Overview
En este video, mostramos un método de producción de una población sincronizada del desarrollo de C. elegans adultos estériles. El protocolo de ejemplo sincroniza los gusanos para estudiar las tasas de consumo de oxígeno en animales vivos.
Protocol
Este protocolo es un extracto de Sarasija y Norman, Medición de las tasas de consumo de oxígeno en Caenorhabditis Elegans intactas, J. Vis. Exp. (2019).
1. Crecimiento y sincronización de la población de nematodos
Estos animales llegarán a la etapa larvaria L4 después de ~ 42 h. En este momento, mueva las larvas L4 usando una selección de platino a placas NGM con semillas OP50 que contengan 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoxyuridina (FUdR) para evitar que produzcan progenie.
NOTA Asegúrese de que dentro de un experimento todas las cepas se sincronizan durante una cantidad similar de tiempo. El tratamiento con FUdR esteriliza a los animales y evita la puesta de huevos y la producción de progenie, lo que podría influir en la OCR. Estos animales esterilizados serán analizados al día siguiente (día 1 animales adultos a ~66 h) para el ensayo. FUdR se ha divulgado para afectar la fisiología y la vida útil de ciertos gusanos mutantes. Por lo tanto, Esto debe tenerse en cuenta cuando el medicamento se utiliza para la esterilización. Los gusanos también pueden esterilizarse mediante mutaciones feminizadoras como fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Sin embargo, estas mutaciones pueden afectar la función mitocondrial.
- Transfiera larvas L4 de fondos genéticos deseados (por ejemplo, N2 [tipo salvaje] y animales sel-12) a placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) (ver Tabla 1 para receta) recién sembradas con un césped de Escherichia coli (OP50). Utilice al menos dos placas de 100 mm o tres de 60 mm para cada cepa. Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada (entre 15-25 °C) durante 3-4 días o hasta que las placas se concentren con un gran número de huevos y gusanos rávidos.
- Lave los huevos y gusanos de las placas utilizando aproximadamente 6 ml de tampón M9 (ver Tabla 1 para receta) por placa de 100 mm de nematodos y transfiérelos con pipetas Pasteur de vidrio en tubos centrífugas individuales de 15 ml para cada cepa. Gire estos tubos hacia abajo durante 3 minutos a 6.180 x g y aspirar fuera del amortiguador M9, reteniendo sólo los animales y huevos pellet.
- Añadir 3-4 ml de solución de lejía (ver Tabla 1 para receta) a cada tubo y vórtice intermitente durante 6 min. Agregue el buffer M9 para llenar cada tubo y girar a 6.180 x g durante 1 min y aspirar supernatant. Repita este lavado con M9 tres veces y mueva el pellet de huevo a un tubo fresco de 15 ml que contenga aproximadamente 9 ml de amortiguador M9.
- Sincronice los gusanos recién nacidos en tuerca a 20 °C durante 16-48 h. Gire estos tubos a 6.180 x g durante 1,5 minutos y baje los animales sincronizados L1 en placas NGM individuales recién cosidas con un césped de OP50 (aproximadamente 6.000-10.000 animales por placa de 100 mm) y manténgalos a 20 °C.
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Representative Results
Tabla 1: Recetas para placas NGM, tampón M9 y solución de lejía.
| Búfer M9 (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 ml | ||
| NaCl | 7 % | ||
| KH2PO4 | 1 % | ||
| Na2HPO4 | 4 % | ||
| 1 M MgSo4 | 1 mL *añadir después del autoclave | ||
| Dividir entre 2 botellas: 500 ml cada una. Autoclave en ciclo líquido (exposición de 15 min) | |||
| Solución de lejía (50 ml) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| blanquear | 14 mL | ||
| 10 N Naoh | 800 μL | ||
| Placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) | 1 L | 0.5 L | 0.25 L |
| NaCl | 1 % | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4.25 g |
| Bacto-peptone | 2,5 g | 1.25 g | 0.625 g |
| un. Autoclave en ciclo líquido (exposición de 45 min), dejar enfriar a ~ 60 ° C y luego utilizar la técnica estéril y añadir lo siguiente: |
|||
| 1 L | 0.5 L | 0.25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M MgSo4 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12.5 mL | 6.25 mL |
| 5 mg/mL de colesterol | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| B. Swirl para mezclar bien después de cada adición. Después de que se hagan todas las adiciones, vierta platos |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
