningen fremstilles.

5. Fremstilling av N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid (EDC) hydrokolorid (HCl) stamløsning

MERK: EDC-oppløsningen er ferskvare og bør brukes umiddelbart etter tilberedning.

  1. Tilsett 20,0 ml renset vann til et nytt 50 ml konisk rør.
  2. Vei ut 200 mg EDC HCl fra trinn 3, og legg det til vannet (trinn 5.1).
  3. Vortex EDC HCL i 15 s ved maksimal hastighet for å generere en klar løsning.

6. Utarbeidelse av EDC HCl/MES arbeidsløsning

MERK: EDC HCl/MES-oppløsningen er ferskvare og bør brukes umiddelbart etter klargjøring.

  1. Tilsett 54,0 ml MES-bufferløsning (klargjort i trinn 2) til en 150 ml plastflaske.
  2. Tilsett 6,0 ml av EDC HCl-stamløsningen (klargjort i trinn 5) til MES-bufferløsningen, og bland ved å riste i 10 s.

7. Merking av perlene med TCPP

  1. Tilsett 4,5 ml EDC-arbeidsløsning (fra trinn 6) til 15 ml polypropylenrøret som inneholder kulene og TCPP i MES-bufferen (trinn 4.7).
  2. Plasser røret i en inverterende rotator ved 35 o / min i 16 timer ved romtemperatur og beskyttet mot lys.
  3. Sentrifuger røret ved romtemperatur i 10 minutter ved 1000 × g.
  4. Aspirer supernatanten og resuspender perlene i 0,8 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
  5. Overfør dråpeoppløsningen til et hetteglass av gult polypropylen med en 1 ml pipette, og oppbevar ved 4 °C inntil videre bruk.
    NOTAT: Perlene er stabile i minst 3 måneder på dette tidspunktet.

8. Kvalitetskontroll (QC) av TCPP-kulene ved flowcytometri

MERK: QC bør sentreres på om median fluorescensintensitet (MFI) av TCPP-kulene er tilstrekkelig lys for deres tiltenkte bruk og mengden partikler som genereres av prosedyren. Se avsnittet om representative resultater for mer informasjon.

  1. Merk en 5 ml polystyren rør som "TCPP negative perler."
    MERK: De negative perlene er forskjellige fra de aminfunksjonaliserte perlene som brukes til merking. Se materialfortegnelsen.
  2. Merk et annet rør som "TCPP positive perler."
  3. Merk et annet rør som "Rainbow perler."
  4. Aliquot 300 μL iskald HBSS inn i rørene merket med "TCPP negative perler" og "TCPP positive perler."
  5. Tilsett 500 μL iskald HBSS i røret merket som "Rainbow perler."
  6. Vortex den ikke-funksjonaliserte polystyren (umerket) perlesuspensjonen kort ved maksimal hastighet (2-3 s), og tilsett 10 μL av den til røret merket "TCPP negative perler."
  7. Vortex den TCPP-merkede dråpefjæringen (avsluttet i trinn 7.5) kort ved maksimal hastighet, og tilsett 3 μL av den til "TCPP positive perler" -røret.
  8. Vortex regnbueperleopphenget kort ved maksimal hastighet, og tilsett to dråper av det i "Rainbow beads" -røret.
  9. Hold alle rør på is, dekket og beskyttet mot lys.
  10. Start de riktige daglige oppstartsprosedyrene for flowcytometeret, og utfør en QC for å verifisere optimal væske og laserjustering.
    MERK: For denne delen av protokollen antas det at operatøren er opplært i bruk av strømningscytometeret som er tilgjengelig, inkludert prosedyrene for standardisering av lysspredningen og fluorescensintensiteten, samt de grunnleggende prinsippene for beregning av riktig kompensasjonsmatrise.
  11. Kjør regnbuekulene og TCPP-perlene uten å endre spenningsinnstillingene mellom de forskjellige løpene.
    1. Kjør og samle 10 000 hendelser av regnbueperlene.
    2. Utfør en skylling med vann, og samle 10.000 hendelser av TCPP-negative perler.
    3. Utfør en skylling med vann, og samle 10.000 hendelser av TCPP-positive perler.
    4. Utfør en 1 min vannskylling.
      NOTAT: Det er viktig å skylle med vann etter å ha kjørt TCPP-perlene. Hvis TCPP ikke skylles fra linjene i cytometeret, er det mulighet for at gjenværende TCPP kan merke celler i neste rør som skal anskaffes.
    5. Utfør de riktige rengjørings- og avstengningsprotokollene som er spesifikke for produsentens instruksjoner for cytometeret.
      MERK: For representative resultater, se figur 1.

