Overview
इस वीडियो में, हम बाँझ वयस्क सी एलिगेंस की एक विकासात्मक सिंक्रोनाइज्ड आबादी के उत्पादन की एक विधि दिखाते हैं। उदाहरण प्रोटोकॉल जीवित जानवरों में ऑक्सीजन की खपत दरों का अध्ययन करने के लिए कीड़े को सिंक्रोनाइज़ करता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल सरसिजा और नॉर्मन का एक अंश है, बरकरार कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, जे विस एक्सपीमें ऑक्सीजन खपत दरों का मापन। (2019).
1. नेमाटोड आबादी का विकास और समकालिकीकरण
ये जानवर ~42 घंटे के बाद एल4 लार्वा स्टेज तक पहुंच जाएंगे। इस समय, 0.5 मिलीग्राम/
नोट सुनिश्चित करें कि एक प्रयोग के भीतर सभी उपभेदों को समान समय के लिए सिंक्रोनाइज्ड किया जाता है। FUdR उपचार जानवरों को निष्फल करता है और अंडा बिछाने और संतान उत्पादन को रोकता है, जो ओसीआर को प्रभावित कर सकता है। इन निष्फल जानवरों का विश्लेषण अगले दिन (दिन 1 वयस्क जानवर ~ 66 एच पर) परख के लिए किया जाएगा। FUdR शरीर विज्ञान और कुछ उत्परिवर्ती कीड़े की उम्र को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है । इसलिए, जब दवा का उपयोग नसबंदी के लिए किया जाता है तो इस पर विचार किया जाना चाहिए। कीड़े को फेम-1 (एचसी17) या फेम-3 (e2006) जैसे उत्परिवर्तनों को नारीवादी बनाने के माध्यम से भी निष्फल किया जा सकता है। हालांकि, ये उत्परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकते हैं।
- वांछित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के L4 लार्वा हस्तांतरण (जैसे, N2 [जंगली प्रकार] और सेल-12 जानवरों) नेमाटोड विकास मीडिया (NGM) प्लेटों पर (नुस्खा के लिए तालिका 1 देखें) हौसले से एस्चेरिचिया कोलाई (OP50) के एक लॉन के साथ वरीयता प्राप्त । प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम दो 100 मिमी या तीन 60 मिमी प्लेटों का उपयोग करें। 3-4 दिनों के लिए या प्लेटों को बड़ी संख्या में अंडे और ग्रेविड कीड़े के साथ केंद्रित होने तक उचित विकास तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस के बीच) पर कीड़े को इनक्यूबेट करें।
- लगभग 6 एमएल एम 9 बफर (नुस्खा के लिए टेबल 1 देखें) का उपयोग करके प्लेटों से अंडे और कीड़े धोएं( निमाटोड की 100 मिमी प्लेट और उन्हें प्रत्येक तनाव के लिए व्यक्तिगत 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ग्लास पेस्टर पिपेट के साथ स्थानांतरित करें। इन ट्यूबों को 6,180 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए नीचे स्पिन करें और एम 9 बफर को एस्पिरेट करें, सिर्फ जानवरों और अंडे की गोली को बनाए रखें।
- प्रत्येक ट्यूब में ब्लीच समाधान (नुस्खा के लिए तालिका 1 देखें) के 3-4 एमएल जोड़ें और 6 मिनट के लिए रुक-रुककर भंवर करें। प्रत्येक ट्यूब को भरने के लिए एम9 बफर जोड़ें और 1 मिनट के लिए 6,180 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनाट को एस्पिरेट करें। इस वॉश को तीन बार एम9 के साथ दोहराएं और अंडे के गोली को एक ताजा 15 एमएल ट्यूब पर ले जाएं जिसमें एम9 बफर का लगभग 9 एमएल हो।
- 16-48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अखरोट बनाकर हौसले से रची कीड़े सिंक्रोनाइज़ करें। इन ट्यूबों को 1.5 मिनट के लिए 6,180 x ग्राम पर स्पिन करें और सिंक्रोनाइज्ड एल1 जानवरों को व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों पर नीचे रखें जो ओपी50 (लगभग 6,000-10,000 जानवरों प्रति 100 मिमी प्लेट) के लॉन के साथ ताजा वरीयता प्राप्त हैं और 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
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Representative Results
तालिका 1: एनजीएम प्लेटें, M9 बफर, और ब्लीच समाधान के लिए व्यंजनों।
| M9 बफर (1 एल) | |||
| dH2O | 1,000 एमएल | ||
| नैक | 5 ग्राम | ||
| KH2PO4 | 3 ग्राम | ||
| Na2HPO4 | 6 ग्राम | ||
| 1 एम एमजीसो4 | 1 एमएल * ऑटोक्लेविंग के बाद जोड़ें | ||
| 2 बोतलों के बीच विभाजित करें: प्रत्येक 500 एमएल। तरल चक्र पर ऑटोक्लेव (15 मिनट एक्सपोजर) | |||
| ब्लीच समाधान (50 एमएल) | |||
| dH2O | 36 एमएल | ||
| विरंजक | 14 एमएल | ||
| 10 एन नाओह | 800 माइक्रोल | ||
| मानक नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटें | 1 एल | 0.5 एल | 0.25 एल |
| नैक | 3 ग्राम | 1.5 ग्राम | 0.75 ग्राम |
| बैक्टो-एगर | 17 ग्राम | 8.5 ग्राम | 4.25 ग्राम |
| बैक्टो-पेप्टोन | 2.5 ग्राम | 1.25 ग्राम | 0.625 ग्राम |
| एक। तरल चक्र पर ऑटोक्लेव (45 मिनट एक्सपोजर), ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें और फिर बाँझ तकनीक का उपयोग करें और निम्नलिखित जोड़ें: |
|||
| 1 एल | 0.5 एल | 0.25 एल | |
| 1 एम CaCl2 | 1 एमएल | 0.5 एमएल | 0.25 एमएल |
| 1 एम एमजीसो4 | 1 एमएल | 0.5 एमएल | 0.25 एमएल |
| 1 एम केपीओ4 | 25 एमएल | 12.5 एमएल | 6.25 एमएल |
| 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल | 1 एमएल | 0.5 एमएल | 0.25 एमएल |
| जन्म। प्रत्येक अतिरिक्त के बाद अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए भंवर। सभी जोड़ों के बाद, प्लेटें डालें |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
