Overview
이 비디오에서는 멸균 성인 C. elegans의발달 동기화 된 인구를 생산하는 방법을 보여줍니다. 예제 프로토콜은 살아있는 동물의 산소 소비율을 연구하기 위해 웜을 동기화합니다.
Protocol
이 프로토콜은 사라시야와 노먼에서 발췌, 그대로 Caenorhabditis elegans에서산소 소비 속도의 측정,J. Vis. Exp. (2019).
1. 선충 인구의 성장과 동기화
이 동물은 ~ 42 h 후 L4 애벌레 단계에 도달합니다. 이때, L4 애벌레를 사용하여 0.5 mg/mL 5-플루오로-2'-데옥시리딘(FUdR)을 함유한 OP50 시드 NGM 플레이트로 이동하여 자손 생성을 방지합니다.
참고 사항 실험 내에서 모든 균주가 비슷한 시간 동안 동기화되는지 확인합니다. FUdR 치료는 동물을 살균하고 OCR에 영향을 미칠 수있는 계란 누워 및 자손 생산을 방지합니다. 이러한 멸균 된 동물은 분석에 대한 다음 날 (1 일 성인 동물 ~66 h)을 분석합니다. FUdR는 특정 돌연변이 벌레의 생리학 그리고 수명에 영향을 미치기 위하여 보고되었습니다. 따라서, 이 약물이 살균에 사용 될 때 고려 되어야한다. 벌레는 또한 fem-1 (hc17) 또는 fem-3 (e2006)와 같은 돌연변이를 여성화하는 수단에 의해 살균 될 수 있습니다. 그러나, 이 돌연변이는 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 원하는 유전적 배경의 L4 애벌레(예를 들어, N2[야생형] 및 셀-12동물)을 선충 성장 매체(NGM 참조) 플레이트(레시피의 표 1 참조)에 게체리치아 대장균(OP50)의 잔디밭으로 갓 씨를 뿌린 다. 각 변형에 대해 적어도 두 개의 100mm 또는 3 개의 60mm 플레이트를 사용하십시오. 3-4일 동안 또는 판이 많은 수의 계란과 중력 벌레로 농축될 때까지 적절한 성장 온도(15-25°C 사이)에서 웜을 배양합니다.
- 선충의 100mm 플레이트당 약 6mL의 M9 버퍼(레시피용 표 1 참조)를 사용하여 계란과 벌레를 씻어 내고 각 변형에 대해 개별 15mL 원심분리기 튜브로 유리 파스퇴기 파이펫으로 옮겨 줍니다. 6,180 x g에서 3 분 동안 이 튜브를 아래로 돌리고 M9 버퍼를 흡인하여 동물과 계란 펠릿만 유지합니다.
- 표백제 용액 3-4mL(레시피표 1 참조)을 추가하고 간헐적으로 소용돌이를 6분 동안 추가합니다. 이 세척을 M9로 세 번 반복하고 달걀 펠릿을 약 9mL의 M9 버퍼가 들어있는 신선한 15mL 튜브로 이동합니다.
- 16-48h동안 20°C에서 누티드하여 갓 부화한 웜을 동기화합니다. 이 튜브를 6,180 x g에서 1.5 분 동안 아래로 돌리고 동기화 된 L1 동물을 OP50 (100mm 플레이트 당 약 6,000-10,000 동물)로 갓 시드 된 개별 NGM 플레이트에 내려 놓고 20 ° C에서 보관하십시오.
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Representative Results
표 1: NGM 플레이트, M9 버퍼 및 표백제 용액을 위한 레시피입니다.
| M9 버퍼 (1 L) | |||
| dH2O | 1,000mL | ||
| 나Cl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL *오토클레이브 후 추가 | ||
| 2 병 사이에 분할 : 500 mL 각. 액체 사이클에 자동 클라브 (15 분 노출) | |||
| 표백제 용액 (50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| 바래다 | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| 표준 선충 성장 미디어(NGM) 플레이트 | 1 L | 0.5 L | 0.25 L |
| 나Cl | 3 g | 1.5 g | 0.75 g |
| 바토-아가르 | 17 g | 8.5 g | 4.25 g |
| 바토 펩톤 | 2.5 g | 1.25 g | 0.625 g |
| a. 액체 사이클에 자동 클라브 (45 분 노출), ~60°C로 식힌 다음 멸균 기술을 사용하고 다음을 추가합니다. |
|||
| 1 L | 0.5 L | 0.25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0.5mL | 0.25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0.5mL | 0.25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12.5 mL | 6.25 mL |
| 5 mg/mL 콜레스테롤 | 1 mL | 0.5mL | 0.25 mL |
| b. 각 첨가 후 완전히 섞이도록 소용돌이. 모든 추가 가 끝나면 접시를 부어 |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