9. Perlefiltrering

MERK: Hvis QC for kulene ved flowcytometri (trinn 8) viser en høy andel partikler (70 % eller høyere), bør du vurdere å filtrere dråpesuspensjonen ved hjelp av protokollen nedenfor (figur 2).

  1. Tilsett 3,20 ml iskald HBSS til 0,8 ml av TCPP-dråpesuspensjonen ferdigstilt i trinn 7,5 (skaper en fem ganger fortynning).
  2. Vortex den fortynnede perlefjæringen ved maksimal hastighet i 15 s.
  3. Fjern stempelet fra en 5 ml engangssprøyte.
  4. Monter sprøyten med et filter med glassfiberspiss (5 μm, 13 mm diameter).
  5. Tilsett 4 ml HBSS i sprøyten.
  6. Tilsett 0,5 ml av den virvelfortynnede dråpesuspensjonen (trinn 9,2).
  7. Bruk stempelet til å filtrere suspensjonen gjennom sprøyte-/filteroppsettet ved ca. 2 dråper/s.
  8. Vask kulene ved å trekke 5 ml fersk HBSS inn i sprøyten gjennom filteret ved ca. 2 dråper/s.
  9. Skyv HBSS ut igjen i avfallsbeholderen med ca. 2 dråper/s.
  10. For å fjerne kulene fra filteret, trekk ytterligere 5 ml fersk HBSS inn i sprøyten gjennom filteret.
  11. Fjern filteret forsiktig fra sprøyten.
  12. Støt dråpesuspensjonen fra sprøyten inn i et 50 ml konisk sentrifugerør.
  13. Sett filteret tilbake på sprøyten, og gjenta trinn 9.10-9.12 fire ganger til. Kast deretter filteret og sprøyten.
  14. Gjenta trinn 9.2-9.13 til alle perlene fra trinn 9.1 er filtrert. Bruk en ny sprøyte og filter hver gang.
  15. Sentrifuger de filtrerte dråpesuspensjonene i 10 minutter ved 1000 × g ved romtemperatur.
  16. Aspirer supernatanten til hver 50 ml tube, og resuspender kulene forsiktig og kombiner dem i 0,5 ml fersk HBSS.
  17. Overfør kulene med en p1000 mikropipette til et nytt hetteglass med gult, glass eller polypropylen, og oppbevar ved 4 °C.
  18. Gjenta trinn 8 for å fastslå om andelen TCPP-relaterte partikler i den filtrerte dråpesuspensjonen har gått ned. For representative resultater, se figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen for TCPP-merking av perler er relativt rask og effektiv. Figur 1 viser et representativt utfall av TCPP-perlemerkingsprosessen bestemt ved flowcytometri. Figur 1A viser den standardiserte profilen til regnbuekuler, som oppdaget i riktig kanal for påvisning av TCPP. Disse perlene fungerer som en QC for standardisering av laserspenningene for påvisning av TCPP av strømningscytometeret. Figur 1B viser lysspredningsprofilen til aminfunksjonalisert polystyren, TCPP-merkede perler. Figur 1C viser lysspredningsprofilen til ikke-funksjonaliserte perler (umerkede perler); Vi bruker disse som en negativ dråpekontroll for å beregne kompensasjonsmatrisen. Populasjonen indikert av det røde rektangelet, som er fraværende i den umerkede perlesuspensjonen, representerer TCPP-relaterte partikler som dannes når TCPP utsettes for koblingsreagenset EDC. Slike aggregater bør utelukkes når fluorescensintensiteten (FI) til kulene bestemmes. Figur 1D viser FI for de merkede perlene, valgt av den svarte porten i figur 1B, som er tydelig flere stokker høyere enn FI for de (ungerte) umerkede perlene (sammenligning av figur 1D med figur 1E).

