Encyclopedia of Experiments: Biology
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- एक बैक्टीरियल फूड सोर्स से वरीयता प्राप्त प्लेटों पर अपने आखिरी लार्वा स्टेज में सेल्फ फर्टिलाइजिंग कीड़े रखकर शुरुआत करें। लार्वा को परिपक्व वयस्कों में विकसित करने की अनुमति दें जब तक कि कीड़े के भीतर अंडे की बहुतायत न हो और प्लेटों पर रखी न जा सके। अंडे और कीड़े इकट्ठा करने के लिए प्लेटों को बफर से धोएं।
इसके बाद, बफर को ब्लीच समाधान से बदलें जो वयस्क कीड़े को भंग कर देता है। अंडे के हिस्से द्वारा संरक्षित, भ्रूण इस उपचार से बच जाएगा, हालांकि वे विकास के विभिन्न चरणों में होंगे। फिर ब्लीच को बफर से बदलें और भ्रूण को विकसित होने दें। भोजन के अभाव में लार्वा अपने अंडों के गोले से निकलता है, विकास पहले लार्वा चरण पर रुक जाएगा।
विकास को फिर से शुरू करने के लिए लार्वा को भोजन के साथ प्लेटों में स्थानांतरित करें। यह शेष लार्वा चरणों के माध्यम से समकालिक प्रगति को प्रोत्साहित करेगा।
जब कीड़े अंतिम लार्वा चरण तक पहुंचते हैं, तो उन्हें भोजन और फ्यूडीआर के साथ प्लेटों में ले जाएं, एक डीएनए संश्लेषण अवरोधक जो संतानों के उत्पादन को रोकता है। फ्यूडीआर की उपस्थिति में निरंतर विकास बाँझ वयस्क कीड़े की आबादी पैदा करता है। इस प्रयोग में, हम नेमाटोड सी एलिगेंसकी आबादी को सिंक्रोनाइज करेंगे।
-शुरू करने के लिए, नेमाटोड ग्रोथ मीडिया या एनजीएम प्लेटों पर एस्चेरिचिया कोलाई के एक हौसले से वरीयता प्राप्त लॉन पर वांछित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के एल 4 लार्वा को स्थानांतरित करें। प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम दो 100 मिलीमीटर या तीन 60 मिलीमीटर प्लेटों का उपयोग करें।
तीन से चार दिनों के लिए उचित विकास के तापमान पर कीड़े को इनक्यूबेट करें या जब तक प्लेटें बड़ी संख्या में अंडे और ग्रेविड कीड़े के साथ केंद्रित न हों। निमाटोड की प्रति 100 मिलीमीटर प्लेट एम 9 बफर के लगभग छह मिलीलीटर का उपयोग करके अंडे और कीड़े को प्लेटों से धोएं। ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक तनाव के लिए अंडे और कीड़े को व्यक्तिगत 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इन ट्यूबों को 6,180 ग्राम पर तीन मिनट के लिए नीचे स्पिन करें।
अपकेंद्रित्र के बाद, सिर्फ जानवर और अंडे की गोली को बनाए रखने M9 बफर बाहर aspirate । प्रत्येक ट्यूब में तीन से चार मिलीलीटर ब्लीच समाधान जोड़ें और छह मिनट के लिए रुक-रुक कर भंवर डालें।
फिर प्रत्येक ट्यूब को भरने के लिए M9 बफर जोड़ें और एक मिनट के लिए 6,180 ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और इस वॉश को तीन बार M9 के साथ दोहराएं।
धोने के बाद, अंडे की गोली को एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब पर ले जाएं जिसमें लगभग नौ मिलीलीटर M9 बफर होते हैं। 16 से 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नटखट करके हौसले से रची कीड़े सिंक्रोनाइज़ करें।
इन ट्यूबों को 1.5 मिनट के लिए 6,180 ग्राम पर नीचे कताई के बाद, सिंक्रोनाइज्ड एल1 जानवरों को व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों पर OP50 के एक हौसले से वरीयता प्राप्त लॉन पर नीचे रखें। प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक रखें जब तक कि जानवर लगभग 42 घंटे के बाद एल4 लार्वा चरण तक न पहुंच जाए। इस समय, एल4 लार्वा को ओपी50 वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए प्लेटिनम पिक का उपयोग करें जिसमें एफयूडीआर के 0.5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर होते हैं ताकि उन्हें संतान उत्पादन से रोका जा सके।
