Encyclopedia of Experiments: Biology
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-Comience colocando gusanos auto fertilizantes en su última etapa larvaria en placas sembradas con una fuente de alimento bacteriana. Permita que las larvas se conviertan en adultos maduros hasta que haya una abundancia de huevos dentro de los gusanos y se colocan en los platos. Lave las placas con tampón para recoger los huevos y gusanos.
A continuación, reemplace el búfer por una solución de lejía que disuelva los gusanos adultos. Protegidos por la cáscara de huevo, los embriones sobrevivirán a este tratamiento, aunque estarán en diferentes etapas de desarrollo. A continuación, reemplace la lejía por un amortiguador y permita que los embriones se desarrollen. A medida que las larvas eclosionan de sus cáscaras de huevo en ausencia de alimento, el desarrollo se detendrá en la primera etapa larvaria.
Transfiera las larvas a platos con alimentos para reanudar el desarrollo. Esto estimulará la progresión sincrónica a través de las etapas larvarias restantes.
Cuando los gusanos lleguen a la última etapa larvaria, muévalos a platos con alimentos y FUdR, un inhibidor de síntesis de ADN que impide la producción de descendencia. El desarrollo continuo en presencia de FUdR produce una población de gusanos adultos estériles. En este experimento, sincronizaremos una población del nematodo C. elegans.
-Para empezar, transfiera larvas L4 de fondos genéticos deseados a un césped recién sembrado de Escherichia coli en medios de crecimiento de nematodos o placas NGM. Utilice al menos dos placas de 100 milímetros o tres de 60 milímetros para cada cepa.
Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada durante tres a cuatro días o hasta que las placas se concentren con un gran número de huevos y gusanos rávidos. Lave los huevos y gusanos de las placas con aproximadamente seis mililitros de amortiguador M9 por placa de 100 milímetros de nematodos. Usando pipetas pasteur de vidrio, transfiera los huevos y gusanos a tubos centrífugas individuales de 15 mililitros para cada cepa. Baja estos tubos durante tres minutos a 6.180 g.
Después de la centrifugación, aspirar fuera del amortiguador M9 reteniendo sólo el animal y el pellet de huevo. Agregue de tres a cuatro mililitros de solución de lejía a cada tubo y vórtice intermitente durante seis minutos.
A continuación, agregue el búfer M9 para llenar cada tubo y girar a 6.180 g durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y repetir este lavado con M9 tres veces.
Después del lavado, mueva el pellet de huevo a un tubo fresco de 15 mililitros que contenga aproximadamente nueve mililitros de amortiguador M9. Sincronice los gusanos recién nacidos en tuerca a 20 grados Celsius durante 16 a 48 horas.
Después de girar estos tubos a 6.180 g durante 1,5 minutos, coloque a los animales L1 sincronizados en un césped recién sembrado de OP50 en placas NGM individuales. Mantenga las placas a 20 grados centígrados hasta que los animales lleguen a la etapa larvaria L4 después de aproximadamente 42 horas. En este momento, utilice una selección de platino para mover las larvas L4 a placas NGM de semillas OP50 que contengan 0,5 miligramos por mililitro de FUdR para evitar que produzcan progenie.