Andelen partikler (dvs. hendelsene angitt av den røde porten i figur 1B) kan variere per merkeparti. For de fleste standard flowcytometriapplikasjoner gjør en dråpeoppheng med 50 % partikler eller mindre det mulig å sette opp kompensasjon riktig i et flerfarget flowcytometrieksperiment ved hjelp av TCPP. Det finnes imidlertid applikasjoner der automatisert dataanalyse brukes, for hvilket mye høyere partikkelinnhold kan forstyrre riktige kompensasjonsinnstillinger. I slike tilfeller anbefales filtrering (protokoll trinn 9 og figur 2). Figur 3 viser effekten av filtrering på dråpesuspensjonen som omfattet ~ 65% partikler (venstre paneler i figur 3A, B). Etter filtrering ble partikkelinnholdet redusert til ~12%. Skadevirkningene av filtrering er noe tap av perler (ikke vist) og et lite tap av FI (figur 3C). Disse effektene bør tas i betraktning når filtrering av dråpesuspensjonen vurderes. Et alternativ til perlefiltrering for å senke partikkelinnholdet er å endre forholdet mellom perlene, TCPP og koblingsreagenset EDC. Imidlertid påvirker endringer i disse forholdene også perlenes FI.

Forholdet mellom partikkeldannelsen, MFI, og perle / TCPP / EDC-forholdet er illustrert i figur 4 og figur 5. Figur 4A og figur 5A viser MFI av de merkede perlene som en funksjon av henholdsvis EDC / TCPP-forholdet og TCPP / perleforholdet. Med økende forholdstall øker MFI til det platåer. De representative eksemplene i figur 4B og figur 5B viser at partikkelinnholdet øker med det respektive økende forholdet. Denne TCPP-merkingsprotokollen ble optimalisert for maksimal MFI, samtidig som partikkelinnholdet ble holdt så lavt som mulig (pilene i figur 4A og figur 5A). Partiklene vises bare når EDC brukes som koblingsreagens under merkingsprosedyren. Ved bruk av bare perler og TCPP dannes det ikke partikler (ikke vist), men merkingen av perlene resulterer i perler med mye lavere FI (sammenligning av figur 6A med figur 6B). Vi prøvde å erstatte denne EDC-baserte koblingsmetoden med en metode basert på en aktivert NHS (N-hydroksysuccinimid) ester av TCPP23. Vi fant imidlertid ingen signifikant forskjell i FI ved bruk av denne alternative koblingsmetoden sammenlignet med bare å bruke perler og TCPP sammen, noe som tyder på at det er ubetydelig kovalent binding av TCPP til perlene med denne metoden (sammenligning av figur 6B med figur 6C).

Dataene som er presentert i alle figurene så langt, ble samlet inn ved hjelp av perler med diameter på 10,6 μm. Vi antydet at større perler kan ha flere TCPP-bindingssteder på grunn av det økte overflatearealet og derfor kunne vise høyere FI. Omvendt antydet vi at mindre perler med mindre overflatearealer og færre TCPP-bindingssteder skulle vise lavere FI. Ved å bruke samme merkeprotokoll som beskrevet her, men med 8,6 μm perler eller 20 μm perler (i stedet for 10,6 μm perler), vi fant den forventede reduksjonen i FI i 8.6 μm perler sammenlignet med 10.6 μm perler (sammenligning av figur 6D med figur 6A). De 20 μm perlene viste en FI utenfor skalaen for strømningscytometeret vi brukte (data ikke vist), men disse større perlene la seg raskt ut av løsningen etterpå og ble ikke forfulgt videre.

