Encyclopedia of Experiments: Biology
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- 세균성 음식 소스와 시드 접시에 자신의 마지막 애벌레 단계에 자기 수정 벌레를 배치하여 시작합니다. 벌레 안에 계란이 풍부하고 접시에 놓일 때까지 애벌레가 성숙한 성인으로 발전하도록 허용하십시오. 계란과 벌레를 수집하기 위해 버퍼로 접시를 씻으라.
다음으로 버퍼를 성인 웜을 용해하는 표백제 용액으로 교체합니다. 계란 껍질에 의해 보호, 배아는 개발의 다른 단계에 있을 것입니다 하지만,이 치료살아남을 것 이다. 그런 다음 표백제를 완충제로 대체하고 배아가 발전할 수 있도록 합니다. 음식이 없는 동안 애벌레가 달걀 껍질에서 부화함에 따라 첫 번째 애벌레 단계에서 개발이 일시 중지됩니다.
애벌레를 음식과 함께 접시에 옮겨 개발을 재개합니다. 이것은 나머지 애벌레 단계를 통해 동기적 진행을 자극합니다.
벌레가 마지막 애벌레 단계에 도달하면 자손의 생산을 방지하는 DNA 합성 억제제인 음식과 FUdR을 사용하여 접시로 옮깁니다. FUdR의 존재에 있는 지속적인 발달은 멸균 성인 벌레의 인구를 생성합니다. 이 실험에서, 우리는 선충 C. elegans의 인구를 동기화합니다.
- 먼저, 원하는 유전 적 배경의 L4 애벌레를 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 에체리치아 대장균의 갓 씨를 뿌린 잔디밭에 옮긴다. 각 변형에 대해 적어도 두 개의 100 밀리미터 또는 3 개의 60 밀리미터 플레이트를 사용합니다.
3~4일 동안 또는 접시가 많은 수의 계란과 중력 벌레로 농축될 때까지 적절한 성장 온도에서 벌레를 배양합니다. 선충의 100밀리미터 플레이트 당 약 6밀리리터의 M9 버퍼를 사용하여 계란과 벌레를 접시에서 씻어냅니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 계란과 벌레를 각 변형에 대해 개별 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기습니다. 6,180g에서 3분간 이 튜브를 아래로 회전시세요.
원심 분리에 따라, M9 버퍼만 동물과 계란 펠릿을 유지 밖으로 흡인. 각 튜브에 3~4밀리리터의 표백제 용액을 넣고 간헐적으로 소용돌이를 6분간 추가합니다.
그런 다음 M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 1 분 동안 6,180g에서 회전합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 M9로 이 세척을 세 번 반복하십시오.
세척 후, 계란 펠릿을 M9 버퍼의 약 9 밀리리터를 포함하는 신선한 15 밀리리터 튜브로 이동합니다. 16~48시간 동안 섭씨 20도에 누디징하여 갓 부화한 벌레를 동기화합니다.
이 튜브를 6,180g에서 1.5분 동안 아래로 회전한 후 동기화된 L1 동물을 개별 NGM 플레이트에 OP50의 갓 시드잔디에 놓습니다. 동물이 약 42 시간 후에 L4 애벌레 단계에 도달 할 때까지 접시를 섭씨 20도에서 유지하십시오. 이 때 플래티넘 픽을 사용하여 L4 애벌레를 FUdR 밀리리터 당 0.5 밀리그램을 함유한 OP50 시드 NGM 플레이트로 이동하여 자손 생성을 방지합니다.