Denne protokollen for merking av perler med TCPP ble utviklet med det formål å ha et pålitelig kompensasjonsverktøy i flowcytometrieksperimenter der TCPP brukes til å merke celler. Tidligere brukte vi A549-celler til dette formålet24, men merkeprosedyren resulterte ikke alltid i høy FI. Videre kunne cellene, selv etter fiksering, ikke brukes i mer enn 1 måned. Protokollen for merking (10,6 μm) perler med TCPP beskrevet her resulterte konsekvent i fargerike perler, som vist i figur 1. Når de samme TCPP-merkede kulene ble testet med flowcytometri etter 300 dager, observerte vi heller ingen signifikant endring i MFI eller partikkelinnhold (figur 7). Koblingen av TCPP til perlene hadde liten effekt på fluorescensutslippsspekteret (figur 8A; sammenligning av den stiplede svarte linjen med den solide svarte linjen, som representerer fluorescensutslippsspekteret til TCPP i oppløsning). Fluorescensutslippsspekteret til TCPP-merkede perler skilte seg mer fra spekteret av TCPP målt i A549 lungekreftceller, spesielt rundt 700-725 nm bølgelengder (figur 8A; stiplet svart linje sammenlignet med den oransje linjen, henholdsvis). Imidlertid, med muligheten til å kompensere TCPP-signalet fra de andre signalene i en multifluoroformerket sputumprøve, fungerte de TCPP-merkede perlene like bra som de TCPP-fargede A549-cellene (sammenlignet henholdsvis figur 8B med figur 8C).

Den. LMD-filer finnes i FlowRepository (https://flowrepository.org), under ID-ene FR-FCM-Z6ZP (figur 1); FR-FCM-Z5UJ (figur 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (figur 4B); FR-FCM-Z6ZS (figur 5B); FR-FCM-Z6ZB (figur 6); FR-FCM-Z6Y5 (figur 8B); og FR-FCM-Z6ZT (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Kvalitetskontroll av perlene merket med TCPP. (A) Regnbueperler. Presentert er histogrammet til regnbuekulene som oppdaget i kanalen spesifikt for APC-fluoroforen. Denne kanalen kan også brukes til å oppdage TCPP-fluorescens. Rainbow-perlene fungerer som en QC for APC-laseren; Den første og fjerde toppen skal falle i regionen som er angitt av de respektive parentesene. (B,D) TCPP-merkede perler. (C,E) Umerkede perler. Denne spesielle prøven av TCPP-merket perleløsning inkluderte 51,9% perler (svart rektangelport i B). Hendelsene i det røde rektangelet representerer partiklene som ble dannet under TCPP-merkingen. Slike partikler var fraværende i den umerkede dråpeløsningen (sammenligning av de røde rektanglene i B og C). Fluorescensintensitetene til de TCPP-merkede og umerkede perlene presenteres i henholdsvis D og E. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremoverspredning; APC = allophycocyanin; TCPP = meso-tetra(4-karboksyphenyl) porfin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk fremstilling av dråpefiltreringsmetoden brukt i protokolltrinn 9.3-9.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekter av filtrering på partikler og fluorescensintensitet. (A) Mikroskopibilder av 10 μm perler merket med TCPP før (venstre bilde) og etter filtrering (høyre bilde). Bildene ble tatt med en 20x forsterkning. Skalastang = 20 μm. (B) TCPP-perlefjæringen før filtrering (venstre profil) inkluderte 25,6 % perler (svart rektangel) og 65,7 % rusk eller partikler (rødt rektangel). Andelen perler i suspensjonen økte til 74,7% etter filtrering (høyre profil; svart rektangel), og rusk redusert til 11,9%. (C) Histogrammer av TCPP FI av perlene som identifisert i B. Histogrammet til venstre representerer de TCPP-merkede perlene før filtrering, med en FI litt høyere enn perlene etter filtrering (histogram til høyre). De røde linjene, plassert på en FI på 1 × 103 i begge figurene, er for å lette sammenligningen av begge histogrammene. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremoverspredning; APC = allophycocyanin; TCPP = meso-tetra(4-karboksyfenyl) porfin; FI = fluorescensintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Forholdet mellom EDC / TCPP-forholdet, median fluorescensintensitet (MFI) og partikkeldannelse. (A) Presentert er forholdet mellom EDC / TCPP-forholdet som brukes i perlemerkingsprotokollen og MFI for de påfølgende TCPP-merkede perlene. Kurven viser gjennomsnittlig MFI av tre uavhengige eksperimenter ± standardavvik (SD). Den røde pilen (3,75) indikerer volumforholdet mellom EDC- og TCPP-løsningene som brukes i denne protokollen. (B) Representative lysspredningsprofiler for dråpesuspensjonene fremstilt med EDC/TCPP-forholdene som angitt over hver profil. Alle profilene er hentet fra det samme eksperimentet. Perlene er indikert med det svarte rektangelet. Partikkeldannelsen, indikert av de røde rektanglene, øker med økende EDC/TCPP-forhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Forholdet mellom TCPP/perleforhold, MFI og partikkeldannelse. (A) Presentert er forholdet mellom TCPP / perler volumetrisk forhold som brukes i perlemerkingsprotokollen og MFI for de påfølgende TCPP-merkede perlene. MFI øker raskt, og når en platåfase etter et TCPP / perleforhold på 2. Kurven viser gjennomsnittlig MFI av tre uavhengige eksperimenter ± standardavvik (SD). Den røde pilen (4,17) indikerer forholdet som brukes i denne protokollen. (B) Representative lysspredningsprofiler av dråpeopphengene fremstilt med TCCP/perle-forholdene som angitt over hver profil. Alle profilene er hentet fra det samme eksperimentet. Perlene er indikert med de svarte rektanglene. Partikkeldannelsen, indikert av de røde rektanglene, øker med økende TCPP/perleforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: En sammenligning av koblingsmetodene og dråpestørrelsene som brukes. Vist er histogrammer av fluorescensintensiteten til kulene merket med TCPP. (A) 10,6 μm perlene ble merket i henhold til protokollen som ble gitt, inkludert bruk av koblingsreagenset EDC. (B) Det samme som (A), men EDC ble utelatt under merkingsprotokollen. (C) De 10,6 μm perlene ble merket ved hjelp av NHS-esteren, i henhold til metoden beskrevet av Kabe et al.23. (D) Samme som (A), men i stedet for 10,6 μm perler ble det brukt 8,6 μm perler. De vertikale røde linjene i hver profil er vilkårlig satt til 1 × 103 for å lette sammenligninger mellom histogrammene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Stabilitet av TCPP-kulene over tid. TCPP-merkede perler (10 μm) ble merket i henhold til protokollen, oppbevart i kjøleskap ved 4 °C og oppbevart i mørket. Dag 0 er dagen for merking. Deretter ble alikoter av de lagrede kulene reanalysert ved hjelp av flowcytometri. Presentert er målinger av (A) MFI og (B) prosentandel partikler i forhold til dag 0-verdien, som ble vilkårlig satt til 100%. De horisontale oransje linjene representerer verdiene 10 % over og 10 % under verdiene på dag 0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: TCPP-perler sammenlignet med TCPP-fargede celler som kompensasjonsverktøy. (A) Fluorescensutslippsspektrene til TCCP i løsning, TCPP koblet til perler og TCPP etter farging av A549 lungekreftceller ble målt på en mikroplateleser. Utslippsspektrene til løselig og perlebundet TCPP er svært like. Begge skiller seg fra de merkede A549-cellene rundt 700 nm bølgelengden. (B,C). En sputumprøve ble behandlet i enkeltceller og merket med flere fluoroforer: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) og TCPP (FL6). For hver fluorofor forberedte vi enfargede kontrollrør som inneholder perler kombinert med den aktuelle fluoroforen. For TCPP ble det satt opp to kontrollrør: ett med TCPP-merkede perler og ett med faste A549-celler merket med TCPP. Dette tillot oss å lage to kompensasjonsmatriser: (B) en der de TCPP-merkede perlene ble brukt som kompensasjonskontroll for TCPP (FL-6) og (C) en der TCPP-merkede A549-celler ble brukt. Disse to kompensasjonsmatrisene er svært like, med den største forskjellen i TCPP-relatert kompensasjon mellom TCPP (FL6) og FL-3. De medfølgende punktdiagrammene som viser disse bestemte parametrene, viser nesten identiske profiler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Reagenser kreves for TCPP-lagerløsningen. Mengdene NaHCO3, renset vann og isopropanol (IPA) er basert på mengden TCPP veid i trinn 1,1 (mellom 49,0 mg og 50,9 mg). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for de mange anvendelsene av porfyriner i kreftdiagnose og terapeutikk2, er det begrenset litteratur om deres potensielle bruk som et flowcytometrisk reagens for identifisering av kreftpopulasjoner versus ikke-kreftcellepopulasjoner i primært humant vev24,25,26. Vår forskning på flowcytometrisk analyse av humant sputum24,27 krever farging av dissosierte sputumceller med TCPP og flere andre fluoroforer. Imidlertid betydde fluorescens av TCPP i deteksjonskanalene beregnet for andre fluoroforer at en TCPP-merket perle var nødvendig som kompensasjonskontroll. Imidlertid var ingen slik perle kommersielt tilgjengelig og måtte utvikles. Feste av tetraaryl porfyriner til silisiumdioksidbaserte molekylsikter28,29 har blitt rapportert. Silisiumdioksidbaserte partikler viste seg imidlertid å være uegnet til å utarbeide flowcytometristandarder (data ikke vist). Derfor fokuserte våre studier på isoporperler.

En løsning av TCPP i isopropanol-vann (1: 1 v / v) 30 merket polystyrenkulene ved pH 6, men MFI var for lav i forhold til de fargede cellene i analysen vår. Vi utforsket kovalent perlemodifisering som en måte å øke MFI. Den kovalente modifikasjonen av de aminfunksjonaliserte latexperlene med NHS-esteren av TCPP gjennom amidasjon ble tidligere beskrevet av Kabe et al.23 ved bruk av ikke-kommersielle 2 μm diameterperler31. I studien av Kabe et al.23 ble TCPP inkubert i DMF med N-hydroksysuccinimid (NHS) 32 i 5 timer for å forberede en aktivert NHS-monoester av TCPP. Denne aktiverte esterløsningen ble deretter reagert med perler som inneholdt en terminal aminlinker. Men da vi brukte denne protokollen på kommersielle aminfunksjonaliserte polystyrenperler, resulterte merkingen i perler med en MFI som ikke var tilstrekkelig lyse for kompensasjon. Derfor utforsket vi direkte amidering av aminpolystyrenperler uten å bruke et NHS-estermellomprodukt.

I dette arbeidet ble aminfunksjonaliserte polystyrenperler behandlet med TCPP i nærvær av amidkoblingsreagensen EDC for å generere amidbindinger mellom aminogruppene på perlene og karboksygruppene på TCPP. EDC ble valgt på grunn av sin vandige løselighet, påvist nytte i vandige amidasjonsreaksjoner over et bredt pH-område, lave kostnader og vannløselig av produkter33,34. Vi reagerte aminpolystyrenperler med diameter på 8,6 μm, 10,6 μm og 20 μm med TCPP og EDC i vann ved pH 6. Tidligere studier har indikert at TCPP forblir løselig ved denne pH, og denne pH er også kompatibel med EDC33. De merkede 8,6 μm perlene resulterte i en MFI som var for lav for analysen vår. De 20 μm perlene hadde en tilstrekkelig høy MFI, men var tilbøyelige til å bosette seg ut av suspensjon og tette strømningscytometeret (ikke vist). 10,6 μm perlene hadde en tilstrekkelig MFI, forble i suspensjon lenge nok til flowcytometrianalyse og ble dermed optimalisert som kompensasjonsstandarder. Spesielt hadde de tilsvarende umerkede perlene lav bakgrunnsfluorescens og kunne brukes som negative kontrollperler for kompensasjon.

Ved å øke det volumetriske reagensforholdet mellom EDC og TCPP mens mengden perler holdes konstant, økte perlen MFI til et platå ble nådd i et forhold på ca. 2. Et MFI-platå ble også observert da forholdet mellom TCPP og perler ble økt mens EDC til TCPP-forholdet ble holdt konstant. Siden TCPP merket perlene i fravær av EDC, kan MFI-platået være et resultat av at kovalente og ikke-kovalente bindingssteder blir mettet på overflaten av perlen. Et TCPP-relatert biprodukt av partikler ble observert når EDC og TCPP ble kombinert ved pH 6. Dette partikkelformede hadde et fluorescensspektrum som ligner på TCPP, men ble ikke dannet i fravær av EDC, noe som tyder på at det er et uoppløselig biprodukt fra reaksjonen av EDC med TCPP. Partiklene var uregelmessig formet, og selv om de generelt var mindre enn 5 μm, kunne de danne større aggregater og kunne også feste seg til overflaten av perlene. TCPP-relaterte partikler ble også observert når aminpolystyrenperler ble reagert med TCPP og EDC. Mengden partikler økte med både et høyere EDC til TCPP-forhold og et høyere forhold mellom TCPP og perler. Reagensforholdene som er valgt i den endelige protokollen er nøkkelen til suksessen til dråpemerkingsprosedyren fordi de sikrer at den resulterende dråpesuspensjonen har en høy MFI mens partikkelnivået forblir akseptabelt. Nivået av partikler produsert i denne protokollen utelukker ikke bruk av TCPP-perler for kompensasjon, men høyere nivåer av partikler kan hemme nøyaktigheten av kompensasjonsinnstillingene35. Vi utviklet også en filtreringsprosedyre som kan redusere nivået av partikler betydelig dersom disse skulle være til stede på et høyt nivå.

Vi gjennomførte vår reaksjon ved hjelp av en roterende agitator. Å ikke agitere reaksjonen resulterer i langsommere farging (data ikke vist). En 16 timers reaksjonstid anbefales. Lengre reaksjonstider (>24 timer) resulterer i høyere nivåer av TCPP-partikler, mens kortere reaksjonstider (<8 timer) resulterer i MFI med lavere dråpe. For den umerkede perlekontrollen brukte vi ikke aminfunksjonaliserte perler som ikke var merket med TCPP fordi autofluorescensen til de umerkede perlene forstyrret beregningen av kompensasjonsmatrisene riktig. I stedet brukte vi ikke-funksjonaliserte polystyrenperler som er like i merke og størrelse. I tillegg oppbevarte vi de umerkede og TCPP-merkede perlene i separate rør. Med begge settene med perler i samme rør observerte vi en viss overføring av TCPP til de umerkede perlene (data ikke vist), noe som forårsaket et høyreskifte i MFI som forbød riktig beregning av kompensasjonsmatrisen.

Oppsummert er de kritiske punktene for å oppnå en høy MFI av TCPP-merkede perler reagensforholdene som brukes under fargereaksjonen, tidspunktet for fargereaksjonen og diameteren til de umerkede perlene. I dette arbeidet ga protokollen beskrevet ovenfor TCPP-fargede perler som var passende størrelse for bruk i et flowcytometer og var tilstrekkelig fluorescerende for kompensasjon. De TCPP-fargede perlene mistet ikke signifikant MFI ved 4 ° C i 300 dager. Fluorescensspekteret til TCPP-kulene var sammenlignbart med TCPP i oppløsning. Videre genererte kompensasjonsmatrisene beregnet med TCPP-merkede perler og fargede A549-celler nesten identiske sputumprofiler i analysen vår, noe som demonstrerte nytten av disse perlene.

Denne protokollen beskriver klargjøring av TCPP-kompensasjonsperler som var nyttige på Navios EX-instrumentet, men de samme perlene fungerer kanskje ikke på et annet instrument med forskjellig følsomhet36 og en annen detektorkonfigurasjon20. Imidlertid foreslår dette arbeidet måter å modulere fluorescensen gjennom dråpestørrelsen og reagensforholdet. TCPP er bare en av flere fluorescerende porfyriner som har vist kreftcelleselektivitet in vitro og in vivo 2,37,38,39. Ikke alle fluorescerende porfyriner kan binde seg til de aminfunksjonaliserte polystyrenkulene som brukes i denne protokollen. Faktisk er bruken av disse perlene begrenset til porfyriner som inneholder en karboksylsyre. Differensialfargingen av forskjellige cellepopulasjoner i humane vevsprøver med porfyriner, målt ved flowcytometri, kan gi innsikt i tidlig utvikling av kreft, dens progresjon og prognose. Bruken av andre porfyriner for å farge humane vevsprøver og deres analyse ved flowcytometri, ved bruk av passende kontrollperler som kompensasjonsstandarder, er en attraktiv retning for videre forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne er ansatte i bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Vi takker David Rodriguez for hjelp med figurforberedelse og Precision Pathology Services (San Antonio, TX) for bruken av Navios EX flowcytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193 Flowcytometri kompensasjonskontroll fluorofor merking aminfunksjonaliserte perler amidasjon porfyrin
Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter